ITRM20000040A1 - Terreno di coltura per la coltura di lactobacillus clearans e metodo per la conservazione di detto ceppo batterico. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE INDUSTRIALE dal titolo: "TERRENO DI COLTURA PER LA COLTURA DI LACTOBACILLUS CLEARANS E METODO PER LA CONSERVAZIONE DI DETTO CEPPO BATTERICO"

DESCRIZIONE

FONDAMENTO DELL'INVENZIONE

1.-.Campo dell'invenzione

La presente invenzione riguarda un terreno di coltura che è idoneo per la coltura di Lactobacillus clearans, che è stato isolato e prescelto dagli inventori, e un metodo per la conservazione del Lactobacillus clearans.

2. Descrizione della tecnica correlata

Il ciclo del mondo della natura è quello di creazione e disgregazione, dal quale non è risparmiata la sostanza biologica. Paludi invece che inondano fanghiglia prodotta dalla disgregazione di proteine rilasciate nel mondo della natura, eventualmente divengono purificate, consentendo che la terra rimanga bellissima nel suo proprio aspetto sin da tempo remotissimo. I meccanismi mediante i quali questo avviene sono rimasti per lungo tempo sconosciuti, ma sono ora noti per coinvolgere primariamente il comportamento di microorganismi, che portano allo sviluppo contemporaneo di vari sistemi di purificazione, includendo procedimenti di fango attivato e la loro applicazione nel trattamento di impianti per acqua di scarico biologica e per acqua di scarico industriale. Data la complessità riguardante la questione di quale tipo dì proprietà caratterizzano i batteri coinvolti in tali purificazioni non è da meravigliarsi che siano necessarie ulteriori analisi specializzata e convaiidamento.

Un'ampia e diversa schiera di sostanze sono lo scopo di questa purificazione, e in ultima analisi sarà impossibile saggiare tutte queste. La nostra attenzione è stata di conseguenza focalizzata su sostanze odorose (la massima parte delle quali sono prodotti di putrefazione e sono dannosi) che sono facilmente e rapidamente determinabili dall'odore, e sono ampiamente classificate in composti odorosi di zolfo, composti odorosi di azoto e composti odorosi di carbonio. Dopo considerevoli ricerche, studi sui composti odorosi di basso peso molecolare, vale a dire composti odorosi di zolfo, quali solfuro di zolfo e solfuro di metile, quali solfuro di zolfo e solfuro di metile, composti odorosi di azoto, quali ammoniaca, indolo e scatolo, e composti odorosi di carbonio quali acido acetico e acido butirrico, hanno mostrato in conclusione che gli obiettivi erano stati sufficientemente raggiunti, consentendo che venga fatto sensazionale progresso nella ricerca per purificazione e deodorizzazione. Cioè, batteri clearance catturano queste sostanze odorose come cibo, non come veleno e le usano come componenti cellulari per se stessi oppure come una sorgente dì energia, mentre i batteri che hanno azione particolarmente potente hanno una capacità deodorante. Attraverso il mondo della natura è stato trovato un gran numero di batteri aventi tali caratteristiche e proliferano dappertutto nel lavoro di purificazione al quale essi sono massimamente adatti. I nostri veri corpi sono un microcosmo, il canale enterico in particolare essendo un organo direttamente collegato al mondo esterno come parte dell'ambiente naturale esso stesso. Non vi sarebbe meraviglia quindi che "gli esperti" nella purificazione esistono negli intestini .

Sulla base delle scoperte di cui sopra, gli inventori hanno studiato batteri clearance enterici tra i batteri non patogeni in grado di vivere negli intestini. Cioè gli inventori hanno scelto il genere Lactobacillus, che esiste ampiamente nel mondo della natura, dall'interno del corpo umano quale il canale enterico, la bocca e la vagina, a erbe, foglie di alberi, frutti agricoli, prodotti alimentari fermentati, terreno e detriti di fogna. Come conseguenza, essi hanno accertato l'esistenza di un gruppo precedentemente.-. sconosciuto appartenente al genere Lactobacillus in grado_ di manifestare una potente capacità di purificazione negli intestini. Questi batteri includono un campo considerevolmente ampio di specie correntemente classificate come appartenenti al genere Lactobacillus quali L. casei, L. salivarius, L. brevis, e L.plantarum, e sono riportati collettivamente come Lactobacillus clearans.

Il Lactobacillus clearans, che sono nuovi lactobacilli in grado di ridurre il solfuro di sodio e l'ammoniaca (domanda di brevetto giapponese esaminata (Kokoku) 4-632), sono batteri idonei che manifestano una potente capacità di purificazione negli intestini attraverso la loro capacità di ridurre il solfuro di sodio, solfuro d'ammonio, metilmercaptano , etilmercaptano, dimetilsolfuro, acetaldeide, scatolo, indolo, metilammina, etilammina, dietilcammina, trietilammina e simili. Gli inventori hanno così trovato queste specie del genere Lactobacillus in grado di manifestare una potente capacità di purificazione negli intestini, hanno scoperto come conseguenza di ricerche batteriologiche che queste specie avevano funzioni del tutto nuove e che è stato assegnato un brevetto per queste specie (1714431). E' divenuto evidente che Lactobacillus clearans non riduce soltanto sostanze dannose odorifere negli intestini, ma sono anche un gruppo che forma flora intestinale, il quale sintetizza vitamine e amminoacidi e regola la crescita di batteri estrinseci, aventi un effetto bruttissimo su gruppi quali batteri che possono venire considerati batteri benefici aventi azione -che è buona per il corpo umano quale azione immunoattivante , tipicamente gruppi appartenenti al genere Lactobacillus e al genere Bifidobacterium, e batteri che al contrario possono essere considerati deleteri a causa della loro natura dannosa e patogena, tipicamente gruppi appartenenti a Veillonella e Clostridium, quali Welchii, e inoltre regolano la crescita di batteri patogeni, riducono la loro tossicità ecc. La tabella 1 mostra le differenze funzionali tra Lactobacillus clearans e le specie convenzionalmente note nel genere Lactobacillus .

Tabella 1

Confronto di funzioni tra Lactobacillus clearans e specie convenzionali del genere Lactobacillus

