ITRM20060037A1 - Inibitori della migrazione cellulare mediata dal complesso tra h-prune e gsk-3 relativi usi nella terapia antitumorale - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: "Inibitori della migrazione cellulare mediata dal complesso tra h-prune e GSK-3 e relativi usi nella terapia antitumorale"

La presente invenzione concerne l'identificazione di nuovi inibitori della migrazione cellulare mediata dal complesso tra h-prune e GSK-3 e i loro relativi usi nella terapia antitumorale, con particolare riferimento al trattamento e alla prevenzione delle metastasi tumorali, di tumori particolarmente aggressivi, quali ad esempio il cancro colon-rettale e pancreatico.

La glicogeno sintasi serina/treonina chinasi (GSK-3) è stata descritta per la prima volta in un pathway metabolico per la regolazione della glicogeno sintasi che è sensibile alla inibizione insulina mediata (Plyte, S. E. et al., 1992). Successivamente è stato dimostrato che GSK-3 regola diverse risposte fisiologiche, comprendenti la sintesi di proteine, l'espressione genica, la localizzazione subcellulare di proteine, e la degradazione proteica, in cellule di mamifero mediante la fosforilazione di molti substrati (Cohen, P. et al., 2001; Doble, B. W. et al., 2003; Grimes, C. A. et al., 2001). Esistono due tipi di GSK-3 nei mammiferi, GSK-3a e GSK-3P (Woodgett, J. R. et al., 1990). GSK-3 è altamente conservata e gioca un ruolo fondamentale nelle risposte cellulari.

Per capire il meccanismo molecolare mediante il quale GSK-3 riconosce specifici substrati bersaglio, si è provato ad isolare diverse proteine che legano GSK-3. A secondo dei suoi partner di legame, GSK-3 può mostrare differenti funzioni di regolazione. Ad esempio, esistono evidenze che dimostrano che GSK-3 regola l'architettura cellulare nelle cellule neuronali. Due proteine di associazione ai microtubuli, Tau e MAP1B, vengono fosforilate da GSK-3, che regola il loro legame ai microtubuli, modulando in questo modo le dinamiche dei microtubuli (Cohen, P. et al., 2001; Jope, R.S. et al., 2004). Un pool non attivo di GSK-3 è stato trovato essere localizzato a livello del "leading edge" delle cellule insieme alla F-actina e semaforina 3A e l'acido lisofosfatidico attivano GSK-3, causando la retrazione del neurite (Eickholt, B.J. et al., 2002). GSK-3 media la promozione Ρ3ηβ-Ρ^ζ -dipendente della polarizzazione e della protrusione cellulare negli astrociti (EtienneManneville, S. et al., 2003). Inoltre, GSK-3 fosforila CRMP2 per stabilire il destino degli assoni e dei dendriti (Yoshimura, T. et al., 2005). E' stato inoltre dimostrato che GSK-3 è coinvolto nel segnale attivato dalla adesione cellulare in cellule non neuronali (Ivaska, J. et al., 2002; Roberts, M.S. et al., 2004). La formazione di lamellipodi nei cheratinociti durante la loro migrazione viene bloccata dagli inibitori di GSK-3 (Koivisto, L. et al., 2003). L'inizio e la stimolazione della motilità degli spermatozoi sono caratterizzati dall'inattivazione di GSK-3 (Somanath, P.R. et al., 2004). Sebbene questi risultati suggeriscano che GSK-3 sia coinvolto nelle dinamiche dei filamenti di astina e dei microtubuli, non è stato ancora compreso come l'attività di GSK-3 sia legata alle molecole coinvolte nella migrazione cellulare.

L'omologo umano della proteina prune di Drosophila (h-prune) appartiene alla superfamiglia DHH delle fosfodiesterasi (PDE), che hanno attività fosfodiesterasica nucleotide ciclica citoplasmatica. La iperespressione di h-prune nelle cellule in coltura è coinvolta nella promozione della motilità cellulare, e l'inibizione della attività di PDE mediante un inibitore di PDE sopprime la motilità hprune indotta (D'Angelo, A. et al., 2004). In base a queste osservazioni, la iperespressione di h-prune nel tumore alla mammella è stata correlata con la progressione e l'aggressività del tumore (W02005/056043; Zollo, M. et al., 2005). Nella domanda di brevetto internazionale W02005/056043 l'autore della presente invenzione ha descritto una nuova attività enzimatica di h-prune correlata alle metastasi, in particolare del cancro alla mammella, e suscettibile dell'inibizione enzimatica terapeutica. E' stato dimostrato che l'enzima h-prune risulta essere iperespresso in concomitanza con una diminuzione dell'espressione di nm-23Hl nei tumori metastatici a livello di differenti tessuti. Inoltre, è stata trovata una correlazione diretta tra un'attività aumentata di h-prune cAMP-PDE e la motilità cellulare, dovuta a un'interazione fisica proteina-proteina con nm23Hl, in un modello di tumore alla mammella. Questa scoperta evidenzia l'interazione tra h-prune e nm23-H1, configurandosi quindi come un effetto "a valle" dell'azione di hprune di alterazione della funzione protettiva di nm23-Hl nella proliferazione cellulare e di soppressione dei processi di metastasi tumorale, con particolare riferimento al cancro alla mammella.

Tuttavia, i meccanismi molecolari "a monte" mediante i quali h-prune regola la motilità cellulare nei diversi tipi di tumori correlati a metastasi altrettanto invasive (es. carcinoma colon rettale o pancreatico) sono ancora da individuare. Ne consegue che gli inibitori noti di h-prune, come il dipiridamolo o IBMX (inibitore attività fosfodiesterasica) non sono sufficientemente efficaci poiché non agiscono "a monte" dell'evento biochimico scatenante, quale è la sintesi della proteina o la sua eventuale interazione con altre proteine "chiave" della cascata del segnale che promuove la migrazione cellulare.

Alla luce di quanto sopra esposto risulta evidente la necessità di identificare nuovi bersagli terapeutici a monte del pathway del segnale che promuove la migrazione di cellule tumorali e di conseguenza di nuovi composti in grado di inibire la diffusione di metastasi tumorali di tumori particolarmente aggressivi, quali ad esempio il cancro colonrettale e pancreatico, caratterizzati dall'iperespressione di h-prune.

Nel corso del presente studio gli autori hanno dimostrato che h-prune è una proteina di legame della glicogeno sintasi chinasi-3 (GSK-3). Infatti, il trattamento delle cellule con inibitori di GSK-3 in duce la dissociazione di GSK-3 da h-prune e inibisce la migrazione cellulare così come il knock down di h-prune o GSK-3 mediante RNAi (siRNA) (vedere Esempio 1, Fig. 1-2). h-prune forma un complesso con paxillina e vinculina a livello delle adesioni focali mentre la perdita di attività di GSK-3 o il knockdown di GSK-3 e h-prune inibiscono il disassemblaggio della paxillina, la fosforilazione della tirosina della chinasi di adesione focale (FAK) e l'attivazione di Rac. Questi risultati indicano anche che GSK-3 e h-prune regolano in modo cooperativo il disassemblaggio delle adesioni focali per regolare la migrazione cellulare.

Inoltre, l'espressione della regione C-terminale di h-prune (aa 333-453) in cellule HeLa S3 inibisce l'interazione di GSK-3 con h-prune e la migrazione cellulare (vedere Esempio 1, Fig. 3). Ne consegue che il legame di GSK-3 ad h-prune è essenziale per la migrazione cellulare.

