ITPI20090153A1 - Un mezzo di contrasto diagnostico ecografico antigene-specifico, un procedimento per la sua preparazione e suoi impieghi nella diagnostica per immagini. - Google Patents

Description

UN MEZZO DI CONTRASTO DIAGNOSTICO ECOGRAFICO ANTIGENE-SPECIFICO, UN PROCEDIMENTO PER LA SUA PREPARAZIONE E SUOI

IMPIEGHI NELLA DIAGNOSTICA PER IMMAGINI

Campo Tecnico dell'Invenzione

La presente invenzione riguarda un mezzo di contrasto

diagnostico ecografico antigene-specifico, un procedimento

per la sua preparazione ed i suoi usi nella diagnostica

ecografica per immagini (comunemente indicata come imaging

diagnostico ecografico).

In particolare, detto mezzo di contrasto si à ̈

rivelato utile per l'individuazione e la caratterizzazione

selettive di tessuti/masse tumorali, differenziandole dai

tessuti (sani) circostanti, tramite il conferimento al

solo tessuto malato di un elevato incremento

contrastografico prolungato nel tempo.

Inoltre, detto mezzo di contrasto si à ̈ anche rivelato

utile come veicolante selettivo sito-specifico di farmaci e/o altri principi attivi al tessuto malato. Descrizione dell'Arte Nota

I mezzi di contrasto (in sigla, mdc) ecografici sono sostanze in grado di incrementare il contrasto delle immagini ecografiche.

Attualmente, tra i più utilizzati vi sono quelli di cosiddetta seconda generazione, che, sostanzialmente, sono costituiti da microbolle di gas, preferibilmente inerti (quali, ad esempio, esafluoruro di zolfo, perfluoroesano, perfluorocarburi, aria, azoto), contenute in un opportuno rivestimento; preferibilmente, detto rivestimento à ̈ sotto forma di capsule/microbolle/microsfere/microvescicole/ microballoons formati da sostanze quali, ad esempio, fosfolipidi o albumina.

L’elemento che incrementa il segnale ultrasonoro à ̈ il gas, che possiede un coefficiente di ecogenicità di molto superiore rispetto a quello dei solidi e dei liquidi. I mezzi di contrasto più utilizzati sono costituiti, ad esempio, da microbolle contenenti gas caratterizzate da una specifica frequenza di risonanza f0 (misurata in genere in MHz), ossia una frequenza di oscillazione alla quale la particella entra in fasi cicliche di compressione e rarefazione. I mezzi di contrasto cosiddetti di seconda generazione risultano particolarmente utili poiché posseggono una frequenza di risonanza compresa nel range di frequenze degli ultrasuoni normalmente utilizzati dai macchinari ecografici esistenti.

Una volta iniettati nel circolo ematico, tali mezzi entrano in risonanza se vengono colpiti da un fascio ultrasonoro. Pertanto, essi generano un fascio ultrasonoro riflesso che presenta caratteristiche fisiche determinate sia dalle proprietà della sostanza iniettata sia da quelle del fascio ultrasonoro insonante/incidente.

In particolare, con riferimento alle caratteristiche della microbolla, se la membrana della stessa à ̈ dotata di maggior spessore e rigidità, determina una risposta sonora riflessa meno intensa (cioà ̈, meno utile) rispetto ad una particella con membrana più sottile e maggiormente elastica. D'altra parte, una membrana troppo sottile presenta lo svantaggio di essere fragile e, quindi, poco resistente all'azione della pressione esercitata dal fascio ultrasonoro incidente. In questo caso, le microbolle potrebbero essere distrutte in un tempo troppo breve per poter fornire un'immagine diagnosticamente utile. All’aumentare del numero di particelle/microbolle/microsfere/microvescicole/microballo ons che vengono a contatto con il fascio di ultrasuoni, si riscontra un aumento lineare del coefficiente di ecogenicità della singola particella/microbolla. Cioà ̈, detto coefficiente assume un valore complessivo risultante dalla moltiplicazione del coefficiente della singola microbolla per il numero totale di microbolle iniettate in circolo.

Per quanto riguarda il fascio ultrasonoro, le sue caratteristiche fondamentali sono la frequenza e la potenza acustica (misurata in genere in KPa). In particolar modo, la potenza acustica à ̈ determinante nel caratterizzare l’entità del fascio riflesso e il tipo di oscillazione della particella.

