ITRM20070371A1 - Citometro laser in flusso per la misura simultanea di taglia indice di rifrazione asfericita' e fluorescenza di particelle microscopiche in sospenzioni liquide o gassose - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: CITOMETRO LASER IN FLUSSO PER LA MISURA SIMULTANEA DI TAGLIA, INDICE DI RIFRAZIONE, ASFERICITÀ E FLUORESCENZA DI PARTICELLE MICROSCOPICHE IN SOSPENSIONI LIQUIDE 0 GASSOSE;

La presente invenzione riguarda sostanzialmente un apparato per la misura simultanea delle caratteristiche, fisiche di particelle microscopiche presenti in sospensioni liquide o gassose.

Più specificamente, il trovato è relativo ad un citometro laser in flusso comprendente una sorgente di luce polarizzata circolarmente e una cella con un capillare. La sorgente irraggia il capillare in cui sono fatte fluire particelle microscopiche in sospensioni liquide o gassose. Ógni particella, a causa, dell'interazione con la radiazione di luce coerente, emette per diffusione e fluorescenza.

Secondo l'invenzione, questa emissione è raccolta - simultaneamente - dai canali di rivelazione della luce non polarizzata diffusa in avanti, della luce polarizzata linearmente diffusa in avanti, della luce non polarizzata diffusa lateralmente in differenti bande spettrali.

In base alle misure di emissione effettuate in questi canali, un apposito software di acquisizione permette di determinare simultaneamente e in tempo reale: taglia, indice di rifrazione, depolarizzazione (asfericità) e fluorescenza di ogni particella.

I test condotti con campioni acquosi di sfere di polistirolo, fluorescenti o non fluorescenti, e cellule di fitoplancton dimostrano che l'invenzione è capace di ricostruire taglia e indice di rifrazione con un'accuratezza dell'1% e che le misure di depolarizzazione e fluorescenza permettono di classificare particelle altrimenti indistinguibili.

La misura simultanea di taglia e indice di rifrazione di particelle microscopiche con sistemi laser è basata sulla teoria di Mie che descrive la diffusione della luce da parte di sfere dielettriche [1] In generale, gli strumenti basati su questa tecnica prendono il nome di contatori laser di particelle [2] e citometri laser in flusso [3], a seconda che le particelle siano sospese in aria e acqua, rispettivamente. Il grande interesse per la classificazione rapida di particelle microscopiche in sospensioni liquide (fitoplancton marino, cellule sanguigne, ecc.) ha favorito l'ampia diffusione di sistemi commerciali basati sulla citometria laser in flusso (LFC).

Le ditte più affermate in questo campo sono:

■ Becton, Dickinson and Company [4],

• Beckman Coulter [5],

• Partec [6].

Nella LFC, il flusso di particelle e il fascio laser sono ortogonali. Quando la particella attraversa il fascio, la radiazione è diffusa con una distribuzione angolare che dipende da taglia e indice di rifrazione. In generale, nei sistemi commerciali ci si limita a misurare la diffusione in avanti (FSC) e la diffusione laterale (SSC), senza ricavare la taglia e l'indice di rifrazione. Spesso, la fluorescenza delle particelle è rivelata in alcune bande spettrali. Tipicamente, la diffusione in avanti è associata alla taglia della particella [7], mentre la -diffusione laterale è dominata da effetti rifrattivi [8]. Sebbene si tratti di semplificazioni, questo approccio permette la classificazione rapida delle cellule in campo clinico, soprattutto se le cellule sono marcate con anticorpi monoclonali coniugati a coloranti fluorescenti. Per quanto riguarda le applicazioni della LFC al fitoplancton marino, segnaliamo i prodotti della CytoBuoy che fabbrica sistemi da laboratorio, per boe e sottomarini [9].

E' importante osservare che, fino ad oggi, la misurazione di taglia e indice di rifrazione è sempre stata effettuata in modo separato e distinto dalla eventuale misurazione di polarizzazione (asfericità) e fluorescenza. Ciò significa che attualmente non è possibile rilevare tutti questi dati per una stessa particella perchè le suddette misure, fatte in tempi diversi, non consentono di rilevare i dati relativi ad una stessa particella.

In altre parole, rilevando la diffusione separatamente rispetto alla fluorescenza, non è possibile associare - a posteriori - dette misurazioni alla particella a cui si riferiscono.