Inoltre h-prune è altamente espressa in tumori a livello del colon-retto e del pancreas (vedere Tabelle 1 e 2, Fig. 8) e tale positività per h-prune è stata correlata all'invasività tumorale, consentendo un pre-screening con questo marker di aggressività tumorale per valutare la possibilità di trattamento con gli inibitori secondo l'invenzione.

Gli autori della presente invenzione hanno quindi individuato nuovi inibitori altamente specifici dell'interazione tra h-prune e la glicogeno sintasi chinasi-3 (GSK-3) da impiegare vantaggiosamente nel trattamento e nella prevenzione delle metastasi di tumori, quali il cancro colon-rettale e pancreatico. Tali inibitori possono agire direttamente bloccando il sito di interazione tra h-prune e GSK-3 e impedendone l'interazione, oppure indirettamente (come combinazione di almeno due inibitori) bloccando le due proteine in modo indipendente dalla loro interazione e impedendone comunque 1'interazione .

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un inibitore della migrazione cellulare mediata dal complesso tra h-prune e GSK-3, in cui detto inibitore è scelto dal gruppo che consiste in siRNA anti-GSK-3, siRNA anti-h-prune, la sequenza amminoacidica C-terminale di h-prune comprendente gli amminoacidi 333-453 della sequenza di h-prune umana e la sequenza oligonucleotidica codificante per essa e anticorpi anti-C-terminale di h-prune, per l'uso in campo medico. In una forma preferita di realizzazione della presente invenzione la GSK-3 può essere GSK-3a o GSK-3P.

In una forma preferita di realizzazione della presente invenzione l'siRNA anti-GSK-3a può comprendere la sequenza nucleotidica 5'-GAAGGUUCUCCAGGACAAGTT-3' . Secondo un'ulteriore forma preferita di realizzazione della presente invenzione l'siRNA anti-GSK-3p può comprendere la sequenza nucleotidica 5'-GAAGGUUCUCCAGGACAAGTT-3' . In un'altra forma di realizzazione dell'invenzione l'siRNA antih-prune può comprendere la sequenza nucleotidica 5'-GGCGUCAAGGUGGCCAUUATT-3' .

Preferibilmente, la sequenza amminoacidica C-terminale di h-prune comprende la seguente sequenza di amminoacidi:

PNLHAYLQGNTQVSRKKLLPLLQEALSAYFDSMKIPSGQPETADVSREQVDKE LDRASNSLISGLSQDEEDPPLPPTPMNSLVDECPLDQGLPKLSAEAVFEKCSQ ISLSQSTTASLSKK (333-453 aa di h-prune). Questa sequenza amminoacidica lega 63Κ-3β e spiazza il legame con h-prune inibendo la migrazione cellulare indotta dal complesso h-prune-GSK-3.

Secondo un'ulteriore forma di realizzazione degli inibitori della presente invenzione, detti anticorpi anti-C-terminale di h-prune sono anticorpi policlonali contro la sequenza amminoacidica C-terminale di h-prune come sopra definita.

Un'ulteriore forma di realizzazione degli inibitori della presente invenzione prevede che detta sequenza oligonucleotidica codifichi per la sequenza amminoacidica C-terminale di h-prune come sopra definita (333-453 aa di h-prune).

La presente invenzione ha ulteriormente come oggetto una sequenza oligonucleotidica codificante per la sequenza amminoacidica C-terminale di h-prune come sopra definita o la sequenza ad essa complementare o la sequenza in cui la T è sostituita dalla U (sequenza di RNA).

Ulteriore oggetto della presente invenzione è un costrutto di acido nucleico comprendente la sequenza oligonucleotidica come sopra definita, per l'uso in campo medico.

Costituisce oggetto ulteriore della presente invenzione l'uso degli inibitori o del costrutto come sopra definiti, per la'preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori.

La presente invenzione concerne ulteriormente una combinazione del dipiridamolo con il 3-(2,4-diclorofenil)-4- (l-metil-lJi-indol-3-ile)-lH-pirrolo2,5 dione, assieme ad uno o più eccipienti e/o adiuvanti farmacologicamente accettabili per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori.

Forma ulteriore oggetto della presente invenzione un kit di parti comprendente il dipiridamolo e il 3-(2,4-diclorofenil)-4-(l-metil-lH-indol-3-ile)-lH-pirrolo-2,5 dione per la somministrazione separata, simultanea o sequenziale ad un soggetto per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori. Preferibilmente, detti tumori sono scelti tra il cancro colon-rettale e il cancro pancreatico.

Ulteriore oggetto della presente invenzione è la combinazione di siRNA anti-GSK-3 con il siRNA anti-h-prune come sopra definiti, assieme ad uno o più eccipienti e/o adiuvanti farmacologicamente accettabili per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori.

L'invenzione si riferisce ulteriormente ad un kit di parti comprendente siRNA anti-GSK-3 con il siRNA anti-h-prune come sopra definiti, per la somministrazione separata, simultanea o sequenziale ad un soggetto per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori. Preferibilmente, detti tumori sono scelti tra il cancro colon-rettale e il cancro pancreatico.

Forma ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente almeno uno degli inibitori o del costrutto come sopra definiti, assieme ad adiuvanti e/o eccipienti farmacologicamente accettabili.

Infine, l'invenzione concerne l'uso della composizione farmaceutica di cui sopra, per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in

CUl

la figura 1 mostra il coinvolgimento di GSK-3 nella migrazione cellulare. (A) Cellule HeLa S3 trattate con gli inibitori indicati sono state sottoposte al saggio della migrazione Transwell. (B) Cellule CHO trattate con NaCl o LiCl sono state sottoposte al saggio di migrazione Transwell. (C) Pannello di sinistra, i lisati di cellule HeLa S3 transfettate con gli sìRNA indicati sono state sondate con gli anticorpi indicati. Pannello di destra, le cellule HeLa S3 transfettate con gli siRNA indicati sono stati sottoposti al saggio di migrazione Transwell. Un RNA a singolo filamento per GSK-3beta è stato usato come controllo. (D) Le cellule HeLa S3 trattate con SB216763 sono state sottoposte a saggio di migrazione random. I risultati mostrati sono medie ± errori standard delle medie da quattro esperimenti indipendenti. DMSO: dimetilsolfossido, Na: NaCl, Li: Liei, SB: SB216763, non trattato: nessun trattamento;

