ITRM20010088A1 - Peptide in grado di inibire l'attivita' del fattore di crescita derivato dalle piastrine (pdgf-bb) e del fattore di crescita derivato dai fi - Google Patents

Peptide in grado di inibire l'attivita' del fattore di crescita derivato dalle piastrine (pdgf-bb) e del fattore di crescita derivato dai fi Download PDF

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Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: " PEPTIDE IN GRADO DI INIBIRE L'ATTIVITÀ DEL FATTORE DI CRESCITA DERIVATO DALLE PIASTRINE (PDGF-BB) E DEL FATTORE DI CRESCITA DERIVATO DAI FIBROBLASTI (bFGF)
Il presente trovato riguarda l'identificazione e la sintesi di un peptide, derivato dal fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) avente la seguente struttura primaria:
Asp-Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu che verrà qui di seguito denominato PEPI.
Tale molecola analoga ad una sequenza propria della struttura di bFGF, si è rivelata in grado di inibire in vitro ed in vivo gli effetti prodotti dal fattore di crescita derivati dalle piastrine (PDGF-BB) ed inibire gli effetti del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF).
In particolare, le prove in vitro effettuate su cellule muscolari di ratto (RASMC) e cellule primarie endoteliali di bovino (BAEC) hanno evidenziato l'efficacia del trovato nell'inibire la proliferazione e la migrazione cellulare ad una concentrazione tale da non risultare tossico per le cellule.
Inoltre, le prove effettuate in vivo, su placche di matrice extra-cellulare ricostruita, iniettate per via sottocutanea in topi CD1, hanno dimostrato la capacità del trovato di inibire 1'angiogenesi indotta dal bFGF.
I dati ottenuti suggeriscono che PEPI è potenzialmente utile nel trattamento di patologie con disordini nella proliferazione e migrazione delle cellule vascolari, come la ri-stenosi dopo angioplastica, l'aterosclerosi, la crescita tumorale e la diffusione delle metastasi.
I fattori di crescita, come il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-BB) e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), svolgono un ruolo di primaria importanza nella proliferazione e differenziamento di molti tipi cellulari. Infatti, l'aumento della concentrazione e/o dell'attività di questi fattori è correlata all'insorgenza di molte patologie, fra cui la crescita tumorale e le malattie vascolari come l'aterosclerosi.
Il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-BB) e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) sono entrambi essenziali nella patogenesi delle malattie connesse all'angiogenesi, poiché direttamente coinvolti nella migrazione e proliferazione cellulare all'interno delle pareti vascolari (Ross, R., et al. 1990, Science, 248, 1009-1012; Ross, R. 1993, Nature, 362, 801-809).
L'angiogenesi è un processo fondamentale che influisce sullo sviluppo dei tessuti, così come sulla crescita tumorale e sulla sua diffusione. Essa è controllata da numerosi fattori capaci di modulare il differenziamento, la proliferazione e la migrazione cellulare (Holash, J., 1999, Oncogene, 18, 5356-5362; Zetter, B.R. et al., 1998, Annu. Rev. Med., 49, 407-424).
In vivo sono state utilizzate con successo varie molecole per inibire patologie associate a disturbi della proliferazione/migrazione delle cellule vascolari (come la ri-stenosi) come anticorpi neutralizzanti diretti contro il PDGF e il bFGF (Rutherford et al., Atherosclerosis, 1997, 45-51), e oligonucleotidi in grado di inibire l'espressione del recettore del PDGF (Sirois, M.G. et al., 1997, Circulation, 95, 669-676). Inoltre, sono attualmente disponibili altri inibitori specifici, capaci di interferire con il legame al recettore, o con la sua dimerizzazione, oppure con la trasmissione del segnale che esso determina (Heldin, C.H. et al., 1998, BBA, F79-F113).
PDGF e bFGF sono necessari per la crescita delle cellule tumorali in vitro, per la crescita dei tumori solidi in vivo, così come per la diffusione delle metastasi (Shawver, L.K. et al., 1997, Clin. Cancer Res., 3, 1167-1177; Vignaud, J.M. et al., 1994, Cancer Res., 54, 5455-5463; Chandler, L.A. et al., 1999, Int. J. Cancer, 81, 451-458; Westphal, J. R. et al., 2000, Int. J. Cancer, 15,86 (6), 768-776).
