ITPI20130026A1 - Metodo e dispositivo per analisi di droghe d'abuso su materiale cheratinico - Google Patents

Metodo e dispositivo per analisi di droghe d'abuso su materiale cheratinico

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ITPI20130026A1
ITPI20130026A1 IT000026A ITPI20130026A ITPI20130026A1 IT PI20130026 A1 ITPI20130026 A1 IT PI20130026A1 IT 000026 A IT000026 A IT 000026A IT PI20130026 A ITPI20130026 A IT PI20130026A IT PI20130026 A1 ITPI20130026 A1 IT PI20130026A1
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abuse
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extraction
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IT000026A
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Silvio Chericoni
Mario Giusiani
Fabio Stefanelli
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Univ Pisa
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Description

†METODO E DISPOSITIVO PER ANALISI DI DROGHE D'ABUSO SU MATERIALE CHERATINICOâ€
DESCRIZIONE
Ambito dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce a un metodo e a un dispositivo per verificare l’assunzione, in particolare il consumo abitudinario, di droghe d’abuso da parte di un soggetto attraverso l’analisi di materiale cheratinico del soggetto, ad esempio capelli o altro materiale pilifero.
Tecnica anteriore – Problemi tecnici
Sono noti procedimenti per stabilire se un soggetto abbia consumato o consumi sistematicamente droghe d’abuso mediante l’analisi di materiale cheratinico. In particolare, sono noti procedimenti immunochimici, che possono utilizzare tecniche come immunofluorescenza a luce polarizzata, e procedimenti cromatografici, che possono impiegare tecniche come gascromatografia o cromatografia liquida abbinate a spettrometria di massa (GC-MS; LC-MS).
I procedimenti di entrambi i tipi richiedono di trattare la matrice cheratinica per estrarne le eventuali droghe o loro metaboliti, ottenendo dei campioni in fase liquida. Un metodo per estrarre le più comuni droghe d’abuso da materiale pilifero per una successiva analisi immunochimica à ̈ costituita dalla soluzione †VMA†sviluppata dalla ditta COMEDICAL.
I procedimenti di entrambi i tipi sopra indicati richiedono una strumentazione professionale, utilizzabile con successo solo da personale qualificato. Ciò comporta alcuni svantaggi:
- un notevole costo della strumentazione;
- notevoli costi della specializzazione del personale che deve utilizzare la strumentazione;
- un tempo non trascurabile per preparare i campioni da analizzare;
- impossibilità di eseguire le analisi in ambiente domestico, mantenendo la discrezione che può essere desiderata da un familiare del presunto consumatore di droga.
Inoltre,
- per preparare il materiale cheratinico da sottoporre ad estrazione devono essere impiegate quantità precise che possono essere determinate solo mediante pesatura con una bilancia di precisione;
- alcuni dei solventi comunemente impiegati possono comportare problemi di sicurezza;
- i procedimenti sopra menzionati sono poco affidabili se i capelli hanno subito un trattamento “cosmetico†.
Sono inoltre noti procedimenti immunochimici, sempre per stabilire qualitativamente il consumo di una droga d’abuso, che vengono applicati a matrici biologiche diverse, tipicamente fluidi biologici come saliva e urina. In particolare, sono noti dispositivi noti per l’esecuzione dei saggi rapidi o kit “on site†che permettono di eseguire tali procedimenti in modo semplice e rapido, senza richiedere personale specializzato. Tuttavia, le droghe d’abuso e/o i loro metaboliti hanno un tempo di permanenza relativamente breve in tali fluidi biologici, rispetto a quanto avviene per la matrice cheratinica. Ad esempio, nell’urina gli oppiacei hanno un tempo di permanenza mediamente di 48-72 ore, ed anche inferiore nella saliva.
Per ottenere risultati affidabili, à ̈ quindi necessario che il test su urina o saliva venga eseguito entro un tempo relativamente breve rispetto al momento in cui la droga à ̈ stata assunta. Pertanto, questi procedimenti possono rilevare soltanto la cosiddetta attualità d’uso, nel caso della saliva, o l’uso recente, nel caso dell’urina, e non permettono di stabilire l’uso pregresso e/o abitudinario di droghe d’abuso da parte del soggetto.
Come mostra la figura 1, un kit “on site†10 comprende fondamentalmente un supporto 11 su cui sono disposti:
- dei pozzetti 12 idonei a ricevere il campione;
- delle strisce 13 aventi struttura porosa che si estendono lungo il supporto a partire dai pozzetti 12 e sono in comunicazione idraulica con essi, in modo che deponendo un campione liquido in un pozzetto 13, il campione avanzi per capillarità lungo la rispettiva striscia 12.
Ciascuna striscia 12 serve per rilevare una specifica classe di droghe. A questo proposito, ciascuna striscia 12 comprende, a partire dal pozzetto:
- una zona 14 in cui à ̈ presente in forma mobile un antigene marcato coniugato con la specifica classe di droghe, in modo che il campione avanzando lungo la striscia 13 trascini con sé l’antigene marcato;
- una riga trasversale di test 15, in cui à ̈ presente, fisso nella matrice porosa della striscia 13, un anticorpo atto a reagire sia con l’antigene marcato, nel qual caso dà luogo a una colorazione della riga 15, sia, competitivamente, con le droghe della specifica classe, in questo caso senza dare luogo a tale colorazione;
- una riga trasversale di controllo 16, in cui à ̈ presente, fissa nella matrice porosa, una sostanza atta a combinarsi con il campione colorando la riga di controllo 16.
Se una droga à ̈ presente con una concentrazione inferiore a un valore limite detto di “cut-off†, essa non à ̈ in grado di saturare i siti di legame dell’anticorpo 14, per cui l’anticorpo della riga di test 15 reagisce con l’antigene marcato e la riga di test 15 si colora, quando viene raggiunta dal campione. Se invece la concentrazione à ̈ superiore al valore di cut-off, la droga satura i siti di legame dell’anticorpo e la riga di test 15 non si colora.
Solo una colorazione della riga di controllo 16 indica che la striscia 13 à ̈ stata percorsa correttamente dal campione e che questo ha lambito la riga di test 15. Un mancata colorazione della riga di controllo 16 non permette di considerare valido il test relativo alla specifica classe di droghe. Una copertura 17 e delle finestre 18 per vedere le righe 15,16 sovrapporte al supporto 11 completano il kit “on site†10.
