ITRM20010005A1

ITRM20010005A1 - Sequenza nucleotidica e corrispondente proteina in grado di regolare l'apoptosi.

Info

Publication number: ITRM20010005A1
Application number: IT2001RM000005A
Authority: IT
Inventors: Rita Bisogni; Annalisa Lamberti; Antonello Petrella; Maria Fiammetta Romano; Maria Caterina Turco; Salvatore Venuta
Original assignee: Univ Napoli Federico Ii; Uni Degli Studi Di Catanzar O
Priority date: 2001-01-10
Filing date: 2001-01-10
Publication date: 2002-07-10
Also published as: EP1349872B1; NZ527445A; US20040072163A1; CA2434739A1; AU2002235827B2; WO2002055553A3; WO2002055553A2; ITRM20010005A0; EP1349872A2; US7589185B2

Description

Descrizione della domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal titolo: "Sequenza nucleonica e corrispondente proteina in grado di regolare l'apoptosi".

Campo invenzione

La presente invenzione è relativa ad una sequenza nucleotidica e corrispondente proteina in grado di regolare l'apoptosi.

Più in particolare l’invenzione si riferisce al’utilizzo di detta sequenza o di utilizzazioni per regolare le attività biologiche delle cellule ed incidere sulle loro alterazioni patologiche.

La morte cellulare programmata, o apoptosi (ref. 1 della bibliografia), é un processo fondamentale per la regolazione di molti fenomeni biologici. Infatti, sia nei processi differenziativi che nei tessuti maturi, l'equilibrio dei compartimenti cellulari é determinato dal rapporto fra la proliferazione cellulare e la morte programmata. Alterazioni, sia nel senso di una deregolata stimolazione che in quello di un deficitario funzionamento dell'apoptosi sono alla base di molte malattie. Malattie degenerative dei tessuti (nel tessuto cerebrale, come in varie forme di demenza, ed in vari altri tessuti) oppure conseguenti a danni acuti nei tessuti (come negli infarti del miocardio, del distretto cerebrale e di altre sedi) o ad eccessivi e/o deregolati processi infiammatori coinvolgono l'apoptosi. Trovare elementi e presidi che regolino l'apoptosi è importante in quanto può significare, in questi casi, poter bloccare il processo di morte cellulare alla base della malattia. In altre patologie, invece, come quelle autoimmunitarie, fa deregolazione deli'apoptosi conduce all'aberrante resistenza delle cellule neoplastiche alle terapie (chemio- e radioterapie, terapie con modificatori biologici, eccetera) che dovrebbero determinarne la morte. Trovare elementi che regolino l'apoptosi significa perciò sia poter combattere l’insorgenza della neoplasia che poter determinare terapeuticamente la morte delle cellule neoplastiche. Questo é infatti un approccio fondamentale, oggi, nella ricerca in campo oncologico. Infine, in altre situazioni, come nell'invecchiamento, o in alterazioni iperplastiche o displastiche come le mielodisplasie ed altre, l'apoptosi gioca un ruolo dì primo piano e poter incidere su di essa significa poter intervenire nel processo.

Sono noti vari elementi che regolano l'apoptosi: le caspasi, enzimi intracellulari che possono provocare la morte della cellula, ed alcuni loro inibitori o attivatori; proteine del mitocondrio, una sede cellulare in cui si svolgono fondamentali processi di regolazione dell'apoptosì; ed altre molecole. Tuttavia, le evidenze in letteratura indicano che vi sono ancora altri elementi, fino ad ora non caratterizzati, che regolano l'apoptosi (1). Ad esempio l'apoptosi può essere regolata dall’attività dei fattori trascrizionali NF-kB/Rel Ref. 6 . E‘ tuttavia ancora oco noto uali siano l'apoptosi. E’ stato trovato che anche parti di esse sono in grado di fungere da regolatori.

Altro oggetto dell’invenzione è l’impiego di dette sequenze a DNA e amminoacidiche a scopo terapeutico per trattare tutte quelle affezioni che dipendono o sono coinvolte nel meccanismo dell’apoptosi, in particolare: malattie degenerative dei tessuti (nel tessuto cerebrale, come in varie forme di demenza, ed in vari altri tessuti), oppure conseguenti a danni acuti nei tessuti (come negli infarti del miocardio, dei distretto cerebrale e di altre sedi), o ad eccessivi e/o deregolati processi infiammatori; patologie autoimmunitarie, che comportano l'aberrante espansione di cellule che aggrediscono l'organismo; neoplasie, poiché la ridotta sensibilità all'apoptosi é alla base dell'espansione del clone neoplastico e perché tale ridotta sensibilità determina la resistenza delle cellule neoplastiche alle terapie (chemio- e radioterapie, terapie con modificatori biologici, eccetera) che dovrebbero determinarne la morte; invecchiamento, o alterazioni iperplastiche o displastiche, come le mielodisplasie ed altre.