li

poi, m-

o e

¬

Nella considerazione perchè Lactobacillus

clearans era in grado di venire prodotto, può

venire desunto quanto segue. Cioè, la terra fusa

nata 4.600.000.000 anni fa, si è raffreddata

producendo vapore acqueo che ha formato i primi

mari . Fino ad allora tuttavia non vi era ancora

ossigeno e il mare era composto di acqua caldissima acida contenente zolfo, ferro e simili prodotti dal magma. Sostanze organiche quali amminoacidi e acidi nucleici sono state sintetizzate poco alla volta mediante reazioni chimiche nei mari, le quali si aggregavano e condensavano nella forma di goccioline oleose. Infine, le forme dì vita nascevano da queste goccioline oleose e continuavano a crescere, consumando materiali organici che si accumulavano nel mare fino ai margini della estinzione. Tuttavia, tra queste forme di vita apparivano batteri anaerobici in grado di impiegare materiali organici quali lo zolfo disciolto nel mare per acquistare energia, e di sintetizzare materiali organici dal diossido di carbonio. Questi batteri anaerobili si sono evoluti per lunghi periodi di tempo differenziandosi nei primi batteri fotosintetici che impiegavano energia per rilasciare ossigeno, e i predecessori anziani del genere Lactobacillus che esiste oggi. Questi giocavano un ruolo attivo nella purificazione delle sostanze dannose odorose dal magma grazie a cui la massima parte delle sostanze dannose veniva fatta precipitare sul fondo dell'oceano, mentre l'ossigeno quindi aumentava, consentendo un ambiente ospitale perchè la vita continuasse fino a prosperare gradualmente e formare i blocchi di base per il successivo fenomeno esplosivo di vita. Un giorno durante questo processo, la massima parte del Lactobacillus soccombeva nella lotta per la crescita con altri batteri che si erano acclimatati e si erano adattati al rigoroso ambiente dell'immenso mondo della natura, evitando di dimorare nelle zone ricche di nutrimento sature con la esistenza di carboidrati, amminoacidi, vitamine e simili, e verso le zone con un ambiente più blando, più costante, dopo di che il loro potere intrinseco di purificazione, cioè, il potere di purificazione contro composti di zolfo odorosi e dannosi e il potere di purificazione contro composti di azoto odorosi e dannosi, veniva gradualmente perduto. Il genere di Lactobacillus tuttavia aveva mantenuto il potere di utilizzare composti di carbonio odorosi fino al giorno attuale .

Sebbene come metodi per conservare Lactobacillus clearans possono venire impiegati vari metodi ben noti quali liofilizzazione, conservazione all'ultrafreddo, oppure metodi liquidi, umidi, semisecchi e secchi o simili, è massimamente importante impedire la perdita della capacità caratteristica di Lactobacillus clearans di ridurre le sostanze odorose e dannose durante lo stoccaggio, e il successivo problema massimamente importante è di assicurare più lunga vitalità conservando nel contempo questa capacità. Le ricerche da parte degli inventori hanno rivelato chiaramente la necessità di considerazione speciale a questo scopo. Cioè data la presenza di sostanze che provocano la rapida diminuzione del titolo batterico durante la sottocultura batterica, non solo il titolo diminuirà gradualmente ma la sua propria sopravvivenza sarà minacciata, indipendentemente da quale metodo di conservazione viene impiegato.

La liofilizzazione è attualmente il metodo predominante di conservazione dei batteri, e Lactobacillus non è una eccezione. Sebbene la liofilizzazione sia stata impiegata per tutti i prodotti che necessitano venire stoccati per lunghi periodi di tempo quali antiflatulenti oppure ceppi di yogurt, la conservabilità di Lactobacillus non è fondamentalmente considerata per essere molto buona. In realtà tentativi di raccogliere e fare rivivere cellule liofilizzate di Lactobacillus commercialmente disponibili sia in casa che fuori, veniva meno al raggiungimento del conteggio di cellule vitali indicato virtualmente in tutti i prodotti, senza considerare la data di termine, tra i quali vi erano alcuni prodotti in cui non sono state trovate cellule vitali. Questo era il caso, nonostante la perizia e i risultati delle ricerche da parte dei fabbricanti. Studi da parte degli inventori su Lactobacillus clearans hanno rivelato che non soltanto il conteggio delle cellule vitali diminuiva ad uno stadio preliminare in presenza di conservanti comunemente impiegati, essi anche portavano ad una riduzione nel titolo. Il Lactobacillus clearans può venire considerato per essere i discendenti, oppure i cosiddetti ceppi mutanti atavici, che erano sopravvissufi.,fino al giorno attuale con la continua successione di azione purificatrice, che i loro precursori tengono a tutti i costi contro composti odorosi di zolfo, composti di azoto e composti di carbonio. E' impossibile predirre quale destino capiterà al delicato Lactobacillus clearans che è ora in uno stato di flusso tra il Lactobacillus precursore e contemporaneo, sotto assistenza umana. Problemi differenti sono demandati per i terreni di coltura impiegati per la coltura di tali batteri e i conservanti impiegati per conservarli. In realtà, nelle prove su questi batteri, il titolo diminuiva sia durante la sottocultura che durante lo stoccaggio. Come tale, i problemi massimi sono quali condizioni di sottocultura consentiranno che il titolo di potenza rimanga inalterato e quali condizioni di stoccaggio consentiranno che il titolo di potenza rimanga inalterato.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Come conseguenza di estere ricerche per porre rimedio a questi problemi, gli inventori hanno sviluppato un terreno di coltura in grado di sostenere il titolo di Lactobacillus clearans nella riduzione del solfuro di sodio ed ammoniaca, e un metodo di conservazione. Cioè, la presente invenzione è un terreno di coltura per la coltura di Lactobacillus clearans, che comprende l'addizione di almeno uno oppure più di solfuro di sodio e ammoniaca acquosa, in maniera tale che, durante la coltura del Lactobacillus clearans, almeno uno oppure più di solfuro di sodio ed ammoniaca venga ridotto dal Lactobacillus clearans mediante la coltura di 24 ore, ed è un terreno di coltura che comprende preferibilmente l'addizione di solfuro di sodio in una concentrazione di 500 ppm, in cui solfuro di sodio viene ridotto del 10% oppure più dalla coltura di 24 ore durante la coltura di Lactobacillus clearans, e preferibilmente che comprende l'addizione di ammoniaca acquosa in una concentrazione di 500 ppm, in cui l'ammoniaca viene ridotta del 10% oppure più mediante 24 ore di coltura durante la coltura del Lactobacillus clearans. Il terreno di coltura comprende preferibilmente l'addizione di almeno uno oppure più di composti odorosi di zolfo, composti odorosi di azoto e composti odorosi di carbonio, in cui il composto odoroso di zolfo è preferibilmente almeno uno oppure più di solfuro di sodio, solfuro di idrogen, solfuro di ammonio, metilmercaptano, etilmercaptano, dimetilmercaptano, difenilsolfuro, difenildisolfuro, dietilsolfuro, dibutilsolfuro e suoi derivati, Il composto odoroso di azoto è prefeibilmente almeno uno oppure più di ammoniaca, scatolo, indolo, acetanilide, metilammina, dimetilammina, dietilammina, trietilammina, e suoi derivati, e il composto odoroso di carbonio è preferibilmente almeno uno oppure più di acido formico, acido acetico, acido propionico, acido butirrico, formaldeide, acetaldeide, propionaldeide, crotonaldeide , fenolo, alcool butilico, alcool amilico e suoi derivati. Il terreno di coltura comprende preferibilmente l'addizione di almeno uno oppure più amminoacido contenente zolfo, acido glutammico, lisina ed acido aspartico come un amminoacido, preferibilmente l'addizione di almeno uno oppure più di Vitamina C, Vitamina E, Vitamina BI2, pantotenato di calcio, acido folico, e nicotinammide come una vitamina, preferibilmente l'addizione di almeno uno oppure più di manganese, zinco, magnesio e molibdeno, come un componente minerale, e preferibilmente l'addizione di almeno uno oppure blu di clorella CGF, latte di soia e polvere biliare.