la figura 2 mostra l'interazione di h-prune con GSK-3. (A) Rappresentazione schematica dei mutanti di delezione di h-prune usati nello studio. (B) I U sati delle cellule COS esprimenti i mutanti di delezione di Myc-h-prune sono stati sondati con anticorpo anti-GSK-3p o anti-Myc (corsie da 1 a 5). Gli stessi U sati sono stati immunoprecipitati con anticorpo ant-Myc, e gli immonoprecipitati sono stati sondati con gli anticorpi indicati (corsie da 6 a 10). (C) Le cellule HeLa S3 trattate con 10 μΜ SB216763 o 30 mM Liei sono stati lisati, e i U sati sono stati sondati con anticorpo anti GSK-3beta o anti-h-prune (corsie da 1 a 4). Gli stessi lisati sono stati immunoprecipitati con anticorpo anti-GSK-3p (corsie da 5 a 6) o anti-h-prune (corsie da 7 a 10), e gli immunoprecipitati sono stati sondati con gli anticorpi indicati. Le bande inferiori selezionate dall'anticorpo anti-hprune in figura 2B ed E erano bande non specifiche. (D) Pannello di sinistra, l'attività della chinasi di GSK-3 negli immunoprecipitati dalle cellule HeLa con l'anticerpo anti-h-prune è stata misurata in presenza o in assenza di SB216763 in vitro. Pannello di destra, i U sati delle cellule HeLa esprimenti Myc-hprune sono stati immunoprecipitati con anticorpo anti Myc o antiHA, e gli immunoprecipitati sono stati sondati con anticorpo anti GSK-3P e l'antincorpo fosfospecifico per GSK-33 Tyr216 (pY216-GSK-33). (E) Dopo che le cellule HeLa S3 sono state trattate con 10 mM di dipiridamolo per 4 ore, h-prune è stato immunoprecipitato dai lisati e gli immunoprecipitati sono stati sondati con anticorpi antiGSΚ-3β e anti-h-prune. HA: emoagglutinina; IP: immunoprecipitazione; Ab: anticorpo; SB: SB216763; Dip: dipiridamolo; Ig: immunoglobulina; DMSO: dimetil solfossido; non trattato: nessun trattamento; simulato: controllo;

la figura 3 mostra il coinvolgimento di h-prune nella migrazione cellulare. (A) Pannello sinistra, i lisati delle cellule Hela S3 transfettate con siRNA di controllo o siRNA per h-prune sono state sondate con gli anticorpi indicati. Pannello di destra, cellule HeLaS3 transfettate con siRNA di controllo o siRNA per h-prune sono stati sottoposti al saggio di migrazione Transwell. (B) Pannello di sinistra, i lisati delle cellule HeLa S3 esprimenti Myc-hprune (333-453) sono stati sondati con anticorpo antih-prune o anti-GSK-3p (corsie da 1 a 4). Gli stessi U sati sono stati immunoprecipitati con anticorpo anti GSK-3beta (corsie da 5 a 8). Pannello di destra, due differenti cloni (CI e C33) delle cellule HeLa S3 esprimenti stabilmente Myc-h-prune (199-453) sono stati sottoposti al saggio di migrazione Transwell. Le cellule transfettate con vettori da soli sono state usate come simulazione di controllo. I risultati mostrati sono medie ± errori standard della media di tre esperimenti indipendenti. IP: immunoprecipitazione; la figura 3C mostra il Western Blotting di anticorpi anti-C-terminale-h-prune: corsia 1 (dalla sinistra); lisati delle cellule HeLa S3 wild-type; corsia 2; lisati delle delle cellule HeLa S3 esprimenti Mycprune; corsia 3; immunoprecipitati con 1'anticorpo anti-prune dai lisati delle cellule HeLa S3 wild type; corsia 4; immunoprecipitati con 1'anticorpo anti-Myc dai lisati delle cellule HeLa S3 esprimenti Myc-prune; corsia 5; immunoprecipitati con 1'anticorpo anti-prune dai lisati delle cellule HeLa esprimenti Myc-prune;

la figura 4 mostra la localizzazione di h-prune e GSK-3 alle adesioni focali. (A) I lisati delle cellule C57MG (corsia 1) sono stati immunoprecipitati con anticorpo anti-h-prune, e gli immunoprecipitati sono stati sondati con gli anticorpi indicati (corsia 3). Gli immunoprecipitati ottenuti con anticorpo anti-GFP sono stati usati com controllo (corsia 2). (B) I U sati delle cellule COS esprimenti i mutanti di delezione di h-prune sono stati sondati con anticorpo anti-Myc (corsie da 1 a 5). Gli stessi U sati sono stati immunoprecipitati con anticorpo antipaxillina, e gli immunoprecipitati sono stati sondati con gli anticorpi indicati (corsie da 6 a 10). I risultati mostrati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (C) Cellule HeLa S3 esprimenti Myc-h-prune sono state lisate, e i lisati sono stati incubati con 0,1 μΜ GST-paxillina o GST immobilizzato su glutatione-Sepharosio . Dopo che GST-paxillina o GST sono stati precipitati mediante centrifugazione, i precipitati sono stati sondati con gli anticorpi indicati. IP: immunoprecipitazione; Ab: anticorpo; simulato: controllo;

la figura 5 mostra il coinvolgimento di GSK-3 e h-prune nelle dinamiche delle adesioni focali. (A) Pannello superiore, monostrati di cellule C57MG su vetrini coprioggetto rivestiti di collagene sono stati trattati con 10 μΜ di SB216763 per 4 ore. Dopo danneggiamento, i monostrati danneggiati sono stati lasciati rigenerarsi per 12 ore. Scala bar, 0,2 min. Pannello inferiore, la lunghezza delle ferite è stata misurata ed espressa come percentuale della distanza iniziale al tempo zero. Cerchi aperti, trattamento con dimetilsofossido (DMSO); cerchi pieni, trattamento con SB216763 (SB). I risultati mostrati sono medie ± errori standard delle medie da tre esperimenti indipendenti. (B) cellule C57MG trattate con 10 μΜ SB216763 (d a f, m a o) o 10 μΜ dipiridamolo (Dip) (g a i) sono rigenerate. Sei ore dopo il danneggiamento, le cellule sono state colorate con anticorpi antipaxillina (a e d), antivinculina (g e j), o anti-hprune (b, e, h e k). Le immagini sono mostrate nei pannelli c, f, i, e 1. Scala bar, 10 μm. I risultati mostrati sono rappresentativi dei tre esperimenti indipendenti. (c) sono state calcolate le costanti di velocità per il disassemblaggio di GTP-paxillina in Fig. 5D e E. Quantificazioni del disassemblaggio GFP-paxillina mostrano medieierrori standard delle medie. (G) L'area di protrusione di lamellipodi è stata quantificata nelle cellule HeLa S3 transfettate con siRNA per GSK-3p o h-prune;

la figura 6 mostra il coinvolgimento di GSK-3 e h-prune nella attivazione di FAK e Rac. (A e B) attivazione di FAK. Le cellule HeLa S3 transfettate con gli siRNA indicati (A) o esprimenti Myc-h-prune (199-453) (B) sono stati sospesi in terreno privo di siero e sono stati mantenuti in sospensione (Sus) o ripiastrati su dischi rivestiti di collagene (Col). Pannello superiore, le cellule sono state U sate 1 ora dopo essere state poste in piastra, e i U sati sono stati sondati con 1'anticorpo fosforo-specifico per la pTyr397FAK (pY397 FAK) o con 1'anticorpo anti-FAK. Pannello inferiore, l'attività di FAK è stata misurata come rapporto di FAK fosforilato (FAK ativo) su FAK totale. (C) GFP o GFP-FAK<K578E/K581E>(SFAK) è stato espresso in cellule NIH 3T3 transfettate con siRNA per GSΚ-3β, e le cellule sono state sottoposte al saggio di migrazione Transwell. Le cellule GFP-marcate migrate sono state normalizzate con efficienza di transfezione. Pannello superiore, i livelli di proteina di GFP-FAK<K578E/K581E>e GSK-3beta sono mostrati mediante anticorpi anti-FAK e GSK-3. Pannello inferiore, abilità di migrazione delle cellule usate in questo saggio. (D) Attivazione Rac. Cellule HeLa S3 transfettate con gli siRNA indicati o trattati con gli inibitori di GSK-3 indicati. Le cellule sono state ripiastrate sui dischi rivestiti di collagene, e i Usati sono stati incubati con GST-CRIB immobilizzato su glutatione sefarosio. Pannello superiore, i lisati totali e i precipitati sono stati sondati con anticorpo anti-Rac-1. Pannello inferiore, l'attività Rac è stata misurata come rapporto tra la quantità di Rac legata a CRIB (Rac attiva) rispetto a Rac nei U sati di cellule totali (Rac totale).

