ITRM20010120A1 - Gene cctra come strumento per produrre progenie di soli maschi nella mosca mediterranea ceratitis capitata. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

della domanda di Brevetto per Invenzione industriale dal titolo:

"Gene Cctra come strumento per produrre progenie di soli maschi nella mosca mediterranea Ceratitis Capitata"

Campo dell'invenzione

La presente invenzione è relativa al gene Cctra come strumento per produrre progenie di soli maschi nella mosca mediterranea Ceratitis Capitata.

Arte nota

La Ceratitis capitata, detta mosca Mediterranea (medfly) è un dittero ben conosciuto a causa degli ingenti danni che provoca alla produzione agricola in Italia e nelle altre aree Mediterranee, come anche nel Nord, Centro e Sud America (Robinson and Hooper, 1989). La medfly, originaria deil' Africa occidentale, ha invaso aree sempre più estese migrando nell'ultimo secolo, probabilmente grazie all'intensificarsi dei trasporti e delle coltivazioni agricole, non solo in Europa ma anche in Australia e nelle Americhe. Ogni femmina inietta mediante l'ovopositore centinaia di embrioni, future larve, nei corpi fruttiferi di oltre 200 specie vegetali di cui più di un centinaio hanno importanza economica (Christenson and Foote, 1960). Inoltre la sua presenza in un paese determina severe restrizioni all'esportazione dei prodotti agrìcoli a causa delle necessarie quarantene imposte dalle organizzazioni di controllo nazionali ed interazionali, quali ad esempio la APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) negli Stati Uniti (Malavasi et al., 1994). Ad esempio, gii USA, la Nuova Zelanda, il Cile ed il Giappone, che attualmente non hanno infestazioni della medfly, proibiscono l'importazione di frutti freschi da paesi in cui non è stata ancora eradicata. Il danno è causato dalle larve che vivono e si nutrono della polpa nel corpo fruttifero della pianta ospite e dalle punture dell'ovopositore che permettono l'entrata nel frutto di micro-organismi che ne causano il deperimento e la caduta prematura (Mitchel and Saul, 1990). In Centro America, escludendo il Messico e Panama, è stato stimato che la medfly ha causato danni annuali pari a più di 25 milioni di dollari US e nel solo Messico anche fino a 800 milioni di dollari US (Gibbs and Eerde, 1981).

Come strategia di eradicaione della medfly, in alternativa ai pesticidi (il più usato negli Stati Uniti è il malathion) o, a volte, in combinazione con quantità ridotte degli stessi (Califonia, USA), viene utilizzata la Tecnica dell'Insetto Sterile (SIT). La SIT è un metodo di controllo non inquinante per Cambiente, che si basa suil'allevamento massivo, la sterilizzazione ed il rilascio di un enorme numero di mosche (Knipling, 1955). Inoltre a differenza dei pesticidi, risulta essere specie-specifico, dato che non elimina specie benefiche come gli impollinatori o specie nemiche naturali. L'accoppiamento dei maschi sterili rilasciati con le femmine native determina un decremento delie potenzialità riproduttive della popolazione infestante residente ed una sua eradicazione, quando vengano rilasciati maschi in quantità sufficiente e per un periodo abbastanza lungo. La dimostrazione del successo della SIT in esperimenti su piccola scala contro la medfly in Hawaii, Costa Rica, Italia ed altre parti del mondo ha portato ad adottarla su scala massiva in Messico, Perù, Guatemala, Chile, Argentina, Florida e California (Boiler, 1987).

L'evento chiave che determina il successo della SIT è il trasferimento di spermi irradiati (radiazioni X o gamma) che portano mutazioni letali dominanti dai maschi rilasciati alle femmine selvatiche. Dato che in Ceratitis, come nella maggior parte degli insetti, il rapporto tra i due sessi è di 1:1, la SIT viene effettuata rilasciando mosche di entrambi i sessi. Tuttavia le femmine allevate, irradiate e rilasciate insieme con i maschi, non contribuiscono alla soppressione della popolazione infestante: infatti i maschi sono poligami e, dopo il rilascio di mosche sterili, si accoppieranno più volte con le varie femmine disponibili. La poligamia aumenterà le probabilità di incontro tra maschio selvatico e fémmina selvatica, piuttosto che con la sterile, annullando l’effetto di soppressione che potrebbero esercitare le femmine sterili. I maschi sterili invece si accoppieranno ciascuno con più fémmine selvatiche e determineranno un marcato effètto di soppressione della popolazione residente. Inoltre le fémmine rilasciate contribuiscono ai danno causato dalla popolazione infestante perforando con l'ovopositore i corpi fruttiferi che possono andare anche in deperimento. Le femmine possono presentare una differente sensibilità alle radiazioni e quindi risultare solo parzialmente sterili rispetto ai maschi irradiati. I maschi sterili, se rilasciati insieme alle femmine sterili, tendono ad accoppiarsi con esse piuttosto che con le selvatiche.

Per potenziare la SIT sono stati, quindi, sviluppati ceppi di Ceratitis con cui è possibile selezionare la progenie maschile, separandola dalla femminile, sterilizzarla e rifasciarla nelle zone infestate. Il controllo generale esercitato con questa strategia sulle infestazioni è più efficace di quello ottenuto con il rilascio di mosche sterili di entrambi i sessi ed inoltre vengono abbattuti i costi di irradiazione e rilascio a parità di numero di mosche (Rendon et al., 2000). I programmi di prevenzione possono essere condotti senza il timore di provocare comunque danni alle colture vegetali a causa delle punture effettuate dalle femmine sterili rilasciate. Sono stati sviluppati ceppi per separare i sessi con metodi genetici e basati suU’utilizzo di traslocazioni cromosomiche che permettono di assodare al cromosoma Y e quindi alla mascolinità, particolari geni selezionabili. Mediante irradiazione con raggi X o gamma sono state indotte rotture cromosomiche e traslocazioni nei nude) delle cellule di Ceratitis a stadio pupale o di maschio adulto. Dopo opportuni incrod sono state selezionate linee che portano traslocazioni cromosomiche reciproche Y-A (Cromosoma Y e un Autosoma) identificandole sulla base di una riduzione della fertilità dei maschi oppure utilizzando analisi di pseudo-linkage di marcatori genetid con il cromosoma Y (Fisher, 2000). In taf modo sono stati sviluppati due tipi di ceppi GSS (Genetic Sexing Strain): il primo è basato sull'utilizzo di una mutazione che causa una colorazione bianca della pupa, invece del color marroncino selvatico; il secondo, più recente e più effidente, è invece basato su una mutazione temperatura-sensibile letale a stadio embrionale (TSL). In entrambi i casi l'allele selvatico è presente in un frammento autosomico traslocato sul cromosoma Y ed il frammento reciproco del cromosoma Y risulta invece traslocato sull'autosoma. La seconda copia dell'autosoma, quella non interessata alla traslocazione, porta un allele mutante. Questi maschi vengono accoppiati con femmine che hanno l'allele mutato in omozigosi sull'autosoma. In tal modo nel primo ceppo traslocato la progenie maschile ha un colore della pupa scura mentre la femminile ha una pupa chiara. Nel secondo ceppo inveoe gli embrioni XY riescono a sopravvivere ad un “heatshock” di 34°C per 24-48 ore perchè hanno un allele selvatico del locus tsl associato al cromosoma Y (ed un frammento di Y, che non contiene il fattore M, traslocato in modo reciproco sullautosoma) mentre le femmine hanno l'allele mutante autosomico in omozigosi (Fisher, 2000).

