ITPI20060103A1 - Ibridi farmacodinamici con attivita' ipoglicemizzante e no-donor ottenuti dalla coniugazione di derivati idrossilati della glibenclamide con acidi carbossilici nitroossi-sostituiti. - Google Patents

Ibridi farmacodinamici con attivita' ipoglicemizzante e no-donor ottenuti dalla coniugazione di derivati idrossilati della glibenclamide con acidi carbossilici nitroossi-sostituiti. Download PDF

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ITPI20060103A1
ITPI20060103A1 IT000103A ITPI20060103A ITPI20060103A1 IT PI20060103 A1 ITPI20060103 A1 IT PI20060103A1 IT 000103 A IT000103 A IT 000103A IT PI20060103 A ITPI20060103 A IT PI20060103A IT PI20060103 A1 ITPI20060103 A1 IT PI20060103A1
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IT
Italy
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compound
hydroxylated
glibenclamide
substituent
Prior art date
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IT000103A
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Inventor
Aldo Balsamo
Vincenzo Calderone
Piero Marchetti
Simona Rapposelli
Scilla Torri
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Univ Pisa
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/50—Compounds containing any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C07C311/52—Y being a hetero atom
    • C07C311/54—Y being a hetero atom either X or Y, but not both, being nitrogen atoms, e.g. N-sulfonylurea
    • C07C311/57—Y being a hetero atom either X or Y, but not both, being nitrogen atoms, e.g. N-sulfonylurea having sulfur atoms of the sulfonylurea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/59—Y being a hetero atom either X or Y, but not both, being nitrogen atoms, e.g. N-sulfonylurea having sulfur atoms of the sulfonylurea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having nitrogen atoms of the sulfonylurea groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

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Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo "IBRIDI FARMACODINAMICI CON ATTIVITÀ IPOGLICEMIZZANTE E NO-DONOR OTTENUTI DALLA CONIUGAZIONE DI DERIVATI IDROSSILATI DELLA GLIBENCLAMIDE CON ACIDI CARBOSSILICI NITROOSSI-SOSTITU ITI"
DESCRIZIONE
Ambito dell'invenzione
La presente invenzione riguarda una nuova classe di composti in grado di esercitare un'azione ipoglicemizzante e contemporaneamente assicurare un rilascio in vivo dì ossido di azoto (NO) .
Inoltre, l'invenzione si riferisce ad una composizione farmaceutica da impiegare nel trattamento di soggetti affetti da deficit di NO endogeno come conseguenza del diabete mellito di tipo 2.
Descrizione della tecnica nota
Come noto, il diabete mellito di tipo 2 è una patologìa caratterizzata dall'incapacità del corpo di rispondere in modo adeguato all'azione dell'insulina prodotta dal pancreas.
Esistono in particolare due fattori che possono determinare l'insorgere di tale patologìa. Da una parte l'insuline-resistenza, dall'altra il deficit di secrezione di insulina.
Lo stato iperglicemico associato alla patologia diabetica costituisce il fattore causale alla base di alterazioni a carico del sistema circolatorio. Tra i vari meccanismi responsabili della correlazione tra iperglicemia e disturbi cardiovascolari, un ruolo sicuramente ben definito spetta allo squilibrio dei sistemi ossidativi, al coinvolgimento dì processi infiammatori vascolari, all'attivazione di segnali intracellulari .
Tutti questi processi, comunque, concorrono a determinare un quadro di disfunzione endoteliale che, attraverso una ridotta biosintesi di ossido di azoto (NO) da parte deli'lndotelio, rappresenta la principale causa delle svariate manifestazioni patologiche cardiovascolari legate al diabete mellito.
Inoltre, spesso il trattamento del diabete mellito di tipo 2 in regime di monoterapia, ossìa di somministrazione di un unico farmaco, non risulta soddisfacente e necessita del ricorso a somministrazioni di più farmaci, "cocktail" farmacologico, dotati di differenti meccanismi d'azione.