la figura 7 mostra la correlazione dell'espressione di h-prune con la aggressività del tumore. (A) analisi immunoistochimica di h-prune nel tumore colon-rettale umano (a e b) e tumore pancreatico umano (c e d). a, ingrandimento, x40; c, ingrandimento, x100. E' stata confrontata l'espressione di h-prune nelle regioni non tumorali e tumorali. B e d, ingrandimento, x400. Le regioni del tumore sono state ingrandite. (B) Le cellule SW480 sono state colorate con anticorpi anti-paxillina (a) o anti-h-prune (b). L'immagine è mostrata nel pannello c. (C) Cellule SW480 trattate con ΙΟμπι di SB216763 (da d a f) o transfettate con siRNA per GSK-3beta (da j a 1) o hprune (da m ad o) sono state danneggiate. Dodici ore dopo il danneggiamento, le cellule sono state colorate con anticorpi antipaxillina (a, d, g, j, e m) o anti-h-prune (b, e, h, k, e n). Le immagini sono mostrate nei pannelli c, f, i, 1 e o. Scala bar, 10 μιη. (D) Pannello superiore, i lisati delle cellule SW480 transfettate con gli siRNA indicati sono stati sondati con gli anticorpi indicati. Pannello inferiore, cellule SW480 transfettate con siRNA indicati sono stati sottoposti al saggio di migrazione Transwell. (E) Le cellule SW480 trattate con 10 μΜ SB216763 e /o 10 μΜ di dipiridamolo sono stati sottoposti al saggio di migrazione Tranwell su collagene. SB: SB216763; Dip: dipiridamolo; DMSO: dimetilsolfossido. I risultati mostrati sono medie ± errori standard della media da tre esperimenti indipendenti.(F) Formula chimica di SB216763;

la figura 8 mostra la correlazione tra l'espressione di h-prune e le caratteristiche clinico-patologiche del cancro colon-rettale (Tabella 1) e pancreatico (Tabella 2);

le figure 9-12 mostrano le mappe dei plasmidi pEF-Bos-myc-h-prune comprendenti rispettivamente la sequenza di h-prune intera (aa 1-453) e parziale (aa 1-332); (aa 199-453); (aa 333-453).

ESEMPIO 1: Studio sul ruolo dell 'interazione di GSK-3 e h-prune nella regolazione della migrazione cellulare mediante modulazione delle adesioni focali MATERIALI E METODI

Materiali

Le cellule HeLa S3 e C57MG sono state fornite da K.Matsumoto (Nagoya University, Nagoya, Giappone) e S. Takada (National Institutes of Naturai Sciences, Okazaki, Giappone), rispettivamente. Il cDNA umano di GSK-3p è stato fornito da J.R. Woodgett (Ontario Cancer Institute, Toronto, Canada). I baculovirus ricombinanti esprimenti glutatione S-transferasi (GST)fuso ad h-prune wild-type (WT) sono stati generati da Y. Matsuura (Osaka University, Suita, Giappone). Il cDNA per la paxillina e il pGEX-oiPAK-CRIB sono stati forniti da H. Sabe (Osaka Vioscience Institute, Osaka Giappone) e K. Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Giappone) rispettivamente. Le cellule HeLa S3 esprimenti in modo stabile h-prune WT o la regione amminoacidica tra dagli amminoacidi 199 a 453 di h-prune sono state generate mediante selezione con G418. Le cellule NIH 3T3 ed HeLa S3 esprimenti in modo stabile GFP-paxillina sono state generate mediante selezione con puromicina. L' anticorpo anti-Myc è stato preparato a partire dalle cellule 9E10. L'anticorpo anti-hprune è stato preparato in conigli mediante immunizzazione con proteine ricombinanti di h-prune (199-453). I duplex di siRNA sono stati usati come segue: GSK-3a umano (senso), 5'-GAAGGUUCUCCAGGACAAGTT-3'; GSK-3p umano (senso), 5'-AGUUAGCAGAGACAAGGACTT-3'; GSK-3p murino (senso), 5'-GAAGUCUAGCCUAUAUCCATT-3'; h-prune (senso), 5'-GGCGUCAAGGUGGCCAUUATT-3'; e casein chinasi la umana (CKIa)(senso), 5'-CCAGGCAUCCCCAGUUGCUTT-3' .

Metodi

Costruzione plasmidi

PCGN/GSK3P (WT), pCGN/GSK3p K85M, pCGN/GSK3p K85R, pCGN/GSK33 Y216F, pCGN/GSK3p S9A, e pGEX-4T/GSK3p (WT) sono stati costruiti come descritto in precedenza (Ikeda, S. et al., 1998; Tanji, C. et al., 2002). Le tecniche standard del DNA ricombinante sono state usate per costruire i seguenti plasmidi: pEF-BOS-Myc/h-prune (WT), pEF-BOS-Myc/h-prune (1-332), pEF-BOS-Myc/h-prune (199-453), pEF-BOS-Myc/h-prune (333-453), pGEX-6P/h-prune (WT), pV-IKS/h-prune (WT), pAd-CMV-Myc/h-prune, e pRSETA/ θ8Κ3β (WT).

Strategia di clonaggio dei plasmidi pEF-BOS vettore pEF-BOS: resistenza ampicillina (5685 bp; descritto in Nucleic Acid Research, Voi. 18, No. 17, p 5322, 1990);

vettore pEF-BOS-myc: vettore pEF-BOS nel quale una coda myc è stata inserita in trame (tra i siti XbaI 3744 ed EcoRI 3738).

(1) pEF-BOS-myc/h-prune:

Il pcDNA-Myc/EGFP-h-prune è stato digerito con BamHI e Xhol, e il frammento di cDNA di h-prune è stato inserito in un vettore pSP-myc digerito con BglII e Sali. Quindi, pSP-myc/h-prune è stato digerito con Spel e BamHI, e il frammento di cDNA di hprune è stato inserito in un vettore pEF-BOS-myc digerito con XbaI e BamHI.

(2) pEF-BOS-myc/h-prune-(1-332) e pEF-BOS-myc/hprune- (333-453):

I frammenti di cDNA di h-prune-(1-332) e hprune-(333-453) sono stati clonati mediante tecnica PCR e inseriti in vettore BSKS digerito con BamHI per confermare la sequenza. BSKS-h-prune-(1-332) e BSKS-h-prune- (333-453) sono stati digeriti con BamHI, e i frammenti sono stati inseriti nel vettore pEF-BOS-myc digerito con BamHI.