Attraverso l'inibizione dell'attività e/o del segnale del PDGF e del bFGF, si ottiene una riduzione effettiva della crescita tumorale ed una diminuzione della diffusione delle metastasi (Abramovich, R. et al., 1999, Br. J. Cancer, 79 (9-10), 1392-8; Bagheri-Yarmand, R. et al.,1998, Br. J. Cancer, 78 (1), 1118; Sola, F. et al, 1995, Invasion Metastasis, 15 (5-6), 222-231; Wang, Y. et al., 1997, Nature Med., 3, 887-893).
Pertanto, antagonisti specifici per il PDGF e il bFGF sono potenziali candidati per il trattamento di malattie proliferative e malattie connesse all'angiogenesi .
In accordo con dati recentemente ottenuti da uno degli inventori, il PDGF-BB e il bFGF hanno un ruolo insospettato nella modulazione delle loro funzioni pro-angiogeniche . In particolare, è stato dimostrato che il bFGF, oltre ad avere il noto effetto proangiogenico, può giocare anche un effetto inibitorio sulla proliferazione e migrazione delle cellule (Facchiano, A. et al., 2000, J. Cell. Sci., 113, 2855-2863) .
Inoltre, sono stati studiati i fattori che possano influenzare la conformazione tridimensionale di queste e quali siano le relazioni esistenti tra la conformazione e le funzioni biologiche (Ragone, R. et al., 1987, Italian J. of Biochem., 36, 306-309; Facchiano, F. et al., 1988, CABIOS, 4, 2, 303-305; Ragone, R. et al., 1989, Protein Engineering, 2, 7, 497-504; Facchiano, A. M. et al., 1989, CABIOS, 5, 4, 299-303; Facchiano, A.M. et al., 1991, CABIOS, 7, 3, 395- 396; Facchiano, A. et al., 1993, J. Mol. Evol., 36 (5), 448-457; Benvenga, S. et al., 1993, EOS-J. of Immunol. and Immunopharm., 13 (1), 18-19; Facchiano, A., 1995, J. Mol. Evol., 40, 570-577; Facchiano, A., 1996, Trends in Genetics, 12(5), 168-169; Scarselli, M. et al., 1997, J. Peptide Sci., 3, 1-9; Benvenga, S. et al., 1999, Amyloid, 6 (4), 250-255; Facchiano, A.M., 1999, Protein Eng., 12 (10),893; Pozzetto, U. et al., 2000, Transplant Int., Suppl. n. 1, 13, S306-S310; Facchiano, A. M., 2000, Bioinformatics, 16 (3), 292-293).
Nella presente invenzione attraverso un metodo di analisi di struttura, sono state identificate le regioni della sequenza aminoacidica del bFGF potenzialmente responsabili della sua attività biologica. Fra queste, un peptide avente la seguente struttura primaria:
Asp-Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu (di qui in poi denominato PEPI), derivato dal bFGF umano si è dimostrato capace di indurre in vitro una forte inibizione degli effetti prodotti dal bFGF, dal PDGF-BB e dal siero fetale bovino (FCS), come la proliferazione e la migrazione cellulare osservata in cellule primarie muscolari lisce di ratto (RASMC) e in cellule primarie endoteliali bovine (BAEC). Tale attività inibitoria è stata osservata ad una dose piuttosto bassa, pari a 10 nanogrammi/millilitro, alla quale il PEPI non risulta tossico in vitro. Come controllo sono state usate la forma denaturata al calore del peptide PEPI in cui l'ordine degli amminoacidi è stato riarrangiato casualmente: entrambe non mostrano alcuna attività.
Il peptide PEPI presenta inoltre una attività inibitoria significativa anche in vivo; esso, infatti, è in grado di inibire 1'angiogenesi in placche di matrice extra-cellulare ricostruita iniettate per via sottocutanea in topi CD1.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
In accordo con quanto sin qui osservato, il peptide PEPI, è stato sintetizzato con un sintetizzatore automatico, usando la tecnica di sintesi standard denominata f-moc.
In seguito, tre differenti campioni del peptide PEPI sono stati testati e hanno dato risultati simili nei saggi biologici effettuati. Inoltre, è stata preparata una versione del peptide riarrangiata casualmente (PEPlscr) usata, in seguito, come controllo negativo in tutti gli esperimenti condotti.
Su tale molecola sono stati effettuati una serie di test in vitro ed in vivo che hanno indicato le caratteristiche funzionali di tale peptide.