Ad esempio, nell'ambito della caratterizzazione delle cellule fitoplanctoniche, è opportuno notare che:

• le cellule fitoplanctoniche possono essere discriminate non solo mediante taglia e indice di rifrazione, ma anche in base a forma e pigmentazione,

e forma e pigmentazione possono essere osservate, rispettivamente, grazie alla depolarizzazione della diffusione e all'emissione di fluorescenza .

Scopo principale della presente invenzione è superare i limiti dei prodotti convenzionali fornendo un dispositivo in grado di combinare LIF, LFC e ottiche polarizzanti al fine di misurare simultaneamente taglia, indice di rifrazione, depolarizzazione o asfericità e fluorescenza di particelle microscopiche in sospensioni liquide o gassose.

Ciò è stato ottenuto, secondo il trovato, prevedendo di combinare insieme la citometria laser a scansione in flusso (LSFC) [15], capace di ricostruire taglia e indice di rifrazione, con opportuni mezzi per la misura della depolarizzazione o asfericità di particelle microscopiche.

Una migliore comprensione dell'invenzione si avrà con la seguente descrizione e con riferimento alle- figure che illustrano, a puro titolo esemplificativo e non già limitativo, una preferita forma di realizzazione.

Nei disegni:

La figura 1 mostra il principio di funzionamento, di un citometro laser in flusso.

La figura 2 è un esempio di dati ottenuti con un citometro laser in flusso: si noti come la fluorescenza della clorofilla permetta di distinguere il fitoplancton (nuvole di punti lungo la linea a 45°) dalle altre particelle (nuvola di punti orizzontale). Osservando colture note, è possibile attribuire le nuvole di punti a tipi di fitoplancton.

La figura 3 è uno schema di FACScan (Becton, Dickinson and Company).

La figura 4 è una foto dell'invenzione: i principali elementi sono indicati con la nomenclatura seguita in Tabella 1 che segue.

La figura 5A è uno schema ottico dell'invenzione: i tre specchi di rinvio (inseriti fra D e Q) e l'ulteriore specchio di rinvio (inserito fra M2 e li) sono ininfluenti e non sono stati indicati .

La figura 5B mostra schematicamente il percorso ottico del fascio laser e della luce diffusa dalle particelle che si riflette sullo specchio sferico sul fondo della cuvette.

La figura 6 mostra l'interfaccia del programma di acquisizione e analisi. Le tracce 1, 2 e 3 rappresentano i segnali relativi a "indicatrix", "trigger" e fluorescenza (il secondo è stato invertito per comodità di visione).

Le figure 7A e 7B sono, rispettivamente, immagini di Chlamydomonas reinhardtii ottenute al microscopio elettronico a scansione e al microscopio ottico ottenute.

Le figure 8A-8D sono istogrammi rispettivamnente relativi a: taglia, indice di rifrazione, fluoresceinza e depolarizzazione ottenuti analizzando un campione di Chlamydomonas reinhardtii mescolato Con sfere di polistirolo fluorescenti e non fluorescenti, aventi-diametro 6 pm.

La figura 9 è uno "Scatter plot" a due dimensioni (taglia e depolarizzazione) analizzando un campione di Chlamydomonas reinhardtii mescolato con sferette di polistirolo fluorescenti, aventi diametro 6 μπι.

La figura 10 è uno "Scatter plot"; a tre dimensioni (taglia, depolarizzazione e fluorescenza) ottenuto analizzando un campione di Chlamydomonas reinhardtii mescolato con sferette di polistirolo fluorescenti e non fluorescenti, aventi diametro 6 pm (i punti più piccoli sono le proiezioni sui piani).

La figura 11 è uno "Scatter plot" a tre dimensioni (taglia, fluorescenza a 530 nm e fluorescenza a 680 nm) ottenuto analizzando un campione preparato mescolando sfere di polistirolo fluorescenti nel verde e non fluorescenti, aventi diametro 2 μπι, con sfere di polistirolo fluorescenti nel rosso e non fluorescenti, aventi diametro 6 μιη.

Il principio di funzionamento della LFC è illustrato in Fig. 1, un esempio di dati è fornito in Fig. 2 e un diffuso strumento commerciale è mostrato in Fig. 3.

Tipicamente, la LFC permette di acquisire simultaneamente 5 parametri: diffusione in avanti, diffusione laterale e fluorescenza in 3 bande spettrali. La velocità di conteggio può superare 10 mila particelle al minuto. Tra i vantaggi della LFC ricordiamo la facilità di preparazione del campione, l'assenza di trattamento chimico e là possibilità di effettuare misure in situ.