Infatti, se la microbolla del mezzo di contrasto viene colpita da un fascio ultrasonoro che abbia bassa pressione acustica (mediamente compresa da 10 a 20 KPa) e una frequenza pari alla frequenza di risonanza del mdc, essa va incontro solamente a variazioni di forma lineari. In questo caso, la fase di compressione risulta, mediamente, di pari entità a quella di rarefazione e il segnale ecografico riflesso à ̈ omnidirezionale (fenomeno cosiddetto dello scattering). Se, invece, il fascio incidente (sempre mantenendo una frequenza pari a quella di risonanza) assume valori di pressione acustica superiori (ad esempio, compresi da 40 KPa a 50 KPa), la fase di rarefazione risulta maggiore di quella di compressione. Questo effetto permette alle microbolle di generare un fascio ultrasonoro riflesso arricchito da una serie di frequenze armoniche multiple di quella di risonanza (2f0, 3f0, 4f0 ecc). Una potenza acustica ancora superiore, ad esempio, fino a circa 1 MPa determina, inoltre, la produzione di frequenza subarmoniche (f0/2, f0/3 ecc). Di norma, una potenza superiore a 1 MPa determina la rottura delle microbolle, effetto utilizzato in tecniche di imaging ecografico con mdc di prima generazione.

L’intensità del fascio ultrasonoro riflesso (misurata in Pa o in dB) risulta proporzionale all’intensità del fascio ultrasonoro incidente e al coefficiente di ecogenicità del mezzo, e inversamente proporzionale al raggio della microbolla costituente il mezzo di contrasto.

Le frequenze armoniche, come già accennato, sono costituite da multipli e sottomultipli della frequenza fondamentale del fascio insonante. Tale produzione di armoniche à ̈ sostanzialmente determinata dai cambiamenti elastici che si verificano nella forma delle microbolle. Come già evidenziato in precedenza, detti cambiamenti sono generati da fasi di compressione e di rarefazione delle microbolle stesse, provocate dalla qualità della pressione acustica esercitata dal fascio ultrasonoro.

In genere, la frequenza armonica preferita à ̈ la seconda armonica, in quanto facilmente visualizzabile sulle apparecchiature ecografiche. Ciò à ̈ determinato dal fatto che la seconda armonica risulta la frequenza più vicina a quella fondamentale, perciò più adeguatamente identificabile.

La sonda ecografica à ̈ in grado di rilevare/leggere questa frequenza se viene opportunamente tarata in fase di ricezione. Inoltre, a seconda delle procedure ecografiche utilizzate (grazie all’utilizzo di opportuni programmi software), à ̈ possibile analizzare il segnale riflesso proveniente dalle varie strutture con una vasta gamma di differenti stratagemmi tecnici. Ad esempio, si possono sottrarre le armoniche provenienti dal tessuto statico, caratterizzare il segnale proveniente esclusivamente dall’apparato vascolare, modulare la fase del segnale, la sua ampiezza o entrambe. L’obiettivo finale à ̈, comunque, quello di riconoscere selettivamente, con un incremento notevole del contrasto, solo le strutture anatomiche che sono impregnate di mezzo di contrasto.

Da un punto di vista tecnico, quando il mdc viene iniettato nel torrente ematico e la sonda ecografia à ̈ posta sulla specifica zona di tessuto corporeo che va analizzata, à ̈ possibile seguire il moto delle microbolle in tre fasi:

- fase arteriosa (da 10 a 35 secondi);

- fase parenchimale (da 40 a 120 secondi);

- fase venosa (da 120 secondi in su, fino alla scomparsa del mezzo di contrasto dal circolo dell’organo in esame).

Purtroppo le attuali microbolle, pur essendo mediamente abbastanza stabili da permettere di ottenere immagini ecografiche, non sono in grado di conferire selettivamente al solo tessuto di interesse diagnostico (ad esempio al tessuto malato/tumorale) un incremento del contrasto (o enhancement contrastografico) sufficientemente elevato e prolungato nel tempo, grazie all'ottenimento di un selettivo adeguato/sufficiente prolungamento del tempo in cui detto tessuto rimane impregnato da parte delle microbolle.

Sarebbe, quindi, molto utile poter avere a disposizione un mezzo di contrasto ecogenico sufficientemente stabile ed in grado di differenziare significativamente e selettivamente nel tempo un tessuto malato (ad esempio tumorale) da un tessuto vicinale sano. In altre parole, sarebbe molto utile poter avere a disposizione un mezzo di contrasto ecografico stabile e in grado di conferire selettivamente al tessuto malato un enhancement contrastografico elevato e prolungato, rispetto al tessuto sano circostante, almeno per tutto il tempo necessario ad effettuare con successo il desiderato esame diagnostico ecografico, grazie all'ottenimento di un prolungato tempo di stazionamento selettivo del mdc nel parenchima di detto tessuto malato.

A conoscenza dell'inventore, mdc ecografici aventi le caratteristiche suddette non sono a tutt'oggi noti.

Tentativi di dare una risposta alla necessità sopra descritta sono stati fatti.

Così, a titolo di esempio, sono state realizzate microbolle/microsfere/microvescicole/microballoons contenenti un gas inerte, in cui uno o più recettori, specifici per uno o più antigeni presenti nel tessuto malato/tumorale, costituiscono una parte minima, in ogni caso, minoritaria, della membrana che delimita il gas.

