ITRM20100286A1 - Microscopio confocale spettrale in riflettanza a larga banda. - Google Patents
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Description
Microscopio confocale spettrale in riflettanza a larga banda
La presente invenzione riguarda un microscopio confocale spettrale in riflettanza a larga banda.
Più precisamente, la presente invenzione riguarda un microscopio confocale in riflettanza a scansione con laser a largo spettro. Questo strumento può essere usato sia per l'analisi spettrale in riflettanza sia per l'imaging morfometrico di sezioni ottiche di campioni di tessuto vitali (in vivo, ex vivo, in vitro), o di campioni per scienza dei materiali. I dati spettrali e le immagini possono essere acquisiti contemporaneamente, in un larghissimo intervallo di lunghezze d'onda, grazie all'uso di una sorgente di tipo supercontinuum (un particolare tipo di laser, dove la generazione della radiazione avviene in una fibra fotonica, detto anche "laser bianco" o "white light laser").
Accanto alla microscopia confocale "tradizionale" legata alla fluorescenza, oggi le soluzioni di microscopia confocale a scansione laser disponibili sul mercato e usate come mezzo per la diagnostica appartengono a due famiglie: i microscopi a riflettanza e quelli con eccitazione laser a due fotoni. Occorre notare che lo sviluppo ha riguardato essenzialmente l'applicazione per la diagnostica e la terapia dermatologica .
La microscopia confocale a scansione laser in riflettanza (ad esempio il sistema "Vivascope" della Mavig GmbH) è una modalità di imaging per visualizzare gli strati più superficiali della cute in tempo reale e in maniera non invasiva ma con alto contrasto e risoluzione spaziale sotto il micrometro, quindi paragonabile all'analisi istologica convenzionale. L'applicazione di questo strumento alla visualizzazione dei diversi strati della pelle ha recentemente portato grandi vantaggi in dermatologia, permettendo di aprire una finestra virtuale sulla pelle in condizioni fisiologiche, senza quindi la necessità di biopsie o trattamento dei tessuti. La possibilità di acquisire immagini ad alta risoluzione e in maniera non invasiva ha ampie applicazioni nelle aree cliniche e di ricerca, come nella diagnosi di lesioni benigne e maligne, l'individuazione dei margini tumorali, l'evoluzione della risposta a trattamenti farmacologici, chirurgici o cosmetici e lo studio patofisiologico dei processi infiammatori.
Nei microscopi confocali a riflettanza, la radiazione, infrarossa e monocromatica, del laser viene focalizzata sul campione di pelle. La radiazione, passando tra strutture cellulari con diversi indici di rifrazione, è naturalmente riflessa, viene raccolta dall'obiettivo, inviata ad un sistema di acquisizione e ricomposta in una immagine bidimensionale in toni di grigio dal software di un computer. Muovendo il fuoco del microscopio lungo l'asse perpendicolare alla superficie della pelle si possono ottenere immagini da piani a diverse profondità nella pelle. (Piergiacomo Calzavara-Pinton, Caterina Longo, Marina Venturini, Raffaella Sala and Giovanni Pellacani Reflectance Confocal Microscopy for In Vivo Skin Imaging, Photochemistry and Photobiology, 2008, 84: 1421-1430; Kishwer S. Nehal, Dan Gareau, and Milind Rajadhyaksha, Skin Imaging With Reflect ance Confocal Microscopy, Semin. Cutan. Med. Surg. 27:37-43,2008).
D'altra parte il tomografo multifotonico commerciale (ad esempio "Dermainspect" della Jenlab GmbH) è basato sulla fluorescenza causata da una eccitazione a due fotoni e dalla generazione di seconda armonica. I campi di utilizzo sono la diagnostica tumorale precoce, l'analisi dell'interazione tra tessuti ingegnerizzati e tessuti umani e lo screening farmacologico in situ (Enrico Dimitrow, Iris Riemann, Alexander Ehlers, Martin Johannes Koehler, Johannes Norgauer, Peter Elsner, Karsten Koenig and Martin Kaatz, Spectral fluorescence lifetime detection and selective melanin imaging by multiphoton laser tomography for melanoma diagnosis, Experimental Dermatology, 18, 509-515, 2009).