I test immunochimici possono non essere in grado di determinare alcune sostanze tal quali, ad esempio la cocaina, che viene letta come “reattività crociata†. In altre parole, il test prevede la determinazione del suo metabolita specifico, benzoilecgonina.
Shin, Lee et al., in Analytical Biochemistry 407 (2020), pp. 281-283, “Microwave-assisted extraction of human hair proteins†, descrivono un procedimento per estrarre proteine da campioni di capelli umani, in cui una soluzione contenente un tampone TrisHCl (pH 8,5), tiourea, urea e mercaptoetanolo, in presenza dei capelli, viene esposta a microonde con una potenza di 600W per un tempo compreso tra 5 e 120 minuti. Le condizioni operative sopra indicate sono scelte in modo degradare la matrice cheratinica, allo scopo di consentire l’estrazione di macromolecole come proteine. Con tale trattamento si ottiene un estratto che non può essere trattato con le tecniche immunochimiche “on site†sopra descritte.
Sintesi dell’invenzione
È quindi scopo della presente invenzione fornire un metodo e un dispositivo per verificare se un soggetto abbia assunto o consumi abitualmente droghe d’abuso, analizzando un suo materiale cheratinico, che di impiego più semplice e più rapido rispetto ai metodi e ai dispositivi noti in cui si analizza materiale cheratinico.
È scopo particolare della presente invenzione fornire un metodo e un dispositivo per estrarre in modo semplice e rapido droghe d’abuso e/o relativi metaboliti dal materiale cheratinico, ottenendo una soluzione utilizzabile in un test qualitativo tipo “on site†, o in un test immunochimico ad uso professionale.
È anche scopo dell’invenzione fornire un metodo e un dispositivo per eseguire un test qualitativo tipo “on site†, in particolare in ambito domestico, a partire da materiale cheratinico di un soggetto, per stabilire se questi abbia assunto/consumi abitualmente droghe d’abuso.
Questi ed altri scopi sono raggiunti da un metodo per estrarre una droga d’abuso o un suo metabolita da un materiale cheratinico di un soggetto, per stabilire se la droga d’abuso e/o il metabolita à ̈ presente nel materiale cheratinico, il metodo comprendendo fasi di:
− predisposizione di una quantità di materiale cheratinico;
− predisposizione di una quantità di una composizione di estrazione;
− contatto della quantità del materiale cheratinico con la quantità della composizione di estrazione, ottenendo un estratto contenente la droga d’abuso e/o il metabolita;
la cui caratteristica principale à ̈ che la composizione di estrazione contiene un composto scelto nel gruppo formato da urea e derivati ureici.
Sorprendentemente, infatti, gli inventori si sono resi conto che l’urea, così come un numero notevole di derivati ureici, ha un’azione solvente nei riguardi di droghe d’abuso e/o metaboliti di droghe d’abuso.
Dato il basso costo e la sostanziale non tossicità dell’urea e della maggior parte dei derivati ureici utili, il metodo permette di estrarre le droghe d’abuso e/o loro metaboliti in modo economico, semplice e sicuro. Vengono quindi superati i limiti di molte sostanze note come solventi delle droghe d’abuso, idonei per una successiva analisi quali-quantitativa strumentale, i quali sono costosi e dannosi per la salute e per l’ambiente.
Poiché anche i campioni liquidi ottenuti con una siffatta soluzione di estrazione sono idonei per le analisi immunochimiche professionali, il metodo permette di ridurre costi e rischi per il personale incaricato di eseguire tali analisi, come pure di ridurre gli oneri di smaltimento dei materiali di risulta.
Come sarà meglio descritto nel seguito, queste ed altre caratteristiche degli estratti ottenibili con il metodo permettono di stabilire in ambito domestico il consumo anche cronico di droghe d’abuso, a costi ridotti e senza rischi per la salute di chi esegue la valutazione.
La fase di contatto può comprendere una fase di permanenza della composizione di estrazione a contatto con il materiale cheratinico a una temperatura di trattamento di almeno 50°C per un predeterminato tempo di trattamento in temperatura, necessario per far avvenire l’estrazione della droga e/o del metabolita a tale temperatura.
In particolare, la temperatura di trattamento può essere superiore a 70°C, più in particolare la temperatura di trattamento può essere superiore a 90°C.
Vantaggiosamente, la composizione di estrazione comprende acqua. In particolare, la composizione di estrazione può comprendere una soluzione acquosa di urea avente una concentrazione di urea predeterminata e un pH predeterminato. In tal caso, la fase di permanenza in temperatura comprende una fase di ebollizione dell’acqua ovvero della soluzione acquosa, e il tempo di trattamento in temperatura, durante il quale permane l’ebollizione, à ̈ compreso tra 10 minuti e 20 minuti, ad esempio l’ebollizione à ̈ fatta durare circa 15 minuti, che à ̈ quanto necessario per far avvenire l’estrazione della droga e/o del metabolita in condizioni di ebollizione, cioà ̈ a circa 100°C.
I tempi richiesti per far avvenire l’estrazione sono quindi notevolmente inferiori ai tempi richiesti dai solventi noti. Ciò permette di ridurre i tempi di preparazione degli estratti idonei per le analisi semiquantitative.
Inoltre, le condizioni di trattamento, in particolare di ebollizione previste dal metodo sono realizzabili in modo semplice anche in ambiente domestico, in particolare la temperatura di ebollizione della soluzione, prossima a quella dell’acqua, costituisce un riferimento utile per definire una procedura di estrazione standard facilmente riproducibile.
Preferibilmente, la concentrazione di urea della soluzione acquosa à ̈ compresa tra 0,1 moli/litro e 3,0 moli/litro. In particolare, la concentrazione di urea può essere compresa tra 0,5 moli/litro e 2,0 moli/litro, più in particolare, la concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,7 e 1,4 moli/litro, ancor più in particolare la concentrazione di urea à ̈ prossima a 1 mole/litro. Preferibilmente, il pH della soluzione acquosa à ̈ compreso tra 4,5 e 7. In particolare, il pH à ̈ compreso tra 5,0 e 6,0, più in particolare il pH à ̈ compreso tra 5,1 e 5,5, ancor più in particolare il pH à ̈ prossimo a 5,2. A tale scopo, la soluzione acquosa può comprendere sistemi tampone, ad esempio un sistema costituito da fosfato di sodio monoacido e fosfato di sodio biacido (K2HPO4e KH2PO4).