In questo tipo di mezzi di contrasto dell'arte nota detti recettori (quali, ad esempio, anticorpi, monoclonali e non, e/o loro frammenti, ad esempio Fab, Fragment Antigen Binding), vengono inglobati all’interno della membrana della microbolla, ad esempio, intercalati tra i componenti della/delle catene fosfolipidiche della stessa. In tal modo, si cerca di favorire/promuovere la formazione di un legame specifico e possibilmente “forte†tra il recettore e il corrispondente antigene, presente nel tessuto da sottoporre a imaging, quando il mezzo di contrasto lo perfonde.

Tuttavia, questa soluzione ha mostrato di non essere sufficiente, come tale, a dare una risposta adeguata alla necessità di riuscire a differenziare tramite imaging ecografico selettivo un tessuto malato (ad esempio tumorale) da un tessuto sano vicinale, conferendo selettivamente al primo un enhancement contrastografico sufficientemente elevato e prolungato nel tempo.

Infatti, la quantità di recettori antigene-specifici inseribili nella membrana della microbolla non può essere elevata (pena un sensibile calo della stabilità della membrana stessa, e, quindi, della microbolla), pertanto, non consente una permanenza prolungata e selettiva della microbolla nell’albero vascolare della struttura in esame. Ciò à ̈ sostanzialmente dovuto al fatto che, con una struttura di questo tipo, si formano legami recettoreantigene in numero troppo esiguo, quindi nel complesso troppo deboli, per riuscire a trattenere selettivamente la microbolla nel solo parenchima di detto tessuto per un tempo prolungato e, comunque, sufficiente per ottenere immagini ecografiche ben contrastate e diagnosticamente utili.

Problema Tecnico

Resta, quindi, tuttora ben viva e sentita nel settore medico la necessità di avere a disposizione un mezzo di contrasto ecografico stabile che sia in grado di legarsi selettivamente ed in misura adeguata, cioà ̈, sufficientemente forte, al solo tessuto da sottoporre ad imaging (generalmente, quello malato/tumorale), rispetto al tessuto circostante (generalmente, quello sano), così da conferire selettivamente allo stesso un enhancement contrastografico significativamente elevato e prolungato, almeno per tutto il tempo necessario e sufficiente per effettuare con successo il desiderato, selettivo, imaging diagnostico ecografico.

Sommario dell'Invenzione

Il Richiedente ha ora del tutto inaspettatamente trovato che, realizzando una microbolla di un gas, opportunamente rivestita almeno da una capsula/ membrana (o outer layer) costituita almeno da una opportuna quantità di almeno un opportuno recettore antigenespecifico per un determinato antigene, à ̈ possibile dare una risposta adeguata al problema tecnico precedentemente descritto.

Forma, pertanto, un oggetto della presente invenzione un mezzo di contrasto ecografico antigene-specifico comprendente una microbolla di un gas, preferibilmente inerte, rivestita almeno da una prima capsula/membrana esterna costituita da una opportuna quantità di almeno un recettore ad alta affinità specifico per un determinato antigene, presente nel tessuto da sottoporre selettivamente ad imaging, come riportato nella allegata rivendicazione indipendente.

Forma poi un altro oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica eco-contrastografica comprendente il mezzo di contrasto di cui sopra, come riportato nella allegata rivendicazione indipendente.

Forma inoltre un altro oggetto della presente invenzione un procedimento per preparare il mezzo di contrasto ecografico di cui sopra, come riportato nelle allegate rivendicazioni indipendenti.

Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso del mezzo di contrasto ecografico di cui sopra per effettuare l'imaging ecografico selettivo di un tessuto (preferibilmente, un tessuto malato/tumorale) rispetto ai tessuti circostanti (preferibilmente, sani), come riportato nella allegata rivendicazione indipendente.

Forma ancora un ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso del mezzo di contrasto ecografico di cui sopra come carrier selettivo di farmaci e/o altri principi attivi.

Altri oggetti della presente invenzione sono descritti nelle allegate rivendicazioni dipendenti.

Descrizione Dettagliata dell'Invenzione

Il mezzo di contrasto ecografico antigene-specifico secondo la presente invenzione comprende una microbolla ecogena di un gas, preferibilmente, inerte, ed à ̈ caratterizzato dal fatto che detta microbolla à ̈ rivestita da almeno un primo rivestimento consistente di una capsula esterna anticorpale (cioà ̈, antigene-specifica), detta capsula anticorpale essendo sostanzialmente costituita almeno da una quantità efficace di almeno un recettore ad alta affinità, specifico per un determinato antigene, che sia presente nel tessuto da sottoporre selettivamente ad imaging ecografico.

In detto mezzo di contrasto, detta microbolla ecogena à ̈ preferibilmente costituita da un gas inerte selezionato dal gruppo comprendente: esafluoruro di zolfo, perfluoroesano, perfluorocarburi, aria, azoto; preferibilmente, esafluoruro di zolfo.

