ITPD990070A1 - Processo per la preparazione dei composti autoreticolati dell'acidoialuronico e dei suoi derivati ottenibili mediante la tecnica - Google Patents
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Description
Descrizione di una domanda di breveto per invenzione industriale dal titolo "Processo per la preparazione dei composti autoreticolati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati ottenibili mediante la tecnica antisolvente supercritico",
OGGETTO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione descrive un processo per la preparazione dei composti autoreticolati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati mediante la tecnica della precipitazione indota mediante antisolvente supercritico (SAS : Supercritical Anti Solvent).
Tali composti reticolati dell’acido ialuronico e dei suoi derivati possono essere vantaggiosamente impiegati per la preparazione di biomateriali da usare in campo medico, chirurgico e nell’ingegneria dei tessuti ad uso medicochirurgico.
CAMPO DELL’INVENZIONE
L'acido ialuronico è un etera polisaccaride composto da residui alternati di acido D-glucuronico e N-acetil-D-glicosammina. E' un polimero a catena lineare con peso molecolare che può variare tra 50.000 e 13.000.0000 Da a seconda della fonte dalla quale viene ottenuto e dai metodi di preparazione e di determinazione impiegati. E' presente in natura nei gel pericellulari, nella sostanza fondamentale del tessuto connettivo degli organismi vertebrati dei quali rappresenta uno dei componenti principali, nel fluido sinoviale delle giunture, nell'umor vitreo, nei tessuti del cordone ombelicale umano e nelle creste di gallo.
L'acido ialuronico esplica un ruolo vitale in molti processi biologici come, ad esempio, l'idratazione dei tessuti, l'organizzazione dei proteoglicani, la differenziazione cellulare, la proliferazione e l'angiogenesi (J. Aigner et al., L. Biomed. Mater. Res., 1998, 42, 172-181).
E' noto che frazioni di acido ialuronico possono essere utilizzate per facilitare la riparazione dei tessuti, come sostituenti del liquido endobulbare, o somministrate per via intra-articolare nelle patologie delle giunzioni, come descritto nei brevetti europei No. 0138572 e No. 0535200.
L'acido ialuronico ha un ruolo fondamentale nel processo di riparazione dei tessuti, soprattutto nei primi stadi della granulazione, stabilizzando la matrice di coagulazione e controllando la sua degradazione, favorendo il reclutamento di cellule infiammatorie come, ad esempio, leucociti polimorfonucleati e monociti, di cellule mesenchimali come, ad esempio, fibroblasti e cellule endoteliali ed, infine, orientando la successiva migrazione delle cellule epiteliali.
E' noto che l'applicazione di soluzioni di acido ialuronico può accelerare la guarigione di pazienti affetti da piaghe, ferite ed ustioni. Il ruolo dell’acido ialuronico nelle varie fasi del processo riparativo dei tessuti è stato descritto, attraverso la costruzione di un modello teorico, da Weigel P. H. et al.: "A model for thè role of hyaluronic acid and fibrin in thè early events during thè inflammatory response and wound healing", J Theor. BioL, 119: 219, 1986.
E’ noto altresì l’utilizzo di frazioni di acido ialuronico a basso peso molecolare per la preparazione di composizioni farmaceutiche aventi proprietà osteoinduttiva (US N. 5,646,129).
I derivati dell’acido ialuronico mantengono tutte le proprietà del suddetto glicosamminoglicano con il vantaggio di poter essere processati in forme diverse e di poter variare la loro solubilità e i tempi di degradazione in base al tipo e alla percentuale di derivatizzazione (EP 0216453 Bl).
Sono noti, inoltre, gli esteri totali o parziali dell’acido ialuronico e i derivati autoreticolati dell’acido ialuronico, il loro uso in campo farmaceutico, cosmetico e nelle aree dei materiali biodegradabili (brevetti US N. 4,851,521; 4,965,353; 5,676,964).
II processo noto fino ad ora per la preparazione dei derivati autoreticolati dell’ acido ialuronico presenta lo svantaggio di raggiungere con difficoltà una reticolazione omogenea in tutta la massa di prodotto. Tale processo consiste, infatti, nel preparare una soluzione di sale dell’acido ialuronico con tetrabutilammonio (HA-TBA) in un solvente organico quale, ad esempio, N-metil-pirrolidone (NMP), dimetilsolfossido (DMSO), dimetilformammide (DMF), alla temperatura al di sotto degli 0 °C, mantenere sotto agitazione mentre viene aggiunta una soluzione di 2-cloro-lmetil-ioduro di piridina (CMPJ) in uno dei suddetti solventi o in solventi organici, per un quantitativo di reticolante pari al 25% rispetto alla massa del polimero. Fin dal primo contatto, il CMPJ produce una reticolazione dell'HA-TBA e, man mano che la viscosità aumenta si ha una segregazione di solido prima che la distribuzione del reticolante sia omogenea, il reticolante aggiunto si deposita preferenzialmente sul solido e non riesce più a penetrare all'interno della soluzione, portando ad una reticolazione disomogenea.