In alternativa, la fase di contatto può prevedere di esporre a microonde la composizione di estrazione a contatto con il materiale cheratinico, ad esempio in un comune forno a microonde, per un determinato tempo di trattamento a microonde. Vantaggiosamente, la fase di esposizione a microonde à ̈ eseguita applicando le microonde alla composizione in contatto con il materiale cheratinico a una potenza compresa tra 150 W e 750 W, in particolare tra 200 e 550 W, più in particolare tra 250 W e 500 W. Il tempo di trattamento con microonde può essere compreso tra 5 secondi e 30 secondi. In particolare il tempo di trattamento con microonde à ̈ compreso tra 10 e 20 secondi. Più in particolare, il tempo di trattamento con microonde à ̈ prossimo a 15 secondi.
Il trattamento a microonde consente di ridurre ulteriormente i tempi di estrazione, rispetto ai tempi richiesti nella tecnica nota per preparare campioni liquidi per analisi immunochimiche professionali su matrice cheratinica. Inoltre, le condizioni previste dal metodo sono realizzabili in modo semplice anche in ambiente domestico, con un comune formo a microonde, circostanza che permette di definire una procedura di estrazione standard facilmente riproducibile.
La fase di contatto può essere vantaggiosamente eseguita senza agitazione, sia essa realizzata mediante riscaldamento e permanenza in temperatura, in particolare a ebollizione, sia essa realizzata con esposizione a microonde.
Rientra nell’ambito della presente invenzione anche un metodo per stabilire se una droga d’abuso e/o un metabolita di una droga d’abuso à ̈ presente in un materiale cheratinico di un soggetto, tale metodo comprendendo:
− una fase di trattamento del materiale cheratinico con una composizione di estrazione come precedentemente descritto;
− una fase di trattamento dell’estratto in un dispositivo per l’esecuzione di un saggio immunochimico rapido, ad esempio con un kit “on site†;
− una fase di interpretazione del saggio immunocromatografico rapido.
Infatti, l’estratto così ottenuto, contenente la droga e/o un suo metabolita, assieme all’urea e/o al derivato ureico, à ̈ compatibile con i substrati utilizzati nei procedimenti per saggi immunochimici qualitativi rapidi “on site†attualmente disponibili per l’analisi di saliva e urine. In altre parole, non vi sono interazioni significative o interferenze tra i residui ureici presenti nell’estratto e tali substrati. Pertanto, il metodo permette di usare tali kit “on site†, impiegati per analisi su urina o saliva, anche per eseguire analisi di materiale cheratinico.
Il metodo secondo l’invenzione, in questa forma realizzativa, permette quindi di unire i vantaggi caratteristici dei saggi immunochimici rapidi, cioà ̈ facilità d’uso, rapidità di risposta e costo limitato, ai vantaggi tipici di un’analisi basata su materiale cheratinico, cioà ̈ la validità dei saggi anche se eseguiti dopo che à ̈ trascorso un tempo relativamente lungo dall’assunzione della droga, e quindi la possibilità di identificare un consumo cronico della droga d’abuso.
Inoltre, la possibilità di usare kit per saggi qualitativi rapidi “on site†consente di verificare qualitativamente il consumo, anche cronico, di droghe d’abuso da parte di un soggetto, senza impiegare strumentazione di laboratorio. Per questo motivo, il metodo à ̈ adatto per un impiego domestico, e permette la verifica in ambito familiare, senza divulgarne l’eventuale esito positivo presso strutture pubbliche. Come anticipato, l’uso domestico del metodo à ̈ agevolato anche dalla sostanziale non tossicità dell’urea e della maggior parte dei derivati ureici utili per saggi rapidi, ed anche dalla facilità di smaltimento dei materiali di rifiuto prodotti dal metodo.
Inoltre, la possibilità di usare procedimenti rapidi “on site†basati sull’analisi di materiale cheratinico può fornire alle strutture sanitarie un sistema di screening per stabilire quali estratti, cioà ̈ quali persone, valutare in modo più approfondito, quali-quantitativamente, con tecniche come GC-MS o LC-MS, che richiedono un maggiore impiego di risorse. Ciò permette di ridurre i costi e i tempi complessivamente necessari per valutare il consumo di droga in una pluralità di soggetti, senza ridurre l’affidabilità della verifica.
La droga d’abuso o sostanza stupefacente che può essere estratta dalla composizione di estrazione può essere costituita da una droga, o da più droghe, scelta o scelte nel gruppo formato da Amfetamina; barbiturici; benzodiazepine; Buprenorfina; Cocaina; Cotinina; EDDP; Fenciclidina; Ketamina; Marijuana; Metadone; Metamfetamina; oppiacei; Ossicodone; Propossifene. Tale gruppo à ̈ esaustivo delle droghe d’abuso di maggiore diffusione.
Il metodo e la composizione di estrazione secondo l’invenzione presentano vantaggi specifici per stabilire se un soggetto abbia consumato specifiche droghe d’abuso, tipicamente cocaina. In questo caso, infatti, nel materiale cheratinico del consumatore si fissa, oltre alla cocaina, una quantità molto più piccola del suo metabolita Benzoilecgonina. I saggi rapidi “on site†, come pure i saggi su strumentazione professionale sono provvisti di dispositivi rilevatori sensibili alla sola Benzoilecgonina. Ora, gli inventori si sono sorprendentemente accorti che, nella fase di contatto tra il materiale cheratinico e la composizione di estrazione, tipicamente una soluzione acquosa di urea, la cocaina si converte pressoché quantitativamente in Benzoilecgonina. Per questo motivo, l’estratto così preparato contiene una quantità di benzoilecgonina data dalla somma di quella già presente nella matrice più quella ottenuta dalla conversione della cocaina estratta. Pertanto, con la soluzione di estrazione e con il metodo secondo l’invenzione, i saggi “on site†e i nei saggi su strumentazione professionale risultano molto più efficaci per stabilire il consumo di cocaina, rispetto al caso in cui la tale conversione non ha luogo.