Secondo il trovato, si prevede un apparato comprendente:

— mezzi per illuminare le particelle da analizzare --con una luce laser polarizzata circolarmente; — un rilevatore a diffusione in avanti atto a misurare simultaneamente la luce non polarizzata e polarizzata. linearmente diffusa dalle particelle in un ampio intervallo dell'angolo polare, tipicamente tra 5° e 100°, dove i fasci non polarizzato e polarizzato sono perpendicolari;

— un rilevatóre à diffusione laterale atto a misurare simultaneamente la luce non polarizzata diffusa dalle particelle nella direzione laterale e la fluorescenza delle particelle in differenti bande spettrali;

— un apposito software di acquisizione ed elaborazione atto a- fornire in tempo reale taglia, indice di rifrazione e un parametro di depolarizzazione delle particelle, sulla base di dette misure di luce non polarizzata e polarizzata rilevate dal rilevatore a diffusione in avanti;

— un apposito software di acquisizione ed elaborazione atto a fornire in tempo reale l'istante di passaggio della particella in un punto noto e parametri di fluorescenza delle particelle, sulla base delle misure di luce non —polarizzata e fluorescenza rilevate dal rivelatore a diffusione laterale;

dette misurazioni e/o calcoli di taglia, indice di rifrazione, depolarizzazione o asfericità e fluorescenza essendo effettuate simultaneamente. Nelle sperimentazioni è stato usato un laser a diodo D con rapporto di polarizzazione elevato (100:1). Tale sorgente, inoltre, è caratterizzata da potenza grande e lunghezza d'onda corta, permettendo al sistema di avere buona sensibilità e di rivelare particelle sub-micrometriche (fino a circa metà della lunghezza d'onda).

Eventualmente, è possibile aumentare il rapporto di polarizzazione inserendo nel fascio un polarizzatore come ad esempio un Glan-Taylor Thorlabs GT10 (diametro "clear aperture": 10 mm, rapporto di estinzione: 100,000:1). Il fascio 1 polarizzato linearmente, dopo essere stato rinviato da tre specchi per compattare il sistema, attraversa una lamina a quarto d'onda Q, uscendo polarizzato circolarmente. Successivamente, dopo essere stato focalizzato da una prima lente Li e aver attraversato uno specchio forato M2, il fascio 1 incide coassialmente su un flusso di particelle 2 in sospensione liquida che attraversa il capillare (diametro: 254 pm) di una cuvette C. Nella zona di interazione (lunghezza inferiore a 5 mm) il fascio ha sezione trasversale piccola (diametro attorno a 30 p FWHM) e quindi il flusso di energia radiante è elevato. La luce 3 diffusa dalla particella 2 è riflessa verso lo specchio forato M2da uno specchio sferico 4 che costituisce il fondo della cuvette C. La radiazione riflessa dallo specchio forato M2, dopo essere stata rinviata da un apposito specchio (non mostrato) per compattare il sistema, è divisa in due parti da un "beam splitter" B non polarizzante. La parte trasmessa è rivelata da un primo fotomoltiplicatore PMi, dopo aver attraversato un polarizzatore P, quella riflessa è rivelata così comiè da un secondo fotomoltiplicatore PM2. Il "beam splitter" B, il polarizzatore P e detti fotomoltiplicatori PMi e PM2sono montati su un blocco di alluminio che permette il passaggio solo alla luce proveniente dallo specchio forato M2. Un primo diaframma regolabile li effettua il filtraggio spaziale del fascio in ingresso.

:Con riferimento alla figura 5B, è interessante notare che essendo osservata la radiazione collimata dallo specchio sferico 4, per ogni posizione della particella 2 lungo il capillare, viene rivelata solo la .luce 3 proveniente da un angolo polare di diffusione ben definito. Quindi, ricostruendo la posizione in base al tempo di acquisizione del segnale, grazie alla misura della velocità della particella 2 e dell'istante del suo passaggio in un: punto noto, è possibile determinare l'intensità della diffusione in funzione dell'angolo polare ("indicatrix") in un ampio intervallo (come detto precedentemente: tipicamente tra 5° e 100°). Infine, la taglia e l'indice di rifrazione della particella vengono ricostruiti a partire dall' "indicatrix" mediante un metodo di inversione [20] della teoria di Mie. L'istante di passaggio della particella 2 in un punto noto è misurato, come vedremo, osservando la diffusione laterale. La velocità della particella 2 è una funzióne, calibrata in precedenza, delle pressioni nel circuito idrodinamico, selezionate dall'operatore .