Ulteriori oggetti dell'invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione detta liata dell'invenzione.

sequenza in cellule Jurkat non stimolate (TO) o stimolate con l’anticorpo anti-Fas CH-11 per vari tempi. L'espressione del gene GAPDH viene mostrata per controllo. La figura 2B si riferisce all’espressione, evidenziata per Northern blot, della nostra sequenza in cellule SH-SY5Y non stimolate (-) o stimolate con dietilmaleato (DEM) (+). L'espressione del gene GAPDH viene mostrata per controllo.

Fig. 3 - Proteina codificata dalla sequenza di Fig. 1. La figura 3A mostra la nostra proteina immunoprecipitata con anticorpi (preparazione anticorpale specifica) da cellule Jurkat non stimolate o stimolate con l'anticorpo anti-Fas CH-11. La figura 3B riporta (a sequenza amminoacidica della proteina.

Fig. 4 - Inibizione dell'apoptosi con oligo antisenso in cellule SH-SY5Y. La figura 4A è il grafico di controllo; la figura 4B è il grafico di DEM (dietilmaleato); la figura 4C è il grafico di DEM+olìgo antisenso; la figura 4D è il grafico di DEM+ oligo di controllo.

Fig. 5 - Effetto dell’oligo antisenso in cinetica sull’apoptosi di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y.

Fig. 6 - Effetto dell’oligo antisenso sull'apoptosi di cellule di Fig. 8 - Espressione intracitoplasmatica della proteina in cellule di leucemia linfatica cronica primaria. La figura 8A si riferisce a cellule non stimolate, mentre la figura 8B si riferisce a cellule stimolate con DEM. Fig. 9 - Espressione intracitoplasmatica della proteina in cellule di leucemia linfatica cronica primaria. La figura 9A si riferisce a cellule non stimolate, mentre la figura 9B si riferisce a cellule stimolate con DEM e la figura 9C si riferisce a cellule stimolate con il farmaco 2-metossiestradiolo (2ME).

Fig. 10 - Espressione intracitoplasmatica della proteina in cellule di leucemia linfatica cronica primaria. La figura 10A si riferisce a cellule non stimolate, mentre la figura 10B si riferisce a cellule stimolate con DEM e la figura 10C si riferisce a cellule stimolate con il farmaco 2ME.

Fig. 11 - Effetto di due olìgo antisenso suH’apoptosi di cellule di leucemia acuta mieloide primaria, indotta da topotecan, un inibitore dell’enzima topoisomerasi, alla concentrazione di 50 ng/ml.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

Secondo la presente invenzione è stato trovato che la sequenza nucleotidica, riportata nella frg.1 e indicata come SEQ ID NO: 1, intera o cellulare, intendendosi per compartimento cellulare il numero di cellule di un tessuto.

In particolare un oligo antisenso da noi disegnato e funzionalmente attivo è quello indicato come SEQ ID NO: 4 e corrispondente alle seguenti 27 basi: CTT AGT CTT ATA CAT TTT TTT AAA ATC. Tale oligo é sufficiente a bloccare l'apoptosi. Tuttavia è del tutto possibile che altri oligo, di altre lunghezze e/o corrispondenti ad altre porzioni, abbiano lo stesso effetto. Ad esempio è stato anche provato i'oligo antisenso corrispondente alle seguenti 25 basi: CTT TCT ATC TTC ATT TTA TTT TTC C e indicato come SEQ ID NO: 5.

Il metodo per identificare il cDNA è il differential display, ed è illustrato nella ref. 3. Il metodo per determinare la sequenza del cDNA identificato è illustrato nella ref. 4. Anche ì metodi per costruire i vettori e le cellule ed i metodi per ottenere la proteina secondo l'invenzione sono illustrati nella ref. 4.

Rientrano nel’ambito della presente invenzione:

- gli oligonucleotidi antisenso in grado di ibridarsi con la sequenza di mRNA corrispondente al cDNA che codifica per la proteina avente la preferite sono le cellule in grado di dare una funzionale espressione della proteina o di sue partì;

- organismi pluricellulari superiori, escluso l’uomo, che contengono dette cellule modificate;

- anticorpi contro la proteina descritta in fig. 3. Peptidi utilizzati per la produzione di anticorpi verso la proteina sono ad es. i seguenti: SEQ ID NO: 6 NSQNNFRNQYINNLKEIKS, SEQ ID NO: 7 KFYEKYRLDKIAETIYA, SEQ ID NO: 8 NLKEEFEGKNYLYPDAKD.