E da tenere in debita considerazione tuttavia che l'utilizzo di mutazioni TSL e traslocazioni cromosomiche determina una ridotta fertilità del ceppo allevato massivamente ed una periodica instabilità (cromosomica) del sistema di "sexing". Per tale ragione, in parallelo alle strategie di genetica classica nell'ultimo decennio sono state effettuate ricerche di genetica molecolare per ottenere nuovi sistemi di produzione di soli maschi in Ceratitis capitata (Louis et al., 1987; Furia et al., 1992; Saccone et al., 1996; idem, 2000).

I requisiti di un buon metodo di produzione di progenie maschile per Ceratitis capitata, come per ogni aftro insetto dannoso, sono che fa mutazione risulti stabile in condizioni di allevamento massivo e che permetta di evitare la perdita della metà della popolazione allevata (le femmine). Gli autori hanno tentato la strategia di indurre in Ceratitis una totale reversione del sesso da femminile a maschile in individui XX e sono da anni impegnati alla ricerca di geni che regolano la determinazione del sesso di Ceratitis. A tal fine possono utilizzare una tecnica di trasferimento genico in Ceratitis (Loukeris et al., 1995; Zwiebel et al., 1995) che permette di inserire stabilmente nel genoma di questa specie frammenti di DNA esogeni. In questo modo gli autori si propongono di produrre ceppi trasformati geneticamente che portano un transgene in grado di indurre o una letalità condizionale femmina-specifica o, meglio ancora, una trasformazione sessuale di femmine in maschi. Dato che i ceppi per il "sexing” di Ceratitis basati su traslocazioni e mutazioni risultano essere instabili in condizioni di allevamento massivo, la manipolazione genetica basata suH'utilizzo di trasposoni può risultare una soluzione alternativa e preferibile a quelle note. Infatti è stato dimostrato ad esempio sia in Drosophla con il trasposone P che in Cerattis con il trasposone Minos, che le inserzioni risultano essere stabili di generazione in generazione. La tecnica di trasferimento genico che utilizza il trasposone Minos è descritta in US Patent n. 05348874.

Nel modello genetico D. melanogaster il sesso dell'individuo viene determinato dal numero di cromosomi X rispetto al numero della serie di Autosomi (X:A ratio) (XX:AA=1 femmine ed XY:AA=0,5 maschi). Il segnale primario “X:A ratio" agisce su un unico gene chiave, Sex-lethal ( Sxl ), attivandolo solo in embrioni XX.AA (Cline and Meyer, 1996; Keyes et al., 1992).

Sxf a sua volta attiva allo stadio larvale nelle sole femmine il gene transformer (tra) e questo modifica l'espressione del gene doublesex ( dsx ), in modo da reprimere il differenziamento sessuale maschile e promuovere quello femminile. In embrioni XY la mancata attivazione di Sxi e quindi di tra, determina una diversa attivazione di dsx che, all'opposto, promuove uno sviluppo maschile reprimendo quello femminile (Burtis and Baker, 1989). La determinazione del sesso è basata su una cascata regolativa in cui eventi di splicing alternativo sesso-specifico producono trascritti parzialmente differenti nei due sessi a partire dai geni Sex-lethal (Sxl), transformer (tra), transformer-2 (tra-2) e doublesex ( dsx ). fn Drosophifa è stato possibile isolare ceppi mutanti in questi geni (o transgenici) nei quali è sufficiente un particolare incrocio o un “beat-shock" per produrre progenie unisessuale (McKeown et al., 1988; Polito et al., 1990; Fortier and Belote, 2000). Quindi Drosophila rappresenta un punto di riferimento per lo studio delle strategie di controllo di vari insetti dannosi sia all'agricoltura ( Ceratitis capitata) che alla salute umana {Anopheles gambiae, noto vettore della malaria).

Nonostante la posizione chiave occupata da Sxl in questa cascata regolati va, geni omologhi a Sxl, isolati in ditteri appartenenti a famiglie diverse dalle Drosophiidae, quali ad esempio Ceratitis capitata (Tephritidae), Mosca domestica (Muscidae) e Megaselia scalaris (Phoridae; più di 200 M.A da Drosophila)) non presentano una regolazione sesso-specifica conservata (Saccone et al., 1996; Sievert et al., 1997; Meise et al., 1998; Saccone et al., 1998; Schutt and Nothiger, 2000). Tali osservazioni suggeriscono che il ruolo del gene Sxl nella determinazione del sesso non sia evolutivamente conservato tra gli insetti.

Anche il segnale primario per la determinazione del sesso di Ceratitis capitata è differente rispetto a quello di Drosophila. Infatti esso consiste di uno o piu’ fattori mascolinizzanti localizzati in prossimità del centromero sul braccio lungo del cromosoma Y la cui natura genetico-molecolare non è al momento conosciuta (Willhoeft and Franz, 1996).

A tutt’oggi è quindi irrisolto il problema del comprendere se negli insetti la determinazione del sesso sia un meccanismo genetico evolutivamente conservato.

Sommario dell'invenzione

La presente invenzione è basata sull’ipotesi che il gene tra sia conservato evolutivamente.

L’ipotesi è stata dagli autori provata isolando l'omologo del gene tra di Drosophila in Ceratitis (Cetra) e rivelando che esso risulta regolato in modo sesso-specifico mediante splicing alternativo. Si propone quindi che nei ditteri in generale e in Ceratitis in particolare sia evolutivamente conservato il segmento regolativo tra>dsx delia cascata regolativa di Drosophila. Al fine di investigane la funzione in VÌVO svolta dal gene Cetra è stata utilizzata la tecnica del silenziamento genico (delta anche “RNA interference") mediato da molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA, doublé strand RNA) con sequenza specifica del gene Cetra.

Iniettando molecole di dsRNA, prodotte artificialmente a partire da un clone di cDNA di Cetra da noi isolato e utilizzato come stampo per la trascrizione in vitro , dimostriamo che è possibile indurre una reversione del fenotipo sessuale da femminile in maschile. Questo esperimento dimostra inoltre che il gene tra di Drosophila risulta essere funzionalmente conservato in un ditero appartenente ad una famiglia (T ephritidae) moderatamente distante dal punto di vista filogenetico dalla famiglia delle Drosophililiae (120 M A; Beverley and Wilson, 1984). L’oggetto della nostra invenzione consiste quindi nell’identificazione ed isolamento di un gene, Cetra, di Ceratitis che funziona da regolatore principale della determinazione del sesso ed in una sua manipolazione genetica ad hoc per utilizzarlo in esperimenti di "gene silencing", tecnica già sviluppata da alcuni anni (Fire et al. 1998, Kennerdel and Carthew, 1998). Infatti dimostriamo qui di seguito che iniettando molecole di dsRNA complementari alla sequenza di Cetra in fasi precoci dello sviluppo embrionale e’ possibile trasformare il fenotipo sessuale di Ceratìtis mascolinizzando in modo apparentemente completo individui dal cariotipo XX (femmine).

