ITPI20000020A1 - Ooncentrazioni di saccarosio e durata dell'esposizione dell'ovocita asoluzioni di caricamento nella procedura di crioconservazione di ovoci - Google Patents
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Description
Concentrazioni di saccarosio e durata dell'esposizione dell'ovocita a soluzioni di caricamento nella procedura di crioconservazione di ovociti umani.
DESCRIZIONE
I benefici di un metodo, indirizzato a crioconservare ovociti umani non fecondati, sono attualmente ben riconosciuti soprattutto nei casi in cui sia necessario conservare ovociti in pazienti che vanno incontro a sindrome di iperstimolazione ovarica e non possono trasferire embrioni durante il trattamento di fecondazione assistita.
Il ridotto numero di nascite da ovociti umani crioconservati riportato in letteratura dimostra le notevoli difficoltà tecniche incontrate nelle procedure di crioconservazione degli ovociti. Le indagini svolte sino ad ora sulla crioconservazione degli ovociti umani forniscono informazioni assai disomogenee e spesso nettamente contrastanti sulla metodologia più idonea e meno dannosa per Γ integrità cellulare e per ottenere una alta percentuale di sopravvivenza ovocitaria.
Un protocollo di crioconservazione degli ovociti umani non è ancora stato standardizzato e il numero degli ovociti utilizzato per ciascuno studio è ancora relativamente basso per poter consentire l’identificazione di una definitiva metodologia da applicare.
La sopravvivenza degli ovociti umani nel procedimento di crioconservazione dipendente dalle dimensioni degli ovociti, dal crioprotettore (composizione, concentrazione e tempi di esposizione) e dalla velocità di congelamento/scongelamento
Il volume dell’ovocita è un parametro molto importante nel processo di crioconservazione in grado di influenzare le percentuali di sopravvivenza, poiché l’elevata quantità di acqua presente nellooplasma favorisce la formazione di ghiaccio intracellulare durante il processo di crioconservazione: il ghiaccio intracellulare è il maggiore responsabile dei danni a carico delle strutture subcellulari durante la crioconservazione. I protocolli per la procedura di crioconservazione di ovociti più largamente utilizzati includono: (a) l’iniziale esposizione degli ovociti ai crioprotettori penetranti (per es. 1,2 propandiolo-PROH), sostanze deputate a ridurre al minimo i danni provocati alle cellule dalla cristallizzazione dell’acqua; (b) una ulteriore esposizione degli ovociti ad una miscela di crioprotettore penetrante e crioprotettore non penetrante (per es. saccarosio), al fine di incrementare la disidratazione ovocitaria; (c) il raffreddamento lento fino alla temperatura di -150°C; (d) lo stoccaggio in azoto liquido (-196°C); (e) lo scongelamento; (f) la diluizione e la rimozione del crioprotettore penetrato all’ interno della cellula con un ritorno al microambiente fisiologico che permetterà le successive manipolazioni.
L’effetto benefico dei crioprotettori è in relazione 1) alla loro concentrazione, 2) alla durata di esposizione e 3) alla temperatura alla quale questi composti vengono addizionati all’ovocita.
L’attuale stato della tecnica per la procedura di crioconservazione dì ovociti utilizza per le soluzioni di raffreddamento e scongelamento concentrazioni di saccarosio di 0,1Μ o 0,2M. Il metodo qui descritto utilizza invece una soluzione di congelamento e scongelamento contenente una concentrazione di saccarosio più elevata pari a 0,3M (o concentrazioni ancora più elevate). La presenza di una concentrazione di saccarosio 0,3M all'esterno della membrana cellulare permette di incrementare il tasso di disidratazione cellulare: inferiore è la quantità di acqua presente nel citoplasma più ridotta è la possibilità, durante il processo di raffreddamento, di formazione di ghiaccio intracellulare dannoso per la sopravvivenza delle strutture intracitoplasmatiche dell’ovocita. La probabilità di sopravvivenza dell’ovocita viene inoltre notevolmente aumentata dopo una adeguata reidratazione dello stesso durante le procedure di scongelamento, utilizzando sempre nel metodo qui descritto soluzioni dì scongelamento contenenti saccarosio nella concentrazione di 0,3M. Inoltre nel metodo qui descritto si espone per un tempo di 15 minuti l’ovocita ad una soluzione cosiddetta di caricamento (1,5M PROH+0,3M saccarosio) e meglio descritta in proseguo, prima dell’inizio dell’abbassamento della temperatura al fine di dare all’ovocita un tempo adeguato per ottenere una ulteriore disidratazione, che riduce ancora più l’eventualità di formazioni dì ghiaccio intracellulare durante le procedure di crioconservazione. Nelle metodiche ad oggi utilizzate il periodo di esposizione del’ovocita alla soluzione di congelamento è di un tempo inferiore di circa il 60% ai 15 minuti del metodo qui descritto.