L’utilizzazione della sequenza e/o proteina (tutte o parti di esse) può riguardare:

reagenti e/o procedure per modulare l'apoptosi, nella terapia di stati patologici che coinvolgano il processo apoptotico, quali ad esempio: - neoplasie;

- malattie degenerative in generale, tutte quelle affezioni, cioè, che comportano perdita parziale o totale dei caratteri morfologici e funzionali tipici di una cellula, di un tessuto o di un organo in modo tale da risultarne impedito lo svolgimento delle funzioni vitali; ad es.: malattie degenerative del sistema nervoso come il morbo di Parkinson e le forme • patologie legate ad eccessiva o deregolata infiammazione, malattie autoimmunitarie, sclerosi multipla, psoriasi, rigetto di trapianto e reazione di trapianto contro l’ospite;

- iperplasie (es. neoproliferazione intimale dopo angioplastica), displasie e malattie similari;

- AIDS, tubercolosi o altre malattie infettive in cui sia implicata l’apoptosi;

- altre patologie in cui sia implicata l’apoptosi;

reagenti e/o procedure per modulare l'apoptosi nell'invecchiamento; reagenti e/o procedure per preservare o ricostituire: compartimenti cellulari e/o tessuti, come nel caso di colture di cellule progenitrici e/o staminali di impiego in ematologia, oncologia, medicina dei trapianti ed altri campi della medicina; cellule e tessuti di impiego in chirurgia plastica e/o ricostruttiva, in tecniche di trapianti, eccetera;

reagenti e/o procedure per favorire <(>'attecchimento dei trapianti; reagenti e/o procedure per modulare la sopravvivenza e/o le dimensioni di sistemi cellulari di impie o nel lavoro di laboratorio, nella ricerca enzimi od altri reattivi specificamente disegnati sulla base della sequenza nucleotidica e/o amminoacidica, unitamente a carriere, vettori e/o additivi noti nell’arte secondo le terapie utilizzate (ad es. tradizionale, genica, antisenso). Le concentrazioni e i dosaggi varieranno in funzione del tipo di affezione, della composizione farmaceutica e del protocollo di somministrazione.

I risultati da noi ottenuti sono indipendenti dalle tecniche qui descritte per l’ottenimento del DNA e della proteina corrispondente. Inoltre, i risultati funzionali da noi ottenuti possono essere riprodotti anche con sequenze nucleotidiche e/o proteiche aventi un grado dì omologia del 40% o superiore, preferibilmente del 60% o superiore, più preferibilmente dell’80% o superiore, ancor più preferìbilmente del 90% o superiore rispetto alle sequenze qui indicate.

Gli effetti funzionali sull apoptosi, che noi abbiamo dimostrato, potrebbero essere ottenuti con altre cellule e/o con altri stimoli; inoltre, potrebbe essere ottenuta una modulazione della proliferazione, che è un programma a cui l'apoptosì è collegata. Abbiamo cioè fornito solo alcuni esempi dell’attività della sequenza e/o proteina (cioè modulatrice Identificazione della nuova sequenza - Per trovare nuovi elementi regolatori dell'apoptosi, ci siamo basati su un sistema di trasfettanti delle linea cellulare Jurkat. Tali cellule sono state trasfettate stabilmente con un vettore plasmidico (pRC/CMV-lkBalfa), esprimente un inibitore (Ik Balia) dei fattori trascrizionali NF-kB; infatti, é noto che tale inibitore, bloccando l'attività NF-kB, aumenta nelle cellule la risposta apoptotica, attraverso meccanismi soltanto parzialmente noti. Cellule di controllo sono state trasfettate con il vettore vuoto (pRC/CMV). I trasfettanti stabili sono stati ottenuti per selezione con geneticina (G418) a 500 microgr/ml. In questo modo, abbiamo ottenuto due varianti di una stessa cellula, delle quali una (lkBalfa+) presentava un blocco nell'attivazione di NF-kB. Tale blocco è stato evidenziato sia per saggio di mobilità elettroforetica (EMSA) che per analisi dell’espressione di un gene reporter (CAT). Per il saggio di mobilità elettroforetica, le cellule sono state lavate in PBS e il pellet risospeso in buffer per estratti (10 mM HEPES pH 7,9; 1,5 mM MgCl2; 1 mM EDTA; 0,5 mM DTT; 0,5 mM PMSF; 10 mM KCI; 10% glicerolo ). Ogni volume di pellet, pari a circa 10 pi, è stato risospeso in 100-200 pi di buffer. Per ottenere i nuclei, la sospensione è stata frammentata con una sirin a da in lin

che lega i fattori NF-kB, che un oligonucleotide di controllo, che non lega tale fattore.