Tuttavia, il trattamento con il cocktail farmacologico può comportare degli svantaggi, quali una imprevedibile interazione farmacodinamica e/o farmacocinetica tra i diversi farmaci, una più difficile gestione della posologia da parte del paziente, costretto ad assumere più preparati farmaceutici e talvolta in tempi differenziati e, generalmente, una scarsa "ccmpìiance" da parte del paziente stesso.
Negli ultimi anni, lo studio di nuovi farmaci '‘ibridi", dotati di un duplice profilo farmacodinamico (una sola molecola dotata di due o più meccanismi azione), è emerso come promettente campo di ricerca. Tale approccio è stato finalizzato al conferimento di migliori proprietà farmacoterapeutiche e/o alla limitazione di effetti avversi.
Tra le strategìe utilizzate nello sviluppo di tali farmaci ibridi, un particolare successo ha riscosso la coniugazione di farmaci "nativi" noti con ulteriori porzioni molecolari capaci di rilasciare ossido d'azoto (NO). I molteplici effetti benefici dell'NO, tra cui, ad esempio, le azioni vasorilasciante, antiaggregante piastrinica è cardioprotettìva, possono infatti rappresentare effetti addizionali e comportare un interessante complemento ad una già esistente azione farmacologica tipica del farmaco nativo.
In letteratura sono descrìtti numerosi esempi di "ibridi farmacodinamici" in cui un farmaco "nativo" è stato dotato anche di un'azione NO-donor (M.c. Breschi et al, J Med Chea, 49, 2006, 2628-2639; P. Del Soldato, WO0230867, 2002).
Su questa strategìa, l'impiego di ibridi farmacodinamici in grado di esercitare un'azione congiunta NO-donor/ipoglicemizzante può essere utile nel trattamento del diabete mellito di tipo 2 e dei disturbi cardiovascolari a questo associati.
Sintesi dell'invenzione
È quindi scopo della presente invenzione fornire un composto in grado di associare ad un'attività ipoglicemizzante un rilascio graduale e modi; ato di ossido di azoto (NO).
È un altro scopo della presente invenzione fornire Una composizione farmaceutica di tipo duale in grado di contrastare l'aspetto patologico prettamente endocrino/metabolico del diabete mellito di tipo 2.
È anche scopo delia presente invenzione fornire una composizione farmaceutica in grado di assicurare il corretto svolgimento delle funzioni cardiovascolari compromesse a causa dì deficit di NO endogeno, imputabile alla disfunzione endotelìale di origine diabetica .
È anche scopo della presente invenzione fornire un composto che non presenti gli effetti collaterali tìpici dei farmaci di tecnica nota.
Questi ed altri scopi sono raggiunti dal composto, secondo l'invenzione, la cui caratteristica principale è di avere un'azione ipoglicemizzante e di rilasciare nel contempo ossido di azoto (NO) detto composto avendo la seguente formula generale CD :
dove almeno uno tra R, Ri, ed Rj è un sostituente comprendente un gruppo nitrossiestereo legato ad un raggruppamento acilico alifatico, aromatico o alifaticoaromatico.
In particolare, il raggruppamento acilico alifatico può essere lineare, o in alternativa ramificato (C2-G12).
Il raggruppamento acilico aromatico può essere il sostituente rappresentato dalla formula (Ili:
in cui:
- X è scelto tra: un atomo di azoto, un CH,
- Rs è scelto tra: un atomo di idrogeno, un gruppo alchilico quale un gruppo metilico, un gruppo etilico, un gruppo iso-propilico, un gruppo propilico, un gruppo butilico, un gruppo isobutilico.
Il raggruppamento acilico alifatico-aromatico può essere un gruppo sostituente rappresentato dalla formula CHI) :
in cui:
— A è scelto tra: un metilene, un gruppo alchilico lineare (C2-C4), un gruppo ramificato, ad esempio
— X è scelto tra: un atomo di azoto, un CH,
— R3è scelto tra: un atomo di idrogeno, un gruppo alchilico quale un gruppo metilico, un gruppo etilico, un gruppo isc-propilice, un gruppo propilico, un gruppo butilico, un gruppo isobutilico.