Il secondo metodo della presente invenzione è un metodo per la conservazione di Lactobacillus clearans che comprende la presenza di almeno uno oppure più di amminoacido contenente zolfo, ovalbumina, polvere biliare, trealosio, raffinosio, cellule di lievito inseribili, clorella, crusca di riso, crusca, latte di soia e succo di carota come un conservante attorno al Lactobacillus clearans durante la conservazione del Lactobacillus clearans, e comprende preferibilmente in aggiunta al conservante sopra menzionato l'addizione di almeno uno oppure più di acido glutammico, lisina, acido aspartico, Vitamina C, Vitamina E, Vitamina B12, pantotenato di calcio, acido folico, nicotinammide , manganese, zinco, magnesio, molibdeno, solfuro di sodio, solfuro di idrogeno, solfuro di ammonio, metilmercaptano, etilmer captano, dimetilmercaptano, dimetilsolfuro, dimetildisolfuro, dietilsolfuro , dibutilsolfuro, ammoniaca, scatolo, indolo, acetanilide, metilammina, dimetilammina, dietilammina, trietilammina , acido formico, acido acetico, acido propionico, acido butirrico, formaldeide, acetaldedie, propionaldeide, crotonaldeide, fenolo, alcool butilico, alcool amilico e loro derivati attorno al Lactobacillus clearans, ed inoltre comprende preferibilmente la presenza di almeno uno oppure più di latte scremato in polvere derivato da animali, ovalbumina, lattosio, polvere di estratto di fegato e siero, nonché almeno uno oppure più di siero di latte di soia derivato da vegetali, trealosio, raffinosio, amido, clorella, clorella CGF, crusca di riso, crusca, succo di alfaalfa, succo di trifoglio, estratto di germi di grano, latte di soia, succo di pomodoro, succo di carota, succo di pompeimo, polvere di aloe, polvere di te verde, e cellule di lievito inseribili come un conservante, e in aggiunta ai conservanti sopra menzionati, l'addizione di almeno uno oppure più di acido glutammico, lisina, acido aspartico, Vitamina C, Vitamina E, Vitamina BI2, pantotenato .di calcio, acido folico, nicotinammide, manganese, zinco, magnesio, molibdeno, solfuro di sodio, solfuro di idrogeno, solfuro di ammonio,metilmercaptano, etilmercaptano, dimetilmercaptano, dimetilsolfuro, dimetildisolfuro, dietilsolfuro, dibutilsolfuro, ammoniaca, scatolo, acetanilide, metilammina, dimetilammina, dietilammina, trietilammina, acido formico, acido acetico, acido propionico, acido butirrico, formaldeide, acetaldeide, propionaldeide, crotonaldeide , fenolo, alcool butilico, alcool amilico e loro derivati attorno al Lactobacillus clearans. Aggiuntivamente, il metodo per conservare Lactobacillus clearans può comprendere qualsiasi metodo di liofilizzazione, conservazione all'ultrafreddo, oppure metodi liquidi, umidi, semisecchi oppure secchi.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

La figura 1 è una illustrazione di coltura con il terreno di coltura per Lactobacillus clearans e la prova del titolo in esso.

DESCRIZIONE DELLE REALIZZAZIONI PREFERITE

I Lactobacillus clearans riportati nella presente invenzione sono ceppi nuovi del genere Lactobacillus clearans.

Questi ceppi di Lactobacillus sono stati depositati nel National Institute of Bioscience and Human -Technology Agency of Industriai Science and Technology (NIBH) di Ibaraki (Giappone) il 16 dicembre, 1999, con i seguenti numeri di deposito e nomi dei microorganismi:

FERM BP-6971 → BHPH-L-1

FERM BP-6972 → BHPH-L-2

FERM BP-6973 → BHPH-L-3.

I Lactobacillus clearans hanno le seguenti caratteristiche biochimiche (1), (2), (3), e (4). Per conoscenza, essi sono ceppi di Lactobacillus: (1) i quali possono ridurre sia Na2S.9H20 e NH4OH quando 0,5 g di Na2S.9H20 e, oppure 0,5 mL di NH4OH viene oppure vengono addizionati a 5 g di estratto di carne, 5 g di peptone, 1 g di glucosio, 1 g di CaC03 e 1 litro di acqua (pH neutro); (2) i quali non mostrano azione che favorisce la crescita anche quando 0,5 g di NaS.9H20 e, oppure 0,5 mL di NH4OH viene oppure vengono addizionati durante la fase di crescita logaritmica durante la coltura dei batteri nel terreno che comprende 1 g di casamìno acido e vitamine (A: 900 IU; Bx: 1 mg; B2: 1 mg; B6: 1 mg; B12 : 5 γ; nicotinammide: 16 mg; pantotenato di calcio: 8 mg; C 64 mg; D2: 120 IU) in terreno di Stephanson-Whethan (abbreviato come S-W; 1 g di KH2P04, 0,7 g MgS04.7H20; 1 g di NaCl; 4 g di (NH4)2HP04; 0,03 g di FeS04.H20; 5 g di glucosio); (3) ceppi naturali isolati mostrano resistenza più forte dei latobaciili convenzionalmente noti e resistenza più debole del Lactobacillus clearans, contro Na2S.9H20; e (4) i quali sono grampositivi, bastoncini, non mobili, di catalasi negativa, con nessuna riduzione di nitrati, nessuna decomposizione di gelatina, nessuna formazione dì indolo oppure di solfuro di idrogeno, ed elevata capacità di formare acido lattico da glucosio e lattosio, nonché crescita accelerata con l'addizione di acido acetico (domanda di brevetto giapponese esaminata (Kokoku) 4-632).

_I vari terreni dati nelle tabelle 2, 3, 4, 5 e 6, quali vari tipi di terreni classificati in terreno nutritivo, terreno moderatamente nutritivo, e terreno altamente nutritivo, possono venire impiegati per la sottocoltura di Lactobacillus clearans.

(Tabella 2 )

Composizione (1) di terreno di sottocoltura (composizione in 1 L) terreno di Stephanson-Wetham

(Tabella 3)

Composizione (2) di terreno di sottocoltura (composizione in 1 litro)

Terreno MRS

(Tabella 4)

Composizione (3) di terreno di sottocoltura (composizione in 1 litro)

Terreno scarsamente nutritivo

Terreno Composizione

a-1 1 g di casamino acido addizionato al terreno di Stephanson-Wetham

a-2 1 g di estratto di lievito

addizionato a terreno di

Stephanson-Wetham

a-3 1 g di casamino acido

0,1 g di vitamina1) addizionato al terreno di Stephanson-Wetham

include Vitamina A: 900 IU; Vitamina Bi : 1 mg; Vitamina B2: 1 mg, Vitamina BI2: 5 μg; nicotinammide : 16 mg: pantotenato di calcio: 8 mg; Vitamina C: 16 mg; Vitamina D2: 120 IU in 1 g:

(Tabella 5)

Composizione (4) di terreno di sottocoltura (composizione in 1 litro)

Terreno moderatamente nutritivo

Terreno Composizione

b-1 1 g di casamino acido

0,1 g di vitamina 11

5 g di latte scremato addizionato al terreno di Stephanson-Wetham

b-2 5 g di estratto di carne

5 g di peptone

5 g di glucosio

b-3 1 g di terreno MRS diluito a metà

include Vitamina A: 900 IU; Vitamina Bx : 1 mg; Vitamina B2: 1 mg. Vitamina Bi2: 5 ^g; nicotinammide: 16 mg: pantotenato di calcio: 8 mg; Vitamina C: 16 mg; Vitamina D2: 120 IU in 1 g=

(Tabella 6)

Composizione (5) di terreno di sottocoltura (composizione in 1 litro)