Ogni oligonucleotide (oligonucleotide NF-kB: 5'-CAACGGCAGGGGAATCTCCCTCTCCTT-3’; oligonucleotide di controllo) è stato utilizzato come DNA a doppio filamento e marcato terminalmente con [gamma-<32>PJATP (Amersham Corp.) usando l'enzima polinucleotide chinasi (New England Biolabs, Beverely, MA). 5 microgrammi di estratti proteici nucleari sono stati incubati in binding buffer (10 mM Hepes ph 7,8, 50 mM KCI, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10% glicerolo, 0,7 mM PMSF, 2 mìcrogrammi di poly[d(l-C) ), in presenza o in assenza di un eccesso molare di oligonucleotidi non marcati, per 15 minuti a 4°C. Successivamente alla miscela di reazione è stato aggiunto l’oligonucleotide radioattivo e, dopo un’incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente, la miscela è stata sottoposta a migrazione elettroforetica su un gel ai 6% di acrilamide/bis-acrilamide (30:1), in un tampone di corsa costituito- da 0,25X Tris borato, in condizioni non denaturanti. A fine corsa il gel è stato seccato sotto vuoto ad 80°C ed esposto per autoradiografia. Questi esperimenti hanno reporter (CAT) sotto il controllo di un enhancer contenente sequenze consensus NF-kB; dopo dieci minuti d'incubazione in ghiaccio, le cellule sono state sottoposte ad un doppio impulso elettrico (0,2 KV, 960 microF), usando un apparato Bio-rad, e poi raccolte, diluite e coltivate in RPMI- 10% FCS. Il successivo saggio enzimatico CAT sugli estratti cellulari ha consentito di valutare l'attività NF-kB delle cellule, e dunque di verificare che cellule lkBalfa+ stimolate con TNF o acido okadaico mostravano, rispetto alle cellule Jurkat wild type o di controllo, una modulazione negativa dell’attività NF-kB. Grazie al blocco di NF-kB, le cellule lkBalfa+ mostravano, rispetto alle cellule wild type o di controllo, una maggiore sensibilità all’apoptosi. Ciò é stato verificato attraverso analisi dell'apoptosi. L'apoptosi delle cellule è stata determinata in citofluorimetria, secondo il metodo riportato nella ref. 2 della bibliografia, utilizzando lo ioduro di propidio (PI) come marcatore del DNA. 5x10<5 >cellule sono state lavate in soluzione salina tamponata (PBS) e risospese in una soluzione contenente 0,1% dì sodio citrato, 0,1% di Triton X-100, 50 microgrammi di ioduro di propidio e 0,2 mg/ml di RNasi A. Dopo 30' di incubazione a 4°C al buio il contenuto di DNA è stato consentito di determinare che, in seguito alla stimolazione con TNF o con acido okadaico, le cellule lkBalfa+ presentavano livelli di apoptosi più alti rispetto alle cellule wild type o alle cellule dì controllo.

Abbiamo stimolato i due tipi cellulari con un induttore di apoptosi: acido okadaico, estratto gli mRNA dai due tipi cellulari, costruito i corrispondenti cDNA e li abbiamo comparati attraverso la metodica del differential display (ref, 3 della bibliografia). In particolare, cellule lkBalfa+ e cellule di controllo (pRC/CMV) sono state trattate con acido okadaico (Sigma) a 70 ng/ml per 8 ore. Dopo tale periodo da tali cellule è stato estratto l'RNA totale (metodo della guanidina isotiocianato). Prima di procedere alla sìntesi del cDNA, l'RNA è stato trattato con DNasi I per una completa rimozione di DNA contaminante (Message Clean, GenHunter Corporation). Una volta controllata l'integrità dell'RNA mediante gel di agarosio, si è proceduti alla sintesi del cDNA utilizzando 1-2 ti, programmi di RNA mediante trascrittasi inversa usando come oligo HT11-G dove H è la sequenza di restrizione per Hind III (AAGCTT). Il cDNA è stato poi amplificato mediante PCR utilizzando come primo oli o HT11-G e come secondo oli o H-AP7 5'AAGCTTAACGAGG3’ in e di circa 500bp è stata punzonata attraverso la lastra ai quattro angoli. In questo modo è stato possibile recuperare il frammento di gel sottostante contenente la banda di interesse. Tale frammento é stato immerso in 100 microlitri di acqua, lasciato per 10 minuti e poi fatto bollire per 15 minuti. Dopo centrifugazione é stato recuperato il sopranatante e precipitato in presenza di glicogeno. Il pellet di DNA é stato risospeso in 10 microlitri di acqua e 4 microlitri sono stati riamplificati utilizzando sempre la stessa coppia di oligo descritta precedentemente, li prodotto deH'amplificazione è stato poi visualizzato su gel di agarosio per verificare la grandezza del frammento e l'assenza di bande contaminanti. Tale prodotto di PCR è stato poi clonato in pGEM-Teasy per poterne determinare la sequenza ed é stato utilizzato come sonda in esperimenti di Northen blot.