Altro scopo dell’invenzione è il metodo per produrre progenie di soli maschi nella mosca mediterranea Ceratitis Capitata.

Ulteriori scopi dell’invenzione riguardano i piasmidi e vettori costruiti per perseguire il metodo dell’invenzione, riguardano anche le cellule comprendenti tali vettori e gli animali transgenici non umani comprendenti tali cellule.

Alri scopi risulteranno evidenti dalla descrizione dell'invenzione.

Breve descrizione delle figure

Fig. 1 Analisi per Northern blot dei trascritti prodotti dal gene Cetra in maschi e femmine adulti. Si possono osservare due trascritti maschio-specifici di circa 1,9 e 1,7 Kb e due i trascritti femmina-specifici di 3,5 e 1,6 Kb. Fig. 2. Sequenza nucleotidica Seq. IDN. 1 del cDNA F1 derivato da un trascritto femmina-specifico del gene Cetra. E’ riportata anche la sequenza aminoacdica Seq. IDN. 2 dedotta corrispondente alla proteina CcTRAF lunga 429 aa. Il simboletto a forma di V indica le posizioni dei bordi introneesone. Le due frecce indicano le posizioni dei due oligonucleotidi utilizzati per produrre molecole di dsRNA.

Fig. 3. Allineamento delle putative sequenze aminoacidiche delle varie proteine omologhe TRA sia delle Drosophilidae che di C. capitata. Le zone più conservate sono indicate con 4 box numerate in cui sono evidenziati in grassetto gli aminoacidi conservati in tutte le proteine allineate. In azzurro sono indicate (e posizioni amminoacdiche comuni a CcTRA, DvTRA e DhTRA. Inoltre le frecce verticali indicano le posizioni degli introni nei geni corrispondenti.

Fig. 4. Analisi per RT-PCR dei trascritti prodotti dal gene Cctra in femmine (2) e maschi (4) adulti di Ceratitis. In A è mostrato uno schema che individua le posizioni del due oligonudeotidi utilizzati nella reazione di amplificazione rispetto ai vari esoni di cui è composto il locus Cctra. In B è mostrato il risultato di una corsa elettroforetica delle reazioni di RT-PCR effettuate: il frammento di cDNA amplificato in femmine è pari a circa 1,3 Kb, come atteso sulla base della sequenza del clone FI (vedi Fig. 2); il frammento di cDNA amplificato in maschi risulta più grande e pari a orca 1 ,6 Kb. Questo prodotto maschio-specifico è stato clonato e ne è stata deteminata la sequenza nucleotidica parziale (dati non mostrati), che evidenzia la presenza di due esoni maschio-specifici addizionali riportati in A in colore blu.

Fig. 5. Differenti classi fenotipiche di mosche trattate secondo l'invenzione. Fig. 6. Linee di corsa elettroforetica di amplificati su DNA genomico.

Descrizione detagliata dell'invenzione

Nella descrizione le dizioni cDNA F1 e cDNA M1 si riferiscono rispettivamente a cDNA femmina-specifico e maschio-specifico.

I risultati funzionali ottenuti dagli autori possono essere riprodotti anche con sequenze nucleoniche e/o aminoacidiche aventi un grado di identità del 40% o superiore, preferibilmente del 60% o superiore, più preferibilmente dell'80% o superiore, ancor più preferibilmente del 90% o superiore rispetto alle sequenze qui di seguito indicate (Yang et al., 2000).

Data la bassa conservazione evolutiva della sequenza nucleotidica di transformer in vane specie di Drosophila (O'Neif and Beiote, 1992), abbiamo scelto di tentare l'isolamento dell'omologo in Ceratitis evitando di impiegare ibridazioni a bassa strìngenza ed utilizzando invece il gene l(3)73Ah (sequenza AE003526[ACCN]). Questo gene risulta strettamente associato a tra (le regioni 3' non tradotte dei due geni sono parzialmente sovrapposte), questa associazione è conservata in altre specie di Drosophilidae ed il gene è altamente conservato per sequenza anche in vertebrati (O’Neil and Beiote, 1992; Irminger-Finger and Nothiger, 1995).

Abbiamo quindi isolato una regione dal genoma di Ceratìtis che risulta contenere l'omologo del gene !(3}Ah ed In sua prossimità l’omologo del gene transformer, che abbiamo chiamato Cetra. Il gene Cctra, come in Drosophila, produce trascrìtti sesso-specifici di differente grandezza. Infatti un clone di cDNA (detto F1) isolato successivamente da una genoteca di femmine adulte ed utilizzato come sonda radioattiva in esperimenti di Northern blot identifica in femmine due messaggeri rispettivamente di crca 3,5 Kb e di 1,6Kb ed in maschi due messaggeri di circa 1,7 Kb e 1,9 Kb (Fig. 1). Il cDNA F1 contiene un inserto di 1,6 Kb e potrebbe, quindi, corrispondere al trascritto femmina-specifico di pari grandezza. Il clone F1 analizzato per sequenza presenta uno schema di lettura aperto che codifica per una proteina di 429 aminoacidi, ricca in serine ed arginine (che costituiscono il cosidetto "motivo” SR) e con brevi regioni di similarità con le proteine TRA delle Drosophilidae (Fig. 2 e Fig. 3).

In un esperimento di RT-PCR due oligonucleotidi (F+ e Z1-) hanno amplificato da RNA estratto da maschi e da femmine, due prodotti rispettivamente di circa 1,6 Kb e di 1,3 Kb (Fig. 4). Il prodotto femmina-specifico di 1,3 Kb ha una lunghezza che è pari a quella attesa sulla base della sequenza del clone F1. Il prodotto di 1 ,6 Kb, che invece risulta più grande, è stato clonato in plasmide (cone MI) e ne è stata determinata la sequenza nudeotidica. Comparando la sequenza del clone M1 con quella del clone F1 è stato possibile stabilire che esso contiene due esoni addizionali, inseriti nella regione codificante e lunghi rispettivamente 40 e 197 nt. Il primo di questi due esoni maschio-specifici introduce un codone di terminazione che determina una possibile traduzione di una proteina CcTRA di soli 59 aminoacidi.

La parziale determinazione della sequenza nudeotidica di un done genomico e la comparazone con le sequenze dei cloni F1 ed M1 ha permesso di stabilire che il locus Cctra è costituito da 5 esoni di cui 2 sono maschiospecifici (Fig. 4A).

L'analisi funzionale del gene transformer di Ceratitis capitata e' stata condotta mediante esperimenti in vivo basati sulla tecnica della "RNA interference” (RNAi) (Fire et al.,1998). Per questo scopo molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA) corrispondenti a regioni esoniche del gene Cctra sono state iniettate in embrioni di Ceratitis capitata. In particolare la regione scelta per la RNAI si estende dalla posizione 154 (esone1) alla posizione 893 (esone 5) del cDNA femmina-specifico di Cctra F1 (Fig 5) e corrisponde a regioni esoniche presenti nel clone di cDNA F1 e nel clone di cDNA MI.