(3) pEF-BOS-myc/h-prune-(199-453)

Per identificare le proteine di legame a GSK-3, una libreria di cDNA umani è stata scansionata usando il metodo dei due ibridi di lievito. Un inserto di 1.8-kb cDNA è stato trovato portare una sequenza contenente h-prune-(199-453). Il cDNA di h-prune-(199-453) è stato digerito con BamHI e inserito in un vettore pEF-BOS-myc digerito con BamHI (figure 9-12). Coltura cellulare

Le cellule COS, NIH 3T3 e HeLa sono state cresciute in terreno Dulbecco modificato Eagle supplementato con siero di vitello 10% e siero bovino fetale 10% (FBS). Le cellule C57MG sono state in terreno Dulbecco modificato Eagle supplementato con siero bovino fetale 10% (FBS) e insulina 10 pg/ml. Le cellule SW480 e CHO sono state cresciute in terreno RPMI e Ham F12 supplementati con FBS 10%, rispettivamente. Quando necessario le cellule sono state trattate con il composto 3-(2,4-diclorofenil)-4-(l-metil-lH-indol-3-ile)-lH-pirrolo-2,5 dione (SB216763; Figura 7F) ìn concentrazioni da 3 a 10 μΜ per 4 ore o con Liei da 3 a 10 mM per 12 ore o trasfettate con l'siRNA per GSK3P o h-prune.

Strategia per generare anticorpi policlonali di coniglio contro h-prune

L'anticorpo anti-h-prune C-terminale è stato preparato in conigli mediante immunizzazione con proteine ricombinanti h-prune-(199-453). Come mostrato nella Figura 3C le cellule HeLa S3 wild-type e le cellule esprimenti Myc-prune sono state U sate. I lisati sono stati direttamente marcati con 1'anticorpo anti-prune o immunoprecipitati con gli anticorpi indicati e quindi gli immunoprecipitati sono stati marcati con 1'anticorpo anti-prune.

pEF-BOS-myc/h-prune- (199-453) è stato digerito con EcoRI, e il frammento di cDNA è stato inserito nel vettore pGEX-6P digerito con EcoRI.

La proteina ricombinante GST-fusa ad h-prune-(199-453) è stata espresso utilizzando E. Coli (DH5a) e purificata utilizzando una colonna glutatione-S-Sepharose. Il GST è stato tagliato con una proteasi di precisione da GST-h-prune-(199-453). h-prune-(199-453) (1 mg) è stato coniugato con KLH ed un coniglio è stato immunizzato con il coniugato per sei volte ogni settimana.

Saggi di migrazione cellulare

Per misurare l'attività di migrazione cellulare, sono stati condotti il saggio Transwell e di cicatrizzazione delle ferite. Il saggio di migrazione cellulare Transwell è stato condotto impiegando una camera Boyden modificata (coltura tissutale trattata, 6,5 mm diametro, 10 pm spessore, 8 pm pori; Transwell)(Costar Cambridge, MA) come descritto in precedenza (Huttenlocher, A. et al., 1996; Oshiro, T., et al., 2002). Il saggio di migrazione di aptotassi è stato condotto rivestendo solo la superficie inferiore della membrana di policarbonato con 10 pg/ml di collagene o fibronectina, mentre il saggio di migrazione random è stato condotto rivestendo entrambe le superfici superiore ed inferiore della membrana con 0,1 pg/ml di collagene. Le cellule HeLa S3, SW480 e CHO (2,5 x IO<4>cellule) e le cellule NIH 3T3 (2,5 x IO<5>cellule) sospese in terreno privo di siero contenente albumina di siero bovino 0,1% in presenza o assenza di inibitori sono state poste nella camera superiore e lasciate migrare verso il lato inferiore della camera superiore per 2-12 ore. Il numero di cellule che migrano verso il lato inferiore della camera superiore è stato contato, e la migrazione cellulare relativa è stata espressa come percentuale delle cellule migrate con il trattamento rispetto a quelle senza il trattamento.

Per consentire il saggio di cicatrizzazione delle ferite, le cellule HeLa S3, C57MG, NIH 3T3 e SW480 sono state piastrate su vetrini copri-oggetto rivestiti di collagene o fibronectina. I monostrati cellulari sono stati rimossi manualmente con la punta di una pipetta di plastica e dopo essere stati lavati con salina in tampone fosfato, i monostrati cellulari danneggiati sono stati lasciati cicatrizzare per un periodo di tempo da 12 a 24 ore.

Immunoistochimica

L'analisi immunoistochimica delle cellule coltivate è stata condotta come descritto precedentemente (Yamamoto, H. et al., 2003) eccetto per il fatto che le cellule coltivate vengono fissate e permeabilizzate simultaneamente con salina in tampone fosfato contenente 3,7% paraformaldeide e Triton X-100 0,5%. L'analisi immunoistochimica dei tessuti imbevuti di paraffina dai pazienti è stata condotta come descritto precedentemente (Kuniyasu, H., et al., 2000). Le sezioni sono state colorate con ematossilina 0,1%. Un risultato viene considerato positivo quando più del 50% delle cellule sono colorate.

I saggi di immunoprecipitazione e con gli RNAi sono stati condotti come descritto in precedenza (Hino, S.I. et al., 2003; Yamamoto, H. et al., 2003). L'attività di GSK-3 è stata saggiata mediante l'uso di peptidi sintetici come substrati (Ikeda, S. et al., 1998; Tanji, C. et al., 2002). L'attività PDE delle cellule HeLa S3 è stata saggiata utilizzando L'attivazione di Rac è stata saggiata mediante l'impiego di GST-CRIB (2). [<3>H]cAMP come substrato (Thompson, W., et al., 1974).

Analisi clinico-patologica di h-prune

Per le analisi immunoistochimiche sono stati usati tessuti imbevuti di paraffina fissati in formalina da 134 pazienti che sono stati sottoposti ad intervento di excisione chirurgica di tumore colonrettale (adenocarcinoma) (n=92) o pancreatico (adenocarcinoma duttale) (n=42). La stadiazione tumorale è stata effettuata secondo il sistema di classificazione TNM (Sobin, L.H., et al., 2002). La procedura per tutelare la privacy era in accordo alle linee guida etiche per la ricerca dei geni del genoma umano redatte dal governo giapponese. Le correlazioni tra i parametri clinicopatologici e l'espressione di hprune sono stati analizzati mediante il test di Fisher. I valori di P inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Costruzione di anticorpi

L'anticorpo anti-h-prune C-terminale è stato preparato in conigli mediante immunizzazione con proteine ricombinanti h-prune-(199-453). Come mostrato nella Figura 3C le cellule HeLa S3 wild-type e le cellule esprimenti Myc-prune sono state U sate. I lisati sono stati direttamente marcati con 1'anticorpo anti-prune o immunoprecipitati con gli anticorpi indicati e quindi gli immunoprecipitati sono stati marcati con 1'anticorpo anti-prune.

RISULTATI

Coinvolgimento di GSK-3 nella migrazione cellulare Gli autori hanno esaminato inizialmente il coinvolgimento di GSK-3 nella motilità cellulare utilizzando un saggio di migrazione Transwell. Le cellule HeLa S3 migrano sia sul collagene sia sulla fibronectina (Fig. 1A). Liei che è un noto inibitore dell'attività di GSK-3 (28, 42) riduce la migrazione delle cellule HeLa S3, mentre NaCl non influenza la migrazione (Fig. 1A). Il 3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-lH-indol-3-ile)-lH-pirrolo-2 ,5 dione (SB216763; Figura 7F) è un altro inibitore della GSK-3 e sopprime la migrazione (Fig. 1A). Le cellule CHO migrano sulla fibronectina ma non sul collagene e il LiCl riduce la loro migrazione (Fig. 1B). L'iperespressione di GSK-3p wild-type o di una forma costitutivamente attiva di GSK-3P non influenza la migrazione cellulare (dati non mostrati) indicando che GSK-3P non è un fattore limitante per la migrazione.