In questo modo, abbiamo potuto selezionare un cDNA, da noi costruito, corrispondente ad un mRNA, che era espresso solo in uno dei due tipi cellulari, e cioè in quello trasfettato con IkBalfa.

Il cDNA, da noi costruito e selezionato, rappresentava quindi soltanto un frammento del corrispondente mRNA.

Determinazione dell’espressione della sequenza in cellule umane -Esperimenti successivi sono stati eseguiti per Northern blot (eseguiti secondo la tecnica descritta nella ref. 5). 30x10® cellule sono state lavate ed il pellet risospeso in 3 mi di Trizol reagent (Life Technologies). L’RNA è stato purificato mediante estrazione con fenolo-cloroformio, successivamente è stato precipitato in alcool isopropilico ed infine lavato in etanolo al 70%. La quantizzazione dell'RNA è stata calcolata utilizzando l’assorbimento a 260 nm e la verifica di normalizzazione è stata ottenuta attraverso elettroforesi su gel di agarosio. 30 microgrammi di RNA sono stati sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio all'1% con formaldeide 2,2 M e quindi trasferiti su filtro di nylon (Hybond, Amersham). I filtri sono stati UV-crosslinked ed ibridati con la sonda corrispondente alla sequenza SEQ ID NO: 1 della figura 1. La sonda è stata marcata con [alfa-32p]ATP per random priming (attività specifica 1-5x10® cpm/ml). I filtri ibridati sono stati sottoposti ad autoradiografla. Questi esperimenti hanno dimostrato che il cDNA da noi ottenuto lega specificamente un mRNA, che si esprime nelle cellule dopo stimolazione con agenti che inducono apoptosi. Infatti, come si vede in fi . 2, tale La Fig. 2 mostra l’espressione della sequenza in cellule umane. A) Attraverso esperimenti di Northern blot, è stata determinata l’espressione della sequenza, come mRNA, in cellule Jurkat, non stimolate (TO) oppure stimolate con l’anticorpo anti- Fas CH-11 per 1h, 3h, 6h o 12h. B). Sempre attraverso esperimenti di Northern blot, è stata determinata l’espressione della sequenza in cellule della linea di neuroblastoma SH-SY5Y, non stimolate (-) o stimolate con DEM (+). L’espressione del gene GAPDH viene riportata come controllo.

Nuova proteina, codificata dalia sequenza - Sulla base della sequenza del cDNA da noi identificato, abbiamo scelto putativi epitopi (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) della proteina corrispondente, ed inoltre abbiamo ottenuto, mediante clonaggio dello stesso cDNA nel vettore di espressione PET22 (ref. 4 della bibliografia), la proteina ricombinante. In accordo a metodologie note all'esperto del ramo abbiamo ottenuto specifici anticorpi di coniglio con i quali abbiamo eseguito esperimenti di immunoprecipitazione utilizzando cellule della linea leucemica T Jurkat trattate e non con anticorpo anti-Fas. 3x10® cellule sono state starvate in mezzo di coltura cisteina metionina-free per centrifugando. Negli estratti totali cosi ottenuti sono state dosate le proteine. Per l'immunoprecipitazione sono stati utilizzati 500 microgrammi di estratto proteico e portati ad un volume finale di 500 , con buffer di lisi. Ai campioni così preparati è stato aggiunto l'anticorpo specifico per la proteina in esame, diluito 1:100, e le miscele sono state incubate a 4°C in agitazione. Dopo tale periodo di incubazione, ai campioni contenenti l'immunocomplesso é stata aggiunta Proteina A-Sepharose (LKB-Pharmacia) e le miscele sono state lasciate 45' a 4°C in agitazione. Al termine dell'incubazione l'immunocomplesso associato alla Proteina A-Sepharose è stato recuperato mediante centrifugazione e caricato su gel di poliacrilammide al 14% per SDS-PAGE. Al termine della corsa elettroforetica il gel è stato essiccato ad 80°C sotto vuoto ed esposto per autoradiografìa.

E' stato possibile così evidenziare la proteina nativa, che risulta essere di circa 20 kD (fig. 3).