Inoltre, in detto mezzo di contrasto, detto almeno un recettore antigene-specifico di detta capsula esterna anticorpale à ̈ preferibilmente selezionato dal gruppo comprendente: anticorpi, monoclonali e non, e/o loro frammenti, quali i Fab, e/o recettori VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor) specifici per cellule endoteliali, cellule miocardiche, cellule della lamina propria, cellule interstiziali, cellule espresse in placche aterosclerotiche, nonché recettori specifici per immunoglobuline, frammenti del complemento, ormoni peptidici e lipidici, neurotrasmettitori; preferibilmente, Fab ad alta affinità, specifici per un determinato antigene.

Preferibilmente, detto recettore antigene-specifico à ̈ addizionato con una minima quantità efficace di almeno una sostanza avente azione stabilizzante sullo stesso.

Detta almeno una sostanza stabilizzante à ̈, preferibilmente, selezionata dal gruppo comprendente: albumina, galattosio, acido palmitico, cianoacrilato; preferibilmente, albumina.

L'albumina à ̈ risultata particolarmente preferita perché esercita una forte azione stabilizzante sulle proteine (anticorpi, Fab e così via) e, quindi, può efficacemente amalgamare, anche a basse dosi, le molecole proteiche costituenti la capsula anticorpale, senza diminuirne eccessivamente la concentrazione e, quindi, l'efficacia.

La quantità di stabilizzante aggiunto à ̈ la minima possibile, tuttavia, sufficiente a stabilizzare la capsula esterna anticorpale. Di norma, il rapporto ponderale reciproco recettore:stabilizzante à ̈ compreso da 10:1 a 1:1; preferibilmente, detto rapporto à ̈ compreso da 7,5:1 a 1,5:1; più preferibilmente, da 5:1 a 2:1; ancor più preferibilmente, da 4:1 a 2,5:1. In una realizzazione preferita dell'invenzione, detto rapporto ponderale reciproco recettore:stabilizzante à ̈ compreso da 3,5:1; preferibilmente, à ̈ di circa 3:1.

In una realizzazione preferita dell'invenzione, il mezzo di contrasto della presente invenzione consiste di una microbolla di un gas inerte rivestita da una capsula esterna anticorpale costituita da un recettore ad alta affinità, specifico per un determinato antigene, che sia presente nel tessuto da sottoporre a imaging diagnostico, in cui detto recettore à ̈ stabilizzato con una quantità di uno stabilizzante in un rapporto ponderale reciproco recettore:stabilizzante compreso da 5:1 a 2:1; preferibilmente, da 4:1 a 2,5:1; più preferibilmente, da 3,5:1; ancor più preferibilmente, di circa 3:1.

In una realizzazione particolarmente preferita dell'invenzione, il mezzo di contrasto della presente invenzione consiste di una microbolla di esafluoruro di zolfo rivestita da una capsula esterna anticorpale costituita da frammenti Fab di anticorpi ad alta affinità, specifici per un determinato antigene, che sia presente nel tessuto da sottoporre a imaging diagnostico, in cui detti frammenti Fab sono stabilizzati con una quantità di albumina in un rapporto ponderale Fab:albumina compreso da 3,5:1, preferibilmente, di circa 3:1.

In un'altra realizzazione preferita dell'invenzione, la capsula esterna anticorpale può ulteriormente contenere una quantità di sostanze selezionate da: recettori antigene-specifici differenti da quello principale e/o farmaci (a solo titolo di esempio assolutamente non limitativo, antitumorali), e/o altri principi attivi, quali, molecole utilizzate in imaging molecolare, mezzi di contrasto radiologici per radiologia convenzionale, tomografia computerizzata, risonanza magnetica, medicina nucleare, molecole biologicamente attive quali ormoni, vitamine, materiale genetico, come nucleosidi, nucleotidi, sostanze sintetiche di natura peptidica, lipidica, glucidica, così che il mdc risultante può essere contemporaneamente utilizzato anche come veicolante, o carrier, selettivo di dette sostanze. In particolare, dette molecole utilizzate in imaging diagnostico sono preferibilmente selezionate da: nanoparticelle di magnetite, composti iodurati, ioni paramagnetici complessi.

In un'altra realizzazione dell'invenzione, il mezzo di contrasto ecografico antigene-specifico ulteriormente comprende un secondo rivestimento della microbolla di gas, situato internamente rispetto alla capsula esterna anticorpale precedentemente descritta, in cui detto secondo rivestimento (detto membrana interna o inner layer) à ̈ costituito da una membrana, a singolo o doppio strato, formata da almeno una componente selezionata da: fosfolipidi, albumina, galattosio, acido palmitico, cianoacrilato e/o loro miscele; preferibilmente, detta membrana interna, o inner layer, à ̈ una membrana fosfolipidica; più preferibilmente, à ̈ una membrana fosfolipidica a singolo strato.