Nel caso della fluorescenza eccitata a due fotoni, due fotoni di uguale lunghezza d'onda nell'infrarosso (intervallo spettrale 800-1200 nm di lunghezza d'onda) sono assorbiti simultaneamente. Ogni fotone fornisce metà dell'energia che è normalmente richiesta per eccitare il fluoroforo in uno stato elettronico a più alto contenuto energetico. Quindi le emissioni blu, verdi, gialle e rosse dei fluorofori possono essere indotte con fotoni nel vicino infrarosso, quindi a più bassa energia. Con un processo a tre fotoni, i fotoni nel vicino infrarosso possono anche indurre fluorescenza ultravioletta. L'intervallo spettrale tra 800 e 1200 nm corrisponde alla finestra ottica di cellule e tessuti, ed è caratterizzata da una alta profondità di penetrazione a causa dei bassi coefficienti di assorbimento e scattering.
Una luminescenza molto particolare invece può essere osservata quando il collagene è illuminato da impulsi laser infrarossi ultra-brevi: in questo caso, le proteine della matrice extracellulare emettono luce ad una lunghezza d'onda che è la metà di quella della luce laser incidente. Questo processo è denominato generazione di seconda armonica (SHG). Avviene solo in alcune strutture molecolari non centrosimmetriche come il collagene, la miosina o la tubulina quando sono investite da intensi impulsi laser ultra-brevi.
La spettroscopia applicata ad un design confocale, invece, è stata finora applicata a metodi Raman e CARS (spettroscopia Raman anti-Stokes coerente o "Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy") confocali, chiamata nel caso di accoppiamento a microscopi ottici microspettroscopia Raman (R. J. Swain and M. M. Stevens, Raman microspectroscopy for non-invasive biochemical analysis of single cells, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 3) o applicata alla spettroscopia di fluorescenza (nel dominio dei tempi o delle frequenze) legata ai tempi di vita dei fluorocromi. La microspettroscopia Raman, che ha conosciuto grande sviluppo in tempi recenti, unisce alla tradizione di analisi chimica tramite spettroscopia vibrazionale la possibilità di eseguire l'indagine su campioni rappresentati da singole cellule vive immerse nel loro medium di coltura senza l'aggiunta di fissativi o reagenti esterni. A differenza della spettroscopia infrarossa l'intervallo spettrale usato evita le zone di grande assorbimento dell'acqua. Il limite fondamentale delle tecniche Raman è l'intrinseca debolezza del segnale che impone quindi la scelta di rivelatori opportunamente sensibili e di sorgenti ad alta intensità.
In entrambi i casi, tuttavia, si utilizza una sola lunghezza d'onda per eccitare fluorocromi o molecole specifiche.
Scopo della presente invenzione è quello di fornire un microscopio confocale in riflettanza che risolva i problemi e superi gli inconvenienti delle tecniche anteriori.
E' oggetto della presente invenzione un microscopio confocale spettrale in riflettanza a larga banda, comprendente una sorgente laser, un divisore di fascio, un sistema di focalizzazione del fascio laser sul campione, un sistema di rilevamento del fascio laser riflesso dal campione e trasmesso dal divisore di fascio, caratterizzato dal fatto che:
detta sorgente laser è una sorgente a spettro continuo nelle lunghezze d'onda del visibile e infrarosso;
- subito dopo la sorgente laser è inserito un espansore di fascio;
- detto divisore di fascio è in materiale opportunamente trasparente in tutto l'intervallo spettrale emesso dalla sorgente ed è posto a 45° rispetto alla direzione del fascio;
- detto sistema di focalizzazione è acromatico e presenta una banda spettrale tra i 200nm e i 20μπι, lunga distanza di lavoro superiore ai 5mm ed una apertura numerica superiore a 0,25.
Preferibilmente secondo l'invenzione, il materiale del divisore di fascio è il Fluoruro di Calcio.
Preferibilmente secondo l'invenzione, il materiale del divisore di fascio è il Solfuro di Zinco.
Preferibilmente secondo l'invenzione, detto sistema di focalizzazione è un primo obiettivo riflettivo.
Preferibilmente secondo l'invenzione, detto obiettivo di focalizzazione presenta un design di Cassegrain-Schwarzschild .
Preferibilmente secondo l'invenzione, la banda spettrale di detto sistema di focalizzazione è compresa tra i 400nm e i 3μπι.
Preferibilmente secondo l'invenzione, la distanza di lavoro è superiore agli 8mm, e l'apertura è superiore a 0,40.
Preferibilmente secondo l'invenzione, il campione è mosso, rispetto al fuoco del sistema di focalizzazione, da un sistema di scansione laterale e assiale a controllo piezoelettrico.