Secondo quanto illustrato in Fig. 3A, la presenza della proteina è stata determinata, attraverso immunopreclpitazione con l’anticorpo specifico descritto sopra, in estratti di: cellule Jurkat non stimolate (-); cellule possesso, e dunque diretto a bloccare l'espressione dello specifico mRNA corrispondente e la sintesi della proteina. L'antisenso era in grado di modulare l'apoptosi, e cioè, in questo caso, di bloccarla {fig. 4, 5, 6 e 7). Ciò dimostra che: 1) il mRNA e ia proteina da noi identificati regolano l'apoptosi; 2) agendo su di essi, nel caso specifico attraverso i nostri cDNA ed antisenso, ma anche con un altro eventuale reagente basato sulla sequenza e/o sulla proteina da noi identificate e di cui abbiamo trovato una specifica funzione ed attività, é possibile modulare l'apoptosi, dunque effettuare un utilizzo per la modulazione della morte programmata.

Fig. 4 - Inibizione dell'apoptosi con oligo antisenso in cellule SH-SY5Y: immagini citofluorimetriche. 3X10<5 >cellule di neuroblastoma sono state incubate a 37°C in un’atmosfera di C02 al 5%, in presenza di dietilmaleato alla concentrazione di 2mM, in presenza 0 in assenza dell’oligo antisenso SEQ ID NO: 4 (CTT AGT CTT ATA CAT TTT TTT AAA ATC) (7 microM) e di quello nonsenso SEQ ID NO: 9 (TTA TAT TCT ATT ATA TTT ATG AAC TCC) (7 microM). Dopo 16h, l’apoptosi è stata analizzata in citofluorimetria, come descritto nel testo.

’ ’

TCT ATT ATA TTT ATG AAC TCC) (7 microM). Dopo 12 e 16 ore le cellule sono state raccolte ed incubate nella soluzione di ioduro di propidio per 30’ a 4°C ed analizzate al citofluorimetro FACScan per la presenza di popolazione a contenuto ipodiploide di DNA.

Fig. 6 - Effetto dell’oligo antisenso sull'apoptosi di cellule di neuroblastoma SH-SV5Y, indotta da dietilmaleato alla concentrazione di 2mM. 3X10® cellule di neuroblastoma sono state incubate a 37°C in un’atmosfera di C02 al 5%, con dietilmaleato alla concentrazione di 2mM, in presenza 0 in assenza dell’oligo antisenso SEQ ID NO: 4 (CTT AGT CTT ATA CAT TTT TTT AAA ATC) (7 microM) e di quello nonsenso SEQ ID NO: 9 (TTA TAT TCT ATT ATA TTT ATG AAC TCC) (7 microM). Dopo 16 ore le cellule sono state raccolte ed incubate nella soluzione di ioduro di propidio per 30’ a 4°C ed analizzate al citofluorimetro FACScan per la presenza di popolazione a contenuto ipodiploide di DNA.

Fig. 7 - Effetto dell’oligo antisenso sull’apoptosi di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y, indotta da dietilmaleato alla concentrazione di 6mM. 3X10® cellule di neuroblastoma sono state incubate a 37“ C in un’atmosfera di CO al 5% con dietilmaleato alla concentrazione di citofluorimetro FACScan per la presenza di popolazione a contenuto ipodiploide di DNA.

Presenza della proteina in cellule primarie ex vivo - Abbiamo ricercato se la proteina da noi studiata fosse presente in cellule primarie umane ex vìvo. A questo scopo, abbiamo analizzato tre campioni di cellule di leucemia linfatica cronica (B-CLL), in quanto tali cellule costituiscono la controparte primaria della linea cellulare da noi inizialmente studiata. Per individuare la proteina, abbiamo compiuto esperimenti di immunofluorescenza intracitoplasmatica. La tecnica utilizzata è basata sul seguente protocollo. 10® cellule sono state fissate ed impermeabilizzate con 250 microlitri di soluzione cytofix/cytoperm (Pharmingen) e sottoposte ad immunofluorescenza indiretta, tramite una prima incubazione con l’anticorpo specìfico preparato come detto in precedenza o con l'anticorpo di controllo, ed una seconda incubazione, previo lavaggio con la soluzione Perm/Wash (Pharmingen), con un anticorpo anti-coniglìo marcato con isotiocianato di fluoresceina. Le cellule sono state lavate e risospese nella soluzione Perm/Wash e, quindi, analizzate al citofluorimetro FACScan (Becton Dlckinson) Fig. 8 - Espressione intracitoplasmatica della proteina in cellule di leucemia linfatica cronica primaria. 2X10<6>/mt sono state incubate con dietilmaieato 2mM. Dopo 24 ore di incubazione a 37°C in un’atmosfera di CO2 al 5%, le cellule sono state raccolte, fissate ed impermeabilizzate con 250 microlitri di soluzione cytofix/cytoperm (Pharmingen) e sottoposte ad immunofluorescenza indiretta tramite una prima incubazione con l’antìcorpo specifico o con l’anticorpo di controllo, ed una seconda incubazione, previo lavaggio con la soluzione Perm/Wash con un anticorpo anti-coniglio marcato con isotiocianato di fluoresceìna. Le cellule sono state lavate e risospese nella soluzione Perm/Wash e, quindi, analizzate al citofluorimetro FACScan (Becton Dickinson) utilizzando il software Lysis 1; la fluorescenza emessa dalle cellule marcate con l’anticorpo specifico è stata paragonata a quella emessa dalle cellule incubate con l’anticorpo non specifico. Basalmente le cellule esprimono la proteina nella percentuale del 33,8%, l'espressione appare aumentata in cellule coltivate con DEM (47,6%).