In particolare, i radicali tra R, Ri, ed R2 che non siano uno dei sostituenti sopra descritti, sono atomi di idrogeno.
Vantaggiosamente, il gruppo sostituente può avere configurazione cis-, o in alternativa configurazione trans-, rispetto al legame CH-NBCO-.
Ad esempio, il composto rappresentato dalla, formula generale (I) è il 5-cloro-N-[2-[4-((4'-trans-(nitrossi)metil )benzoilossi)cicloesilcarbamoilsulfamoil )fenil)etil)-2-metpssi-benzamide, di seguito indicato come DK315.
Secondo un altro aspetto dell'invenzione un procedimento di sintesi di un composto di formula generale il) prevede una reazione di condensazione tra un derivato idrcssilato di una sulfonilurea ed un acido carbossilico.
Ad esempio, la sintesi del suddetto derivato idrossi-sulfonilureico può essere condotta secondo procedimenti noti, riportati in letteratura, si veda ad esempio R.A. Hill et al Bioorg Med Chem, 11 , 2003 , 2099-2113.
Vantaggiosamente, la reazione di condensazione tra il derivato idrossilato della sulfonilurea e l'acido carbossilico viene condotta in presenza di dicicloesilurea (DCC) e di quantità catalitiche di 4-dimetilamminopiridina (DMAP).
Nell'esempio riportato, il derivato idrossilato è un composto idrossilato sull'anello cicloesilico della glibenclamide .
Preferibilmente, il derivato idrossilato della glibenclamide è un metabolita attivo di questa, ad esempio :
4-trans-idrossiglibenclamide (M-1),
3-CIS-idrossiglibenclamìde (M-2),
Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione una composizione farmaceutica per il trattamento del diabete mellito di tipo 2 comprende una determinata quantità di almeno un composto avente formula generale (I) c
sopra illustrata e descritta.
In particolare, i gruppi funzionali presenti sul farmaco "nativo" sono in grado dì assicurare la coniugazione con opportuni linker provvisti di gruppi NO-donor attraverso la formazione di legami facilmente idrolizzabili in vìvo, quale il legame estereo. Di conseguenza, la composizione farmaceutica che si ottiene è in grado di contrastare l'aspetto patologico prettamente endocrino/metabolico del diabete mellito di tipo 2, grazie al profilo farmacodinamico del farmaco "nativo", secretagogo dell'insulina, e allo stesso tempo rappresenta una fonte esogena di NO, in grado di assicurare il corretto svolgimento di quelle funzioni cardiovascolari notoriamente compromesse a causa del deficit di NO endogeno, imputabile alla disfunzione endoteliaie di origine diabetica.
In particolare, oltre ad almeno uno dei composti sopra descritti, la composizione farmaceutica può comprendere anche eccipienti farmacologicamente accettabili.
Si riporta di seguito a titolo di esempio un possibile procedimento di sintesi di un composto, secondo la presente invenzione, in particolare il DK315.
ESEMPIO I
Sintesi di 5-cloro-N-{2-[4-C(4'-trans-[(nitrossi)metil)benzoilossi)cicloesilcarbamoilsulfamoil) ) fenil)etil)-2-metossi -benzamide (DK315).
Ad una soluzione di 5-cloro-N~[2-(4-{(4'-transidrossi) cicloesilcarbamoilsulfamoil)fenil)etil)-2-metossi-benzamide (250 mg, 0.49 mmcl) e acido 4-[(nitrossi)metil)banzoico (97 mg, 0.49 mmol) in CH2C12 è stata addizionata dicicloesilurea (DCC) (122 mg; 0.59 mmol) e 4-dimetilamminopiridina (DMAP) in quantità catalitica. La sospensione è stata agitata vigorosamente a temperatura ambiente per circa 3h. Trascorso tale periodo, il precipitato formatosi durante la reazione viene filtrato ed il filtrato concentrato a pressione ridotta. 11 prodotto grezzo ottenuto viene quindi purificato mediante cromatografia su colonna utilizzando come eluente una miscela di CHC13/MeOH (9.5:0.5)per dare il composto desiderato come solido bianco.