Per produrre il dsRNA di Cctra sono stati disegnati quattro oligonudeotidi sintetici denominati: 154+, 154+/T7, 893- e 893-/T7 in base alla sequenza del cDNA Cctra F1. Gli oligonucleotidi 154+/T7 e 893-/T7 presentano al 5' la sequenza del promotore per l'RNA polimerasi del fago T7. Usando tali oligonucleotidi nella combinazione 154+ con 893-/T7 e 164+/7 con 893-ed il cDNA Cctra F1 come stampo, sono stati amplificati per PCR frammenti di DNA di circa 0.8 Kb che differiscono sdo per la posizione dei promotore artificiale.

Successivamente a partire da tali frammenti é stata eseguita una reazione di trascrizione in vitro che ha permesso di ottenere i due RNA a singolo filamento senso e antisenso complementari (ssRNA). Infine quantità equimolari dei due ssRNA sono state poste in soluzione di annealing in modo da ottenere gli RNA a doppio filamento e il dsRNA e' stato poi trasferito nel buffer di iniezione. Sono stati iniettati, con il dsRNA prodotto, 300 embrioni di mosche del ceppo white eye, nel polo posteriore, e 210 embrioni di mosche del ceppo selvatico Benakeion nel polo anteriore. Dagli embrioni iniettati si sono sviluppate 149 larve appartenenti al ceppo white eye (tasso di sopravvivenza embrionale del 49,6%) e 89 larve del ceppo Benakeion (tasso di sopravvivenza embrionale del 42,3%) (Tab. 1). Sono state successivamente raccolte 84 pupe white eye (tasso di sopravvivenza larvale del 56,3%) e 68 pupe Benakeion (tasso di sopravvivenza larvale del 76,4%). Infine sono nate 69 mosche white eye (tasso di sopravvivenza degli adutti rispetto agli embrioni iniettati del 23%) e 48 mosche Benakeion (tasso di sopravvivenza degli adulti rispetto agli embrioni iniettati del 22,8%). Le mosche adulte possono essere suddivise nelle classi fenotipiche riportate in Tab. 1.

Tabella 1

Il rapporto fra i sessi delle mosche nate dai due esperimenti risulta essere chiaramente sbilanciato in favore del sesso maschile. Nelle mosche nate dalie iniezioni al polo posteriore di embrioni del ceppo white eye, la percentuale di maschi nati rispetto alle femmine è del 98,3%, mentre per le mosche nate dalle iniezioni nel polo anteriore di embrioni del ceppo selvatico Benakeion, la percentuale di maschi nati rispetto alle femmine è del 90,6%. Tali percentuali potrebbero essere dovute ad una letalità femminaspecifica oppure ad una completa mascolinizzazione delle mosche XX di sesso femminile (le percentuali sono state calcolate considerando solo le mosche dei due sessi con fenotipo normale). Sono inoltre presenti mosche con fenotipi intermedi, che possiamo definire intersessi. Questi intersessi mostrano una trasformazione sessuale parziale, limitata alla regione prossima al polo di iniezione, infatti dalle iniezioni ai polo posteriore di embrioni del ceppo white eye sono state ottenute sei mosche intersessi con apparato riproduttore maschile, ma con la testa di tipo femminile (occhi con riflessi verdi ed assenza delle antenne). Dalle iniezioni ai polo anteriore di embrioni del ceppo selvatico Benakeion, invece, si sono sviluppate dieci mosche intersessi con apparato riproduttore femminile, ma con la testa di tipo maschile (presenza di antenne e riflessi sull’occhio di colore blu elettrico). Sono state ottenute inoltre 7 mosche su 117 (1 femmina e 6 maschi), con malformazioni dell'apparato riproduttivo esterno, che risulta solo abbozzato o quasi completamente assente.

In figura 5 sono riportate le differenti classi fenotipiche ottenute. Nella figura 5 A, sono mostrate rispettivamente in basso una femmina selvatica (6enakion) ed in alto una mosca iniettata ( Benakion ) che presenta un fenotipo a mosaico intersesso, con l'addome femminile e la testa maschile (vedi antenne maschio-specifiche). In 5B e 5C sono mostrati rispettivamente un maschio dal fenotipo sessuale normale (ceppo white eye) ed uno privo di antenne (ceppo white eye ; iniezione posteriore), un tratto fenotipico interpretabile come incompleta mascolinizzazione della testa. In fìg. 50 sono ritratte in atto una femmina (ceppo white eye ) ed in basso una femmina iniettata che ha un anomalo apparato riproduttivo esterno. In Fig. 5E infatti si può osservare questa zona ingrandita che ha un aspetto chiaramente differente dalla forma selvatica femminile (Fig. 5F) ed è priva del caratteristico ovopositore.

Il maschio di Ceratitìs presenta nell’occhio un riflesso blu (Fig. 5H) che invece è assente nella femmina (Fig. 5G) ma che è presente in intersessi iniettati al polo anteriore che hanno testa "mascolinizzata” ed apparato riproduttivo femminile (Fig. 51 e 5A in alto).

Nelle poche mosche intersessi la conrelazione tra sito di iniezione (anteriore-posteriore) in embrioni ed effetto locale sul fenotipo sessuale dell'adulto (testa-addome) è spiegabile con il fatto che lo sviluppo dei ditteri è basato su un sistema di coordinate antero-posteriori e dorso-ventrali in parte attivo già nell'uovo e poi nell'embrione che stabilisce a questi stadi precoci "quali" siano i vari gruppi cellulari che daranno origine alle varie strutture dell'adulto (Carroll, 1998).

I dati raccolti suggeriscono fortemente che l’iniezione del dsRNA specifico interferisca con la normale espressione dei gene Cctra, reprìmendo, come atteso, la sua funzione negli individui iniettati. La disparita’ osservata nel numero di individui dei due sessi può essere spiegata con due ipotesi alternative: 1) il <,,>silenziamento<,, >di transformer" e' letale per le femmine che quindi non arrivano allo spupamento; 2) le femmine iniettate col dsRNA vanno incontro a reversione sessuale e si sviluppano in maschi apparentemente normali ma con cariotipo XX. Per discemere tra le due ipotesi abbiamo stabilito il cariotipo di dieci mosche di fenotipo maschile nate dall’iniezione al polo posteriore di embrioni del ceppo white eye. DNA genomico estratto da singola mosca e' stato sottoposto ad esperimenti di PCR basati sull'uso di oligonucleotidi che amplificano specificamente una regione del cromosoma Y di circa 1Kb (Anleitner and Haymer, 1991). Come controllo positivo di tale esperimento sono stati inclusi nella PCR i DNA genomici estratti da maschi e femmine del ceppo white eye dei due sessi. I risultati di tale esperimento sono mostrati in fig. 6A.