I risultati di tali test sono riportati nelle figure allegate in cui:
la Fig.l mostra i risultati di esperimenti di dose dipendenza condotti su cellule RASMC, in cui la proliferazione è indotta da FCS (10%), e valutata dopo 48 ore in presenza ed in assenza di PEPI a concentrazioni comprese tra lg/mi e 1 pg/ml;
la Fig.2A mostra l'effetto del PEPI e del PEPscr sulla proliferazione indotta da PDGF-BB (10ng/ml) in cellule RASMC;
la Fig.2B mostra l'effetto del PEPI e del PEPlscr sulla proliferazione spontanea, in presenza di BSA, in cellule RASMC;
la Fig.3A mostra l'effetto del PEPI e del PEPscr sulla proliferazione indotta da PDGF-BB (10ng/ml) in cellule BAEC;
la Fig.3B mostra l'effetto del PEPI e del PEPlscr sulla proliferazione spontanea, in presenza di BSA, in cellule BAEC;
la Fig.4A mostra l'effetto della presenza e dell'assenza di PEPI e PEPscr (10ng/ml) sulla migrazione cellulare indotta da FCS (1%) in cellule BAEC;
la Fig.4B mostra l'effetto della presenza e dell'assenza di PEPI e PEPscr (10ng/ml) sulla migrazione cellulare indotta da PDGFD-BB (10 ng/ml) in cellule BAEC;
la Fig.4C mostra l'effetto della presenza e dell'assenza di PEPI e PEPscr (10ng/ml) sulla migrazione cellulare indotta da bFGF (10 ng/ml) in cellule BAEC;
la Fig.5A mostra l'effetto della presenza e dell'assenza di PEPI e PEPscr sulla migrazione cellulare indotta da EGF (10ng/ml) in cellule BAEC;
La Fig.5B mostra l'effetto della presenza e dell'assenza di PEPI e PEPscr sulla migrazione cellulare indotta da aFGF (10ng/ml) in cellule BAEC;
la Fig.5C mostra l'effetto della presenza e dell'assenza di PEPI e PEPscr sulla migrazione cellulare indotta da Fibronectina (10ng/ml) in cellule BAEC;
la Fig.5D mostra l'effetto della presenza e dell'assenza di PEPI e PEPscr sulla migrazione cellulare indotta da VEGF (10ng/ml) in cellule BAEC;
la Fig.6 mostra l'effetto di PEPI e PEPscr sulla migrazione cellulare indotta da PDGF-BB (10ng/ml) in cellule RASMC;
la Fig.7 mostra l'effetto di PEPI e PEPscr sulla angiogenesi indotta da bFGF in placche di matrice extra-cellulare ricostruita, iniettate in topi CD1.
TEST DELL'ATTIVITÀ IN VITRO DEL PEPTIDE PEPI
Per questo studio sono state utilizzate cellule muscolari primarie di aorta di ratto (RASMC) ottenute da ratti maschi di ceppo "Wistar" di sei mesi di età, secondo una tecnica già nota (Sterpetti, A. V. et al., 1992, J. Vasc. Surg., 6, 16-20); cellule primarie endoteliali di aorta bovino (BAEC) ottenute secondo protocolli noti (D'Arcangelo, D. et al., 2000, Circ.Res.,86,312-318).
SAGGIO DI MIGRAZIONE
La migrazione cellulare è un processo fondamentale nello sviluppo di nuovi vasi sanguigni. Pertanto l'effetto di PEPI sulla migrazione indotta da diversi fattori chemio-attrattivi è stata testata principalmente su cellule endoteliali (BAEC). I saggi di migrazione sono stati effettuati in camere di Boyden modificate (prodotte da Neuroprobe Ine.),secondo la tecnica standar già nota (Albini, A. et al., 1995, Int. J. Cancer,61,121-129; Facchiano, A. et al., 2000, J. Cell. Sci., 113, 2855-2863). Le cellule sono state poste nella parte superiore della camera dell'apparato di Boyden. Come fattori chemioattrattivi sono stati utilizzati il siero fetale bovino (FCS) al 10%; i seguenti fattori ricombinanti umani: PDGF-BB, bFGF e il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF). Il peptide PEPI o il PEPscr (di controllo, riarrangiato casualmente) diluiti in acqua, sono stati aggiunti alla soluzione contenente il fattore di crescita alla concentrazione finale riportata in ogni esperimento. E' stata quindi analizzata la chemiotassi indotta dal bFGF (10ng/ml), 0 dal PDGF-BB (10ng/ml), o dal FCS (2%), misurata in assenza ed in presenza di 10ng/ml di PEPI e PEPlscr.