In particolare, il derivato ureico, o i derivati ureici presente/presenti nella composizione di estrazione può/possono essere scelti tra tiourea, tetraetil urea, tetrametil urea e idantoina. In particolare, la composizione di estrazione comprende una soluzione acquosa di tiourea avente una concentrazione di tiourea predeterminata e un pH predeterminato.
La tiourea si distingue dagli altri derivati, e principalmente dall’urea stessa, per il fatto di produrre un estratto in cui la cocaina e la Benzoilecgonina sono presenti sostanzialmente nello stesso rapporto di quantità che nel materiale cheratinico. Infatti, la tiourea non à ̈ in grado di promuovere la conversione della cocaina in Benzoilecgonina. Tale condizione à ̈ vantaggiosa, se non strettamente necessaria, nel caso di preparazione di campioni destinati ad un’analisi gas cromatografica, più in particolare in gas-massa.
Secondo un altro aspetto dell’invenzione, gli scopi sopra indicati sono raggiunti da una composizione per estrarre una droga d’abuso o un suo metabolita da un materiale cheratinico di un soggetto, ottenendo un estratto contenente la droga d’abuso e/o il metabolita, la cui caratteristica principale à ̈ di comprendere un composto scelto tra urea e derivati ureici.
Vantaggiosamente, la composizione di estrazione comprende una soluzione acquosa di urea avente una predeterminata concentrazione di urea e un predeterminato pH. In particolare la concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,1 e 3,0 moli/litro, più in particolare tra 0,5 e 2,0 moli/litro, più in particolare, la concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,7 e 1,4 moli/litro, ancor più in particolare, la concentrazione di urea à ̈ prossima a 1 mole/litro. In particolare, il pH à ̈ compreso tra 4,5 e 7, più in particolare tra 5,0 e 6,0 più in particolare il pH à ̈ compreso tra 5,1 e 5,5, ancor più in particolare il pH à ̈ prossimo a 5,2.
In una composizione comprendente uno o più derivati ureici, questo o questi possono essere scelti tra tiourea, tetraetil urea, tetrametil urea e idantoina.
La composizione di estrazione può comprendere una soluzione acquosa di tiourea avente una concentrazione di tiourea predeterminata e un pH predeterminato.
Rientra nell’ambito dell’invenzione anche l’uso di una composizione per estrarre una droga d’abuso o un metabolita di una droga d’abuso da un materiale cheratinico di un soggetto, tale composizione contenendo un composto scelto tra urea e derivati ureici, per stabilire se la droga d’abuso e/o il metabolita à ̈ presente nel materiale cheratinico. La composizione può avere una o più delle caratteristiche opzionali sopra indicate.
Secondo un altro aspetto dell’invenzione, gli scopi sopra indicati sono raggiunti da un dispositivo per estrarre una droga d’abuso o un suo metabolita da un materiale cheratinico di un soggetto, ottenendo un estratto contenente la droga d’abuso e/o il metabolita, il dispositivo comprendendo:
− un contenitore di preparazione configurato per ricevere una quantità predeterminata del materiale cheratinico; − una quantità predeterminata di una composizione di estrazione
− un contenitore di estrazione configurato per ricevere la quantità predeterminata di composizione di estrazione assieme alla quantità predeterminata di detto materiale cheratinico;
− mezzi per portare a contatto la quantità del materiale cheratinico con la quantità della composizione di estrazione nel contenitore di estrazione;
la cui caratteristica principale à ̈ che la composizione di estrazione contiene un composto scelto nel gruppo formato da urea e derivati ureici.
Oltre ai vantaggi evidenziati enunciando le varie caratteristiche del metodo, il dispositivo secondo l’invenzione permette di preparare l’estratto in modo semplice, poiché evita la fase di pesatura della quantità di materiale cheratinico.
Vantaggiosamente, il contenitore di estrazione à ̈ un contenitore cilindrico provvisto di una tacca di livello corrispondente alla quantità del materiale cheratinico, suddiviso secondo una lunghezza predeterminata.
In una forma realizzativa, la composizione di estrazione comprende una soluzione acquosa di urea avente una concentrazione di urea predeterminata e un pH predeterminato. In particolare la concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,1 e 3,0 moli/litro, più in particolare tra 0,5 e 2,0 moli/litro più in particolare, la concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,7 e 1,4 moli/litro, ancor più in particolare à ̈ prossima a 1 mole/litro. In particolare, il pH à ̈ compreso tra 4,5 e 7, più in particolare tra 5,0 e 6,0, più in particolare il pH à ̈ compreso tra 5,1 e 5,5, ancor più in particolare il pH à ̈ prossimo a 5,2.
In una forma realizzativa, i derivati ureici sono scelti tra tiourea, tetraetil urea, tetrametil urea e idantoina.
Vantaggiosamente, il contenitore di estrazione del kit à ̈ configurato per resistere a una temperatura di estrazione, in particolare 100°C, per un tempo predeterminato, in particolare 20 minuti e/o per resistere a microonde di potenza predeterminata, in particolare compresa tra 150 W e 750 W, in particolare per un tempo predeterminato, per esempio dell’ordine di 20 secondi.
Rientra nell’ambito della presente invenzione anche un kit per eseguire una verifica di presenza di una droga d’abuso e/o di un suo metabolita in un materiale cheratinico di un soggetto, il kit comprendendo:
− mezzi per estrarre la droga d’abuso o il metabolita dal materiale cheratinico come sopra indicati;
− un saggio immunocromatografico rapido provvisto di mezzi di alimentazione dell’estratto.