Quindi l’utilizzo nella procedura di crioconservazione di concentrazioni di saccarosio pari a 0,3M permette di aumentare la sopravvivenza di ovociti, diminuendo il rischio di formazione del ghiaccio intracellulare. Tale risultato è ulteriormente rafforzato dal tempo di esposizione (15 minuti) dell’ovocita alla soluzione cosiddetta di caricamento.
Si espone in detaglio il procedimento di crioconservazione con l’innovazione rivendicata.
Per le soluzioni di congelamento si utilizza:
una soluzione PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline w/o sodium bicarbonate);
una soluzione di equilibrazione (1,5M PROH);
una soluzione di caricamento (1.5M PROH+0,3M saccarosio);
una soluzione SSS (Synthetic Serum Substitute).
La composizione delle specifiche soluzioni è:
SOLUZIONE PBS PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline w/o sodium bicarbonate) , SOLUZIONE DI EQUILIBRAZIONE 1.5M PROH
6,79 ml PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline w/o sodium bicarbonate) 1,21 mi PROH (1,2 propanediol C H O )
SOLUZIONE DI CARICAMENTO 1.5M PROH+0,3M saccarosio
6,79 mi PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline w/o sodium bicarbonate) 1,21 mi PROH (1,2 propanediol C3 H8 O2 )
1, 128 gr saccarosio (C12 H22 O2 )
SOLUZIONE SSS (Synthetic Serum Substitute)
Queste soluzioni vengono utilizzate in un programma di raffreddamento lento. Le soluzioni una volta preparate vengono agitate, filtrate e conservate a 4°C. E’ consigliabile mantenerle per 15 minuti a temperatura ambiente prima di utilizzarle.
Ottenute le soluzioni sopraindicate:
si prepara una piastra petri contenente 2.1 mi di soluzione PBS 0,9 ml SSS (Synthetic Serum Substitute)
In questa soluzione tutti gli ovociti vengono “lavati” dal loro medium di coltura prima di essere trasferiti nella soluzione di equilibrazione.
Si prepara un’idonea piastra a 4 pozzetti.
1. i pozzetti E12 Ez . Sn, contengono 0.350 ml di soluzione di equilibrazione (1.5M PROH) 0,150 ml di SSS (Synthetic Serum Substitute).
In questa soluzione vengono trasferiti 1 o 2 ovociti per pozzetto dopo essere stati “lavati” nella soluzione PBS e vi sosteranno per 10 minuti prima di essere trasferiti nella soluzione di caricamento.
2. i pozzetti C1 C2. Ln, contengono 0.350 ml di soluzione di caricamento (1.5M PROH+0.3M saccarosio) 0,150 ml di SSS (Synthetic Serum Substitute).
In questa soluzione vengono trasferiti gli ovociti (prelevati dalla soluzione di equilibrazione) che vengono rapidamente caricati nella paillette. Successivamente le paillette verranno trasferite nel congelatore computerizzato programmabile ed ivi mantenute per 15 minuti alla temperatura di 20°C prima dell’inizio del programma di raffreddamento.
Per le soluzioni di scongelamento si utilizza:
1) una soluzione madre 1.0M PROH la cui composizione è:
14,35 mi PBS (Dulbecco’ s Phosphate Buffered Saline w/o sodium bicarbonate)
1,65 ml PROH (1,2 propanediol C3H8O2 )
La soluzione madre viene utilizzata per la preparazione delle seguenti due successive soluzioni:
1.1) SOLUZIONE 1.0M PROH 0.3M saccarosio la cui composizione è 8 ml di soluzione madre (1.0M PROH) 1,128 gr. saccarosio (C12H22O11);
1.2) SOLUZIONE 0.5M PROH 0.3M saccarosio, la cui composizione è:
4 ml di soluzione madre (1.0M PROH)
4 ml PBS (Dulbecco’ s Phosphate Buffered Saline w/o sodium bicarbonate)
1,128 gr. saccarosio (C12H22O11).