Tutti i saggi di migrazione sono stati eseguiti alla temperatura di 37°C in 5% C02, per una durata complessiva di 5 ore; successivamente i filtri sono stati rimossi, fissati con etanolo assoluto e colorati con blu di toluidina. Le cellule migrate sono state quindi contate ad un ingrandimento 400X, in 15 campi per filtro, ed è stato riportato il numero medio di cellule per campo. Ogni esperimento è stato eseguito almeno tre volte in duplicato.
Gli esperimenti hanno evidenziato che, in tutti 1 casi, PEPI inibisce significativamente e più del 50%, la migrazione delle BAEC, mentre PEPlscr non mostra alcun effetto (Figure 4A, 4B e 4C). Quando sono stati testati bFGF o PDGF-BB, PEPI è stato utilizzato sia nella porzione superiore che in quella inferiore dell'apparato di Boyden, ed è stata osservata un'attività inibitoria lievemente migliore quando viene dispensato nella parte inferiore.
Contrariamente a ciò il controllo riarrangiato PEPlscr non mostra alcuna attività in entrambe le porzioni della camera di Boyden. Al fine di valutare la specificità di tale effetto inibitorio è stato testato l'effetto di PEPI su altri fattori chemioattrattivi. La migrazione delle cellule endoteliali indotta da aFGF o VEGF o EGF o Fibronectina non viene influenzata dal PEPI né dal peptide PEPlscr (Figure 5A, 5B, 5C e 5D), indicando che la molecola in oggetto influenza specificamente bFGF e PDGF-BB.
Risultati simili sono stati ottenuti sulla chemiotassi di cellule RASMC indotte da PDGF-BB e FCS. PEPI è in grado di inibire la migrazione delle RASMC del 60% circa, mentre la versione PEPlscr risulta inattiva (Figura 6).
SAGGIO DI PROLIFERAZIONE
Il saggio di proliferazione è stato condotto sia su cellule primarie di aorta di ratto SMC che su cellule endoteliali bovine (BAEC). Le cellule sono state seminate in pozzetti da 6 (lxlO<5 >cellule/pozzetto), lasciate crescere per 24 ore in Dulbecco Modified eagle's medium (DMEM) addizionato con 10% FBS, alla temperatura di 37°C in 5% C02. Quindi, il terreno di coltura è stato sostituito con terreno DMEM contenente 0.1 % BSA per 24 ore. Successivamente tale terreno è stato nuovamente sostituito con terreno fresco contenente solo 0.1 % BSA, oppure 0.1 % BSA e fattori di crescita alla concentrazione finale di 10 ng/ml o siero fetale bovino (FCS) al 10%, il tutto in presenza o in assenza del peptide PEPI o del peptide di controllo. Ogni saggio è stato effettuato a tempi crescenti fino ad un massimo di 3 giorni e le cellule sono state contate con un ematocitometro.
Il PEPI è stato dapprima testato in esperimenti di dose-dipendenza: cellule di ratto RASMC nelle quali è stata indotta la proliferazione da FCS al 10%, sono state analizzate a 48 ore, in presenza ed in assenza di differenti dosi di PEPI le cui concentrazioni variavano da 1 microgrammi/mi a lpg/ml (figura 1). Come controllo sono stati utilizzati la forma denaturata al calore di PEPI e la versione riarrangiata casualmente. Il PEPI ha mostrato in questi esperimenti una attività inibitoria dipendente dalla dose utilizzata, che raggiunge il 60% di inibizione ad una concentrazione di 10ng/ml, mentre i peptidi di controllo non evidenziano alcuna attività. Di conseguenza la dose di 10ng/ml è stata scelta per i successivi esperimenti in vitro.
L'effetto del PEPI è stato testato sulla proliferazione indotta dal PDGF-BB e dal bFGF (10ng/ml per ciascun composto), in cellule RASMC e in cellule BAEC. La figura 2A mostra il marcato decremento della proliferazione indotta dal PDGF-BB. In esperimenti fermati a diversi tempi, la proliferazione indotta dal PDGF-BB (10ng/ml) viene significativamente inibita dalla presenza del PEPI in tutti i punti analizzati. La presenza del PEPI riesce quasi a bloccare completamente la proliferazione delle cellule, mentre il peptide di controllo riarrangiato (PEPlscr) non mostra alcun effetto a qualsiasi tempo testato (figura 2Δ).