La capacità dei fluidi antisolventi quali, ad esempio, la anidride carbonica (CO2), di solubilizzarsi nei solventi organici all’aumentare della pressione è stata sfruttata, nella presente invenzione, per cercare di controllare la reazione di autoreticolazione caratterizzata da una cinetica molto veloce soprattutto nella fase iniziale di miscelazione dei reagenti.
La possibilità di lavorare con liquidi molto meno viscosi, in quanto rigonfiati, consente di realizzare la miscelazione in tempi minori e con maggiore efficacia di quanto non avvenga nel processo tradizionale.
Il fluido antisolvente compresso permette così di operare in un mezzo rigonfiato e quindi disperso e di controllare meglio la reazione di reticolazione una volta innescata, abbassandone la velocità.
L’aggiunta del reticolante nella massa rigonfiata avviene in tempi molto brevi grazie ad un particolare sistema di iniezione, appositamente studiato. Grazie al rigonfiamento ad opera dell’ antisolvente compresso, all’agitazione della massa e all’iniezione repentina del reticolante, è stato possibile controllare la velocità di reticolazione negli istanti iniziali a temperature comprese tra 0 e 20°C, preferibilmente 10 °C.
A questa temperatura, la viscosità del mezzo è tale da consentire una buona omogeneizzazione della massa, a differenza del processo classico che deve essere condotto a temperature prossime a -20 °C.
E’ essenziale lavorare al di sotto della pressione di precipitazione in modo che la separazione del polimero dalla fase liquida avvenga per effetto della reticolazione e non venga indotta da precipitazione per effetto antisolvente; in questo secondo caso, infatti, il reticolante non sarebbe più in grado di penetrare all’ interno del precipitato e quindi di far avvenire la reazione se non superficialmente.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione descrive un processo per la preparazione dei composti autoreticolati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati mediante la tecnica della precipitazione indotta da antisolvente supercritico (SAS : Supercritical Anti Solvent).
Tali composti reticolati dell’acido ialuronico e dei suoi derivati possono essere vantaggiosamente impiegati per la preparazione di biomateriali da usare in campo medico, chirurgico e nell’ ingegneri a dei tessuti in campo medicochirurgico.
L’impianto impiegato per la conduzione della tecnica è schematizzato in figura 1.
Il processo secondo la presente invenzione prevede i seguenti passaggi: a) preparare le soluzioni del sale di ammonio quaternario dell’ acido ialuronico o dei suoi derivati e del reticolante;
b) caricare le soluzioni del sale di ammonio quaternario e del reticolante rispettivamente nel precipitatore e nel recipiente da cui aspira la pompa per il liquido;
c) regolare la velocità di rotazione nell’intervallo compreso tra 200-1000 rpm, preferibilmente tra 250 e 450 rpm;
d) regolare la temperatura nell’intervallo compreso tra -20 e 20 °C, preferibilmente tra 0 e 10 °C;
e) regolare la pressione del fluido al di sotto di quella di precipitazione del sale di ammonio quaternario dell’acido ialuronico o dei suoi derivati, che è funzione del solvente e della temperatura;
f) iniettare la soluzione del reticolante nel precipitatore ad una pressione maggiore rispetto a quella presente nel precipitatore allo scopo di disperdere tutta la quantità di reticolante uniformemente nella soluzione del polimero di partenza;
g) eventualmente, iniettare nel precipitatore una soluzione tampone; h) aumentare la temperatura fino a valori compresi tra 20 e 50 °C, preferibilmente tra 15 e 40°C;
i) lasciare reagire dalle due alle 12 ore, preferibilmente 6 ore;
j) lavare il prodotto mediante flusso di antisolvente a pressione compresa tra 60 e 150 bar, preferibilmente tra 80 e 100 bar;
k) depressurizzare e raccogliere il prodotto.
Tra i derivati dell'acido ialuronico sono da preferire i seguenti:
- gli esteri parziali dell'acido ialuronico in cui una parte delle funzioni carbossiliche è esterificata con alcoli della serie alifatica, aromatica, arilalifatica, cicloali fatica, eterociclica (EP 0216453 Bl);
- gli esteri parziali dell'acido ialuronico in cui una parte delle funzioni carbossiliche è esterificata con un alcool aralifatico e la seconda parte con alcoli ali fatici lineari a catena lunga con un numero di atomi di carbonio da 10 a 22 (WO 98/08876);
- i derivati parzialmente O-solfatati (WO 95/25751) e/o N-solfatati (W098/45335);
- i derivati ammidici dell'acido ialuronico.