Preferibilmente secondo l'invenzione, il microscopio comprende mezzi atti a centrare il fuoco del sistema di focalizzazione all'ingresso di una fibra monomodale, la quale è montata all'altra estremità su un sistema meccanico miniaturizzato che comprende un sistema per la suzione e l'ancoraggio al campione ed un controllo piezoelettrico per la scansione della fibra rispetto al campione, in particolare detti mezzi potendo essere accoppiati a sistemi endoscopici.
Preferibilmente secondo l'invenzione, il sistema di focalizzazione è atto a raccogliere la luce riflessa dal campione, la quale attraversa il divisore di fascio ed è convogliata attraverso un sistema ottico in grado di mantenere 1'acromaticità del fascio e quindi acromaticamente focalizzata attraverso un secondo obiettivo su un pinhole la cui apertura è variabile e controllabile in maniera continua e ripetibile tramite mezzi di controllo piezoelettrici.
Preferibilmente secondo l'invenzione, detto secondo obiettivo di focalizzazione del fascio in uscita dal campione sul pinhole è di tipo riflettivo e presenta un design di Cassegrain-Schwarzschild.
Preferibilmente secondo l'invenzione, detto pinhole è costituito da una coppia di lamine con un corpo principale ed una coda di rondine opportunamente lavorate disposte con le code di rondine affacciate e a contatto simmetricamente da una parte e dall'altra di un piano, le lamine di detta coppia di lamine essendo atte ad essere mosse in maniera continua lungo il piano rispetto al loro centro comune, delimitando in tal modo un foro romboidale di diametro variabile tra 0 e 200 μπι.
Preferibilmente secondo l'invenzione, il pinhole è accoppiato otticamente ad un sistema di raccolta che attraverso una fibra ottica o un libero cammino, convoglia il segnale ad un sistema di dispersione cromatica ed a una successiva sezione di acquisizione ed analisi spettrometrica lineare formata da uno o più sensori ad array o matriciali.
L'invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo ma non limitativo, con particolare riferimento ai disegni delle figure allegate, in cui:
- la figura 1 mostra lo schema costruttivo del microscopio confocale secondo l'invenzione.
- la figura 2 mostra lo schema del pinhole secondo l'invenzione, in tre viste differenti (a) sezione, (c) dall'alto, e (b) in prospettiva
Lo strumento secondo l'invenzione è un microscopio confocale a scansione laser. Esso è alimentato da una sorgente laser LS a spettro largo e continuo nelle lunghezze d'onda del visibile e infrarosso.
Il fascio in uscita dalla fibra fotonica che lo genera viene espanso attraverso un espansore di fascio o "beam expander" acromatico BE (necessario per mantenere la possibilità di inviare tutte le lunghezze d'onda generate dalla sorgente senza aberrazione cromatica), indispensabile per sfruttare le caratteristiche costruttive dell'obiettivo riflettivo.
A seguire, attraverso un sistema di specchi piani M, il fascio di luce viene inviato su un divisore di fascio o "beam splitter" BS di materiale opportunamente trasparente in tutto l'intervallo spettrale emesso dalla sorgente e posto a 45 rispetto alla direzione del fascio.
Il ruolo del beam-splitter (divisore di fascio) è particolarmente critico per il microscopio secondo l'invenzione. Infatti, tale componente deve essere attraversato due volte dalla fascio laser proveniente dalla sorgente, una prima volta in riflessione ed una seconda volta in trasmissione. Diversi elementi costruttivi sono stati tenuti in considerazione, come di seguito elencati.
Anzitutto, la sequenza riflessione/trasmissione potrebbe essere invertita, in via di principio, in trasmissione/riflessione. Tuttavia, è opportuno riservare alla riflessione la precedenza nel percorso del fascio in quanto si deve garantire la minima distorsione ottica verso l'obiettivo rivolto verso il campione. Questa scelta ha anche l'effetto di ridurre l'intensità incidente in maniera determinata dal coefficiente di riflessione della lamina, per evitare il sovraccarico termico del campione.
La soluzione innovativa della presente invenzione, legata all'uso di una sorgente a largo spettro come il laser a fibra fotonica qui utilizzato, sta anche nel modo di ridurre la intensità di radiazione depositata sul campione, attraverso un beam splitter secondo 1'invenzione.