Resa: 32%(110mg, 0.16 mmol]
Punto di fusione: 85-87<°>C
<1>H-NMR (CPC13)8: 1.09-2.04 (m, 8H); 3.02 (t, 2H, J = 6.7Hz); 3.66-3.76 (m, 3H); 3.81 (s, 3H); 4.88-4.96 (m, 1H); 5.46 (s, 2H); 6.44 (d, 1H, 6 .7 Hz); 6.88 (d, 1H,
Analisi Elementare :
Si riportano dì seguito i risultati sperimentali di alcuni test condotti sul composto DK315 finalizzati ad indagare gli effetti secretagoghi dell'insulina e il rilascio di ossido di azoto (NO), potenzialmente utile per il trattamento delle diverse conseguenze dei diabete mellito di tipo 2.
Risultati sperimentali
È stato condotto uno studio funzionale sull'effetto di M-l e DK315 in isole pancreatiche umane isolate mediante digestione della ghiandola con collagenasi e successiva purificazione su gradiente di densità.
Per la digestione il pancreas viene preparato eliminando i tessuti in eccesso (tessuto adiposo, tessuto vascolare ecc.) e utilizzando una parte appropriata della ghiandola (generalmente corpo e coda). Per la digestione è stato impiegato l'enzima collagenasi (Roche, collagenase P). Il dotto pancreatico viene incannulato e la soluzione per la digestione (collagenasi, 1,5 mg/ml) solubilizzata in 200 mi di Hanks' Balanced Salts (HBSS) con il 2% di albumina umana (Human-Albumin® Biagini 20%) è lentamente iniettata per distendere il tessuto. Dopo distensione, la ghiandola è introdotta in un beker di vetro e posta all'interno di un bagnetto ad acqua termostatato alla temperatura di 36,5°C. L'azione della collagenasi viene controllata una prima volta dopo 8 minuti e successivamente ogni 3 minuti osservando un'alìquota del preparato al microscopio a luce invertita. Dopo circa 15 minuti .1 beker viene rimosso dal bagnetto e il pancreas viene continuamente agitato con l'ausìlio di pinze chirurgiche sterili fino a quando la digestione non raggiunge un livello valutato idoneo; a questo punto il tessuto viene filtrato su setacci di acciaio posti in sequenza, le cui maglie misurano rispettivamente 400 e 90 um. La soluzione passa attraverso ì filtri ed i frammenti maggiori rimasti intrappolati sul filtro da 4Q0 pm vengono recuperati all'interno del beker per continuarne la digestione. Il tessuto trattenuto sul filtro da 90 μτη viene recuperato con HBSS al 2% dì albumina umana in un beker. La stessa procedura di filtrazione, lavaggio e raccolta in soluzione di HBSS, viene ripetuta ogni 5 minuti per circa 45 minuti o comunque fino a completa digestione dell'organo.