Nelle linee di corsa elettroforetica da 1 a 10 si osserva l’amplificato su DNA genomico delle mosche derivanti dall'esperimento di RNAi sul ceppo white eye. Nelle linee di corsa eiettroforetica 11 e 12 si osserva l'amplificato su DNA genomico estratto da femmine white eye. Nelle linee di corsa 13 e 14 e' riportato il risultato della PCR su maschi white eye. Nella linea 16 è presente il controllo negativo. Si può notare che soltanto 4 individui (1 -2-6-7) generano il pattern di amplificazione caratteristico (frammento Y-specifico di 1,1 Kb atteso; le altre bande sono dovute ad amplificazione di altre copie dell'elemento ripetuto) dei maschi white eye (11-12, due maschi white eye non iniettati), mentre i restanti 6 (3-4-5-8-9-10) mostrano un pattern fémmina specifico paragonabile a quello in 13-14 (due femmine white eye non iniettate). Nella linea di corsa elettroforetica 15 si osserva l'amplificato su DNA genomico estratto da mosche di sesso femminile e di sesso maschile del ceppo white eye. In fig. 6B e' mostrato un esperimento di controllo volto ad accertare la presenza di DNA genomico in ciascuno dei campioni analizzati in Fig. 6A. In questo caso sono stati utilizzati come inneschi due oligonudeotidi sintetici, Cctra 154+ e Cctra 1113- che amplificano un frammento genomico di circa 2.2 Kb del gene Cctra. Pertanto si può concludere che dei 10 maschi esaminati soltanto 4 hanno un cariotipo XY, mentre gli altri hanno un cariotipo XX. Questi ultimi sono da considerarsi delle femmine revertite in maschi apparentemente normali. Queste dati indicano, quindi, che lo sbilandamento in favore dei maschi osservato in tab. 1 è spiegabile con una reversione sessuale fenotipicamente completa di individui con cariotipo femminile XX piuttosto che con una letalità femmina-specifica.

Il gene transformer di Ceratitis capitata (Cetra) come in Drosophila risulta strettamente associato e sovrapposto ai gene i(3)Ah, codifica per una proteina ricca in serine ed arginine, produce trascritti di differente lunghezza nei due sessi mediante splidng alternativo (McKeown et al., 1987) ed è indispensabile per il corretto sviluppo degli individui di sesso femminile ma non di quello maschile (Sturtevant, 1945). Abbiamo dimostrato per la prima volta che la tecnica dell’RNAi funziona anche nella spede Ceratitis capitata e che è un metodo utile per produrre progenie di soli maschi utilizzando sequenze del gene Cctra, infatti l'iniezione, in fasi precoci dello sviluppo embrionale, di molecole di dsRNA corrispondenti a regioni esoniche di Cctra induce una trasformazione sessuale di individui XX in maschi fenotipicamente indistinguibili da quelli XY. Al contrario gli embrioni XY iniettati si sviluppano in maschi adulti apparentemente normali. Alcune delle mosche presentano un fenotipo con caratteristiche sia maschili sia femminili. I due tipi di intersessi ottenuti ("femmine con antenne” e "maschi privi di antenne”) possono essere stati determinati dalla mancata diffusione del dsRNA in tutto l'embrione dopo l'iniezione. Infatti si può notare che la trasformazione sessuale della parte anteriore o posteriore del corpo degli intersessi è strettamente correlata al sito di iniezione del dsRNA.

La presenza di alcune femmine normali nella progenie iniettata e' probabilmente spiegabile con errori tecnici-manuali nella fase di iniezione (ad esempio, l'embrione è stato perforato ma non è stata iniettata soluzione). Sulla base dei risultati ottenuti, proponiamo l’utilizzo dell'intera sequenza nudeotidica del cDNA F1 contenente le regioni esoniche del gene Cctra (Fig. 2) per eliminare dalla progenie (a presenza delle femmine trasformandole in maschi di Ceratitis, mediante la strategia da noi utilizzata. Avendo rivelato una conservazione funzionale del gene transformar di Drosophila, quale regolatore principale della determinazione del sesso anche di Ceratitis, proponiamo che la nostra invenzione sia estendibile in molte altre specie di ditteri dannosi per l’agricoltura, per la salute dell'uomo e degli animali da allevamento.

L’utilizzo di molecole a doppio filamento di RNA che contengano sequenze differenti da quelle da noi utilizzate ma comunque derivate dal gene Cctra avranno la capacità di interferire con questa funzione genica e di indurre la trasformazone sessuale di Ceratitis.

Il “slenziamento genico” che si può indurre mediante l’RNAi in Ceratitis può essere effettuato con l’uso di un vettore di trasformazione (Fortier and Belote (2000) con cui introdurre nel genoma di Ceratitis un transgene inducibile che produce molecole di dsRNA specifiche del gene Cctra. Con questa metodica la interferenza è ritenuta massima e la progenie sarà costituita esclusivamente da maschi XY ed individui XX completamente mascolinizzati.

Anche altre manipolazioni molecolari operabili su questo gene a/o sui suoi prodotti possono dare risultati simili. E' possibile, ad esempio, che l'iniezione di molecole antisenso di DNA o RNA con la sequenza specifica complementare a quella dei trascritti di Cctra o di anticorpi che riconoscono la proteina CcTRA<F >(antibody blocking) siano in grado di indurre un "knockout” della funzione genica e, quindi, una mascolinizzazione degli individui XX. L’efficienza di questi sistemi comunque dovrebbe essere minore di quella ottenuta con liniezioni di molecole dsRNA Cctra.

Per un utilizzo della nostra invenzione su scala industriale volto alla produzione massiva di soli maschi abbiamo ideato i seguenti percorsi di lavoro, alcuni alternativi, altri complementari o integrativi: 1) sviluppo di un ceppo transgenico che produce in modo inducibile dsRNA (Fortier and Belote, 2000; Kennerdell and Carthew, 2000; Lam and Thummel, 2000) con sequenze specifiche del gene Cctra ; 2) sviluppo di un sistema di trasferimento delle molecole di dsRNA alternativo all'iniezione di singoli embrioni, mediante ad esempio lipofezione o elettroporazione; 3) sviluppo di transgeni chimerici Cctra-GFP per esprimere in modo sesso-specifico proteine fluorescenti di differente colore e separare gli embrioni XX (di un colore) da quelli XY (di un altro colore) mediante dispositivi automatici del tipo “cellsorting” utilizzati per separare cellule (Sorensen et al., 1999); 4) sostituzione del gene endogeno Cctra con una versione modificata, mediante ricombinazione omologa, che permetta di indurre la trasformazione di femmine in maschi (Rong and Golic, 2000). In particolare il punto 3 propone una nostra idea originale di applicare ad embrioni di Ceratitis una tecnica di separazione sviluppata per le cellule e basata su una differente colorazione in vivo che possono avere cellule ed organismi se esprimono un trangene esogeno codificante per la proteina Green Fluorescent, GFP.