Tra i sali di ammonio quaternario sono da preferire quelli di tetrabutilammonio. Gli agenti reticolanti sono, ad esempio, 2-cloro-lmetil-ioduro di piridina, 2-cloro piridina, 2-cloro-N-isopropil piridinio ioduro, 1 -fluoro 2,4 dinitrobenzene.
Le soluzioni vengono preparate in solventi organici quali, ad esempio, N-metilpirrolidone (NMP), dimetilsolfossido (DMSO), dimetilformammide.
ESEMPIO 1
Preparazione del sale dell’acido ialuronico con tetrabutilammonio
(da Vd negli altri brevetti)
ESEMPIO 2
Preparazione di acido ialuronico autoreticolato partendo da soluzioni di sali dell’acido ialuronico con tetrabutilammonio
La preparazione di acido ialuronico autoreticolato è stata condotta a partire da soluzioni di sali dell’acido ialuronico con tetrabutilammonio (HA-TBA) in N-metilpirrolidone (NMP) alla concentrazione di 15 e 20 mg/ml a due temperature diverse. Le condizioni operative mantenute durante le prove sono riportate in Tabella 1.
Tabella 1 Condizioni operative nelle prove di
reticolazione di una soluzione di HA-TBA in
NMP con l’aggiunta di trietilammina per
tamponare l 'acidità prodotta dalla reazione.
Procedura operativa
Vengono preparate le soluzioni contenenti il polimero e il reticolante e vengono quindi caricate rispettivamente nel precipitatore e nel recipiente da cui aspira la pompa per il liquido.
Il precipitatore viene chiuso ermeticamente e collegato alle linee di alimentazione e di evacuazione dell’impianto, nonché alla linea di iniezione del solvente. Vengono quindi alloggiati l’agitatore ed il motore elettrico ad esso accoppiato, mantenuto ad una velocità di rotazione di 400 r.p.m.
La temperatura interna del precipitatore viene mantenuta ad un valore compreso tra 0 e 20 °C, preferibilmente 0°C.
Una volta raggiunta la temperatura desiderata, inizia la fase di carica del precipitatore.
Quando la pressione raggiunge il valore desiderato, inferiore a quello di precipitazione, viene arrestato il flusso agendo sulla valvola VM1 ed il sistema viene mantenuto agitato a pressione costante.
A questo punto si aziona la pompa del liquido, che aspira la soluzione contenente il CMPJ da un serbatoio e la comprime nella linea di iniezione. Agendo sulle valvole a tre vie VT1 e VT2, si effettua un switch dei flussi in modo da mettere in comunicazione le linee I e Π con la CO2. La pressione della linea viene portata ad un valore superiore a quello presente nel precipitatore in modo da garantire un gradiente sufficiente all’iniezione di tutto il volume presente nel loop. A questo punto viene aperta la valvola on-off V1 permettendo alla soluzione col reticolante di essere iniettata nel recipiente a pressione. Questa fase dura qualche frazione di secondo dopodiché la valvola V1 viene chiusa.
Mantenendo il sistema sotto agitazione, si procede ad aumentare la temperatura del fluido di servizio sino ad un valore compreso tra 20 e 50 °C, preferibilmente 35 °C, sfiatando al tempo stesso il precipitatore per mantenersi al di sotto del valore di pressione di precipitazione.