Infatti, tale intensità non può essere semplicemente regolata agendo sulla potenza della sorgente laser utilizzata. Il controllore del laser permetterebbe, in effetti, un facile controllo della potenza di emissione, ma, contemporaneamente, una riduzione eccessiva può modificare profondamente lo spettro di emissione eliminando gran parte dello spettro visibile. Infatti, l'estensione dello spettro dei laser "supercont inuum" è legato in maniera complessa a fenomeni non lineari e, quindi, sotto una certa soglia di potenza lo spettro risulterebbe profondamente alterato.
Per tutti questi motivi, il materiale scelto per il componente BS è il Fluoruro di Calcio (CaF2). Tale scelta risulta dettata da un complesso di fattori. Principalmente, si vuole avere un materiale di buone proprietà ottiche (assenza di assorbimento) per l'intervallo spettrale estremamente esteso del laser fotonico utilizzato (450nm-2.5μπι) e una buona stabilità strutturale e chimica. Non sembrano possibili altre scelte, salvo rinunciare a qualche proprietà fondamentale. Nella tabella 1 sono illustrati gli svantaggi o le caratteristiche per altri materiali possibili. L'unico materiale utilizzabile in alternativa è il Solfuro di Zinco (ZnS), conosciuto con il nome commerciale CLEARTRAN™ (della CVD Ine.), che ha caratteristiche simili, ma esclude la possibilità di lavorare con sorgenti che si possano estendere nella regione ultravioletta per esperimenti di fluorescenza. Tale materiale potrebbe rappresentare una interessante alternativa. Tuttavia, l'alto indice di rifrazione (2.27 a Ιμπι) produce una minore trasmissione (circa il 70%), e quindi una maggiore riflessione che, se aumenterebbe in teoria il segnale a disposizione, costringerebbe ad una diminuzione della potenza in ingresso per campioni molto sensibili al riscaldamento locale. Come già detto, tale variazione può comportare una modifica profonda nello spettro di emissione del laser a fibra fotonica. I vetri più comuni sono stati esclusi in quanto opachi nell'infrarosso.
La soluzione proposta secondo la presente invenzione è quindi l'utilizzo del Floruro di Calcio come materiale per il divisore di fascio BS per avere una finestra spettrale accessibile tra i 0.15μπι e i 6μπι, con una trasmissione superiore al 90% in tale intervallo, un ottimo grado di insolubilità in acqua, con conseguente stabilità nel tempo, l'assenza di difetti che possano essere centri di diffusione o assorbimento da parte di intensi fasci laser, e l'assenza di fenomeni di birifrangenza che, con sorgenti coerenti nella configurazione data, produrrebbero deleterie modulazioni nella risposta ottica.
Tabella 1
L'indice di rifrazione del cristallo fa sì che una parte del fascio, come descritto, venga riflessa verso l'obiettivo riflettivo acromatico OBI e quindi da questo focalizzata sul campione S.
Un altro punto importante del microscopio secondo l'invenzione è costituito dall'obiettivo OBI che focalizza il fascio sul campione. Per gli scopi del presente microscopio confocale l'obiettivo deve essere caratterizzato da una larga banda spettrale, lunga distanza di lavoro e alta apertura numerica per permettere di focalizzare il fascio su un'area molto ristretta sul piano focale, sulla superficie o dentro il campione in analisi.
Nel prototipo realizzato si è utilizzato un obiettivo con una banda spettrale tra i 200nm e i 20μπι, una distanza di lavoro di 10,4mm, ed una apertura numerica di 0,52. Preferibilmente, la banda è compresa tra i 400nm e i 3μπι, la distanza di lavoro è superiore ai 5mm, e l'apertura è superiore a 0,25.
La soluzione secondo l'invenzione usa un obiettivo riflettivo. Questo tipo di obiettivo, che può essere caratterizzato da design di Cassegrain-Schwarzschild, risponde ai requisiti sopra esposti, e non trova generale applicazione nei microscopi confocali in quanto richiede una particolare cura nella geometria del fascio. Inoltre, generalmente non si ha necessità di un intervallo spettrale così vasto come il caso esposto. Sebbene non si possano escludere altre soluzioni, gli obiettivi rifrattivi, comunemente usati, soffrirebbero di uno spostamento del fuoco in funzione della lunghezza d'onda.
Un sistema di scansione laterale e assiale a controllo piezoelettrico XYZs muove il campione rispetto al fuoco dell'obiettivo.