Detta membrana interna (o inner layer) può ulteriormente comprendere altre sostanze quali, ad esempio, opportuni farmaci, molecole utilizzate in imaging diagnostico, mezzi di contrasto radiologici per radiologia convenzionale, tomografia computerizzata, risonanza magnetica, medicina nucleare, molecole biologicamente attive quali ormoni, vitamine, materiale genetico, come nucleosidi, nucleotidi, sostanze sintetiche di natura peptidica, lipidica, glucidica, da veicolare selettivamente al tessuto da sottoporre ad imaging. In particolare, dette molecole utilizzate in imaging diagnostico sono preferibilmente selezionate da: nanoparticelle di magnetite, composti iodurati, ioni paramagnetici complessi.

In una realizzazione dell'invenzione, la microbolla di gas inerte rivestita da una membrana interna (o inner layer), come qui sopra descritta, può anche essere rappresentata da un qualsiasi mezzo di contrasto ecografico noto o già in commercio.

In una realizzazione preferita dell'invenzione, il mezzo di contrasto della presente invenzione consiste di una microbolla di un gas inerte rivestita da un rivestimento interno (o inner layer) costituito da una membrana come subito sopra descritta; detto inner layer à ̈ a sua volta rivestito da un rivestimento esterno consistente di una capsula esterna anticorpale consistente di una quantità efficace di un recettore ad alta affinità, specifico per un determinato antigene, che sia presente nel tessuto da sottoporre a imaging diagnostico, in cui detto recettore à ̈ stabilizzato con una minima quantità efficace di uno stabilizzante in un rapporto ponderale reciproco recettore:stabilizzante compreso da 5:1 a 2:1; preferibilmente, da 4:1 a 2,5:1; più preferibilmente, da 3,5:1; ancor più preferibilmente, di circa 3:1.

In una realizzazione particolarmente preferita dell'invenzione, il mezzo di contrasto della presente invenzione consiste di una microbolla di esafluoruro di zolfo rivestita da una membrana interna fosfolipidica a singolo strato, a formare un core interno ecogenico (o inner core); detto core interno à ̈ ulteriormente rivestito da una capsula esterna anticorpale consistente di frammenti Fab di anticorpi ad alta affinità, specifici per un determinato antigene, che sia presente nel tessuto da sottoporre a imaging diagnostico, stabilizzati con una quantità di albumina in un rapporto ponderale Fab:albumina compreso da 3,5:1, preferibilmente, di circa 3:1.

Dal punto di vista dimensionale, la microbolla di gas come tale ha un diametro medio compreso da ≤ 1 Î1⁄4m a 5 Î1⁄4m; più preferibilmente, detto diametro medio à ̈ ≤ 3 Î1⁄4m.

A sua volta, lo spessore della capsula esterna anticorpale mediamente non supera 400 nm; preferibilmente, à ̈ < 300 nm: più preferibilmente, à ̈ < 200 nm.

Anche lo spessore della membrana interna (preferibilmente, fosfolipidica) costituente l'eventuale secondo rivestimento, quello più interno, della microbolla mediamente non supera 400 nm; preferibilmente, à ̈ < 300 nm: più preferibilmente, à ̈ < 200 nm.

Di conseguenza, il diametro medio complessivo della microbolla finale, costituente il mezzo di contrasto ecografico della presente invenzione, non supera i 6 Î1⁄4m; preferibilmente, Ã ̈ < 5 Î1⁄4m.

Tale valore non supera il diametro medio dei globuli rossi (circa 8 Î1⁄4m) e, pertanto, garantisce la sicurezza della particella di mezzo di contrasto.

Inoltre, risultando inferiore a 10 Î1⁄4m, garantisce anche alla particella del mezzo di contrasto di poter superare la barriera polmonare.

In conseguenza di tutto ciò, à ̈ pertanto un oggetto della presente invenzione anche una composizione farmaceutica eco-contrastografica comprendente un mezzo di contrasto in accordo con tutto quanto sopra descritto.

In una realizzazione preferita dell'invenzione, i componenti, o i precursori, del mezzo di contrasto secondo l'invenzione possono essere opportunamente predisposti e confezionati individualmente in un opportuno kit diagnostico (e in tale forma distribuiti al medico), così da poter essere facilmente assemblati e ricostituiti subito prima dell'uso, ad esempio, tramite opportuna miscelazione e agitazione di detti componenti/precursori.

Detto kit viene preparato e strutturato, mutatis mutandis, in analogia a quanto viene normalmente fatto per i kit diagnostici già noti ed in commercio.

Il procedimento per preparare le microbolle del mezzo di contrasto secondo la presente invenzione viene preferibilmente realizzato adottando tecnologie preparative note, utilizzate normalmente per realizzare le microbolle contenenti gas dei mezzi di contrasto ecografici dell'arte.