Terreno altamente nutritivo

Terreno Composizione

c-1 terreno MRS

c-2 100 g di latte scremato

c-3 30 g di latte scremato addizionato a terreno MRS

Il metodo per saggiare il titolo di Lactobacillus clearans viene descritto in appresso; quelli .che seguono sono esempi delle funzioni che hanno questi batteri: (1) la capacità di ridurre sostanze odorose dannose quali il composto di zolfo solfuro di sodio e il composto di azoto ammoniaca; (2) la capacità di migliorare la flora intestinale, cioè la capacità di aumentare i batteri benefici quali Bifidobacterium e Lactobacillus, e per ridurre marcatamente batteri dannosi quali Veillonella e Clostridium, incluso Welchii; e (3) la capacità di sopprimere la crescita e la tossicità di infezioni intestinali da parte di 0102-1985. Il Lactobacillus clearans che viene saggiato è del tutto diverso, la Tabella 7 dà la percentuale di riduzione in solfuro di sodio ed ammoniaca determinata quando era elevato il titolo dei tre ceppi tipici, vale a dire BHPH-L-1 (FERM P-17149, FERM BP-6971), BHPH-L-2 (FERM P-17148, FERM BP-6972), e BHPH-L-3 (FERM P-17150, FERM BP-6973). (Tabella 7)

Percentuale di riduzione in solfuro di sodio ed ammoniaca da parte di Lactobacillus clearans con elevato titolo

Il terreno di coltura base ha idealmente crescita eccellente e minima riduzione nel titolo. Questo è il punto più importante relativo alla resa di batteri dal punto di vista della giacenza pratica della coltura di massa (aumento proporzionale) . Con la ricerca di un terreno di coltura ideale, noi abbiamo trovato con successo la chiave. Cioè, come indicato nella tabella 8, diventa evidente che quando la coltura è stata trattata con l'addizione di solfuro di sodio oppure ammoniaca al terreno di base, era essenziale che le due sostanze addizionate fossero ridotte in una certa estensione nelle 24 ore, con sottocolture nei terreni senza che qualsiasi di tale riduzione desse come risultato una considerevole perdita del titolo, rendendole in ultima analisi non utilizzabili. Cioè, la tabella 8 mostra che nei casi in cui 0,5 g di solfuro di sodio e 0,5 mL di ammoniaca acquosa sono stati addizionati ad 1 litro di terreni, le sostanze odorose che servono come componenti nutritivi intrinseci, quali sostanze odorose di zolfo, azoto e carbonio, non venivano impiegate come sorgenti nutritive in terreni nutritivi eccessivamente elevati, e che venivano impiegate soltanto sorgenti nutritive facilmente utilizzabili, dando come risultato quantità maggiori di batteri, ma con la graduale perdita e in ultima analisi la disattivazione delle caratteristiche batteriche. Qui, ammoniaca acquosa si riferisce ad ammoniaca acquosa reagente, quale soluzione acquosa contenente 25,0 fino a 27,9 peso/volume % di ammoniaca.

(Tabella 8)

Percentuale di riduzione in solfuro di sodio ed ammoniaca in terreni di coltura ai quali essi sono stati addizionati per Lactobacillus clearans

I più importanti amminoacidi che costituiscono le cellule batteriche oppure gli enzimi sono stati studiati con il tipo per loro effetti su Lactobacillus clearans. E' stato rivelato che l'addizione di amminoacidi specifici, vale a dire amminoacidi contenenti zolfo quali cistina metionica, cisteina e taurina, nonché acido glutammico, lisina ed acido aspartico,. erano estremamente efficaci quando addizionati durante la sottocoltura, mentre l'addizione di prolina, tirosina, e simili portava con sé una rapida diminuzione del titolo. Cioè, essi potevano largamente classificati in tre gruppi: certi tipi di amminoacidi che aiutavano a trattenere il titolo di Lactobacillus clearans, altri tipi che avevano effetto inferiore, e ancora altri che portavano con sé una riduzione significativa nel titolo. Questo risolveva con successo la contraddizione negli esperimenti convenzionali, specificatamente, la contraddizione che se un agente nutritivo è stato impiegato in uno sforzo per facilitare la crescita di batteri, l'agente nutritivo sarà eccellente per i batteri, ancora le caratteristiche che si distinguono della riduzione delle sostanze dannose sarà perduta. Di conseguenza, è necessario far rilevare fortemente che gli amminoacidi efficaci sopra menzionati dovevano venire mescolati con i composti odorosi di zolfo, azoto e carbonio sopra menzionati per impedire che il titolo diminuisca ulteriormente. Noi abbiamo cercato sostanze in grado di tale aumento oppure potenziamento e abbiamo condotto estesi studi. Come conseguenza, noi abbiamo scoperto che Vitamina C, Vitamina E, Vitamina B12, pantotenato di calcio,acido folico, nìcotinammide e simili erano vitamine efficaci. E' divenuto chiaro che queste vitamine sono profondamente coinvolte nella produzione di enzimi che riducono sostanze odorose quali composti odorosi di zolfo, azoto e carbonio.

.E.'-,stato anche scoperto che manganese, zinco, magnesio, molibdeno e simili sono minerali efficaci. E' divenuto chiaro che questi minerali sono profondamente coinvolti nelle attività degli enzimi che riducono sostanze odorose quali composti odorosi di zolfo, azoto e carbonio.

Questo è stato confermato coltivando Lactobacillus clearans in terreni contenenti le vitamine e minerali efficaci sopra menzionati, e asportando successivamente i batteri, e addizionando poi semplicemente una porzione del brodo di coltura risultante ad un liquido contenente una sostanza odorosa quale un composto odoroso di zolfo, azoto oppure carbonio, dando come risultato la riduzione di tali sostanze odorose.

E' stato anche scoperto che clorella CGF, di latte di soia, polvere biliare e simili erano sostanze efficaci per mantenere il titolo di Lactobacìllus clearans. In aggiunta allo studio dei componenti di coltura, è anche preferibile sottoporre a sottocoltura batteri nella fase di crescita logaritmica in terreni successivi durante la sottocoltura oppure crescita in uno sforzo di impedire qualsiasi riduzione del titolo. E1 anche preferibile evitare denaturazione con calore nei componenti del terreno durante la produzione e sterilizzazione del terreno.

E' stato poi studiato un metodo di conservazione, dando come risultato la conclusione che l'argomento più importante è di produrre dapprima un conservante favorevole. Conservanti comunemente impiegati al momento nei lactobacilli quali lattosio, vari tipi di amido e latte scremato (1) sono facilmente da trattare (2) non sono costosi, (3) possono venire somministrati direttamente nel corpo vivente, e non producono disfunzioni quando assunti. Per questi ed altri motivi vi è una forte tendenza ad impiegarli primariamente per convenienza umana anche se essi sono sia favorevoli che instabili per lactobacilli. Al momento, essi possono assumere la forma di capsule enteriche, noi abbiamo deciso di rivedere queste circostanze dal punto di vista di lactobacilli, senza assumere priorità sulla parte degli esseri umani, come un modo per attirare l'attenzione ai lactobacilli. Così un'ampia varietà di sostanze è stata saggiata come conservanti, dalle sostanze a base di proteine comunemente impiegate nelle colture batteriche, ai compositi di varie sostanze animali e vegetali e saccaridi, per un'ampia varietà di'ceppi batterici, includendo i tre ceppi tipici di Lactobacillus clearans, cioè BHPH-L-1 (FERM P-17149, FERM BP-6971), BHPH-L-2 (FERM P-17148, FERM BP-6972), e BHPH-L-3 (FERM P-17150, FERM BP-6973). Le quantità in cui i conservanti vengono addizionati variano ampiamente in dipendenza dal tipo del conservante, con un ampio intervallo di idoneità, e così non possono venire determinate come una materia di principio assoluto, ma generalmente oscillano, in termini del rapporto in peso dei prodotti solidi conservanti, da 1 a 500 volte quello delle cellule batteriche centrifugate.