La luce riflessa dal campione S viene raccolta dall'obiettivo (condensatore) OBI, attraversa il beam splitter BS e viene convogliata attraverso un sistema ottico M in grado di mantenere 1'acromat icità del fascio (combinazione di specchi paraboloidi e piani tutti con superficie ottimizzata per tutto l'intervallo spettrale in uso) e quindi focalizzata (sempre in maniera acromatica) tramite l'obiettivo 0B2 su un pinhole PH la cui apertura è variabile e controllabile tramite tecnologia piezoelettrica.
Il pinhole PH è elemento caratterizzante e cruciale per ogni sistema confocale. La sua presenza assicura la possibilità di effettuare un sezionamento ottico del campione, perché esclude dalla rivelazione il segnale non proveniente dal volume di fuoco dell'obiettivo.
In molti sistemi è fornita la possibilità di scelta tra diversi pinhole a dimensione fissa. Nel caso della presente invenzione si è prevista la necessità di lavorare con livelli di intensità di segnale e necessità di risoluzione assiale molto diversi.
La soluzione secondo la presente invenzione è rappresentata in figura 2 e consiste nella progettazione di un disegno originale composto da una coppia di lamine 110,120 con un corpo principale 111,121 ed una coda di rondine 112,122 opportunamente lavorate che possono essere spostate in maniera simmetrica rispetto ad un piano 200 e continua rispetto al punto centrale 130 delimitando così un foro romboidale 140 di diametro variabile tra 0 e 200 μπι. Il movimento, come già accennato, è gestito e controllato da un piezoelettrico assemblato e calibrato su questo sistema specifico che permette quindi di variare in maniera continua e ripetibile l'apertura del pinhole per adattare la rivelazione alle diverse necessità sperimentali.
Il pinhole è accoppiato otticamente ad un sistema di raccolta che, attraverso una fibra ottica o un libero cammino, convoglia il segnale ad un sistema di dispersione cromatica ed a una successiva acquisizione formata da uno o più sensori ad array AS (Array-Spectrometer, o Spettrometro Lineare; i sensori possono essere diodi, CMOS, CCD, o qualsiasi altro dispositivo equivalente) che permette l'acquisizione simultanea di tutte le lunghezze d'onda riflesse da uno stesso punto (il punto di fuoco).
In alternativa alla scansione con il sistema di assi motorizzati a controllo piezoelettrico, per campioni che non è possibile deporre sugli assi motorizzati è possibile centrare il fuoco dell'obiettivo o di altri dispositivi ottici acromatici in ingresso di una fibra monomodale la quale, montata in uscita su un sistema meccanico miniaturizzato per endoscopia che comprenda un sistema di suzione e ancoraggio del tessuto, effettui una scansione tridimensionale a controllo piezoelettrico sul campione. Questo strumento così accoppiato a sistemi endoscopici permette di raggiungere le superfici interne dell'organismo umano (applicazioni su tutto il tratto digerente, ma anche di tipo ginecologico, urologico o grandi vasi).
Questo sistema permette infatti alla sorgente e al rivelatore di essere posizionati anche ad una certa distanza dal campione oggetto di indagine, senza la necessità di una connessione meccanica rigida tra le parti (si veda in proposito il brevetto statunitense N.
6,341,036, "Confocal miniaturized System incorporated into a compact probe") . In questo caso, la luce riflessa dal campione viene quindi di nuovo raccolta dalla fibra e in uscita da questa raccolta dall'obiettivo OBI o da altro dispositivo ottico acromatico e da qui segue il medesimo cammino indicato sopra .
La soluzione innovativa proposta risiede nell 'utilizzo contemporaneo di tutte le lunghezze d'onda acquisite. Al contrario di altre progettazioni, tutto il disegno della macchina è rivolto a questo scopo .
Un software appositamente sviluppato presiede il controllo di scansione, acquisizione e memorizzazione dei dati.
Lo strumento secondo l'invenzione è innovativo perché rende possibile coniugare spettroscopia di riflettanza nel visibile e vicino infrarosso su campioni di dimensioni arbitrarie con risoluzione submicrometrica con tecniche di imaging confocale.
L'imaging confocale, che è stato tradizionalmente diviso tra la microscopia a fluorescenza, usata soprattutto per la ricerca e la microscopia a riflettanza, usata nella pratica clinica, permette la visualizzazione di molecole fluorescenti e dell'architettura tissutale, rispettivamente.