Così, in una realizzazione preferita dell'invenzione, detto procedimento di preparazione comprende almeno una fase in cui una quantità efficace di almeno un recettore antigene-specifico, eventualmente addizionato di una opportuna quantità efficace di uno stabilizzante, viene adeguatamente agitata con soluzione fisiologica sotto atmosfera di un gas, preferibilmente inerte, per il tempo sufficiente a ottenere microbolle di detto gas rivestite da una capsula esterna anticorpale contenente detto recettore antigene-specifico.

A solo titolo di esempio, assolutamente non limitativo dell'invenzione, una polvere liofilizzata di una miscela Fab/albumina 3:1 (circa 10 - 40 mg) viene miscelata, sotto atmosfera di esafluoruro di zolfo, ad esempio, in una fiala sigillata, con circa 5 mL di soluzione fisiologica (0.9% di NaCl) e opportunamente agitata per pochi minuti a temperatura ambiente, ad esempio, manualmente o sotto sonicazione, a dare le microbolle di mezzo di contrasto sopra descritte.

In un'altra realizzazione preferita dell'invenzione, il procedimento di preparazione comprende almeno una fase b) in cui una quantità di microbolle ecogene preformate contenenti un gas, preferibilmente inerte, e rivestite da una membrana interna (inner layer) formata da una componente selezionata dal gruppo comprendente: fosfolipidi, albumina, galattosio, acido palmitico, cianoacrilato e/o loro miscele, preferibilmente, fosfolipidi, viene miscelata, in soluzione fisiologica, con una quantità efficace di almeno un recettore antigenespecifico, eventualmente addizionato di una opportuna quantità efficace di uno stabilizzante, e adeguatamente agitata per il tempo sufficiente ad ottenere microbolle di detto gas ulteriormente rivestite da una capsula esterna anticorpale antigene-specifica contenente detto recettore antigene-specifico.

Come già anticipato in precedenza, dette microbolle ecogene preformate contenenti un gas possono anche essere rappresentate da microbolle/microsfere/ microvescicole/microballoons costituenti i mdc ecografici noti nell'arte. In tal caso, le stesse vengono sintetizzate utilizzando le metodologie note, comunemente impiegate per la loro preparazione.

Preferibilmente, detto procedimento di preparazione comprende ulteriormente una prima fase a) in cui una sostanza selezionata da: fosfolipidi, albumina, galattosio, acido palmitico, cianoacrilato e/o loro miscele, preferibilmente, fosfolipidi, viene adeguatamente agitata con soluzione fisiologica sotto atmosfera di un gas, preferibilmente inerte, per il tempo sufficiente ad ottenere microbolle di detto gas rivestite da una membrana interna formata da detta sostanza.

A solo titolo di esempio, assolutamente non limitativo dell'invenzione, detto procedimento preferibilmente comprende una prima fase a) in cui:

a) una polvere liofilizzata di fosfolipidi (circa 25 mg) viene miscelata, sotto atmosfera di esafluoruro di zolfo, ad esempio, in una fiala sigillata, con circa 5 mL di soluzione fisiologica (0.9% di NaCl) e opportunamente agitata per pochi minuti, ad esempio manualmente o sotto sonicazione, a temperatura ambiente, a dare una microsospensione delle suddette microbolle ecogene preformate, a membrana singola fosfolipidica, contenenti esafluoruro di zolfo.

Detta prima fase a) Ã ̈ seguita da una seconda fase b) in cui:

b) alla micro-sospensione derivante dalla precedente fase a) viene aggiunta una polvere liofilizzata di una miscela Fab/albumina 3:1 (circa 10 - 40 mg) e la miscela risultante viene opportunamente agitata per pochi minuti, ad esempio manualmente o sotto sonicazione, a temperatura ambiente, a dare le microbolle di mezzo di contrasto ulteriormente rivestite da una seconda membrana costituita dalla capsula esterna anticorpale (antigene-specifica), sopra descritta.

Il tempo massimo di stoccaggio delle microbolle dello stato dell'arte, una volta preparate, Ã ̈ di circa 6 ore (in fiala sigillata).

A sua volta, il loro tempo di permanenza nel circolo ematico periferico à ̈ di circa 6 minuti.

In confronto a ciò, la stabilità delle microbolle del mezzo di contrasto ecografico secondo la presente invenzione à ̈ mediamente risultata significativamente superiore, e, quindi, migliore, di quella delle microbolle dello stato dell'arte. Mediamente, il tempo di permanenza nel circolo ematico periferico delle microbolle del mezzo di contrasto ecografico secondo la presente invenzione à ̈ stimabile ad almeno 8 minuti; preferibilmente, almeno 10 minuti.

La capsula esterna anticorpale, specifica per un determinato antigene, di una microbolla di mezzo di contrasto ecografico secondo la presente invenzione à ̈ risultata capace di rimanere “ancorata†al tessuto da sottoporre ad imaging selettivo significativamente più a lungo delle particelle di mezzo di contrasto tradizionali, se tale antigene à ̈ presente in detto tessuto. In conseguenza di ciò, la struttura di detto tessuto risulta maggiormente positiva all’enhancement contrastografico per un tempo maggiormente prolungato, rispetto agli altri tessuti circostanti.