Gli amidi riportati nella presente invenzione non sono limitati a qualsiasi particolare materiale di partenza, ma esempi includono amido solubile, amido di grano, amido di patata e amido di patata dolce. Le cellule di lievito insensibili riportate nella presente invenzione si riferiscono a lievito in uno stato non vitale. Un esempio è lievito di Baker, può venire reso inattivo in 10 minuti di trattamento con acqua calda a 100°C e poi essiccato. Dopo essere stato reso inattivo, tuttavia, il lievito di Baker che può essere o in uno stato secco oppure umido. Polvere di estratto di lievito si riferisce ad estratto di lievito che è stato essiccato e prodotto in polvere. Il metodo di essiccamento non è particolarmente limitato.

ESEMPI I Lactobacillus clearans sono stati sottoposti a sottocoltura nei vari terreni dati nele tabelle 2, 3, 4, 5 e 6, terreni per saggiare il titolo sono stati inoculati in ciascuno stadio della sottocoltura, e il titolo è stato saggiato dalla porima fino alla nona generazione. La procedura viene illustrata nella figura 1, i risultati del saggio sul titolo sono dati nella tabella 9, e la tabella 10 riassume tutti i ceppi. Il titolo è rappresentato dai cerchi concentrici per indicare virtualmente nessuna riduzione nel titolo, mediante un cerchio per indicare una lieve diminuzione nel, ma sufficiente ritenzione del titolo, mediante un triangolo per indicare una riduzione graduale nel titolo che non è idonea per scopi pratici, e mediante una "x" per indicare una perdita considerevole di titolo. Fondamentalmente, una diminuzione nel titolo è stata notata su tutti i terreni, aumentando nell'ordine da terreni scarsamente nutritivi a terreni moderatamente, a terreni altamente nutritivi. Le differenze aumentano rapidamente con ulteriori sottocolture. Tabella 9

Correlazione tra il numero di sottocoltiire e il titolo di Lactobacillus clearans in vari terreni

1 ) composti odorosi di zolfo 7) composti odorosi di azoto (Tabella 10)

Coltura di Lactobacillus clearans e correlazione generale delle sottocolture e titolo.

Γ

In considerazione delle loro caratteristiche, i Lactobacillus clearans sono stati sottoposti a sottocoltura con l'addizione delle sostanze odorose putrefacenti enteriche che contengono composti odorosi di zolfo, azoto e carbonio, addizionate a terreni di coltura scarsamente, moderatamente ed elevatamente nutritivi, i batteri sono stati trapiantati a terreni per saggiare il titolo, e il titolo è stato saggiato, con i risultati dati nella tabella 11. Qui, i componenti F sono quelli che comprendono 0,2 g di solfuro di metile, 0,3 g di scatolo, e 1 g di acido butirrico per litro di terreno. Diversamente dai componenti F, sostanze odorose putrefacenti, che comprendono composti odorosi di zolfo, azoto e carbonio, quali solfuro di sodio, mercaptano, indolo, acido acetico e acido propionico, potevano venire selezionati per il saggio senza grosse differenze nei risultati.

(Tabella 11)

Correlazione tra numero di sottocolture e titolo di Lactobacillus clearans in terreno contenente componenti F.

! 1 campasti odorasi di zolfo 2) composti odorosi di azoto La tabella 11 mostra che l'addizione di componenti F al terreno di base come la sottocoltura e terreni di crescita era importante per impedire che il titolo di Lactobacillus clearans diminuisse, questo essendo particolarmente vero quando il terreno di base era terreni altamente nutritivi. Era anche chiaro che vi era una riduzione relativamente minore nel titolo mediante la terza generazione di sottocoltura quando venivano addizionati i componenti F. Tuttavia, dopo di che il titolo diminuiva rapidamente .

Nei termini di conservanti, la tabella 12 mostra le variazioni nella vitalità di Lactobacillus clearans quando sono stati addizionati conservanti a base di proteinaamminoacidi. La tabella 13 mostra le variazioni nella vitalità di Lactobacillus clearans quando sono stati addizionati saccaridi e conservanti complessi di proteina di origine animale vitaminaminerale, e la tabella 14 mostra le variazioni nella vitalità di Lactobacillus clearans quando vengono addizionati conservanti ■complessi di proteina vegetale-vitamina-minerale altri consevanti. Qui il succo di alfaalfa e il succo di trifoglio si riferiscono a liquidi che sono stati prodotti addizionando dieci volte acqua alla erba alfaalfa oppure all'erba di trifoglio per produrre un succo, questi essendo impiegati come succo di alfaalfa oppure succo di trifoglio rispettivamente. La quantità in cui i conservanti vengono addizionate sono espresse in termini di rapporto in peso del conservante relativo al peso delle cellule vitali. Ad esempio una quantità di 10 indica che il conservante è stato addizionato in una quantità dieci volte quella della cellule vitali. La vitalità di Lactobacillus clearans viene espressa come una percentuale, dove 100% è il conteggio di cellule vitali immediatamente dopo la liofilizzazione. La vitalità durante la liofilizzazione viene indicata come cerchi concentrici quando la vitalità è maggiore di 90%, come due cerchi concentrici ad un cerchio quando il regime è 80 fino a 90%, come un cerchio quando il regime è 60 fino a 80%, come un quadrato quando il regime è 40 fino a 60%, come un triangolo quando il regime è 20 fino a 40%, e come una "x" quando il regime è inferiore a 20%. Le variazioni nel titolo di Lactobacillus clearans durante lo stoccaggio sono indicate come + quando il titolo è stato mantenuto ad un livello elevato, come quando il titolo diminuiva leggermente, con ± quando il titolo diminuiva in maniera chiara, con - quando il titolo diminuiva considerevolmente, e come - -quando il titolo diminuiva rapidamente.

(Tabella 12)

Variazioni nella vitalità di Lactobacillus clearans con l'impiego di conservanti a base di proteinaamminoacido.

Espresso come rapporto in peso del consevante relativo al peso delle cellule vitali (Tabella 13)

Variazioni nella vitalità di Lactobacillus clearans con l'impiego di saccaridi e conservanti complessi di proteina su base animale-vitamina-minerale

* Espressi come rapporto in peso di conservante relativo al peso di cellule vitali (Tabella 14)

Variazione nella vitalità di Lactobacillus clearans con l'impiego di complessi di proteine vegetali. Vitamina minerale ed altri.

Dalle tabelle 12, 13, e 14 è evidente che l'impiego di conservanti che forniscono elevata vitalità durante la liofilizzazione di Lactobacillus clearans, risultava in buona vitalità anche durante lo stoccaggio, e che allo stesso momento venivano ottenute riduzioni più basse nel titolo. Cioè, determinando esattamente la vitalità durante la liofilizzazione, era possibile ottenere sensazionale progresso nella successiva ricerca con il rapido studio delle condizioni, alla scelta dei conservanti alla temperatura di precongelamento e liofilizzazione, tempo di essiccamento e simili, senza prendere moltissimo tempo. Come conseguenza, diveniva chiaro che metodi comunemente impiegati per Lactobacillus convenzionalmente noti, erano idonei per condizioni quali la temperatura di precongelamento e liofilizzazione e il tempo di essiccamento durante il trattamento di Lactobacillus clearans, ma che la efficacia del conservante era il fattore più_ importante per il mantenimento della vitalità e per il titolo.