Breve descrizione dei disegni
L’invenzione verrà di seguito illustrata con la descrizione di forme realizzative della scalmiera secondo l’invenzione, fatta a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento ai disegni annessi, in cui:  la figura 1 mostra schematicamente un kit “on site†, ossia un dispositivo di tipo noto per eseguire saggi rapidi su campioni di saliva;
 la figura 2 mostra un kit per estrarre una droga d’abuso o suo metabolita da un materiale cheratinico;
 le figure 3 e 4 mostrano kit multipli per estrarre una droga d’abuso o suo metabolita da un materiale cheratinico in una prima forma realizzativa;
 la figura 5 mostra un kit per eseguire una verifica on site di presenza di una droga d’abuso o suo metabolita in un materiale cheratinico;
 la figura 6 mostra un kit multiplo per eseguire una verifica on site di presenza di una droga d’abuso o suo metabolita in un materiale cheratinico;
 le figure 7-11 illustrano l’impiego del kit delle figure 2-4 nella fase di predisposizione di una quantità di materiale cheratinico per l’estrazione;
 le figure 12-13 illustrano l’impiego del kit in una prima parte della fase di contatto della quantità di materiale cheratinico con la composizione di estrazione;  la figura 14 illustra una fase di permanenza della composizione di estrazione a contatto con il materiale cheratinico a una predeterminata temperatura di trattamento per un predeterminato tempo di trattamento;
 la figura 15 illustra una fase di esposizione a microonde della composizione di estrazione a contatto con il materiale cheratinico per un predeterminato tempo di trattamento;
 la figura 16 mostra il contenitore di estrazione dopo il trattamento di figura 14 o 15, contenente un estratto per la verifica;
 le figure 17 e 18 illustrano una fase di trattamento dell’estratto in un dispositivo per l’esecuzione di un saggio immunochimico rapido.
Descrizione di forme realizzative preferite
Con riferimento alla figura 2, viene descritto un kit monouso 20 per estrarre una droga d’abuso e/o un suo metabolita eventualmente presenti in un materiale cheratinico, impiegando una composizione di estrazione 23 ottenendo un estratto liquido contenente detta eventuale droga d’abuso e/o suo metabolita. Il kit 20 comprende un contenitore di preparazione 21 del materiale cheratinico, idoneo a ricevere una quantità predeterminata di materiale cheratinico. Il contenitore di preparazione può essere, ad esempio, una comune provetta Falcon.
In una forma realizzativa, il kit 20 può comprendere anche delle comuni forbici 33 per sminuzzare opportunamente il materiale cheratinico nel contenitore di preparazione 21.
Il kit 20 comprende inoltre una quantità di una composizione di estrazione 23 contenente urea o un derivato ureico, in particolare scelto tra tiourea, tetraetil urea, tetrametil urea e idantoina. La composizione di estrazione 23 può essere fornita in un flacone monodose 24 che fa parte del kit 20, in una quantità idonea per una singola verifica, cioà ̈ per una verifica su una quantità di materiale cheratinico di un singolo soggetto. Ad esempio, la quantità di soluzione di estrazione può essere dell’ordine di 500 microlitri, o tale da consentire il prelievo di almeno 500 miclolitri.
Il kit 20 comprende inoltre un contenitore di estrazione 22 idoneo a ricevere la quantità predeterminata di composizione di estrazione 23 assieme a una quantità predeterminata di materiale cheratinico, sufficienti per ottenere un estratto liquido impiegabile in un saggio di determinazione di una droga d’abuso.
Il contenitore di estrazione 22 à ̈ realizzato in un materiale, preferibilmente plastico, resistente ad una temperatura di estrazione, per esempio dell’ordine di 100°C e/o in un materiale resistente a microonde di potenza predeterminata, per esempio dell’ordine di 150-750 W, per un prefissato tempo di trattamento.
Il contenitore di estrazione 22 à ̈ vantaggiosamente provvisto di un tappo ermetico 25 per chiudere il contenitore 22 durante l’estrazione, come descritto nel seguito.
Ad esempio, il contenitore di estrazione 22 può avere la forma di una provetta, più in particolare di una fiala tipo Eppendorf.
Il kit 20 può altresì comprendere un pistoncino o pestello 27, preferibilmente in materiale plastico, idoneo per l’inserimento nel contenitore di estrazione 22.
In una forma realizzativa vantaggiosa, il contenitore di estrazione 22 à ̈ provvisto di una tacca di livello 29 che corrisponde ad un volume di quantità di materiale cheratinico, suddiviso e opportunamente compresso, a sua volta corrispondente a una predeterminata massa di materiale cheratinico idonea per eseguire un’estrazione.
In tal modo, un utilizzatore comprimendo il materiale fino alla tacca 29 ha la certezza di usare una quantità idonea di materiale cheratinico.
In una forma realizzativa, il kit 20 può inoltre comprendere delle pinzette 34 quali mezzi per prelevare dal contenitore di preparazione 21 la quantità di materiale cheratinico ivi preparata e riporlo nel contenitore di estrazione 22, in cui deve essere poi introdotta la composizione di estrazione 23.
Una tacca, non rappresentata può essere opzionalmente prevista anche nel contenitore di preparazione 21 per una stima preliminare di materiale cheratinico usato.
In una forma realizzativa, il kit 20 può inoltre comprendere una pipetta 35, ad esempio una pipetta Pasteur, per prelevare, dopo l’estrazione, l’estratto dal contenitore di estrazione 22 e portarlo in una sezione di alimentazione di un dispositivo per stabilire la presenza di una o più droghe e/o rispettivi metaboliti.
Ad esempio, tale sezione di alimentazione può essere un pozzetto 12 di un kit “on site†del tipo mostrato in figura 1.
Con riferimento alle figure 3 e 4, vengono descritti kit 40 e 50 per estrarre una droga d’abuso e/o un suo metabolita eventualmente presenti in una pluralità di quantitativi di materiale cheratinico provenienti, in particolare, da soggetti diversi.
Il kit 40 comprende un multiplo di una quantità di soluzione di estrazione idonea per una singola verifica. Ad esempio, Il kit 40 può contenere una pluralità di flaconi monodose 24 ciascuno contenente una quantità di soluzione di estrazione idonea per una singola verifica. preferibilmente nella forma di un assieme 37 di contenitori monodose stampati separabili.
Il kit 40 comprende poi moduli monouso 30, in numero uguale ai flaconi monodose 24. Ciascun modulo 30 comprende un contenitore di preparazione 21 e un contenitore di estrazione 22 e, preferibilmente, un pestello 27 e/o una pipetta 35, come descritto con riferimento alla figura 2.