Se le particelle 2 sono sferiche, i segnali e I∑rrispettivamente in uscita dai suddetti fotomoltiplicatori PMi e PM2, sono uguali (a meno di un fattore costante, legato alla differente efficienza dei rispettivi canali di rivelazione, che può essere reso uguale a 1 aggiustando il guadagno dei fotomoltiplicatori).

-i3e, invece, le particelle non sono sferiche, la depolarizzazione:

è non nulla.

Quindi, la misura della depolarizzazione consente di discriminare le particelle sferiche: ciò è particolarmente utile per classificare le cellule f itoplanctoniche. .

Con riferimento allo schema ottico di figura 5A, la parte del trovato :relativa alla determinazione della taglia e dell'<'>indice di rifrazione della particella ("indicatrix"), nonché della forma della particella (polarizzazione) comprende:

— un laser a diodo (405 nm) D

— una lamina a quarto d'onda Q

— una lènte di:focalizzazione Li

— una cuvette C

— uno specchio forato M2

— un diaframma a iride li

— un "beam-splitter" non polarizzante B — un polarizzatore P

— due fotomoltiplicatori PMi e PM2

Secondo una caratteristica peculiare dell'invenzione, il dispositivo è atto a rilevare contemporaneamente anche la radiazione laterale mediante un obiettivo microscopico.

Con riferimento allo schema ottico di figura 5A, la parte del trovato relativa alla determinazione dei pigmenti della particella (fluorescenza), nonché a rilevare il passaggio della particella in un punto noto ("trigger") comprende:

— lente di collimazione L2

— specchio dicroico M4

— diaframma a iride I2

— specchio dicroico M5

— filtro interierenziale (680 nm) Fi

— fotomoltiplicatore PM3

— filtro interferenziale (530 nm) F2

— fotomoltiplicatore PM4

— diaframma a iride I3

— filtro interferenziale (405 nm) F3

— fotomoltiplicatore PM5

La luce è separata in tre zone spettrali mediante due specchi dicroici. La riflessione di un primo specchio dicroico M4indirizza la diffusione laterale ad un quinto fotomoltiplicatore PM5che misura l'istante di passaggio della particella in un punto noto e fornisce il "trigger" della misura. Il quinto fotomoltiplicatore PM5è montato su un blocco di alluminio che permette il passaggio solo alla luce proveniente dalla particella 2. Un terzo diaframma regolabile I3ed un terzo filtro interferenziale F3effettuano, rispettivamente, i filtraggi spaziale e spettrale del fascio in ingresso.

Un secondo specchio dicroico M5:

e riflette la radiazione verde ad un quarto fotomoltiplicatore PM4che misura la fluorescenza della particella attorno a 530 nm, dopo il filtraggio spettrale effettuato da un secondo filtro interferenziale F2,

• trasmette la radiazione rossa ad un terzo fotomoltiplicatore PM3che misura la fluorescenza della particella 2 attorno a 680 nm, dopo il filtraggio spettrale effettuato da un primo filtro interferenziale Fi.

I fotomoltiplicatóri e i filtri interferenziali ora descritti sono montati su un blocco di alluminio che permette il passaggio solo alla luce proveniente dalla particella 2. Un secondo diaframma regolabile I2effettua il filtraggio spaziale del fascio in ingresso. Una foto dell'<’>invenzione è mostrata in Fig. 4. Gli elementi ottici sonò descritti in Tabella 1.

I segnali rivelati dai fotomoltiplicatori sono amplificati dagli amplificatori "transìmpedance" indicati in Tab. 1, digitalizzati da un convertitore analogico digitale ADLINK DAQ-2010 (4 canali, 14 bit, 2 MS/s) e, finalmente, memorizzati e analizzati su un personal computer industriale. L'interfaccia grafica del programma di acquisizione e analisi sviluppato dagli inventori (FastSFC) è mostrata in Fig. 6. Una volta inserito il campione (tipicamente qualche migliaio di particelle), il sistema lo analizza in pochi minuti fornendo - per ogni particella - i dati relativi a: taglia, indice di rifrazione, depolarizzazione (o asfericità) e fluorescenza.