Sono stati esclusi i conservanti senza effetti conservanti quando impiegati di per sè, ed i conservanti che rimangono sono stati studiati in varie combinazioni. Alcuni dei risultati sono dati nelle tabelle 15, 16 e 17. Qui, le quantità in cui i conservanti vengono addizionati sono espresse come il rapporto in peso del conservante relativo al peso delle cellule vitali. Ad esempio, una quantità di 10 indica che il conservante è stato addizionato in una quantità dieci volte quella delle cellule vitali. La vitalità di Lactobacillus clearans durante la liofilizzazione è indicata come due cerchi concentrici quando la vitalità è maggiore di 90%, come due cerchi concentrici su un cerchio quando il regime è 80 fino a 90%, come un cerchio quando il regime è 60 fino a 80%, come un quadrato quando il regime è 40 fino a 60%, come un triangolo quando il regime è 20 fino a 40%, come una "x" quando il regime è inferiore a 20%. Un confronto delle tabelle 13 e 14 rivela che i conservanti procuravano migliore vitalità quando impiegati in combinazione che quando impiegati da soli. L'impiego combinato di conservanti derivati da animali con tipi derivati da piante dava come risultato una buona vitalità durante la lipofilizzazione, naturalmente, ma anche migliori effetti durante il successivo stoccaggio. I risultati sono dati nella tabella 18, dove le variazioni nel titolo di Lactobacillus clearans durante lo stoccaggio sono indicate con + quando il titolo è stato mantenuto ad un livello elevato, come quando il titolo diminuiva leggermente, come ± quando il titolo diminuiva chiaramente, come -quando il titolo diminuiva in maniera considerevole, e come - - quando il titolo diminuiva rapidamente.

(Tabella 17)

Variazioni nella vitalità di Lactobacillus clearans con combinazioni di quattro fino a cinque tipi di conservanti

Espressa come rapporto in peso di conservante relativo al peso di cellule vitali (Tabella 18)

Variazioni nella vitalità e titolo di Lactobacillus clearans con l'impiego di conservanti che procurano più del 90% di vitalità durante la vitalizzazione

Vitalità media con il tempo

Variazioni 3 6 12 del titolomesi mesi mesi

Con l'impiego di

conservanti che

procurano il 90% 95% 80% 70% + di vitalità durante la liofilizzazione

Era evidente che sono stati ottenuti eccellenti effetti conservanti con l'uso congiunto di sostanze alle quali aderiscono e vivono i lactobacilli assieme ad una relazione simbiotica nel mondo della natura, quale crusca di riso, crusca, lievito, clorella, erbe quali trifoglio, frutta quali pompeimi, insieme con le sostanze segnate con un singolo cerchio oppure quadrato nelle tabelle 12, 13, e 14, quale latte di soia.

E' stato anche confermato che la conservabilità poteva venire ulteriormente accrescita quando venivano addizionate sostanze che mantenevano efficacemente il titolo, quali composti odorosi di zolfo, azoto e carbonio, amminoacidi quali amminoacidi contenenti zolfo e acido glutammico, vitamine, quali Vitamina C e pantotenato di calcio, minerali quali zinco e magnesio, e polvere biliare, sia di per sè che in combinazione, per conservanti altamente efficaci durante la sottocoltura di Lactobacillus clearans.

In aggiunta alla liofilizzazione, come metodi per conservare Lactobacillus clearans, sono state contemplate varie forme di conservazione, quali conservazione ad umido di liquidi oppure di masse cellulari, conservazione semi-secca con circa un contenuto di umidità di circa 15%, conservazione a secco con un contenuto in umidità di circa l'8% e conservazione all'ultrafreddo tra circa -40 e -196°C, ma fondamentalmente sono stati ottenuti buoni risultati quando conservati con conservanti che mostravano gli effetti eccellenti- descritti sopra durante l'impiego nella liofilizzaizone.

La presente invenzione è stata descritta in dettaglio in appresso con riferimento ad esempi, ma il campo della presente invenzione non è limitato soltanto a questi esempi.

(Esempio 1)

10 litri di terreno (pH 7,0) contenente 5 g di estratto di' carne (Wako Pure Chemical Industries LTD.), 5 g di peptone (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 3 g di butirrato di sodio ((Wako Pure Chemical Industries LTD.), 1 mL di ammoniaca acquosa ((Wako Pure Chemical Industries LTD.), 10 g di glucosio ((Wako Pure Chemical Industries LTD.), 0,5 g di cistina ((Wako Pure Chemical Industries LTD.), e 2 g di estratto di lievito (Nihon Seiyaku) per litro di terreno sono stati inoculati con Lactobacillus clearans (FERM P-17150, BP-6073) per 72 ore di coltura anaerobica a 37°C. Il brodo di coltura è stato centrifugato, dando 10 g di una massa cellulare. La massa è stata lavata con 500 mL di soluzione salina fisiologica (preparata con cloruro di sodio da (Wako Pure Chemical Industries LTD.) e centrifugata per due volte. La massa cellulare purificata risultante è stata introdotta in una soluzione costituita da 500 mL di latte di soia (da Tsujimoto Shokuhin Kogyo), 50 g di latte scremato (Snow Brand Milk Products, Co.), 30 g di trealosio (Hayashibara KK), e 0,5 g di cistina ((Wako Pure Chemical Industries LTD.), ed agitata completamente. Il miscuglio è stato liofilizzato nel vuoto mediante un metodo comunemente in uso per dare 133 g di preparazione di cellule batteriche. Il conteggio di cellule era 3,0 x IO9 cellule/grammo. La preparazioen di cellule è stata stoccata a temperatura ambiente con un essiccante a base di gel di silice (Manabe Kaseihin) e con un assorbente di ossigeno (Mitsubishi Gas Chemical Co.), il conteggio delle cellule vitali è stato studiato per 18 mesi per calcolare la vitalità, ed è stato saggiato il titolo con i risultati dati nella tabella 19. La tabella 19 mostra che è stato mantenuto un elevato titolo di Lactobacillus clearans virtualmente senza diminuzione.

(Tabella 19)

Esempio di variazioni nel conteggio, vitalità e titolo

(Esempio 2)

10 litri di terreno (pH 7,0), contenente 30 g di siero di latte di soia (Fuji Oil Co.), 1 g di peptone (Wako Pure Chemical Industries LTD.), 1 g di cistina ( Wako Pure Chemical Industries LTD.), 3 g di acetato di sodio (Wako Pure Chemical Industries LTD.), 0,2 g di solfuro di sodio ( Wako Pure Chemical Industries LTD.), 0,01 g di pantotenato di cacio (Wako Pure Chemical Industries LTD.), e 2 g di lievito di Baker (Orientai Yeast) per litro di terreno è stato inoculato con Lactobacillus clearans (FERM P-17149, BP-6971) per 72 ore di coltura anaerobica a 37°C. Il brodo di coltura è stato centrifugato, dando 28 g di una massa cellulare costituita da Lactobacillus clearans e cellule di lievito insensibili. La massa è stata lavata con 500 mL di soluzione salina fisiologica (preparata con cloruro di sodio da (Wako Pure Chemical Industries LTD.) e centrifugata per due volte. La massa cellulare purificata risultante è stata introdotta in 500 mL di acqua contenente 10 g di clorella essiccata ( Yamaki ), 25 g di trealosio ( Hayashibara KK ), e 5 g di amido solubile ( Wako Pure Chemical Industries LTD.) e agitata completamente. Il miscuglio è stato poi liofilizzato nel vuoto mediante un metodo comune per dare 43 g di preparazione di cellule batteriche. Il conteggio delle cellule era 10,0 x IO9 cellulè/grammo. La preparazione di cellule è stata stuccata a temperatura ambiente in vasi di vetro schermati dalla luce insieme con un essiccante a base di gel di silice (Manabe Kaseihin) e un assorbente di ossigeno (Mitsubishi Gas Chemical Co.), il conteggio di cellule vitali è stato studiato per 18 mesi per calcolare la vitalità, ed è stato saggiato il titolo, con i risultati dati nella tabella 20. La tabella 20 mostra che è stato mantenuto un titolo elevato di Lactobacillus clearans virtualmente senza riduzione .