Gli autori dell'invenzione hanno depleto GSK-3 endogeno in cellule HeLa S3 mediante l'impiego di RNAi per determinare se GSK-3 fosse coinvolto in modo decisivo nella regolazione della migrazione cellulare. siRNA specifici per GSK-33 o GSK-3a riducono i livelli rispettivi ma non i livelli di vinculina e CKIa. Un oligonucleotide senso a singolo filamento per GSK-3P o un siRNA per CKIa non agiscono sui livelli delle proteine GSK-3p o GSK-3a. Una riduzione di GSK-3p o di GSK-3a ma non di CKIa inibisce la migrazione delle cellule HeLa S3 (Fig. 1C). Dato che questi saggi sono stati effettuati rivestendo la superficie inferiore delle membrane con i substrati, i risultati dimostrano il coinvolgimento dì GSK-3 nell'aptotassi. La migrazione random è stata studiata rivestendo entrambe le superfici inferiore e superiore delle membrane con i substrati. L'inibizione di GSK-3 sopprime anche la migrazione random delle cellule HeLa S3 (Fig. 1D). Pertanto, GSK-3 è coinvolto sia nell'aptotassi, sia nella migrazione random.

Identificazione di h-prune come proteina di legame di GSK-3

Per identificare le proteine di legame di GSK-3 che sono coinvolte nella migrazione cellulare, è stata screenata la libreria di cDNA di cervello umano utilizzando il metodo dei due ibridi in lievito (Ikeda, S. et al., 1998; Yamamoto, H. et al., 1998). Un inserto di cDNA da 1,8 kDa è stato trovato codificare una sequenza contenente una regione di lettura aperta di h-prune (Fig. 2A). h-prune appartiene alla famiglia DHH e mostra attività PDE (fosfodiesterasica), e 1'iperespressione di h-prune incrementa la migrazione cellulare che è inibita dalla soppressione della sua attività PDE (D'Angelo, A. et al., 2004). In particolare, è stato dimostrato che la regione amminoacidica C-terminale 333-453 (PNLHAYLQGNTQVSRKKLLPLLQEALSAYFDS MKIPSGQPETADVSREQVDKELDRASNSLISGLSQDEEDPPLPPTPMNSLVDE CPLDQGLPKLSAEAVFEKCSQISLSQSTTASLSKK; GeneBank NP 067045) dì h-prune umana (Sequenza amminoacidica GeneBank NP 021222.1) è sufficiente e necessaria per la formazione del complesso con GSK-3P in cellule intatte (Fig. 2B). Tale regione della proteina è stata individuata come inibitore della formazione del complesso tra h-prune e GSK-3P proprio perché comporta lo spiazzamento del legame, inibendo la migrazione cellulare indotta dal suddetto complesso.

Questi risultati indicano che l'attività chinasica di GSK-3 viene richiesta per la interazione con h-prune in cellule intatte. GSK-3 non fosforila h-prune in vitro, e il composto SB216763 da solo non influenza la fosforilazione di h-prune in cellule intatte, laddove il<32>P è stato marcato metabolicamente (dati non mostrati). L'attività chinasica di GSK-3 nei complessi immuni con h-prune è stata rilevata utilizzando substrati peptidici, e la forma fosforilata a livello della Tyr216 di GSK-3P, che è una forma attiva, è stata osservata nei complessi immuni di hprune (Fig. 2D), indicando che GSK-3 complessato con h-prune è attivo. Il trattamento delle cellule HeLa S3 con il dipiridamolo non influenza la formazione del complesso tra h-prune e GSK-3P (Fig. 2E), suggerendo che l'attività di PDE di h-prune non sia necessaria per il legame di h-prune a GSK-3.

Co involgimento di h-prune nella migrazione cellulare L'impiego di un siRNA per h-prune sopprime la motilità cellulare nel saggio di migrazione Transwell (Fig. 3A) indicando che h-prune è necessaria per la migrazione cellulare. L'espressione della regione C-terminale di Myc-h-prune in cellule HeLa S3 inbisce la formazione di un complesso di GSK-3P con h-prune a livello endogeno, e le cellule esprimenti il mutante Myc-h-prune (due cloni differenti CI e C33) mostrano una migrazione rallentata (Fig. 3B). Questi risultati suggeriscono che il legame tra GSK-33 e h-prune sia coinvolto nella migrazione cellulare.

Localizzazione di h-prune nelle adesioni focali Per chiarire il modo in cui avviene la regolazione della migrazione cellulare da parte di GSK-3β e h-prune, è stata esaminata la localizzazione subcellulare di queste proteine: GSK-3p è stato localizzato a livello delle fibre dello stress in cellule HeLa S3 dopo trattamento delle cellule con Triton X-100 mentre h-prune è localizzata a livello delle adesioni focali dove è presente la paxillina e le due proteine sono co-localizzate (dati non mostrati). In modo consistente con questi studi di localizzazione i saggi di immunoprecipitazione dimostrano che h-prune è associata con la paxillina e la vinculina insieme a GSK-3p a livello endogeno in cellule HeLA S3 (dati non mostrati) e C57MG (Fig. 4A). Myc-h-prune (1-332), ma non Myc-h-prune (333-453) o Myc-h-prune (199-453) interagiscono con la paxillina (Fig. 4B), indicando che il GSK-Ββ e la paxillina formano un complesso con differenti regioni di h-prune. Inoltre, il precipitato GST-paxillina-h-prune ricombinante, vinculina, e GSK-3p dalle cellule HeLa S3 esprimenti Myc-h-prune (Fig. 4C). Considerati insieme questi risultati suggeriscono che h-prune si lega a GSK-3 attiva a livello delle adesioni focali.

Ruolo di GSK-3 e h-prune nella formazione delle adesioni focali

Il saggio di migrazione eterogenea di cicatrizzazione delle ferite è stato condotto per esaminare i ruoli di GSK-3 e h-prune nella formazione delle adesioni focali. Le cellule C57MG sono state lasciate migrare in colture danneggiate eterogenee, comportando la chiusura delle ferite dopo 12 ore che viene inibita da SB216763 (Fig. 5A). La paxillina e la vinculina sono state osservate visibilmente nelle cellule migranti di controllo, e h-prune è stata colocalizzata con esse (Fig. 5B, a-c, j—1). Le adesioni focali più estese che includono la paxillina, la vinculina e h-prune si formano ai bordi delle cellule trattate con SB216763 (Fig. 5B, d-f, m-o). Queste proteine sembrano accumularsi a livello delle adesioni focali nelle cellule trattate rispetto alle cellule controllo. Il dipiridamolo non influenza la localizzazione subcellulare di paxillina e h-prune (Fig. 5B, g-i) indicando che l'attività PDE non è richiesta per la localizzazione di h-prune alle adesioni focali. Le cellule knocked down per GSK-3p mostrano l'accumulo di paxillina, vinculina e h-prune alle adesioni focali (dati non mostrati).