La proliferazione spontanea (in presenza di albumina serica bovina, BSA) non viene influenzata in maniera significativa né da PEPI né da PEPlscr a nessuno dei tempi analizzati, indicando che entrambe le molecole non risultano tossiche per sé alle dosi utilizzate sia sulle cellule RASMC (Figura 2B), che sulle cellule BAEC (figura 3B). PEPI inoltre mostra un effetto inibitorio simile nelle cellule BAEC stimolate con bFGF (10ng/ml) (Figura 3A).
E' stato poi eseguito in vivo il seguente test: ANGIOGENESI NELLE PLACCHE DI MATRICE EXTRA-CELLULARE
RICOSTRUITA
L'angiogenesi in placche di matrice extra-cellulare ricostituita (denominate "Matrigel", prodotte da Collaborative Biomedicai Products, Beckton-Dickinson) è stata eseguita come riportato in precedenza (Muhlhauser, J., 1995, J. Circ. Res. ,77,1077-1086). Brevemente, sono stati iniettati per via sotto-cutanea in topi CDl (femmine di 19 settimane di età), le placche di matrice extracellulare ricostruita addizionate con bFGF (150 ng/ml) in assenza o in presenza del PEPI (10 microgrammi/ml) . Il bFGF induce la formazione della rete dei capillari in 7 giorni, quindi le placche sono state espiantate dopo 7 giorni dall'iniezione e incluse in paraffina. Le sezioni ottenute sono state colorate con la procedura tricromica di Masson, osservate con un analizzatore di immagine ottico, ed è stato quantificato il numero di vasi per mm<2 >all'interno delle placche.
La figura 7 mostra la potente azione del peptide PEPI nell'inibire la formazione dei vasi sanguigni indotta dal bFGF (ovvero 46% di inibizione rispetto al bFGF da solo). Dieci animali sono stati usati come controllo (trattati con solo bFGF) e quattordici animali invece sono stati trattati con bFGF in presenza di PEPI. Questo esperimento dimostra che il peptide PEPI è in grado di inibire fortemente la nuova formazione di vasi sanguigni indotta dal bFGF ed indica che questa molecola costituisce un buon candidato per ulteriori studi in vivo.
In conclusione:
1) PEPI ha mostrato una potente e specifica azione inibitoria sulle proprietà mitogene e chemioattrattive del fattore di crescita derivato dalle pistrine (PDGF-BB) , del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF)e del siero fetale bovino (FCS) in vitro.
2) E' stata dimostrata una attività anti-angiogenica in vivo in saggi che utilizzano le placche matrice extra-cellulare ricostruita.
Questi risultati indicano il PEPI come un ottimo candidato per ulteriori ricerche in modelli animali di crescita tumorale e metastasi, e di altre malattie vascolari .

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI 1) Peptide avente la seguente struttura primaria: Asp-Pro-His-Lle-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu 2) Peptide avente una identità di sequenza di almeno il 60% con la sequenza secondo la rivendicazione 1. 3) Peptide avente una omologia di carica elettrica o idrofilia o idrofobicità o grado di esposizione al solvente o conformazione tridimensionale, pari ad almeno il 60% della sequenza secondo la rivendicazione 1. 4) Molecole peptidiche e non-peptidiche che mostrino una somiglianza conformazionale o di disposizione di gruppi funzionali, di almeno il 60% con la sequenza secondo la rivendicazione 1. 5) Uso dei peptidi secondo le rivendicazioni 1 o 2 o 3 o 4 come inibitori del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF). 6) Uso dei peptidi secondo le rivendicazioni 1 o 2 o 3 o 4 per fare un medicamento in grado di modificare la proliferazione cellulare. 7) Uso dei peptidi secondo le rivendicazioni 1 o 2 o 3 o 4 per fare un medicamento in grado di modificare la migrazione cellulare e la migrazione delle cellule neoplastiche verso potenziali siti di metastasi . 8) Uso dei peptidi secondo le rivendicazioni 1 o 2 o 3 o 4 come inibitori della crescita di tumori primari e metastasi. 9) Uso dei peptidi secondo le rivendicazioni 1 o 2 o 3 o 4 per fare un medicamento da utilizzare come coadiuvante nella terapia delle patologie neoplastiche e vascolari. 10) Uso dei peptidi secondo le rivendicazioni 1 o 2 o 3 o 4 per fare un medicamento utilizzabile nel trattamento delle malattie vascolari. 11) Uso dei peptidi secondo le rivendicazioni 1 o 2 o 3 o 4 per fare un medicamento utile nella terapia degli eventi trombotici e delle patologie associate .
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