La procedura di purificazione condotta successivamente ha come scopo principale quello di separare il tessuto esocrino da quello endocrino. 11 volume di HBSS raccolto è aliquotato in provette di polipropilene coniche da 50 mi e centrifugato a 250 g per 2 minuti a 4 °C. Il surnatante viene scartato ed il pellet (approssimativamente di 1-2 mi) risospeso con 15 mi di una soluzione costituita dall'80% di Lymaphoprep (Nycomed) e dal 20% di HBSS. Sulla superficie della soluzione sono quindi stratificati 10 mi di Hanks's per creare un opportuno gradiente di densità. Dopo centrifugazione per 5 minuti a 909 giri al minuto a 4°C, le isole si concentrano all'interfaccia tra Io strato di Lymphoprep e quello di HBSS dove vengono recuperate e nuovamente centrifugate per 2 minuti a 909 giri al minuto a 4°C. Al termine della procedura, aliquote contenenti circa 2500 isole sono sospese in 40 mi di mezzo di coltura (M199 addizionato con 10% di siero bovino ed antibiotici), caricate in fiasche di plastica per colture cellulari in sospensione (75 cm<2>, IwaJci) e messe in coltura a 27°C in un incubatone a CO2 (5% C02) .Il mezzo di coltura viene cambiato una prima volta la mattina successiva all'isolamento al fine di rallentare, per diluizione, l'azione della coilagenasi, poi settimanalmente per rinnovare i componenti essenziali di coltura { Bugliani M, et ai., Transplant Proc . 2004, 36(3) : 605-6) ,
Studio funzionale
Per la determinazione in vitro della funzionalità βcellulare, le isole isolate sono state sottoposte ad incubazione statica in soluzioni dì Krebs-Ringerbicarbonato-Hepes (KRBH), addizionate con albumina 0.5% e glucosio alle concentrazioni di 3.3 mM e 16.7 mM a pH 7.4. Gruppi di ìsole di dimensioni simili sono state trasferite in provette di polipropilene da 5 mi (ogni punto sperimentale è stato eseguito in tripletta) e preincubate per 45 minuti con soluzione di KRBH contenente glucosio 3.3 mM. Dopo un veloce lavaggio le isole sono incubate per 45 minuti ancora con KEBH glucosio 3.3 mM. Da ogni provetta è stata raccolta un'aliquota di surnatante per la determinazione delia quantità di insulina rilasciata in condizioni basali. Successivamente le stesse isole sono incubate per 45 minuti con glucosio 16.7 mM oppure glibenclamide (Gb) 10 μΜ, Gb 100 μΜ, metabolita 4-trans-idrossì-glibenclamide (M-l) 10 m, M-l 100 μΜ, DK31510 μΜ, DK315 100 μΜ. Da ogni provetta si raccoglie un'aliquota di surnatante per la determinazione della quantità di insulina rilasciata in seguito a stimolo. Come descritto di seguito, la determinazione dell'insulinemia viene eseguita con metodica IRMA {Lupi R et al, Diabetes, 2002, 51 (5) , 1437-42; Marchetti P. et al . , Diabetes, 2002, 51 (5) , 1419-24) .
Dosaggio dell'insulina con metodo IRMA (immuno radiometric assay)
Come noto, il metodo IRMA è un dosaggio immunoradiometrico basato sull'utilizzo di anticorpi, marcati radioattivamente, contro l'antigene che deve essere determinato. Il saggio prevede l'impiego di provette in polipropilene con il fondo rivestito di anticorpi monoclonali anti-insulina. Dopo l'aggiunta del campione da misurare, il sistema viene completato con l'utilizzo di un anticorpo monoclonale tracciante marcato con 1125. Dopo lavaggio, la rimanente radioattività legata alla provetta riflette la concentrazione dell'antigene (Lupi R et al, Biabetes, 2002, 51(5),1437-42).
Metodica
La procedura richiede 2 giorni e le seguenti operazioni vengono eseguite in sequenza:
1° Giorno
I campioni vengono messi a 4°C il giorno prima dell'esperimento .
2° Giorno
Gli standard forniti dal kit vengono ricostituiti con l'aggiunta degli opportuni volumi di acqua milliQ e passati al vortex. Nelle provette, precedentemente numerate, vengono dispensati 50 μl di standard o di campione in doppio. Successivamente a ciascuna provetta vengono aggiunti 50 μl di anticorpo tracciante (radioattivo) e dopo agitazione i campioni vengono posti ad incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Al termine del periodo d'incubazione si aggiunge 1 mi dì tampone di lavaggio ricostituito con acqua milliQ. Il liquido viene aspirato con una pompa a vuoto e l'operazione di lavaggio viene ripetuta per altre due volte con 2 mi del tampone di lavaggio.
I campioni e gli standards vengono posti in sequenza numerica crescente in raccoglitori del contatore gamma e ciascuno analizzato per 60 secondi.
Studio funzionale sull'effetto di M-1 e DK315 in un modello di muscolatura liscia vascolare
Al fine di evidenziare una attività vasorilascìante legata al rilascio di NO, i composti sono stati testati su anelli di aorta, prelevata da ratti albini maschi del ceppo Wistar1250-350 g), nel rispetto della normativa europea sulla sperimentazione animale (European Community Councii Directive 86-609).