L'inibizione dell'attività di GSK-3 non influenza il livello di espressione di h-prune (Fig. 2C). Dato che è stato suggerito che la formazione di adesioni focali estese è dovuta al ridotto turnover delle adesioni focali (Ridley, A. J. et al., 2003) sono stati esaminati gli effetti di GSK-3 e h-prune sulla dinamica delle adesioni focali. E'stata misurata la costante di velocità di disassemblaggio delle adesioni contenenti paxillina nelle cellule migranti NIH 3T3 ed è stato riscontrato che la velocità media di disassemblaggio della GFP-paxillina dai siti di adesione è ridotta nelle cellule trattate con Liei (Fig. 5C). Le costanti di velocità di disassemblaggio della paxillina in cellule trattate con RNA di controllo, cellule knocked down per GSK-3P, e cellule knocked down per h-prune erano (9,3 ± 1,4) X IO<-2>min<-1>(3,4 ± 0,6) X IO<'2>min<"1>e (3,4 ± 0,5) X IO<"2>min<"1>, rispettivamente. I lamellipodi all'apice cellulare sono stati misurati mediante misurazione dell'area di protrusione. La formazione della protrusione dei lamellipodi era ridotta in cellule knocked down per GSK-3P e hprune (Fig. 5D). Questi risultati insieme suggeriscono che entrambe GSK-3P e h-prune sono necessarie per il disassemblaggio efficiente dei complessi di adesione.

Coinvolgimento di GSK-3f 3 e h-prune nell 'attivazione di FAK e Rac

E'stato riportato che i fibroblasti privi di FAK hanno una ridotta velocità di migrazione, con un incremento nel numero e nella dimensione delle adesioni localizzate in periferia (Ilic, D. et al., 1995, Webb, D. J. et al., 2004). FAK viene attivata attraverso la fosforilazione della Tyr397 che viene iniziata con l'interazione tra le integrine e il loro ligando (Schaller, M.D. et al., 1994). Quindi, per esaminare il ruolo di GSK-3P e h-prune nell'attivazione di FAK, le integrine sono state attivate ponendo le cellule HeLa S3 a contatto con il collagene. La fosforilazione della Tyr 397 di FAK mediante stimolazione con il collagene era ridotta in cellule knocked-down per GSK-3P e h-prune (Fig. 6A). L'iperespressione di h-prune (199-453) che inibisce l'interazione di GSK-3 con h-prune, sopprime anche la fosforilazione di Tyr 397 di FAK (Fig. 6B). Questi risultati suggeriscono che FAK agisca a valle di GSK-3. In modo coerente con queste osservazioni l'espressione di una forma costitutivamente attiva di FAK, FAK<K578E/K581E>(Gabarra-Niecko, V.P. et al., 2002) ha parzialmente liberato le cellule knocked-down per GSK-33 dall'inibizione della migrazione (Fig. 6C). E'stato anche esaminato il ruolo di GSK-3 e h-prune nell'attivazione della piccola proteina G Rac che stimola la migrazione cellulare. L'attivazione collagene-dipendente di Rac è stata soppressa mediante la riduzione di GSK-3 e h-prune in cellule HeLa S3 o mediante inibizione dell'attività di GSK-3 (Fig. 6D). Questi risultati indicano che GSK-3 e h-prune regolano l'attivazione di FAK e Rac in modo cooperativo. Correlazione di h-prune con la aggressività tumorale Nel corso di un precedente lavoro gli autori della presente invenzione avevano dimostrato l'elevata espressione di h-prune nel cancro alla mammella (D'Angelo, A., et al., 2004; Zollo, M., et al., 2005). E'stata verificata l'espressione di h-prune in altri tumori, come il tumore al colon-retto e panereatico. Sebbene l'epitelio del colon-retto non neoplastico contenga alcune cellule h-prune-positive, il tessuto tumorale manifesta una colorazione molto più intensa (Fig. 7 A, a-b). I risultati vengono considerati positivi quando più del 50% delle cellule è colorato. In totale 27 casi (29,3%) su 92 casi di tumore del colon-retto erano positivi per h-prune. La positività per h-prune è stata correlata con il grado di invasività T, con il grado di metastasi lìnfonodale N, con il grado di metastasi distale M (P = 0.0132, P = 0.0044 e P = 0.0215, rispettivamente; test di Fisher)(Fig. 8, Tabella 1). Inoltre, la colorazione di h-prune è stata osservata più frequentemente agli stadi III/IV rispetto agli stadi I/II (P = 0.0044). Simili risultati sono stati anche osservati negli casi di cancro pancreatico (18/42 casi erano positivi) eccetto per i casi di grado M (Fig. 7A, c-d e Fig. 8, Tabella 2). Non esiste una significativa associazione tra l'espressione di h-prune e il grado M, ma i casi di cancro pancreatico con metastasi distanti hanno una tendenza ad esprimere h-prune più intensamente rispetto ai casi privi di metastasi distali. Questi risultati suggeriscono che l'espressione incrementata di h-prune potrebbe essere correlata alla maggiore aggressività tumorale.

Come osservato in altre linee cellulari h-prune è si colocalizza con la paxillina a livello delle adesioni focali in cellule derivate da tumore al colon retto SW480 (Fig. 7B). Il trattamento di una coltura di cellule SW480 danneggiata con SB216763 (Fig. 7F) o con gli siRNA di GSK-30 o h-prune causa l'accumulo di paxillina a livello del bordo della cellula (Fig. 7C). La riduzione di GSK-3 o di h-prune mediante RNAi inibisce la migrazione delle cellule SW480 (Fig. 7D). In modo coerente con altre osservazioni il dipiridamolo sopprime la migrazione delle cellule SW480 (Fig. 7E). Tuttavia, SB216763 in combinazione con il dipiridamolo inibisce la migrazione cellulare in modo molto più consistente (Fig. 7E), suggerendo che la combinazione degli inibitori dell'attività PDE di hprune e dell'attività chinasica di GSK-3 previene la invasività o la metastasi del cancro colon-rettale.

BIBLIOGRAFIA

Plyte, S.E., K. Hughes, E. Nikolakaki, B.J. Pulverer, e J. R: Woodgett. 1992. Biochim. Biophys. Acta 1114:147-162.

Cohen, P. e S. Frame. 2001. Nat. Rev. Mol. Celi. Biol. 2:769-776.

Doble, B. W., e J. R. Woodgett. 2003. J. Celi. Sci. 116: 1175-1186.

Grimes, C. A., e R. S. Jope. 2001. Prog. Neurobiol. 65:391-426.

Woodgett, J. R. 1990. EMBO J. 9:2431-2438.

Jope, R.S. e G. V. W. Johnson. 2004. Trends. Biochem. Sci. 29:95-102.

Eickholt, B.J.F.S: Walsh e P. Doherty. 2002. J. Celi. Biol. 157:211-217.

Etienne-Manneville, S. e Halla A. 2003. Nature 421:753-756.

Yoshimura, T., Kawano, Y., Ariinura, N., Kawabatta, A., Kikuchi, A. e Kaibuchi K. 2005. Celi 120:137-149.

Ivaska, J., Nissinen, L., Immonen N., Eriksson, J.E., Kahari, V.-M. e Heino, J. 2002. Celi. Biol.

22:1352-1359.

Roberts, M.S., Woods, A. J., Dale, T.C., Van der Sluijs, P. e Normann, J.C. 2004. Mol. Celi. Biol.

24:1505-1515.

Koivisto, L., Alavian, K., Hàkkinen, L., Pelech, S., McCulloch C.A., e Larjava, H. 2003. J. Celi. Sci.

116:3749-3760.