(Tabella..20)

Esempio di variazioni nel conteggio di cellule vitali, vitalità e titolo in Lactobacillus clearans

_

I

d

z

1

V

(Esempio comparativo 1)

10 litri di terreno (pH 7,0) contenente 10 g di estratto di carne (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 10 g di peptone (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 3 g di estratto di lievito (Nihon Seiyaku), 10 g di glucosio (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 2 g di K2HP04, 1 g di MgS04.7H20, 1 g di NaCl e 1 g di CaCl2.2H20 per litro di terreno è stato inoculato con Lactobacillus clearans (FERM P-17150, BP-6973) per 72 ore di coltura anaerobica a 37°C. Il brodo di coltura è stato centrifugato, dando 18 g di una massa di cellule. La massa è stata lavata con 500 mL di soluzione salina fisiologica (preparata con cloruro di sodio da (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), e centrifugata per due volte. La massa di cellule purificata risultante è stata introdotta in 1000 mL di soluzione di amido solubile al 20% (Wako Pure Chemical Industries, LTD.) e completamente agitata. Il miscuglio è stato liofilizzato nel vuoto mediante un metodo comune per dare 204 g di preparazione di cellule batteriche. Il conteggio di cellule era 4,5 x IO9 cellule/grammo. La preparazione di cellule è stata stoccata a temperatura ambiente con un essiccante a base di gel di silice (Manabe Kaseihin) e un assorbente di ossigeno (Mitsubishi Gas Chemical Co.}, il conteggio di cellule vitali è stato studiato per 18 mesi per calcolare la vitalità, ed è stato saggiato il titolo con i risultati dati nella tabella 21.La tabella 21 mostra che non soltanto la vitalità diminuiva rapidamente, ma che diminuiva anche considerevolmente il titolo, quando Lactobacillus clearans veniva coltivato in un terreno comune e conservato mediante un metodo comune.

(Tabella 21)

Esempio di variazioni nel conteggio di cellule vitali di Lactobacillus clearans, vitalità e titolo nel terreno e conservazione comuni

(Esempio di confronto 2)

10 litri di terreno (pH 7,0) contenente 10 g di estratto di carne (Wako Pure Chemical Industries, LTD .), 10 g di peptone (Wako Pure Chemical Industries, LTD.) 3 g di estratto di lievito (Nihon Seiyaku), 10 g di glucosio (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 2 g di K2HP04, 1 g di MgS04.7H20, 1 g di NaCl e 1 g di CaCl2.2H20 per litro dì terreno è stato inoculato con Lactobacillus clearans (FERM P-17150, BP-6973) per 72 ore di coltura anaerobica a 37°C. Il brodo di coltura è stato centrifugato, dando 18 g di una massa cellulare. La massa è stata lavata con 500 mi di soluzione salina fisiologica (preparata con cloruro di sodio della Wako Pure Chemical Industries, LTD.) e centrifugata due volte. La massa di cellule purificata risultante è stata introdotta in una soluzione costituita da 900 mL di latte di soia (da Tsujimoto Shokuhin Kogyo), 90 g di latte scremato (Snow Brand Milk Products, Co.), 54 g di trealosio (Hayashibara LL), e 0,9 g id cistina (neutra) (Wako Pure Chemical Industries, LTD.) e agitata completamente. Il miscuglio è stato liofilizzato nel vuoto mediante un metodo comune per dare 239 g di preparazione di cellule batteriche. Il conteggio di cellule era 5,0 x IO9 cellule/grammo. La preparazione di cellule è stata stoccata a temperatura ambiente con un essiccatore a base di gel di silice (Manabe Kaseihin) e un assorbente di ossigeno (Mitsubishi Gas Chemical Co.), il conteggio di cellule vitali è stato studiato per 18 mesi allo scopo di calcolare la vitalità ed è stato saggiato il titolo con i risultati dai nella tabella 22. La tabella 22 mostra che veniva ottenuta buona vitalità, sebbene non così buona come nell'esempio 1, quando il Lactobacillus clearans è stato coltivato mediante un metodo comune e conservato mediante il metodo della presente invenzione. Il titolo tuttavia diminuiva un pò durante la coltura, e dopo di che tendeva a_ continuare la diminuzione, anche se gradualmente.

(Tabella 22)

Esempio di variazione nel conteggio di cellule vitali, vitalità e titolo nel Lactobacillus clearans, in terreno comune ma con conservazione mediante la presente invenzione

(Esempio di confronto 3)

10 litri di terreno (pH 7,0), contenente 5 g di estratto di carne (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 5 g di peptone (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 3 g di butirrato di sodio (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 1 g di ammoniaca acquosa ( Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 10 g di glucosio (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), 0,5 g di cistina (Wako Pure Chemical Industries, LTD.), e 2 g di estratto di lievito (Nihon Seiyaku) per litro di terreno è stato inoculato con Lactobacillus clearans (FERM P17150, BP-6973) per 72 ore di coltura anaerobica a 37°C. Il brodo di coltura è stato centrifugatom, dando 10 g di una massa cellulare. La massa è stata poi lavata con 500 mL di soluzione salina fisiologica (preparata con cloruro di sodio da (Wako Pure Chemical Industries, LTD.) e centrifugata per due volte. La massa di cellule purificata risultante è stata introdotta in 550 mL di soluzione di amido solubile al 20% (Wako Pure Chemical Industries, LTD.) e completamente agitata. Il miscuglio è stato lipofilizzato nel vuoto mediante un metodo comune per dare 112 g di preparazione di cellule batteriche. Il conteggio delle cellule era 2,5 x IO9 cellule/grammo. La preparazione di cellule è stata stoccata a temperatura ambiente con un essiccante a base di gel di silice (Manabe Kaseihin) e un assorbente di ossigeno (Mitsubishi Gas 'Chemical Co.), il conteggio di cellule vitali è stato studiato per 18 mesi per calcolare la vitalità, ed è stato saggiato il titolo, con i risultati dati nella tabella 23. La tabella 23 mostra che la vitalità tendeva ad essere la stessa come quella nell'esempio di confronto 1 quando il Lactobacillus clearans veniva coltivato nel terreno della presente invenzione e conservato mediante un metodo comune. Il titolo non diminuiva così rapidamente come esso diminuiva nell 'esempio di confronto 1, ma tendeva a diminuire gradualmente .

(Tabella 23)

Esempio di variazioni in conteggio di cellule vitali, vitalità e titolo nel Lactobacillus clearans, in terreno della presente invenzione, ma mediante conservazione comune.