Gli animali sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale, sotto leggera anestesia con etere etilico. Il tratto toracico dell'aorta é stato asportato e accuratamente ripulito del tessuto connettivo ed adiposo e l'endotelio è stato rimosso meccanicamente, mediante strofinamento del lume dell'arteria con un ago da siringa. Anelli di aorta di 5 mm sono stati alloggiati, con un precarico di 2 g, in bagni per organi isolate da 20 mi e immersi in soluzione di Tyrode (composizione mM: NaCi 136.8; KC1 2-95; CaC12 1.80; MgS04 7H2G 1.05; NaH2PO4 0.41; NaHC03 11.9; Glucosio 5.5), termostatata a 37°C e continuamente gorgogliata con una miscela gassosa di 02 (95%} e C02 (5%).
La tensione sviluppata dalla muscolatura liscia vascolare è stata registrata attraverso un trasduttore isometrico (Grass FTO3), connesso ad un sistema computerizzato per la rilevazione e l'analisi dei dati (Bio-pac). Dopo un periodo di equilibrio di 60 min, l'avvenuta rimozione dell'endotelio è stata verificata tramite la somministrazione di acetilcolina 10 microM a preparati precontratti con KC1 30 mM. Uh effètto vasorilasciante del acetilcolina inferiore al 10% rispetto alla contrazione indotta dal KC1 è stato considerato indice dì un'accettabile rimozione dell'endotelio, Gli organi in cui è stata osservata un'azione vasorilasciante superiore a questo limite sono stati scartati,
A) Curve concentrazione-risposta vasorilasciante 40 min dopo il controllo della rimozione endoteliale, i preparati sono stati contratti con KCl (30mM) e, al plateau, sono state somministrate concentrazioni cumulative crescenti di M-1 o di DK315 (1nM-100μΜ). Esperimenti preliminari hanno consentito di valutare sia l'inefficacia del veicolo (dimetilsolfossido, DMSO) sia che la contrazione indotta da KCl (30 mM) è stabile per almeno 60 min.
Lo stesso protocollo sperimentale è stato seguito con preparati in cui, subito dopo il controllo della rimozione dell'endotelio, è stato incubato ODQ 1 microM (inibitore dell'enzima guanilato ciclasi),
B) Valutazione "time-course" della risposta vasorilasciante
40 min dopo il controllo della rimozione endoteìiale, i preparati sono stati contratti con KC1 (30mM) e, al plateau, è stata somministrata una singola, concentrazione fi microM} di M-1, di DK315 o del farmaco di riferimento sodio nitroprussiato (noto detatore di NO). L'effetto vasorilasciente è stato osservato per 50 min.
Analisi dei dati
Il profilo dell'azione vasorilasciante è stato espresso in termini di efficacia (Emax) e di potenza (pIC5O).
Il valore di Emax rappresenta la massima risposta vasorilasciante registrata nelle curve concentrazionerisposta, espresso come % rispetto al tono contrattile indotto dal KCl (30 mM). Il parametro di pIC50 rappresenta il cologaritmo della concentrazione molare del composto in esame in grado di indurre una risposta vasorilasciante pari al 50% del tono contrattile causato dal KCl (30 mH) ed è stato ricavato dalle curve concentrazione-risposta, mediante procedura di calcolo computerizzato (software: GraphPad Prism 3.0). I parametri di efficacia e potenza sono espressi come media errore standard, ricavati da 6 diversi esperimenti.
Effetto secretagogo dell'insulina
Sono stati preliminarmente condotti esperimenti con isole pancreatiche di cinque donatori, le cui caratteristiche sono riportate nella tabella 1.
Nelle figure 1 e 3 riportate nelle tavole allegate sono illustrati i risultati ottenuti per tre diverse prove. I risultati dì secrezione sono espressi come indice di stimolazione (IS). Questo è dato dal rapporto tra la quantità di insulina rilasciata in seguito a stimolo e la quantità di insulina rilasciata in condizioni basali.