Somanath, P.R., Jack, S.L. e Vijayaraghavan S.

2004. J. Androl. 25:605-617.

D'Angelo, A., Garzia L., André, P., Carotenuto, P., Aglio, V., Guardiola, 0., Arrigoni, G., Cossu, A., Palmieri, G., Aravind, L., Zollo, M. 2004. Cancer Celi. 5:137-149.

Zollo, M., André, P., Cossu, A., Sini, M.C., Marino, N., Budroni, M., Tanda, F., Arrigoni, G., Palmieri, G. 2005. Clin. Cancer Res. 11:199-205.

Ikeda, S., Kishida, S., Yamamoto, H., Murai, H., Koyama, S., Kikuchi, A. 1998. EMBO J. 17:1371-1384.

Tanji, C., Yamamoto, H., Yorioka, N., Kohno, N., Kikuchi, K., Kikuchi, A. 2002. J. Biol. Chem.

277:36955-36961.

Huttenlocher, A., Ginsberg, M.H., Horwitz, A.F.

1996. J. Celi. Biol. 134:1551-1562.

Oshiro, T., Koyama, S., Sugiyama, S., Rondo, A., Onodera, Y., Asahara, T., Sabe, H. e Kikuchi, A.

2002. J. Biol. Chem. 277:368618-38626.

Yamamoto, H., Ihara, M., Matsuura Y., e Kikuchi, A. 2003. EMBO J. 22:2047-2059.

Kuniyasu, H., Yasui, W., Shinohara, H., Yano, S., Ellis, L. M., Wilson, M. R., Bucana, C.D., Rikita, T., Tahara, E., e Fidler, I. J. 2000. Am. J. Pathol. 157:1523-1535.

Hino, S.-I., Michiue, T., Asashima, M. e Kikuchi, A. 2003. J. Biol. Chem. 278:14066-14073.

Thompson, W. J., Brooker, G., e Appleman, M. M.

1974. Methods Enzymol. 38:205-212.

Sobin, L. H. e Wittekind C.H. 2002. Classificazione TNM die tumori maligni, 6a edizione Wiley-Liss.

Yamamoto, H., Kishida, S., Uochi, T., Ikeda, S., Asashìma, M., e Kikuchi, A. 1998. Mol. Celi. Biol.

18:2867-2875.

Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge K., Firtel, R. A., Ginsberg, H., Borisy, G., Parsons, T., e Horwitz, A. R. 2003. Science. 302:1704-1709.

Ilic, D., Furuta, Y., Kanazawa S., Takeda, N., Sobue, K., Nakatsuji, N., Nomura, S., Fujimoto, J., Okada, M., Yamamoto, T. e Aizawa, S. 1995. Nature.

377:539-544.

Webb, D. J., Donais, K., Whitmore, L.A., Thomas, S. M., turner, C. E., Parsons, J. T., e Horwitz, A. F. 2004. Nat. Celi. Biol. 6:154-161.

Schaller, M. D., Hildebrand, J. D., Shannon, J. D., Fox, J. W., Vines R. R. e Parsons, J. T. 1994. Mol. Celi. Biol. 14:1680-1688.

Gabarra-Niecko, V. P.. Keelv. P. J., e Schaller, M. D. 2002. Biochem. 365:591-603

W02005/056043.

Claims (18)

1. RIVENDICAZIONI 1. Inibitore della migrazione cellulare mediata dal complesso tra h-prune e GSK-3, in cui detto inibitore è scelto dal gruppo che consiste in siRNA anti-GSK-3, siRNA anti-h-prune, la sequenza amminoacidica C-terminale di h-prune comprendente gli amminoacidi 333-453 della sequenza di h-prune umana e la sequenza oligonucleotidica codificante per essa e anticorpi anti-C-terminale di h-prune, per l'uso in campo medico.
2. 2. Inibitore secondo la rivendicazione 1, in cui detta GSK-3 è GSK-3a o GSK-3p.
3. 3. Inibitore secondo la rivendicazione 2, in cui 1'siRNA anti-GSK-3a comprende la sequenza nucleotidica 5'-GAAGGUUCUCCAGGACAAGTT-3'.
4. 4. Inibitore secondo la rivendicazione 2, in cui 1'siRNA anti-GSK-33 comprende la sequenza nucleotidica 5'-GAAGGUUCUCCAGGACAAGTT-3'.
5. 5. Inibitore secondo la rivendicazione 1, in cui 1'siRNA anti-h-prune comprende la sequenza nucleotidica 5'-GGCGUCAAGGUGGCCAUUATT-3'.
6. 6. Inibitore secondo la rivendicazione 1, in cui detta sequenza amminoacidica C-terminale di h-prune comprende la seguente sequenza di amminoacidi PNLHAYLQGNTQVSRKKLLPLLQEALSAYFDSMKIPSGQPETADVSREQVDKE LDRASNSLISGLSQDEEDPPLPPTPMNSLVDECPLDQGLPKLSAEAVFEKCSQ ISLSQSTTASLSKK.
7. 7. Inibitori secondo la rivendicazione 1, in cui detti anticorpi anti-C-terminale di h-prune sono anticorpi policlonali contro la sequenza amminoacidica come definita nella rivendicazione 6.
8. 8. Inibitore secondo la rivendicazioni 1, in cui detta sequenza oligonucleotidica codifica per la sequenza amminoacidica C-terminale di h-prune come definita nella rivendicazione 6.
9. 9. Sequenza oligonucleotidica codificante per la sequenza amminoacidica C-terminale di h-prune come definita nella rivendicazione 6 o la sequenza ad essa complementare o la sequenza in cui la T è sostituita dalla U.
10. 10. Costrutto di acido nucleico comprendente la sequenza oligonucleotidica secondo la rivendicazione 9, per l'uso in campo medico.
11. 11. Uso degli inibitori come definiti secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 8 o del costrutto secondo la rivendicazione 10, per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori .
12. 12. Combinazione del dipiridamolo con il 3-(2,4-dìclorofenil)-4- (l-metil-1H-indol-3-ile)-lH-pirrolo-2,5 dione, assieme ad uno o più eccipienti e/o adiuvanti farmacologicamente accettabili per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori.
13. 13. Kit di parti comprendente il dipiridamolo e il 3- (2,4-diclorofenil)-4-(l-metil-1H-indol-3-ile) -1H-pirrolo-2,5 dione per la somministrazione separata, simultanea o sequenziale ad un soggetto per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori.
14. 14. Combinazione di siRNA anti-GSK-3 come definito secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 4 con il siRNA anti-h-prune come definito secondo la rivendicazione 5, assieme ad uno o più eccipienti e/o adiuvanti farmacologicamente accettabili per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori.
15. 15. Kit di parti comprendente siRNA anti-GSK-3 come definito secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 4 con il siRNA anti-h-prune come definito secondo la rivendicazione 5, per la somministrazione separata, simultanea o sequenziale ad un soggetto per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori .
16. 16. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 11-15, in cui detti tumori sono scelti tra il cancro colonrettale e il cancro pancreatico.
17. 17. Composizione farmaceutica comprendente almeno uno degli inibitori secondo ognuna nelle rivendicazioni da 1 a 8 o il costrutto secondo la rivendicazione 10, assieme ad adiuvanti e/o eccipienti farmacologicamente accettabili.
18. 18. Uso della composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 17, per il trattamento e/o la prevenzione delle metastasi dei tumori.