Verrà ora illustrato il funzionamento del trovato descrivendo la misura di un campione di Chlamydomonas reinhardtii, un'alga verde eucariote unicellulare, lunga circa 10 pm, che si muove servendosi di due flagelli, lunghi circa 10 pm (Fig. 7A E 7B). Tale cellula offre un test ideale per l'invenzione avendo forma ellittica e contenendo clorofilla-a che implicano, rispettivamente, depolarizzazione non nulla e fluorescenza attorno à 680 nm. I risultati del test, illustrati in Figg. 8A-8D e Tab. 2, sono stati ottenuti con un campione di Chlamydomonas reinhardtii (che chiameremo semplicemente "chlamydomonas") mescolato con sfere di polistirolo fluorescenti e non fluorescenti, aventi diametro 6 pm, (indicate come "6 pm F" e "6 pm NF", rispettivamente).

Prima- di tutto, osserviamo che l'invenzione misura correttamente la taglia e l'indice di rifrazione delle sfere. Infatti, i valori attesi: 6.0 μπι e 1.61 - 1.62 .[19], rispettivamente, sono compatibili con i valori misurati: 6.07±0.27 pm. e 1.62910.022, rispettivamente (ottenuti mediando i risultati di 6 pm F e 6 pm NF), corrispondenti a errori relativi dell'1% in entrambi i casi. Inoltre, come ci attendiamo, tutte le sfere hanno depolarizzazione nulla e la fluorescenza è diversa da zero solo per 6 pm F.

Per quanto riguarda la classificazione delle:particelle, notiamo che, a causa della grande variabilità naturale,nella taglia delle cellule (visibile al microscòpio), il relativo istogramma è piuttosto largo ed è impossibile distinguerle dalle sfere. Anche per l'indice di rifrazione vale un discorso analogo: pur essendo significativamente diversi i valori per cellule e sfere, esiste una sovrapposizione non trascurabile negli istogrammi: una cellula può essere scambiata per una sfera e viceversa. La situazione migliora se si osserva la fluorescenza: le sfere non fluorescenti sono completamente risolte. Sfortunatamente, ci può essere ancata confusione tra sfere fluorescenti e cellule. Finalmente, se si tiene conto della depolarizzazione,, è praticamente impossibile scambiare cellule e sfere.

Questi risultati sono ancora più evidenti negli "scatter plot" a due e tre dimensioni di Fig. 9 e 10, rispettivamente, e dimostrano quanto è utile la misura della depolarizzazione per 1'accurata classificazione delle particelle microscopiche: senza di essa, sarebbe stato impossibile distinguere totalmente cellule e sfere.

Per esemplificare l'utilità dell'osservazione della fluorescènza in due bande spettrali, è stato misurato un campione preparato mescolando sfere di polistirolo fluorescenti nel verde e non fluorescenti, aventi diametro 2 pm (indicate come "2 pm F" e "2 pm NF", rispettivamente), con sfere di polistirolo fluorescenti nel rosso e non fluorescenti, aventi diametro 6 pm (indicate come "6 pm F" e "6 pm NF", rispettivamente). Lo "scatter plot" a tre dimensioni di Fig. 11 dimostra che CLASS risolve i quattro tipi di particelle in nuvole di punti ben distinte.

BIBLIOGRAFIA

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Claims (17)