Il kit 50 comprende un flacone 38 di una quantità di soluzione di estrazione 23 per l’esecuzione di un notevole numero di verifiche. Il kit 50 comprende poi una pluralità di moduli monouso 30, del tipo descritto con riferimento al kit 30. In tal caso, ciascun modulo 30 può comprendere una pipetta addizionale 35 o un contagocce per prelevare una quantità predeterminata di soluzione di estrazione 23 dal flacone 38 e depositarla nella provetta di estrazione 22.
I kit multipli 40 e 50, comprendenti una pluralità di quantitativi monodose di soluzione di estrazione 23 e una pluralità di moduli monouso 30, possono essere vantaggiosamente impiegati in strutture sanitarie, ad esempio, per eseguire screening qualitativi su più soggetti per valutare quali di questi destinare a valutazioni qualiquantitative approfondite.
I kit 40 e 50 comprendono vantaggiosamente forbici 33 per sminuzzare il materiale cheratinico e pinzette 34 per trasferire il materiale cheratinico preparato dal contenitore di preparazione 21 al contenitore di estrazione 22.
Il contenitore di estrazione 22, in particolare nel kit 50, può essere poi provvisto di una seconda tacca di livello, non rappresentata, superiore alla tacca 29, corrispondente alla quantità di soluzione di estrazione 23 idonea per eseguire un’estrazione.
In una forma realizzativa, la provetta di estrazione 22 dei kit 20,40,50 può comprendere mezzi di riscaldamento propri, non rappresentati da usare in alternativa all’impiego di acqua bollente o altro mezzo riscaldante esterno al kit 20,40,50. Ad esempio, i mezzi di riscaldamento propri possono comprendere un circuito in cui una resistenza riscaldante à ̈ disposta sulla provetta di estrazione 22 ed à ̈ associata o associabile a una batteria, il circuito di riscaldamento essendo calibrato per erogare una corrente per un tempo tale da portare il contenuto della provetta di estrazione 22 alla temperatura di estrazione e a farvelo permanere per un idoneo tempo di estrazione.
Con riferimento alla figura 5, viene descritto un kit monouso 60 per verificare la presenza di una droga d’abuso e/o di un suo metabolita in un materiale cheratinico. Il kit 60 comprende un kit 20 del tipo descritto con riferimento alla figura 2, per estrarre l’eventuale droga d’abuso o il suo metabolita dal materiale cheratinico, e comprende inoltre un kit per eseguire un saggio immunocromatografico rapido 10 ad esempio del tipo descritto con riferimento alla figura 1, provvisto di mezzi di alimentazione 12 dell’ estratto.
Con riferimento alla figura 6, viene descritto un kit 70 per verificare la presenza di una droga d’abuso e/o di un suo metabolita in un materiale cheratinico in una pluralità di quantitativi di materiale cheratinico provenienti, in particolare, da soggetti diversi. Il kit 70 comprende un kit 30 o 40 del tipo descritto con riferimento alla figura 3 o alla figura 4, e comprende inoltre una pluralità di kit per saggi immunocromatografici rapidi 10, ad esempio del tipo descritto con riferimento alla figura 1. Ad esempio, tale dispositivo può comprendere una strumentazione ad uso professionale per analisi di tipo immunochimico.
In alternativa, tale dispositivo può essere un saggio rapido “on site†, ad esempio, un saggio comunemente usato per la determinazione di stupefacenti nella saliva. In tal caso, un kit 40 per stabilire la presenza di una droga o suo metabolita comprende il kit di estrazione 20 o 30 sopra descritto e un tale saggio rapido “on site†10 la cui struttura e funzionamento sono state descritte assieme alla tecnica anteriore con riferimento alla figura 1.
Un dettagliato foglietto illustrativo, non rappresentato, può essere previsto per insegnare come usare i kit 20, 40, 50, 60, 70.
La figura 7 mostra una fase di predisposizione di materiale cheratinico 19 in un contenitore di preparazione 21 di un kit 20,40,50, in cui materiale pilifero come capelli 19’ viene sminuzzato, con le forbici 33, all’interno del contenitore 21, fino a raggiungere un livello considerato soddisfacente per estrarre un quantitativo idoneo per l’estrazione, come mostrato in figura 8.
Come mostrano le figure 9 e 10, una quantità di materiale cheratinico 19 viene successivamente prelevata dal contenitore 21 e introdotta nel contenitore di estrazione 22, provvisto di una tacca di livello 29, ad esempio con la pinzetta 34. Dopo, ed eventualmente anche durante tale fase, il materiale cheratinico 19 viene compresso nel contenitore 22 per mezzo del pestello 27, in modo da portare il livello del materiale cheratinico 19 in corrispondenza della tacca di livello 29, come mostra la figura 11.
Successivamente, come rappresentato dalle figure 12 e 13, una quantità di soluzione di estrazione 23 viene prelevata dal flacone 24, per esempio con la pipetta 35, e introdotta nel contenitore 22, in modo da realizzare una contatto tra la soluzione 23 e il materiale 19.
Il contenitore di estrazione 22 così preparato viene chiuso col tappo ermetico 25 e sottoposto a un trattamento di estrazione.
Secondo una variante, il contenitore di estrazione 22 viene portato ad una temperatura di estrazione e ivi mantenuto per un tempo di estrazione che può dipendere dalla temperatura di estrazione. Ad esempio, come mostrato in figura 14, il contenitore 22 viene almeno parzialmente immerso in un bagno di acqua bollente 80, cioà ̈ a circa 100°C per un tempo di estrazione 81 normalmente da 10’ e 20’, tipicamente dell’ordine di 15’, ad esempio un un normale contenitore riscaldabile da cucina 84 o da laboratorio. In alternativa, l’estrazione termica può compiersi anche per esposizione del contenitore 22 a vapori di acqua bollente, per un tempo predeterminato.
Secondo un’altra variante, il contenitore di estrazione 22 viene sottoposto a microonde, ad esempio viene mantenuto in un comune forno a microonde 82 per un tempo 83 dell’ordine di 15“, come mostrato in figura 15, con la potenza di irraggiamento impostata tra 150 W e 750 W, in particolare tra 200 e 550 W, più in particolare tra 250 e 500 W.
La figura 16 mostra un contenitore di estrazione 22 dopo la fase di estrazione di figura 14 o 15, contenente, oltre ad un residuo materiale cheratinico 19, un estratto 28 che può contenere una droga d’abuso o un suo metabolita eventualmente contenuta nel materiale pilifero 19’.