_

I

d

z

2

V

LKactobacillus clearans sono nuovi ceppi di lactobacilli che utilizzano e degradano composti odorosi di solfo, di azoto e di carbonio, e sono stati notati come ceppi efficaci che dimostrano una potente capacità di purificazione negli intestini a causa delle funzioni di cui sopra.

Tuttavia non vi sono metodi noti quali quello per ottenere lactobacilli con un elevato titolo che manifesti tali funzioni, oppure metodi per mantenere il titolo elevato che viene ottenuto per lunghi periodi di tempo.

L'impiego del terreno di coltura della presente invenzione consente che Lactobacillus clearans vengano coltivati con un elevato titolo in una maniera stabile, cosicché possono venire facilmente degradati e eliminati i composti odorosi dannosi, di zolfo, azoto e carbonio. Di conseguenza, non solo sostanze odorose dannose enteriche sono diminuite, ma i batteri considerati per essere benefici per la flora intestinale possono venire sostanzialmente aumentati, mentre la crescita dei batteri dannosi può venire fortemente soppressa .

L'impiego del metodo di conservazione nella presente invenzione consente che Lactobacillus clearans con un elevato titolo vengano conservati per lunghi periodi di tempo, cosicché ogniqualvolta richiesto possono venire facilmente degradati ed eliminati i composti odorosi dannosi di zolfo, azoto e carbonio.

Claims (5)

1. RIVENDICAZIONI 1. Terreno di coltura per la coltura di Lactobacillus clearans, che comprende l'addizione di almeno uno oppure l'uno e l'altro di solfuro di sodio ed ammoniaca acquosa, cosicché, durante la coltura del Lactobacillus clearans, almeno uno oppure l'uno e l'altro del solfuro di sodio e di ammoniaca vengono ridotti dal Lactobacillus clearans nelle 24 ore di coltura.
2. 2 . Terreno di coltura per la coltura di Lactobacillus clearans, che comprende l'addizione al terreno di coltura come esposto nella rivendicazione 1, di almeno uno oppure più dei composti odorosi di zolfo, composti odorosi di azoto e composti odorosi di carbonio.
3. 3 . Terreno di coltura per la coltura del Lactobacillus clearans, in cui il composto odoroso di zolfo come esposto nella rivendicazione 2 è almeno uno oppure più di solfuro di sodio, solfuro di idrogeno, solfuro di ammonio, metilmercaptano, etilmercaptano, dimetilmercaptano, dimetilsolfuro, dimetildisolfuro, dietilsolfuro, dibutilsolfuro e loro derivati.
4. 4. Terreno di coltura per la coltura del Lactobacillus clearans, in cui il composto odoroso di azoto come esposto nella rivendicazione 2, è almeno uno oppure più di ammoniaca, scatolo, indolo, acetanilide, metilammina, dimetilammina, dietilammina , trietilammina e loro derivati.
5. 5. Tereno di coltura per la coltura del Lactobacillus clearans, in cui il composto odoroso di carbonio come esposto nella rivendicazione 2, è almeno uno oppure di acido formico, acido acetico, acido propionico, acido butirrico, formaldeide, acetaldeide, propionaldeide, crotonaldeide, fenolo, alcool butilico, alcool amilico e loro derivati. S. Terreno di coltura per la coltura di Lactobacillus clearans, che comprende l'addizione ad un terreno di coltura come esposto in qualsiasi delle rivendicazioni 1 fino a 5, di almeno uno opprue più di amminoacido contenente zolfo, acido glutammico, lisina ed acido aspartico come un amminoacido . 7. Terreno di coltura per la coltura di Lactobacillus clearans, che comprende l'addizione ad un terreno di coltura come esposto in qualsiasi delle rivendicazioni 1 fino a 6, di almeno uno oppure più di Vitamina C, Vitamina E, Vitamina BI2, pantotenato di calcio, acido folico e nicotinammide, come una vitamina. 8 . Terreno di coltura per la coltura di Lactobacillus clearans, che comprende l'addizione ad un terreno di coltura come esposto in qualsiasi delle rivendicazioni 1 fino a 7, di almeno uno oppure più di manganese, zinco, magnesio e molibdeno, come un componente minerale. 9. Terreno di coltura per la coltura di Lactobacillus clearans, che comprende l'addizione ad un terreno di coltura come esposto in qualsiasi delle rivendicazioni 1 fino ad 8, di almeno una oppure più di clorella CGF, latte di soia e polvere biliare. 10. Terreno di coltura per la coltura di Lactobacillus clearans che comprende l'addizione ad un terreno di coltura come ..esposto in qualsiasi delle rivendicazioni 1 fino a 9, di _solfuro di sodio in una concentrazione di 500 ppm, in cui il solfuro di sodio viene ridotto del 10% oppure più nelle 24 ore di coltura durante la coltura di Lactobacillus clearans. 11. Terreno di coltura per la coltura di Lactobacillus clearans, che comprende l'addizione ad un terreno di coltura come esposto in qualsiasi delle rivendicazioni 1 fino a 9, di ammoniaca acquosa in una concentrazione di 500 ppm, in cui l'ammoniaca viene ridotta del 10% oppure più nelle 24 ore di coltura durante la coltura di Lactobacillus clearans. 12. Metodo per la conservazione di Lactobacillus clearans, che comprende la presenza di almeno uno oppure più di amminoacido contenente zolfo, ovalbumina, prodotto biliare, trealosio, rabbinosio, cellule di lievito insensibili, clorella, crusca di riso, crusca, latte di soia e succo di carota, come un conservante attorno al Lactobacillus clearans durante la conservazione del Lactobacillus clearans. 13 . Metodo per la conservazione di Lactobacillus clearans, che comprende, in aggiunta ad un conservante come esposto nella rivendicazione 12, l'addizione di almeno uno oppure più di acido glutammico, lisina, acido aspartico. Vitamina C, Vitamina E, Vitamina BI2, pantotenato di calcio, acido folico, nicotinammide, manganese, zinco, magnesio, molòibdeno, solfuro di sodio, solfuro di idrogeno, solfuro di ammonio, metilmercaptano, etilmercaptano, dimetilmercaptano, dimetilsolfuro, dimetildisolfuro, dietilsolfuro, dibutilsolfuro, ammoniaca, scatolo, indolo, acetanilide, metilammina, dimetilammina, dietilammina, glutammico, lisina, acido aspartico, Vitamina C, Vitamina E, Vitamina BI2, pantotenato di calcio, acido folico, nicotinammide, manganese, zinco, magnesio, molibdeno, solfuro di sodio, solfuro di idrogeno, solfuro di ammonio, metilmercaptano, etilmercaptano, dimetilmercaptano, dimetilsolfuro, dimetildisolfuro, dietilsolfuro, dibutilsolfuro, ammoniaca, scatolo, indolo, acetamnilide, metilammina, dimetilammina, dietilammina, trietilammina, acido formico, acido acetico, acido propionico, acido butirrico, formaldeide, acetaldeide, propionaldeide, crotonal'deide, fenolo, alcool butilico, alcool amilico e loro derivati attorno al Lactobacillus clearans. 16. Metodo di conservazione. per la conservazione di Lactobacillus clearans come esposto in qualsiasi delle rivendicazioni 12 fino a 15, in cui il metodo di conservazione comprende qualsiasi metodo di liofilizzazione, conservazione all'ultrafreddo, oppure*metodi a liquido, ad umido, a semisecco oppure a secco.