L’agitazione viene protratta per un tempo variabile, compreso tra 4 e 12 ore e preferibilmente 6 ore, alla temperatura desiderata, per consentire di completare
Claims (2)
- La temperatura interna del precipitatore viene mantenuta ad un valore compreso tra 0 e 20 °C, preferibilmente 0°C. Una volta raggiunta la temperatura desiderata, inizia la fase di carica del precipitatore. Quando la pressione raggiunge il valore desiderato, inferiore a quello di precipitazione, viene arrestato il flusso agendo sulla valvola VM1 ed il sistema viene mantenuto agitato a pressione costante. A questo punto si aziona la pompa del liquido, che aspira la soluzione contenente il CMPJ da un serbatoio e la comprime nella linea di iniezione. Agendo sulle valvole a tre vie VT1 e VT2, si effettua un switch dei flussi in modo da mettere in comunicazione le linee I e Π con la CO2. La pressione della linea viene portata ad un valore superiore a quello presente nel precipitatore in modo da garantire un gradiente sufficiente all’iniezione di tutto il volume presente nel loop. A questo punto viene aperta la valvola on-off V1 permettendo alla soluzione col reticolante di essere iniettata nel recipiente a pressione. Questa fase dura qualche frazione di secondo dopodiché la valvola V1 viene chiusa. Mantenendo il sistema sotto agitazione, si procede ad aumentare la temperatura del fluido di servizio sino ad un valore compreso tra 20 e 50 °C, preferibilmente 35 °C, sfiatando al tempo stesso il precipitatore per mantenersi al di sotto del valore di pressione di precipitazione. L’agitazione viene protratta per un tempo variabile, compreso tra 4 e 12 ore e preferibilmente 6 ore, alla temperatura desiderata, per consentire di completare la reticolazione ad opera del reticolante, senza incorrere nella precipitazione del soluto per effetto antisolvente. Per depressurizzare il vaso di precipitazione, si agisce sulla valvola VM2. Si lascia il sistema in queste condizioni per un paio di minuti dopodiché si abbassa la velocità di agitazione ad un valore compreso tra 50 e 500 rpm, preferibilmente di 200 r.p.m., e si comincia la fase di depressurizzazione agendo sulla valvola VM2. Una volta evacuata completamente la CO2 presente nel precipitatore, questo viene scollegato dalla linea del reticolante che viene pulita facendovi fluire NMP puro per mezzo della pompa stessa. Si procede, infine, allo scollegamento del vaso dalla linea e al recupero del polimero reticolato. Essendo l’invenzione cosi descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modifiche non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell’invenzione e tutte quelle modifiche che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell’ambito delle seguenti rivendicazioni: b) caricare le soluzioni del sale di ammonio quaternario e del reticolante rispettivamente nel precipitatore e nel recipiente da cui aspira la pompa per il liquido; c) regolare la velocità di rotazione nell’intervallo compreso tra 200-1000 rpm, preferibilmente tra 250 e 450 rpm; d) regolare la temperatura nell’intervallo compreso tra -20 e 20 °C, preferibilmente tra 0 e 10 °C; e) regolare la pressione del fluido al di sotto di quella di precipitazione del sale di ammonio quaternario dell’acido ialuronico o dei suoi derivati; f) iniettare la soluzione del reticolante nel precipitatore ad una pressione maggiore rispetto a quella presente nel precipitatore; g) eventualmente, iniettare nel precipitatore una soluzione tampone; h) aumentare la temperatura fino a valori compresi tra 20 e 50 °C, preferibilmente tra 15 e 40°C; i) lasciare reagire dalle due alle 12 ore, preferibilmente 6 ore; j) lavare il prodotto mediante flusso di antisolvente a pressione compresa tra 60 e 150 bar, preferibilmente tra 80 e 100 bar; k) depressurizzare e raccogliere il prodotto.
- 2) Processo secondo la rivendicazione 1, in cui i derivati dell'acido ialuronico sono gli esteri parziali dell'acido ialuronico in cui una parte delle funzioni carbossiliche sono esterificate con alcoli della serie alifatica, aromatica, arilalifatica, cicloalifatica, eterociclica. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui i derivati dell’acido ialuronico sono gli esteri parziali dell’acido ialuronico in cui una parte delle funzioni carbossiliche è esterificata con un alcool aralifatico e la seconda parte con alcoli alifatici lineari a catena lunga con un numero di atomi di carbonio da 10 a 22. 4) Processo secondo la rivendicazione 1, in cui i derivati dell’acido ialuronico sono i derivati parzialmente O-solfatati e/o N-solfatati . 5) Processo secondo la rivendicazione 1, in cui i derivati dell’ acido ialuronico sono i derivati ammidici dell'acido ialuronico. 6) Processo secondo la rivendicazione l, in cui il sale di ammonio quaternario è il sale di tetrabutilammonio. 7) Processo secondo la rivendicazione 1, in cui gli agenti reticolanti sono scelti dal gruppo che consiste in 2-cloro-lmetil-ioduro di piridina, 2-cloro piridina, 2-cloro-N-isopropil piridinio ioduro, 1 -fluoro 2,4 dinitrobenzene. 8) Processo secondo la rivendicazione 1, in cui le soluzioni vengono preparate nei solventi organici scelti dal gruppo che consiste in N-metilpirrolidone (NMP), dimetilsolfossido (DMSO), dimetilformammide. 9) Composti reticolati dell’ acido ialuronico e dei suoi derivati ottenibili attraverso la tecnica della precipitazione indotta da antisolvente per la preparazione di biomateriali da usare in campo medico, chirurgico, nell’ ingegneria dei tessuti.
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