L’estratto 28 può essere poi sottoposto a un’analisi immunochimica di tipo noto, ad esempio su strumentazione di tipo professionale, o, come mostrano le figure 17 e 18, in un kit “on site†10 del tipo descritto con riferimento alla figura 1, in cui, per mezzo della pipetta monouso 35, l’estratto 28 viene prelevato dal contenitore 22 e portato in corrispondenza del o dei pozzetti 12 del kit 10.
Esempi
Sono stati predisposti 100 campioni reali di materiale cheratinico raccolti durante la normale attività di laboratorio. Il materiale predisposto comprendeva sia campioni positivi che campioni negativi.
La composizione di estrazione era una soluzione acquosa di urea con purezza minima 98%, alla concentrazione 1M pH, tamponata a pH 5,2 con tampone fosfato 0,1 moli/litro.
La composizione di estrazione, unita al materiale cheratinico à ̈ stata mantenuta a 100°C per 15 minuti con mezzi riscaldanti convenzionali e/o sottoposta a microonde per una potenza di 300-450 W, per 15 secondi.
Porzioni di ciascun campione così ottenuto sono state inoltre analizzate con un procedimento GM-MS, cioà ̈ un procedimento basato su analisi gascromatografica e spettrometria di massa.
Per l’analisi gascromatografica à ̈ stato impiegato un GC/MS QP2010 Ultra con autocampionatore modello AOC-20i entrambi della ditta Shimadzu.
L’analisi cromatografica à ̈ stata eseguita utilizzando una colonna da 15 metri Rtx® -5MS con riempimento Crossbond® 5% difenile/95% polisilossano, avente un diametro interno di 0,25 mm e uno spessore della fase stazionaria di 0,25 mm (Restek). La temperature dell’iniettore à ̈ stata mantenuta a 270 °C, con un volume di iniezione di 1 ml in modalità “splitless†, in cui l’intero campione iniettato va interamente in colonna cromatografica senza subire prelievi a livello dell’iniettore. La temperature iniziale del forno, di 100 °C, à ̈ stata mantenuta per 90 secondi ed à ̈ poi stata aumentata alla velocità di 17 °C/min fino a 320 °C, a cui à ̈ stata mantenuta per 1 minuto. La “transfer line†à ̈ stata mantenuta ad una temperatura di 250 °C mentre la sorgente ionica à ̈ stata mantenuta a 200 °C. Come carrier à ̈ stato utilizzato elio con un flusso di 1,5 ml/min.
In sintesi, i risultati ottenuti dai test secondo l’invenzione e i risultati ottenuti mediante tecnica GC-MS hanno evidenziato una totale corrispondenza tra i due metodi.
La descrizione di cui sopra di forme realizzative del kit secondo l’invenzione, e di esempi di esecuzione del metodo secondo l’invenzione, à ̈ in grado di mostrare l’invenzione dal punto di vista concettuale in modo che altri, utilizzando la tecnica nota, potranno modificare e/o adattare in varie applicazioni tale forma realizzativa specifica senza ulteriori ricerche e senza allontanarsi dal concetto inventivo, e, quindi, si intende che tali adattamenti e modifiche saranno considerabili come equivalenti della forma realizzativa specifica. I mezzi e i materiali per realizzare le varie funzioni descritte potranno essere di varia natura senza per questo uscire dall’ambito dell’invenzione. S’intende che le espressioni o la terminologia utilizzate hanno scopo puramente descrittivo e, per questo, non limitativo.

Claims (27)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per estrarre una droga d’abuso o un metabolita di una droga d’abuso da un materiale cheratinico, per stabilire se detta droga d’abuso e/o detto metabolita à ̈ presente in detto materiale cheratinico, detto metodo comprendendo fasi di: − predisposizione di una quantità di detto materiale cheratinico; − predisposizione di una quantità di una composizione di estrazione; − contatto di detta quantità di detto materiale cheratinico con detta quantità di detta composizione di estrazione, ottenendo un estratto contenente detta droga d’abuso e/o detto metabolita; caratterizzato dal fatto che detta composizione di estrazione contiene un composto scelto nel gruppo formato da urea e derivati ureici.
  2. 2. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detta fase di contatto di detta quantità di detto materiale cheratinico con detta quantità di detta composizione di estrazione comprende una fase di permanenza di detta composizione di estrazione a contatto con detto materiale cheratinico a una temperatura di trattamento di almeno 50°C per un predeterminato tempo di trattamento in temperatura, in particolare, detta temperatura di trattamento à ̈ superiore a 70°C, più in particolare, detta temperatura di trattamento à ̈ superiore a 90°C.
  3. 3. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detta fase di contatto di detta quantità di detto materiale cheratinico con detta quantità di detta composizione di estrazione comprende una fase di esposizione a microonde di detta composizione di estrazione a contatto con detto materiale cheratinico, per un determinato tempo di trattamento a microonde.
  4. 4. Un metodo come da rivendicazione 3, in cui dette microonde sono applicate a detta composizione in contatto con detto materiale cheratinico a una potenza compresa tra 150 W e 750 W, in particolare tra 200 W e 550 W, più in particolare tra 250 W e 450 W, e detto tempo di trattamento con microonde à ̈ compreso tra 5 secondi e 30 secondi, in particolare, detto tempo di trattamento con microonde à ̈ compreso tra 10 e 20 secondi, più in particolare detto tempo di trattamento con microonde à ̈ prossimo a 15 secondi.
  5. 5. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detta composizione di estrazione comprende acqua.
  6. 6. Un metodo come da rivendicazione 5, in cui detta composizione di estrazione comprende una soluzione acquosa di urea avente una concentrazione di urea predeterminata e un pH predeterminato.
  7. 7. Un metodo come da rivendicazioni 2 e 5, in cui detta fase di permanenza in temperatura comprende una fase di ebollizione di detta acqua, e detto tempo di trattamento in temperatura à ̈ compreso tra 10 minuti e 20 minuti.
  8. 8. Un metodo come da rivendicazione 6, in cui detta concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,1 moli/litro e 3,0 moli/litro, in particolare, detta concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,5 moli/litro e 2,0 moli/litro, più in particolare, detta concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,7 moli/litro e 1,4 moli/litro.