Sono stati, quindi, calcolati 1 valori medi per le tre diverse prove. Questi sono riportati nelle tabelle 2 e 3 e sono graficamente illustrati nelle figure 2 e 4.
Con riferimento alla figura 1, il primo gruppo di istogrammi indica gli indici di stimolazione del glucosio (IS G) ; il secondo gruppo gli indici dì stimolazióne in risposta alla glibenclamide a basse concentrazioni (IS Glib 10 μΜ); il terzo gruppo indica gli indici di stimolazione in risposta al metabolita M-1 a basse concentrazioni (IS M-l 10 μΜ) ; il quarto gruppo di istogrammi indica gli indici di stimolazione in risposta alla glibenclamide ad alte concentrazioni (IS Glib 100 pM) ed infine il quinto gruppo di istogrammi indica gli ìndici di stimolazione in risposta al metabolita M-1 ad alte concentrazioni (IS M-1 100 μΜ).Nella figura 2 sono riportate le medie dì tali esperimenti.
Con riferimento alla figura 3, il primo gruppo di istogrammi ìndica gli indici dì stimolazione del glucosio (IS G); il secondo gruppo di istogrammi indica gli ìndici di stimolazione in risposta alla glibenclamide a basse concentrazioni (IS Glib 10 μΜ); il terzo gruppo dì istogrammi indica gli indici di stimolazione in risposta all'ibrido DK315 a basse concentrazioni (IS DK315 10 μM}; il quarto gruppo di istogrammi indica gli indici di stimolazione in risposta alla glibenclamide ad alte concentrazioni (IS Glib 100 μΜ). Il quinto gruppo di istogrammi ìndica gli indici di stimolazione in risposta all'ibrido DK315 ad alte concentrazioni (IS DK315 100 μΜ). Nella figura 4 sono riportate le medie di tali esperimenti.
I dati di questo studio indicano che, analogamente alla glibenclamide, il suo metabolita 4-trans-idressiglibenclamide CH—1) e l'ibrido DK315 hanno simile effetto secretagogo dell'insulina. In particolare, l'ibrido DK315 induce il rilascio di insulina con un'efficacia che appare particolarmente evidente alle concentrazione più alta [100 μΜ].
Indagine dell'effetto vasorilascianteNO-mediato
In figura 5 sono riportate le curve concentrazionerisposta vasorilasciante per DK315, in assenza [controllò, quadrati neri) o in presenza di ODO 1 μΜ (+ODQ, quadrati bianchi), un inibitore selettivo della guanilato ciclasì solubile (sGC).
In ascissa, le concentrazioni molari della composizione farmaceutica sono riportate come logaritmi in base 10. In ordinata, l'effetto vasorilasciante è espresso come % rispetto alla pre-contrazione indotta da KCl 30 mM.
In particolare, il composto DK315 induce una risposta vasorilasciante dose-dipendente mostrando una efficacia totale (Emax = 100 in tutti gli esperimenti svolti) e una potenza sub-micromolare (pIC50 = 7.24 0.012).
La presenza (1 μΜ) di ODQ ha pressoché totalmente abolito la risposta vasorilasciante di DK315. Poiché l'azione vasorilasciante di NO è legata alla sua capacità dì attivare l'enzima guanilato ciclasi, fatto che ODQ abbia abolito l'effetto vasorilasciante di DK31S ìndica che tale composto induce l'effetto vasodilatatore attraverso la liberazione di NO.
DK315 è pertanto una molecola dotata di proprietà farmacodinamiche di NQ-donor. Alle concentrazioni saggiate, il composto M-1 non ha mostrato significativi effetti vasodilatatori.
Valutazione_ "time-course"_ della risposta vasorilasciante
In figura 6 è riportato l'andamento della risposta vasorilasciante in funzione del tempo per DK315 (quadrati) e per un farmaco di riferimento, il sodio nitroprussiato (SNP), (triangoli). In ascissa, sono indicati i minuti di osservazione. In ordinata, l'effetto vasorilasciante è espresso come % rispetto alla pre-eontrazione indotta da KC1 30 mM. Entrambi 1 farmaci sono stati somministrati alla concentrazione 1 μΜ, al tempo 0.