Fig. 9 - Espressione intracitoplasmatica della proteina in cellule di leucemia linfatica cronica rimaria. 2X10<6>/ml sono state incubate con incubazione, previo lavaggio con la soluzione Perm/Wash con un anticorpo anti-coniglio marcato con isotiocianato di fluoresceina. Le cellule sono state lavate e risospese nella soluzione Perm/Wash e, quindi, analizzate al citofluorimetro FACScan (Becton Dickinson) utilizzando il software Lysis 1; la fluorescenza emessa dalle cellule marcate con l'anticerpo specifico è stata paragonata a quella emessa dalle cellule incubate con l’anticorpo non specifico. Basalmente le cellule esprimono la proteina nella percentuale del 17,3%, l’espressione aumenta in presenza di DEM (55,5%) e di 2ME (53,1%).

Fig. 10 - Espressione intracitoplasmatica della proteina in cellule di leucemia linfatica cronica primaria. 2X10®/ml sono state incubate con dietilmaleato 2mM e con 2-metossiestradiolo (2ME) (Sigma) 20microM. Dopo 24 ore di incubazione a 37°C in un’atmosfera di C02 al 5%, le cellule sono state raccolte, fissate ed impermeabilizzate con 250 microlitri di soluzione cytofix/cytoperm (Pharmingen) e sottoposte ad immunofluorescenza indiretta tramite una prima incubazione con l’anticorpo specifico o con l'anticorpo di controllo, ed una seconda incubazione, previo lavaggio con la soluzione Perm/Wash con un

esprimono la proteina nella percentuale del 27,2%, l’espressione non appare regolata da DEM (28,3%) o da 2ME (23,1%).

I tre campioni saggiati nelle figure 8, 9 e 10 erano tre campioni di leucemia biologicamente differenti, ottenuti cioè da tre pazienti diversi affetti dalla stessa patologia.

Modulazione del’apoptosi in cellule primarie ex vivo - Per determinare se la nostra proteina moduli l'apoptosi in cellule primarie ex vivo, abbiamo analizzato l'effetto di due specifici oligonucleotidi antisenso, che ne bloccano l'espressione. Due oligo nonsenso sono stati usati come controllo. Tale effetto è stato analizzato in cellule di leucemia acuta mieloide, ottenute dal sangue periferico del paziente ed incubate con uno specifico farmaco, che si usa nei protocolli terapeutici di questo tipo di leucemia: il topotecan, un inibitore delle topoisomerasi che induce apoptosi. Mentre gli oligonucleotidi nonsenso di controllo non avevano alcun effetto, gli oligonucleotidi specifici, che bloccano l'espressione della nostra proteina, inibiscono fortemente l’apoptosi, come illustrato nella fig. 11. Ciò Indica che la nostra proteina entra in un circuito di regolazione dell’apoptosi in cellule umane primarie ex vivo, e che agendo su di essa è ossibile modulare l’a o tosi.

(CTT AGT CTT ATA CAT TTT TTT AAA ATC) (7 microM), dell’oligo antisenso 2 SEQ iD NO: 5 (CTT TCT ATC TTC ATT TTA TTT TTC C), dell’oligo nonsenso 1 SEQ ID NO: 9 (TTA TAT TCT ATT ATA TTT ATG AAC TCC) (7 microM) e dell’oligo nonsenso 2 SEQ ID NO: 10 (TTT TTC TTC ATT AAA TAA CTA AGG) (7 microM). Dopo 5 giorni le cellule sono state raccolte ed incubate nella soluzione di ioduro di propidio per 30’ a 4°C ed analizzate al citofìuorimetro FACScan per la presenza di popolazione a contenuto ipodiploide di DNA.