  9. 9. Un metodo come da rivendicazione 6, in cui detto pH à ̈ compreso tra 4,5 e 7, in particolare, detto pH à ̈ compreso tra 5,0 e 6,0, più in particolare detto pH à ̈ compreso tra 5,1 e 5,5.
  10. 10. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detta droga d’abuso à ̈ scelta nel gruppo formato da: Amfetamina; Barbiturici; benzodiazepine; Buprenorfina; Cocaina; Cotinina; EDDP; Fenciclidina; Ketamina; Marijuana; Metadone; Metamfetamina; Oppiacei; Ossicodone; Propossifene.
  11. 11. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detti derivati ureici sono scelti tra tiourea, tetraetil urea, tetrametil urea e idantoina.
  12. 12. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detta composizione di estrazione comprende una soluzione acquosa di tiourea avente una concentrazione di tiourea predeterminata e un pH predeterminato.
  13. 13. Un metodo per stabilire se una droga d’abuso e/o un metabolita di una droga d’abuso à ̈ presente in un materiale cheratinico, detto metodo comprendendo: − una fase di trattamento di detto materiale cheratinico con una composizione di estrazione secondo una delle rivendicazioni precedenti; − una fase di trattamento di detto estratto in un dispositivo per l’esecuzione di un saggio immunochimico rapido; − una fase di interpretazione di detto saggio immunocromatografico rapido.
  14. 14. Una composizione per estrarre una droga d’abuso o un metabolita di una droga d’abuso da un materiale cheratinico, ottenendo un estratto contenente detta droga d’abuso e/o detto metabolita, caratterizzata dal fatto di comprendere un composto scelto nel gruppo formato da urea e derivati ureici.
  15. 15. Una composizione come da rivendicazione 14, comprendente una soluzione acquosa di urea avente una concentrazione di urea predeterminata e un pH predeterminato.
  16. 16. Una composizione come da rivendicazione 15, in cui detta concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,1 e 3,0 moli/litro, in particolare, detta concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,5 e 2,0 moli/litro, più in particolare, detta concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,7 moli/litro e 1,4 moli/litro.
  17. 17. Una composizione come da rivendicazione 15, in cui detto pH à ̈ compreso tra 4,5 e 7, in particolare, detto pH à ̈ compreso tra 5,0 e 6,0, più in particolare detto pH à ̈ compreso tra 5,1 e 5,5.
  18. 18. Una composizione come da rivendicazione 14, in cui detti derivati ureici sono scelti tra tiourea; tetraetil urea; tetrametil urea e idantoina.
  19. 19. Una composizione come da rivendicazione 14, in cui detta composizione di estrazione comprende una soluzione acquosa di tiourea avente una concentrazione di tiourea predeterminata e un pH predeterminato.
  20. 20. Uso di una composizione di estrazione contenente un composto scelto nel gruppo formato da urea e derivati ureici per estrarre una droga d’abuso o un metabolita di una droga d’abuso da un materiale cheratinico, per stabilire se detta droga d’abuso e/o detto metabolita à ̈ presente in detto materiale cheratinico.
  21. 21. Uso come da rivendicazione 20, in cui detta composizione di estrazione ha almeno una delle caratteristiche indicate nelle rivendicazioni dalla 15 alla 19.
  22. 22. Un kit (20,40,50) per estrarre una droga d’abuso o un metabolita di una droga d’abuso da un materiale cheratinico (19) e ottenere un estratto (28) contenente detta droga d’abuso e/o detto metabolita, detto kit (20,40,50) comprendendo: − un contenitore di preparazione (21) configurato per ricevere una quantità predeterminata di detto materiale cheratinico (19); − una quantità predeterminata di una composizione di estrazione (23); − un contenitore di estrazione (22) configurato per ricevere detta quantità predeterminata di composizione di estrazione (23) assieme a detta quantità predeterminata di detto materiale cheratinico (19); − mezzi per portare a contatto detta quantità di detto materiale cheratinico (19) con detta quantità di detta composizione di estrazione (23) in detto contenitore di estrazione (22); caratterizzato dal fatto che detta composizione di estrazione (23) contiene un composto scelto nel gruppo formato da urea e derivati ureici.
  23. 23. Un kit (20,40,50) come da rivendicazione 22, in cui detto contenitore di estrazione (22) à ̈ un contenitore cilindrico provvisto di una tacca di livello (29) corrispondente a detta quantità di detto materiale cheratinico (19), suddiviso secondo una lunghezza predeterminata.
  24. 24. Un kit (20,40,50) come da rivendicazione 22, in cui detta composizione di estrazione (23) comprende una soluzione acquosa di urea avente una concentrazione di urea predeterminata e un pH predeterminato, in particolare, detta concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,1 moli/litro e 3 moli/litro, più in particolare, detta concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,5 e 2,0, ancor più in particolare, detta concentrazione di urea à ̈ compresa tra 0,7 moli/litro e 1,4 moli/litro, in particolare, detto pH à ̈ compreso tra 4,5 e 7, più in particolare, detto pH à ̈ compreso tra 5,0 e 6,0, più in particolare il pH à ̈ compreso tra 5,1 e 5,5.
  25. 25. Un kit (20,40,50) come da rivendicazione 22, in cui detti derivati ureici sono scelti tra tiourea, tetraetil urea, tetrametil urea e idantoina.
  26. 26. Un kit (20,40,50) come da rivendicazione 22, in cui detto contenitore di estrazione (22) Ã ̈ configurato per resistere ad una temperatura di estrazione, in articolare 100°C, per un tempo predeterminato, in particolare 20 minuti e/o per resistere a microonde di potenza predeterminata, in particolare compresa tra 150 W e 750 W, per un tempo predeterminato, in particolare 20 secondi.
  27. 27. Un kit (60,70) per verificare la presenza di una droga d’abuso e/o un metabolita di una droga d’abuso in un materiale cheratinico, detto kit comprendendo: − un kit (20,40,50) per estrarre detta droga d’abuso o detto metabolita da detto materiale cheratinico (19) secondo una delle rivendicazioni dalla 22 alla 26; − un saggio immunocromatografico rapido (10) provvisto di mezzi di alimentazione (12) di detto estratto (28).
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