1. RIVENDICAZIONI:. 1. Apparato per la misura simultanea di taglia, indice di rifrazione, asfericità e fluorescenza di particelle microscopiche in sospensioni liquide o gassose, caratterizzato dal fatto che comprende, in combinazione: mezzi per la citometria laser a scansione in flusso (LSFC) atti a ricostruire taglia e indice di rifrazione delle particelle, ed opportuni mezzi per la misura della depolarizzazione o asfericità di particelle microscopiche, nonché della loro fluorescenza e/o pigmentazione .
2. 2. Apparato secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che comprende: — mezzi per illuminare le particelle;da analizzare con una luce laser polarizzata circ1olarmente; — un rilevatore a diffusione in avanti atto a misurare simultaneamente la luce non polarizzata e polarizzata linearmente diffusa dalle particelle in un ampio intervallo dell'angolo polare, tipicamente tra 5° e 100°, dove i fasci non polarizzato e polarizzato sono perpendicolari; — un rilevatore a diffusione laterale atto a misurare simultaneamente la luce non polarizzata diffusa dalle particelle nella direzione laterale e la fluorescenza delle particelle in differenti bande spettrali; - un apposito software di acquisizione ed elaborazione atto a fornire in tempo reale taglia, indice di rifrazione e un parametro di depolarizzazione delle particelle, sulla base di dette misure di luce non polarizzata e polarizzata rilevate dal rilevatore a diffusione in avanti;. — un apposito software di acquisizione ed elaborazione atto a fornire in tempo reale l'istante di passaggio della particella in un punto noto e parametri di fluorescenza delle particelle, sulla base delle misure di luce non polarizzata e fluorescenza rilevate dal rivelatore della diffusione laterale; dette misurazioni e/o calcoli di taglia, indice di rifrazione, depolarizzazione o asfericità e fluorescenza essendo effettuate simultaneamente.
3. 3. Apparato secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detti mezzi per illuminare le particelle (2) comprendono un laser a diodo (D) con rapporto di polarizzazione elevato (ad esempio 100:1).
4. 4. Apparato secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti mezzi per la determinazione della taglia e dell'indice di rifrazione della particella ("indicatrix"), nonché della forma della particella (polarizzazione), comprendono : - un laser a diodo (405 rati) (D); - una lamina a quarto d'onda (Q); - una lente di focalizzazione (Li); - una cuvette (C); - uno specchio forato (M2); - un diaframma a iride (li); - un "beam-splitter" non polarizzante (B); - un polarizzatore (P); - due fotomoltiplicatori (PMi e PM2).
5. 5. Apparato secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che il "beam splitter" (B), il polarizzatore (P) e detti fotomoltiplicatori (PM<'>i e PM2) sono montati su un blocco di alluminio che permette il passaggio solo alia luce proveniente dallo specchio forato (M2).
6. 6. Apparato secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti mezzi per la determinazione della pigmentazione della particella (fluorescenza) e per la rilevazione del passaggio della particella in un punto noto ("trigger") comprendono: -lente di collimazione (L2); - specchio dicroico (M4) ; - diaframma a iride (I2) ; - specchio dicroico (M5) ; - filtro interferenziale (680 nm) (Fi) ; - fotomoltiplicatore ( PM3) ; - filtro interferenziale (530 nm) (F2) ; - fotomoltiplicatore (PM4) ; - diaframma a iride (I3) ; - filtro interferenziale (405 nm) (F3) ; - fotomoltiplicatore (PM5) .
7. 7. Apparato secondo; la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detti fotomoltiplicatori e detti filtri interferenziali sono montati su un blocco di alluminio che permette il passaggio sólo alla luce proveniente dalla particella (2).
8. 8. Apparato secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto rilevatore a diffusione laterale comprende un obiettivo microscopico.
9. 9. Apparato secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che è atto a separare la luce in tre zone spettrali mediante due specchi dicroici (M« e M5).
10. 10. Apparato secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che un primo specchio, dicroico (M4) è atto a riflettere la diffusione laterale verso un quinto fotomoltiplicatore (PM5) atto a misurare l'istante di passaggio della particella in un punto noto ed a fornire il "trigger" della misura; detto quinto fotomoltiplicatore (PM5) essendo montato su un blocco di alluminio che permette il passaggio solo alla luce proveniente dalla particella (2).
11. 11. Apparato secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che un terzo diaframma regolabile (I3) ed un terzo filtro interferenziale (F3) sono atti ad effettuare, rispettivamente,, i filtraggi spaziale e spettrale del fascio in ingresso
12. 12. Apparato secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che un secondo specchio dicroico (M5) è atto a: • riflettere la radiazione verde ad un quarto fotomoltiplicatore (PM4) atto a misurare la fluorescenza della particella attorno a 530 nm, dopo il filtraggio spettrale effettuato da un secondo filtro interierenziale (F2), • trasmettere la radiazione rossa ad un terzo fotomoltiplicatore (PM3) atto a misurare la fluorescenza della particella (2) attorno a 680 rati, dopo il filtraggio spettrale effettuato da un primo filtro interferenziale (Fi).
13. 13. Apparato secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che un secondo diaframma regolabile. (I2) è atto ad effettuare il filtraggio spaziale del fascio in ingresso.
14. 14. Apparato secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che tra il laser (D) e la lente di focalizzazione (Li) è previsto un polarizzatore laser; detto polarizzatore laser essendo atto ad incrementare il rapporto di polarizzazione del fascio laser.
15. 15. Apparato secondò la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che prevede una lamina a quarto d'onda per ruotare la polarizzazione del fascio laser.
16. 16. Apparato secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto polarizzatore (P) è un polarizzatore di Glan-Thompson.
17. 17. Apparato secondo la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che detto polarizzatore laser è un polarizzatore di Glan-Taylor.