Claims

RIVENDICAZIONI 1) Sequenza nucleotidica isolata indicata come SEQ ID NO: 1.
2) Sequenza nucleotidica che codifica per un polipeptide o peptide compreso nella sequenza amminoacidica indicata come SEQ iD NO: 3.
3) Sequenza nucleotidica complementare alla sequenza secondo le riv. 1 e 2.
4) Polinucleotide od oligonucleotide isolato comprendente porzioni della sequenza nucleotidica indicata come SEQ ID NO: 1.
5) Polinucleotide od oligonucleotide isolato comprendente porzioni della sequenza nucleotidica indicata come SEQ ID NO: 2.
6) Polinucleotide od oligonucleotide complementare al polinucleotide od oligonucleotide secondo le riv. 4 e 5.
7) Polinucleotide od oligonucleotide omologo al 40% o superiore rispetto al polinucleotide od oligonucleotide secondo le riv. 4-6.
8) Polinucleotide od oligonucleotide omologo al 60% o superiore rispetto al polinucleotide od oligonucleotide secondo le riv. 4-6.
9) Polinucleotide od oligonucleotide omologo aH’80% o superiore rispetto al polinucleotide od oligonucleotide secondo le riv. 4-6. 13)Polipeptide o peptide omologo al 60% o superiore rispetto al polipeptide secondo la riv. 11. 14)Polipeptide o peptide omologo all’80% o superiore rispetto al polipeptide secondo la riv. 11. 15)Oligonucleotide antisenso in grado di ibridarsi con la sequenza di mRNA derivata dal cDNA che codifica per la proteina avente la sequenza indicata in SEQ ID NO: 3. 16)cDNA secondo la riv. 15 ottenuto per amplificazione POR mediante utilizzo di un primo oligo HT11-G e un secondo oligo H-AP7: 5'AAGCTTAACGAGG3'. 17)0!igonucleotide antisenso scelto fra quelli aventi la sequenza: SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. 18)Sequenza polinucleotidica o polipeptidica secondo le riv. 1-17 da usare in campo medico. 19) Plasmide comprendente il polinucleotide od oligonucleotide secondo le riv. 4-9. 20)Plasmide secondo la riv. 19 da impiegare come vettore di clonaggio e di espressione. 24)Cellu)a modificata con il plasmide secondo le riv. 19-20. 25) Cellula modificata secondo la riv. 24 in grado di esprimere la proteina indicata come SEQ ID NO: 3 o suoi frammenti o suoi omologhi al 40% di omologia o superiore. 26)Organismo pluricellulare, escluso l’uomo, comprendente cellule modificate secondo le riv. 24-25. 27)Anticorpi contro la proteina indicata come SEQ ID NO: 3. 28) Composizioni farmaceutiche comprendenti una sequenza polinucieotidica o polipeptìdica secondo le riv. 1-17 da usare in campo medico. 29) Composizioni farmaceutiche comprendenti una sequenza polinucieotidica o poiipeptìdica secondo le riv. 1-17 da usare per modulare l’apoptosi o altri tipi di morte cellulare e/o fa proliferazione e/o l'equilibrio di un compartimento cellulare. 30) Composizioni farmaceutiche secondo le riv. 28-29 comprendenti ulteriormente uno o più componenti scelti fra: anticorpi, enzimi, carriere, vettori. 31)Composizioni farmaceutiche comprendenti il vettore secondo le riv. come le distrofie muscolari ed altre; del muscolo cardiaco come la miocardiopatia dilatativa ed altre; di altri organi e tessuti; c) stati patologici conseguenti a danni ischemia acuti e cronici nei tessuti; d) patologie legate ad eccessiva o deregolata infiammazione, malattie autoimmunitarie, sclerosi multipla, psoriasi, rigetto di trapianto e reazione di trapianto contro l'ospite; e) iperplasie, displasie e malattie similari; f) AIDS, tubercolosi o altre malattie infettive in cui sia implicata l’apoptosi; g) altre patologie in cui sia implicata l’apoptosi; 33. Kit per la determinazione dell'apoptosi comprendente una sequenza polinucleotidica o polìpeptidica secondo le riv. 1-17. 34. Kit secondo la riv. 33 comprendente ulteriormente uno o più componenti scelti fra: anticorpì, enzimi, carriers, vettori, reagenti specifici, e altresì comprendente spiegazioni per l’utilizzo di detto kit. 35. Kit secondo le riv. 33-34 da impiegare per una fra le seguenti procedure: nell'invecchiamento; per preservare o ricostituire sopravvivenza e/o le dimensioni di sistemi cellulari di impiego nel lavoro di laboratorio, nella ricerca scientifica e/o nella diagnostica. 36. Impiego di una sequenza nucleotidica o polipeptidica secondo le riv, 1-17, o di parti di detta sequenza/e, per preparare farmaci che modulino l’apoptosi o altri tipi di morte cellulare e/o la proliferazione e/o l'equilibrio di un compartimento cellulare. 37. Impiego di una sequenza nucleotidica o polipeptidica, o dì parti di detta sequenza/e, secondo le riv. 1-17 per kit diagnostici.