Il conagg io del primo omologo del gene transformer in una specie non appartenente alle Drosophilidae apre la strada allidentifìcazione di geni omologhi in altre specie. Infetti il clonaggio dell’omologo di transformer di Drosophila in Ceratitis capitata ha permesso di dimostrare una conservazione del gene sia strutturale, che regolativa e funzionale. Tenuto conto che Drosophila e Ceratitis appartengono a due famiglie di ditteri che nel gruppo Acalyplratae (comprendente crca 60 delle 120 famiglie di ditteri) sono tra le più distanti filogeneticamente (120 milioni di anni), proponiamo che il gene transformer sia un regolatore chiave della determinazone del sesso in molte altre specie di ditteri anche di interesse economicosanitario. L’allineamento delle sequenze proteiche e nucleotidiche dei geni tra isolati nelle Drosophilidae con quelle derivate dal gene Cctra ci ha permesso di identificare brevi sequenze aminoacidìche (vedi Fig. 3) particolarmente conservate che abbiamo utilizzato per disegnare varie coppie di oligonucleotidi "degenerati" da impiegare nella ricerca di omologhi di tra in altri insetti di interesse economico (varie specie di Bactrocera) e sanitario ( Glossina , Anopheles, etc.). Ad esempio, già la stessa famiglia delle Tephritidae a cui appartiene Ceratitis annovera molte altre specie dannose per le coltivazioni agricole: quali, ad esempio, la Bractnocera oleae, anche conosciuta come Dacus, che danneggia le olive nell'area del Mediterraneo; in Australia sono famose la Bactrocera tryoni, la Bractrocera musae (banana fruitfly) e la Bractrocera papayae (papaya fruitfly). Il donaggio di omologhi in queste altre specie permetterà sviluppare la medesima strategia da noi applicata in Ceratitis per la produzione di progenie di soli maschi e l’impiego della tecnica del maschio sterile.

Gli esempi seguenti servono a meglio illustrare l'invenzione e non sono da considerare limitativi della portata della medesima.

ESEMPI

Tutte le tecniche standard di biologia molecolare necessarie per "blotting", ibridazione, digestione enzimatica e costruzione di plasmidi chimerici sono essenzialmente quelle descritte in Maniatis et al. (1982).

Esempio 1

Estrazione di DNA genomico da singola mosca

L'estrazione del DNA genomico e' stata condotta come suggerito in Andrew and Thummel (1994) adattando il protocollo ad una singola mosca di Ceratitis capitata:

Una singola mosca è stata omogeneizzata manualmente con un pestello in 200 μl di buffer di lisi (20mM Tris, pH 7.5, 0.2 M NaCI, 20 mM EDTA, 2% SDS) in eppendorf, sono stati aggiunti 20 μl di Proteinasi K (BOEHRINGER MANNHEIM) alla concentrazione finale di 250 μg/ml, la soluzione è stata incubata a 50°C per 1 ora. Sono stati poi aggiunti 100 μl di Fenolo e miscelati ai “vortex" per 5 minuti. . Sono stati aggiunti 100 μl di Cloroformio e miscelati ai “vortex” per 5 minuti. La soluzione è stata centrifugata per 5 minuti a 13000 rpm e la fase acquosa superiore è stata trasferita in eppendorf. Sono stati aggiunti 200 μl di Cloroformio e miscelati al “vortex"per 5 minuti. Il campione è stato centrifugato per 5 minuti a 13.000 rpm. La fase acquosa è stata trasferita, quindi, in una eppendorf a cui sono stati aggiunti 400 μl di Etanolo 95%. Gli acidi nucleici sono stati precipitati per 2 ore a -20°C e mediante centrifugazione per 5 minuti a 13000 rpm ad una temperatura di 4°C. Eliminato il sumatante e risospeso il pellet in 30 μl di TE 1X, sono state aggiunte 10 unità di Rnasi-DNAsi free (PROMEGA) ed il campione è stato incubato per 2 ore a 37°C.

Esempio 2

Analisi ca riotipica mediante PCR

Per la amplificazione di sequenze Y-specfiche é stata utilizzata la Taq DNA Pofymerase (AMERSHAM PHARMACIA) e una strumentazione Perkin Helmer Gene Amp 9600. Gli oligonucleotidi sintetici utilizzati come innesco sono:

1-Y-SPECIFIC. 5' GCGTTTAAATATACAAATGTGTG 3' (SEQ. ID. NO.

)

1Kb Y-SPECIFIC: 5' TACGCTACGAATAACGAATTGG 3'

Per ogni reazione di PCR sono stati usati 0.4 μΙ di Dl NA genomico. L'amplificazione e' stata preceduta da un primo step di denaturazione del tempiato a 94°C per 5' e successivamente 35 cidi di reazione come descrìtto di seguito: 94°C per 1'; 60°C per 1'; 72°C per T. I prodotti di PCR sono stati analizzati su gei di agarosio.

L’oligonucleotide utilizzato per amplificare un frammento di DNA dal locus Cctra ha la seguente sequenza:

Cctra 1113- 5’ CTGGAACTGGCACTGGTATTG 3’

Esempio 3

Northern blot

La preparazione di RNA totale da embrioni, larve e adulti del ceppo Benakion, e' stata effettuata utilizzando Guanidina isotiodanato (SIGMA) ed ultracentrìfugazione in CsCJ come descrìtto in Maniatis et al. (1982); l'arricchimento in poly(A+) e' stato ottenuto mediante cromatografia su colonnine di cellulosa complessate con oligodT (CLONTECH). Per ogni linea elettroforetica sono stati caricati crca 4 μl di RNA poly(A+), poi separati in gel denaturante di formaldeide 2,2 M e buffer RB e trasferiti su membrane di Hybond-NX (AMERSHAM). L'ibridazione e' stata condotta utilizzando come sonda molecolare un frammento del cDNA F1 di Cctra (dalla posizione 99 alla 1495). Per marcare la sonda e' stato impiegato (a<32>P)dCTP (NEN) in reazioni di "nick translation" (GIBCO BRL). Per l'analisi autoradiografica sono state usate lastre fotografiche (KODAK) e rilevazioni mediante Phosphorimager (MOLECULAR DYNAMICS).

Esempio 4

Analisi di trascrìtti per RT-PCR

La fase dì retrotrascrizione della RT-PCR e' stata effettuata utilizzando come innesco oligodT e l'enzima Superscript II (GIBCO BRL). Per la amplificazione mediante PCR sono stati utilizzati, come inneschi, i seguenti digonudeotidi :

F+ = 5' catgaacatgaatattacaaaggc 3'

ZI- = 5'cacgacgcttatagctgttgt 3'

Le posizioni 5’ dei due oligonudeotidi sono rispettivamente 88 e 1484 sulla sequenza del clone F1.

L'amplificazione e' stata preceduta da un primo step di denaturazione del templato a 94°C per 5' e successivamente 35 ddi di reazione come descritto di seguito: 94°C per V; 60°C per 1'; 72°C per 2'30"

I frammenti di cDNA amplificati sono stati donati nel vettore pUC-18 (AMERSHAM-PHARMACIA-BIOTECH, Sure Clone Ligation Kit) e sequenziali (BYOLABS T7 Sequencing Kit). Gli allineamenti di sequenze sono stati effettuati mediante i programmi Macaw, Blast e FASTA. Per le ricerche in banche dati sono stati usati i programmi: Blast EBI, Blast Japan, Flybase e Blast NCBI.