Mediamente, questo selettivo enhancement contrastografico prolungato si riscontra a partire da 120 secondi dall’iniezione del mezzo di contrasto. A sua volta, del tutto inaspettatamente, l'aumento selettivo dell'enhancement si verifica anche prima di 120 secondi dalla somministrazione.

Tutto ciò à ̈ ascrivibile al fatto che, tramite la struttura innovativa della capsula esterna anticorpale (costituita, come sopra descritto, per la maggior parte da anticorpi ad alta affinità, specifici per un determinato antigene), à ̈ stato possibile conferire una maggior forza di legame a questi due elementi immunologici (anticorpo:antigene), nonché una maggiore stabilità alla microbolla nel suo complesso.

La preferenza di utilizzare frammenti Fab di anticorpi, rispetto ad un anticorpo intero, à ̈ dovuta al fatto che l’anticorpo, privato del suo frammento Fc (frammento cristallizzabile), perde le sue proprietà citotossiche e attivanti le molecole del complemento. In questo modo, à ̈ possibile eliminare, o quanto meno limitare sensibilmente, l'insorgenza di effetti collaterali.

Il mezzo di contrasto secondo la presente invenzione consente di caratterizzare meglio neoplasie interessanti organi facilmente studiabili con l’esame ultrasonografico, come, ad esempio, il testicolo, il rene, il fegato, la tiroide, la mammella, i muscoli scheletrici degli arti. E’ possibile, con detto mezzo di contrasto ecografico, caratterizzare le lesioni sia mirando a markers neoplastici sia mirando a molecole sovraespresse a livello endoteliale durante il processo di neovascolarizzazione.

Detto mezzo di contrasto può anche essere impiegato come veicolante di farmaci che posseggono recettori specifici per molecole, espresse a livello endoteliale, che rappresentano marker di neovascolarizzazione neoplastica.

Allo stesso modo, detto mezzo di contrasto si può prospettare come un mezzo di contrasto specifico per markers tumorali, poiché à ̈ noto il fenomeno di micrometastatizzazione locale, che determina una diffusione delle cellule neoplastiche per via vascolare nelle immediate vicinanze del tumore. E’ possibile, quindi, non solo caratterizzare una lesione neoplastica ma anche ampliare il quadro diagnostico ricercando eventuali foci di metastatizzazione non rilevabili dall’esame ecografico convenzionale o da altre tecniche di imaging.

Esempi assolutamente non limitativi di possibili, vantaggiose applicazioni cliniche di un mezzo di contrasto ecografico secondo la presente invenzione sono brevemente descritti nella seguente sezione, per illustrarne l'ampio potenziale applicativo.

- Le cellule del carcinoma embrionario del testicolo presentano positività ad antigeni quali l’alfafetoproteina (AFP) e la gonadotropina corionica (HCG). Lo studio selettivo della positività di una massa testicolare a questi due antigeni, opportunamente caricati sulla capsula esterna anticorpale di un mdc secondo la presente invenzione, permetterebbe di diagnosticare meglio, o di escludere dalle ipotesi diagnostiche un tumore a cellule germinali di tipo misto (quale appunto il carcinoma embrionario), senza dover ricorrere ad una esplorazione chirurgica, che risulterebbe inutile e dannosa per il paziente.

- Molti tumori epiteliali esprimono citocheratine: tumori come quelli mammari potrebbero essere tipizzati per citocheratine come la 8, la 18 o la 19. Inoltre, la citocheratina 5 o la citocheratina 6 potrebbero essere individuate nel caso di un tumore squamocellulare.

- Lo studio con un mdc ecografico secondo l'invenzione specifico per alfa-fetoprofeina offrirebbe dei vantaggi nel processo diagnostico di neoplasie epatiche.

- Ca<125>, caricato sul mdc ecografico secondo l'invenzione, potrebbe essere utilizzato per studiare masse sospette per tumore maligno dell’utero o delle ovaie.

- CEA (Antigene Carcino-Embrionario) potrebbe essere utilizzato per confermare o escludere a livello epatico la presenza di metastasi da carcinoma colo-rettale.

- Lo studio di particolari antigeni CD (Classe di Differenziazione) potrebbe agevolare la diagnosi di tumori delle cellule ematiche.

- Le molecole espresse durante il processo di neovascolarizzazione sono fondamentali e caratteristiche nel processo di crescita delle neoplasie maligne. Anticorpi contro il VEGF agevolerebbero vantaggiosamente l’identificazione di questo fenomeno.