2) una soluzione 0.3M saccarosio
8 ml PBS (Dulbecco’ s Phosphate Buffered Saline w/o sodium bicarbonate) 1,128 gr. saccarosio (C12H22O11).
3) una soluzione PBS
8 mi PBS (Dulbecco’ s Phosphate Buffered Saline w/o sodium bicarbonate) 4) una soluzione SSS (Synthetic Serum Substitute).
Queste soluzioni sono utilizzate in un programma di scongelamento rapido. Le soluzioni una volta preparate vengono agitate, filtrate e conservate a 4°C. E’ consigliabile mantenerle per 15minuti almeno a temperatura ambiente prima di utilizzarle.
Ottenute le soluzioni sopraindicate si prepare una idonea piastra a 4 pozzetti (A,B,C,D)
Il pozzetto A contiene 0,350 ml di soluzione 1.1 (SOLUZIONE 1.0M PROH 0.3M saccarosio) 0,150 ml di soluzione 4 SSS (Synthetic Serum Substitute).
In questa soluzione viene “scaricato” il contenuto della paillette preventivamente mantenuta in aria per 30 sec. e poi immersa a bagnomaria (30°C) per 40 sec. Gli ovociti vengono mantenuti in questa soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente.
Il pozzetto B contiene 0,350 ml di soluzione 1.2 (SOLUZIONE 0.5M PROH 0.3M saccarosio) 0,150 mi SSS (Synthetic Serum Substitute).
Gli ovociti prelevati dalla soluzione di cui al pozzetto A vengono trasferiti in questa soluzione dove vengono mantenuti per ulteriori 5 minuti a temperatura ambiente.
Il pozzetto C contiene 0,350 ml di soluzione 2 (SOLUZIONE 0.3M saccarosio) 0.150 mi di soluzione SSS (Synthetic Serum Substitute). Gli ovociti prelevati dalla soluzione di cui al pozzetto B vengono trasferiti in questa soluzione dove vengono mantenuti per ulteriori 10 minuti a temperatura ambiente.
Il pozzetto D contiene 0,350 ml di soluzione 3 (SOLUZIONE PBS) 0,150 ml di soluzione SSS (Synthetic Serum Substitute).
Gli ovociti prelevati dalla soluzione di cui al pozzetto C vengono trasferiti in questa soluzione dove vengono mantenuti per 10 minuti a temperatura ambiente e poi per ulteriori 10 minuti a 37°C,
Gli ovociti possono quindi essere trasferiti in un medium di coltura convenzionale ed essere utilizzati per la inseminazione.
Claims (3)
- RIVENDICAZIONI 1) Si rivendica l'utilizzo di concentrazioni di saccarosio pari a 0,3M per soluzioni dì congelamento (in soluzione di caricamento 1,5M PROH 0,3M saccarosio) e scongelamento (in soluzione 1,0M PROH 0,3M saccarosio; in soluzione 0,5M PROH 0.3M saccarosio; in soluzione 0,3M saccarosio), in procedura di crioconservazione di ovociti, come descritta, al fine di ottenere una ottimale disidratazione degli ovociti per una loro migliore sopravvivenza.
- 2) Si rivendica l’utilizzo di concentrazioni di saccarosio superiori a 0, 3M (0,4M; 0,5M, ecc.) per soluzioni dì congelamento e scongelamento in procedura di crioconservazione di ovociti, come descritta, al fine di ottenere una ottimale disidratazione degli ovociti per una loro migliore sopravvivenza.
- 3) Si rivendica l'esposizione del'ovocita per il tempo di 15 minuti (o per un tempo superiore) alla soluzione di caricamento come descritta al fine di ottimizzare la disidratazione dell'ovocita, sempre per una migliore sopravvivenza nella procedura di crioconservazione descritta.
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