Esempio 5

Screening di library

Per isolare il done genomico contenente il gene transfòrmer è stata analizzata una library genomica EMIBL3 di Ceratitis capitata (preparata a partire da DNA genomico del ceppo Benakion). La sonda molecolare utilizzata in questo esperimento è una porzione di un cDNA del gene Ccl(3) (Pane et al., unp. res.) marcato radioattivamente con (a<32>P)dCTP.

E’ stato effettuato uno screening di una cDNAteca di femmine adulte di Ceratitis capitata (preparata a partire da RNA del ceppo Benakion; Saccone et al., 1998). La sonda molecolare adoperata è una porzione del gene Cctra ottenuta per digestione enzimatica e marcata con (a<32>P)dCTP (risultati non pubblicati). L'ibridazione e' stata condotta a 65°C per 14h in una soluzione di 5X SSPE, 0.1% SDS, DENHARDT 5X, DNA carrier (L1FE-TECHNOLOGIES) 0.1 mg/ml. Successivamente i filtri sono stati sottoposti a 3 lavaggi per 15' a temperatura ambiente in SSPE 2X, SDS 0,1%; 1 lavaggio a 37°C per 30' in SSPE 2X, SDS 0.1 %; 1 lavaggio a 65°C per 2h in SSPE 2X, SDS 0.1%; 1 lavaggio a 65°C per 30' in SSPE 1X, SDS 0.1%.

Esempio 5

Preparazione dei dsRNA di Cctra ed iniezione in embrioni di Ceratitis capitata

Il dsRNA di Cctra é stato ottenuto mediante trascrizione in vitro usando come DNA stampo prodotti di PCR. Per la realizzazione dei DNA stampo sono stati usati i seguenti oligonucleotidi (i numeri indicano le posizioni sulla sequenza del clone F1):

La coppia T7/154+, 893- ha prodotto il substrato per il ssRNA (RNA a singolo filamento) "senso"; mentre la coppia 154+, T7/893- ha fornito il DNA stampo per il ssRNA "antisenso". La reazione di amplificazione è stata preceduta da un primo step di denaturazione del templato a 94°C per 5' ed e' consistita in 35 cicli di reazione come di seguito riportato: 94 °C per 1'; 60°C per V; 72°C per 1'. Il templato adottato per questa PCR e' un frammento del cDNA F1 (dada posizione 154 alla posizione 893). Tutti i passaggi di PCR sono stati condotti utilizzando acqua trattata con DEPC. Successivamente i prodotti di PCR sono stati usati direttamente per la reazione di trascrizione in vitro come suggerito nel protocollo del kit di trascrizione in vitro RNA Trascription Kit (STRATAGENE). Quantità equimolari dei ssRNA "senso" ed "antisenso" sono state poste in buffer di annealing (1mM Tris pH 7.5; 1 mM EDTA) per 24h in modo da ottenere il dsRNA (RNA a doppio filamento). Il dsRNA e' stato poi trasferito in buffer di iniezione (5 mM KCl; 0.1 mM NaP04 pH 7,8) ad una concentrazione finale pari a 5 mM. La tecnica di iniezione del dsRNA e' essenzialmente quella ideata per la trasformazione della linea germinale di Drosophila melanogaster (Rubin and Spradling, 1982) con gli adattamenti descritti in Kennerdel and Carthew (1998). Gli embrioni sono stati raccolti ogni ora, poi decorionati a mano, mediante aghi di siringhe da insulina da 1 mi, essiccati per un tempo compreso tra i 60 e 120 secondi, ricoperti con Halo-carbon oli 700 (SIGMA) ed iniettati un gruppo al polo anteriore ed un altro gruppo al posteriore.

Esempio 6

Mantenimento dei ceppi Benakeion e w/w

Le mosche del ceppo Benakeion e di quello white eye, utilizzate per ottenere gli embrioni da iniettare, vengono allevate come segue. Gli individui adulti sono mantenuti all'interno di due gabbie separate (40 cm x 40 cm x 32 cm), costruite in modo da permettere la deposizione delle uova all'interno di vaschette contenenti acqua distillata. Queste vaschette vengono svuotate su un retino che lascia passare l'acqua, ma trattiene gii embrioni che verranno trasferiti in capsule Petri contenenti una particolare "pappa" costituita da un frullato di 400 ml di H20, 30 gr di carta, 30 gr di zucchero, 30 gr di un estratto di lievito (Laboratorio Dott. Picconi, Gessate, Milano), 10 mi “stock colesterolo” (140 ml H20, 50 ml EtOH 95%, 10 gr Colesterolo C27H460, Sigma), 8.5 ml di “stock acido benzoico” (50 gr Acido Benzoico C7He02, 300 ml EtOH 95% e 150 ml H20) 10 ml di “stock HCI” (384 ml H20 e 66 ml HCI 37%). Le capsule in cui gli embrioni si sono sviluppati in larve vengono trasferite in contenitori chiusi dove é presente della sabbia. I contenitori sono chiusi, in quanto le larve, attraverso una contrazione del corpo, saltano nella sabbia (che serve ad evitare che le larve aderiscano tra loro) dove formeranno le pupe. Le pupe vengono separate attraverso un setaccio che permette il passaggio solo della sabbia e trasferite in capsule Petri. Dopo circa 10-13 giorni nascono mosche adulte che verranno rilasciate nelle gabbie precedentemente descritte (tutto il ciclo vitale viene attuato in una camera a 25°C e dura circa 1 mese).

La cura delle mosche iniettate con il dsRNA é simile a quella vista in precedenza. Infatti gli embrioni iniettati devono essere trasferiti, appena sviluppati in larve, dall’olio minerale, alle piastre con la “pappa”. Tale passaggio viene effettuato allo stereoscopio aiutandosi con delle siringhe da insulina da 1 ml. II resto del ciclo vitale segue uno sviluppo normale. Gli adulti nati vengono poi analizzati al microscopio, fotografati ed eventualmente congelati a -80°C per essere usati poi per successive analisi molecolari. Referenze