Alla concentrazione di 1 μΜ,il composto DK315 ha provocato una risposta vasorilasciante pressoché completa che raggiunge il livello massimo in circa 30 min. La risposta massimale indotta da tale concentrazione è risultata analoga a quella prodotta dal farmaco di riferimento sodio nitroprussiato (SNP), tuttavia il confronto tra il profilo dell'andamento dell'effetto in funzione del tempo mostrato da DK315 e quello mostrato dal SNP consente di rilevare che la vasodilatazione indotta da DK315 può essere correlata ad un rilascio relativamente lento di NO. DK315 può essere considerato dunque un "NO-donor lento".
Alla concentrazione 1 μΜ, il composto M-1 non ha indotto un effetto vasorilasciante significativo.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composto caratterizzato dal fatto di avere un'azione ipoglicemizzante e di rilasciare nei contempo ossido di azoto (NO), detto composto avendo la seguente formula generale (I) : 0 CH w// O 0 o o N N H H N H dove almeno uno tra E, R1, ed R2è un sostituente comprendente un gruppo nitrossiestereo legato ad un raggruppamento acilico alìfatico, aromatico o alifatico-aromatico .
  2. 2, Composto, secondo la rivendicazione 1, in cui detto sostituente è rappresentato dalla formula (I I) : Ό R3 O y x H ONO2 in cui : — X è scelto tra: un atomo di azoto, un CH, — R3è scelto tra: un atomo di idrogeno, un gruppo alchilico quale un gruppo metilico, un gruppo etilico, un gruppo iso-propilico, un gruppo propilico, un gruppo butilico, un gruppo isobutilico.
  3. 3. Composto, secondo la rivendicazione 1, in cui detto sostituente è rappresentato dalla formula CU I):
    in cui: — A è scelto tra: un metilene, un gruppo aichilico lineare CC2-C4), un gruppo ramificato, ad esempio -CH(CH3),-CH(CH2-CH3), -CH(iso-propile). — X è scelto tra: un atomo di azoto, un CH, <—>R3 è scelto tra: un atomo di idrogeno, un gruppo aichilico quale un gruppo metilico, un gruppo etilico, un gruppo iso-propilico, un gruppo propilico, un gruppo butìlico, un gruppo isobutilico.
  4. 4. Composto, secondo la rivendicazione 1, 2 o 3, in cui detto gruppo sostituente di natura alifatica o di formula (II) o (III) presenta configurazione cisrispetto al legame CK-NBCO-.
  5. 5. Composto, secondo la rivendicazione 1, 2 o 3, in cui detto gruppo sostituente di natura alifatica o di formula (II) o CU I) presenta configurazione trans- rispetto al legame CH-NHCO-.
  6. 6 . Procedimento di sintesi di un composto come da rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto dì prevedere una reazione di condensazione tra un derivato idrossilato di una sulfonilurea ed un acido carbossilico.
  7. 7. Procedimento, secondo la rivendicazione 6, in cui detta reazione di condensazione tra detto derivato idrossilato della sulfonilurea e detto acido carbossilico viene condotta in presenza di dicicloesi lurea (DCC) e di quantità catalitiche di 4-dìmetilamminopiridina (DMAPl.
  8. 8. Procedimento, secondo la rivendicazione 6, in cui detto derivato idrossilato della sulfonilurea è un composto idrossilato sull'anello cicloesilico della glibenclamide .
  9. 9. Procedimento, secondo la rivendicazione 8, in cui detto composto idrossilato sull'anello cicloesilico della glibenclamide è un metafoolita attivo di questa scelto tra : — 4-trans-idrossiglibenclamide (M—1), — 3-cis-idrossiglibenclamide (M-2),
  10. 10 .Composizione farmaceutica per il trattamento del diabete mellito di tipo 2 caratterizzato dal fatto di comprendere una determinata quantità di almeno un composto avente formula generale (I) secondo la rivendicazione 1.
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