In particolar modo, l'utilizzo di questi mezzi di contrasto ecografici si presenta come particolarmente promettente in età pediatrica, in cui à ̈ indiscutibilmente più richiesto, e più sicuro, l’impiego di tecniche diagnostiche poco invasive. Infatti, la maggiore specificità/selettività biologica delle microbolle della presente invenzione si presenta come particolarmente promettente per limitare il ricorso alla biopsia; e ciò à ̈ sicuramente auspicabile in età infantile.

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un mezzo di contrasto ecografico antigene-specifico comprendente una microbolla ecogena di un gas, detta microbolla essendo rivestita da almeno un primo rivestimento consistente di uno strato esterno antigene specifico, detto strato esterno antigene specifico essendo sostanzialmente costituito da una quantità efficace di almeno un recettore ad alta affinità, specìfico per un antigene, detto recettore antigene specifico essendo addizionato di una quantità efficace di almeno una sostanza stabilizzante dello stesso, caratterizzato dal fatto che il rapporto ponderale reciproco recettore:sostanza stabilizzante à ̈ compreso da 10:1 a 1:1.
2. 2. II mezzo di contrasto secondo la rivendicazione 1, in cui detto rapporto ponderale reciproco recettore:sostanza stabilizzante à ̈ compreso da 7,5:1 a 1,5:1; preferibilmente, da 5:1 a 2:1; più preferibilmente, da 4:1 a 2,5:1; molto più preferibilmente, da 3,5 a 1 ; ancor più preferibilmente, à ̈ di circa 3:1.
3. 3. Il mezzo di contrasto secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta microbolla ecogena di un gas à ̈ costituita da un gas inerte selezionato dal gruppo comprendente: esafluoruro di zolfo, perfluoroesano, perfluorocarburi, aria, azoto; preferibilmente, esafluoruro di zolfo.
4. 4. Il mezzo di contrasto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un recettore antigene-specifico di detto strato esterno antigene specifico à ̈ selezionato dal gruppo comprendente: anticorpi, monoclonali e/o non, e/o loro frammenti, Fab, e/o VEGFR, Recettori Vascolari del Fattore di Crescita Endoteliale, specifici per cellule endoteliali, cellule miocardiche, cellule della lamina propria, cellule interstiziali, cellule espresse in placche aterosclerotiche, e/o recettori specifici per immunoglobuline, frammenti del complemento, ormoni peptidici e lipidici, neurotrasmettitori; preferibilmente. Fab ad alta affinità, specifici per un determinato antigene.
5. 5. 11 mezzo dì contrasto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta almeno una sostanza stabilizzante à ̈ selezionata dal gruppo comprendente: albumina, galattosio, acido paimitico, cianoacrilato e/o loro miscele; preferibilmente, albumina.
6. 6. Il mezzo di contrasto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, ulteriormente comprendente un secondo rivestimento della microbolla di gas, situato internamente rispetto allo strato esterno antigene specifico, in cui detto secondo rivestimento à ̈ formato da una membrana costituita da almeno una componente selezionata da: fosfolipidi, albumina, galattosio, acido paimitico, cianoacrilato e/o loro miscele; preferibilmente, da fosfolipidi,
7. 7. Una composizione farmaceutica eco-contrastografica comprendente un mezzo di contrasto in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.
8. 8. Un procedimento per preparare il mezzo di contrasto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, comprendente almeno una fase in cui una quantità efficace di almeno un recettore antigene specifico, addizionato o no di una quantità efficace di uno stabilizzante, viene agitata con soluzione fisiologica e sotto atmosfera di un gas, preferibilmente inerte, per il tempo sufficiente ad ottenere microbolle di detto gas rivestite da uno strato esterno antigene specifico contenente detto almeno un recettore antigene specifico.
9. 9. Un procedimento per preparare il mezzo di contrasto secondo la rivendicazione 6 comprendente almeno una fase b) in cui una quantità di microbolle ecogene preformate contenenti un gas, preferibilmente inerte, e rivestite da un strato interno membranoso, formata da una componente selezionata da: fosfolipidi, albumina, galattosio, acido paimitico, cianoacrilato e/o loro miscele, preferibilmente, fosfolipidi, viene miscelata, in soluzione fisiologica, con una quantità efficace di almeno un recettore antigene specifico, addizionato o no di una quantità efficace di uno stabilizzante, e agitata per il tempo sufficiente ad ottenere microbolle di detto gas ulteriormente rivestite da una capsula esterna antìcorpale contenente detto almeno un recettore antigene specifico.
10. 10. Uso di un mezzo di contrasto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, per preparare una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7.
11. 11. L'uso secondo la rivendicazione 10, per effettuare l'imaging ecografico selettivo e specifico di un tessuto, preferibilmente, un tessuto malato/tumorale, rispetto ai tessuti circostanti, preferibilmente, sani.
12. 12. L'uso secondo la rivendicazione 10 o 11, per veicolare selettivamente e specificamente farmaci e/o principi attivi ad un tessuto malato rispetto ai tessuti sani circostanti.