Anleitner, J. E. and Haymer, D. S. (1991). Y enriched and Y specfic DNA

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Gene Cctra di Ceratitis Capitata che codifica per la proteina CcTRA in grado di regolare il fenotipo sessuale nei ditteri, in particolare in Ceratitis Capitata. 2. cDNA isolato del gene Cetra derivato dall’mRNA maschio-specifico. 3. cDNA isolato femmina-specifico indicato come Seq. IDN 1. 4. Sequenza nuceotidica isolata corrispondente al cDNA femminaspecifico indicato come Seq. IDN 1 5. Sequenza nuceotidica secondo la riv. 4 che codifica per un polipeptide o peptide compreso nella sequenza amminoacidica indicata come Seq IDN: 2. 6. Polinuceotide od oligonuceotide isolato comprendente porzioni della sequenza nudeotidica indicata come Seq IDN 1. 7. Polinuceotide od oligonuceotide omologo al 60% o superiore rispetto al Polinuceotide od oligonuceotide secondo la riv. 6. 8. Polinuceotide od oligonuceotide omologo all’80% o superiore rispetto al Polinuceotide od oligonuceotide secondo la riv. 6. 9. Sequenza amminoacdica isolata indicata come Seq IDN 2. 10. Sequenza nuceotidica di Cctra codificante per la regione amminoacdica corrispondente alla box 1 di fig. 3. 11. Sequenza nuceotidica di Cctra codificante per la regione amminoacidica corrispondente alla box 2 di fig. 3. 12. Sequenza nuceotidica di Cctra codificante per la regione amminoaddica corrispondente alla box 3 di fig. 3. 13. Sequenza nuceotidica di Cctra codificante per la regione amminoaddica corrispondente alla box 4 di fig. 3. 14. Sequenza nucleotidica complementare alle sequenze secondo (e riv. 10-13. 15. Polipeptide o peptìde omologo al 40% o superiore rispetto alle sequenze amminoacidiche secondo le riv. 10-13. 16. Polipeptide o peptide omologo al 60% o superiore rispetto alle sequenze amminoacidiche secondo le riv. 10-13. 17. Polipeptide o peptide omologo al 80% o superiore rispetto alle sequenze amminoacidiche secondo le riv. 10-13. 18. oligonuceotide antisenso in grado di ibridarsi con la sequenza di mRNA derivata dal cDNA secondo le riv. 2 e 3. 19. Sequenza polinuceotidica o polipeptidica secondo le riv. precedenti da usare per regolare la determinazione del sesso nei ditteri, in particolare in Certitis Capitata. 20. Anticorpo contro la proteina CcTRA. 21.Plasmide comprendente il polinucleotide od oligonucleotide secondo le riv. 2-8 e 10-13. 22. Plasmide secondo la riv. 21 da impiegare come vettore di donaggio e di espressione. 23. Vettore comprendente il polinucleotide od oligonucleotide secondo le riv. 2-8 e 10-13. 24. Vettore secondo la riv. 23 comprendente ulteriormente un gene codificante per una proteina fluorescente. 25. Cellula modificata con il plasmide secondo le riv. 21-22. 26. Cellula modificata secondo la riv. 25 in grado di esprimere la proteina CcTRA o suoi frammenti o suoi omologhi al 40% di omologia o superiore. 27. Organismo pluricellulare, escluso l’uomo, comprendente cellule modificate secondo le riv. 25-26. 28. Animali transgenici non umani "knock out” in cui il gene Cctra è inattivato parzialmente o totalmente. 29. Impiego di una sequenza nuceotidica o polipeptidica secondo le riv. 2-8 e 10-13, o di parti di detta sequenza/e, come regolatrice della determinazione del sesso in ditteri. 30. Impiego di una sequenza nuceotidica o polipeptidica secondo le riv. 2-8 e 10-13, o di parti di detta sequenza/e, come regolatrice delia determinazione del sesso in Ceratitis Capitata. 31. Procedimento di silenziamento genico mediato da molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA) con sequenza specifica del gene Cctra secondo la riv. 1. 32. Procedimento secondo la riv. 31 condotto iniettando molecole di dsRNA, prodotte artificialmente a partire da un Clone di cDNA di Cctra in embrioni di ditteri per indurne una reversione dei fenotipo sessuale da femminile in maschile. 33. Procedimento secondo la riv. 32 in cui gli embrioni sono di Ceratitis capitata. M. Procedimento secondo la riv. 31 in cui la regione scelta per il silenziamento si estende dalla posizione 154 (esonel) alla posizione 893 (esone 5) del cDNA femmina-specifico Seq. IDN 1 di Cctra e corrisponde a regioni esoniche presenti nei clone di cDNA F1 e nel clone di cDNA M1. <35>· Procedimento di silenziamento genico secondo le riv. 31-34 effettuato con l’uso di un vettore di trasformazone con cui introdurre nel genoma di Ceratitis un transgene inducibile che produce molecole di dsRNA specifiche dei gene Cctra. 36. Procedimento di silenziamento secondo le riv. 32-35 in cui vengono iniettate molecole antisenso di DNA o RNA con la sequenza specifica complementare a quella dei trascritti di Cctra o di anticorpi che riconoscono la proteina CcTRA<F>· 37. Procedimento secondo la riv. 32 in cui l'iniezione è sostituita con tecniche scelte fra lipofezione ed elettroporazione. 38. Gene Cctra secondo la riv. 1 comprendente 5 esoni di cui 2 sono maschio-specifici. 39. Processo per produrre il dsRNA di Cccra caratterizzato dal fatto che si utilizzano quattro oligonucleotidi sintetici denominati: 154+, 154+/T7, 893- e 893-/T7 con la sequenza del cDNA Cetra F1 come stampo. 40. Processo secondo la riv. 39 in cui gli oligonucleotidi 154+/T7 e 893-/T7 presentano al 5' la sequenza del promotore per l'RNA polimerasi del fago T7. 41. dsRNA prodotto secondo le riv. 39-40 da iniettare in embrioni di ditteri nel polo posteriore o nel polo anteriore per ottenere una selezione sesso-specifica. 42. Impiego della sequenza nucleotidica del cDNA F1 contenente le regioni esoniche del gene Cctra per eliminare dal progenie di ditteri, in particolare di Ceratitis, la presenza delle femmine trasformandole in maschi. 43. Ceppo transgenico che produce in modo inducibile dsRNA con sequenze specifiche del gene Cctra. 44. Transgene chimerico Ccfra-GFP codificante per una proteina fluorescente. 45. Procedimento per separare embrioni XX da embrioni XY caratterizzato dal fatto che si impiega il transgene della riv. 44 che esprime in modo sesso-specifico proteine fluorescenti di differente colore. 46. Processo di amplificazione di sequenze Y-specifiche mediante Taq DNA Polymerase caratterizzato dal fatto che si utilizza un oligonuceotide di innesco scelto fra; 1-Y-SPECIFIC. 5' GCGTTTAAATATACAAATGTGTG 3' 1Kb Y-SPECIFIC. 5' TACGCTACGAATAACGAATTGG 3' 47. Processo di amplificazione di un frammento di DNA dal locus Cctra mediante la seguente sequenza: Cctra 1113- 5’ CTGGAACTGGCACTGGTATTG 3’ 48. Processo di amplificazione di un frammento di RNA da ditteri maschi e femmine mediante PCR caratterizzato dal fatto che si sono utilizzati, come inneschi, i seguenti ofigonucleotidi : F+ = 5’ catgaacatgaatattacaaaggc 3' Z1 - - 5'cacgacgcttatagctgttgt 3' 49. Oligonucleotide scelto fra: Cctra 154+: 5’ CAGTGGTTCGGTTCGGAAG 3’ Cctra 893-: 5’ TCCATGATGTCGATATTGTCC 3’ Cctra 154+/T7: 5' TAATACGACTCACTATAGGGCAGTGGTTCGGTTCGGAAG 3' Cctra 893-/T7: 5' TAATACGACTCACTATAGGGTCCATGATGTCGATATTGTCC 3' per otenere il dsRNA di Cctra.