Lo strumento secondo l'invenzione unisce l'informazione di natura fisico-chimica ad altissima risoluzione spettrale e alta risoluzione spaziale portata dalla risposta spettroscopica all'informazione strutturale portata dall'imaging tipico dell'approccio confocale, grazie alla contemporanea elaborazione di uno spettro di frequenze invece che di una sola frequenza.
La possibilità di associare ad ogni punto di scansione (corrispondente a dimensioni fisiche dell'ordine del micron o inferiori) un intero spettro fa superare una delle passate limitazioni della microscopia a riflettanza a singola lunghezza d'onda: la mancanza di specificità per organelli e ultrastrutture (Kishwer S. Nehal, Dan Gareau, and Milind Rajadhyaksha, Skin Imaging With Reflectance Confocal Microscopy, Semin. Cutan. Med. Surg. 27:37-43,2008).
La possibilità di osservare la stessa superficie fisica sotto ad es. 2000 diverse lunghezze d'onda equivale alla possibilità di avere 2000 differenti modi di contrasto, come nella fluorescenza o nell'istologia diverse sonde sono utilizzate per caratterizzare diversi bersagli. Gli approcci spettrale e di imaging, combinati in maniera sinergica, portano alla possibilità di avere quindi immagini multimodali da sezioni ottiche con la possibilità di ottenere un contrasto struttura-specifico.
Le applicazioni prevedibili di questa tecnologia coinvolgono campi come la dermatologia, la cosmetologia, l'oculistica, la farmacologia (sia come farmacodinamica che farmacocinetica), la bioingegneria tissutale, ma anche molte tematiche legate alla endoscopia. La possibilità di poter variare la potenza di emissione del laser su regioni estremamente definite di tessuto, anche in maniera automatica, amplia le potenziali applicazioni dalla diagnostica alla terapia altamente selettiva di diverse patologie e alle applicazioni tipiche dei laser ad uso "cosmetico".
Un'altra caratteristica dello strumento secondo l'invenzione è la possibilità di combinare alle tecniche descritte anche la microscopia confocale a scansione laser convenzionale o la spettroscopia Raman, per aumentare il potenziale diagnostico e le relative applicazioni .
In quel che precede sono state descritte le preferite forme di realizzazione e sono state suggerite delle varianti della presente invenzione, ma è da intendersi che gli esperti del ramo potranno apportare modificazioni e cambiamenti senza con ciò uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1) Microscopio confocale spettrale in riflettanza a larga banda, comprendente una sorgente laser (LS), un divisore di fascio (BS), un sistema (OBI) di focalizzazione del fascio laser sul campione (S), un sistema di rilevamento (M, 0B2, PH, AS) del fascio laser riflesso dal campione (S) e trasmesso dal divisore di fascio (BS), caratterizzato dal fatto che: detta sorgente laser (LS) è una sorgente a spettro continuo nelle lunghezze d'onda del visibile e infrarosso; subito dopo la sorgente laser (LS) è inserito un espansore di fascio (BE); - detto divisore di fascio (BS) è in materiale opportunamente trasparente in tutto l'intervallo spettrale emesso dalla sorgente ed è posto a 45° rispetto alla direzione del fascio; - detto sistema (OBI) di focalizzazione è acromatico e presenta una banda spettrale tra i 200nm e i 20μπι, una distanza di lavoro superiore ai 5mm ed una apertura numerica superiore a 0,25.
- 2) Microscopio secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il materiale del divisore di fascio (BS) è il Fluoruro di Calcio (CaF2).
- 3) Microscopio secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il materiale del divisore di fascio (BS) è il Solfuro di Zinco (ZnS).
- 4) Microscopio secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto che detto sistema (OBI) di focalizzazione è un primo obiettivo riflettivo.
- 5) Microscopio secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto obiettivo (OBI) di focalizzazione presenta un design di Cassegrain-Schwarzschild .
- 6) Microscopio secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, caratterizzato dal fatto che la banda spettrale di detto sistema di focalizzazione (OBI) è compresa tra i 400nm e i 3μπι.
- 7) Microscopio secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, caratterizzato dal fatto che il sistema di focalizzazione (OBI) presenta una distanza di lavoro superiore agli 8mm, e un'apertura superiore a 0,40.
- 8) Microscopio secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, caratterizzato dal fatto di comprendere un sistema di scansione laterale e assiale a controllo piezoelettrico (XYZs) adatto a muovere il campione (S) rispetto al fuoco del sistema di focalizzazione (OBI).
- 9) Microscopio secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, caratterizzato dal fatto di comprendere mezzi atti a centrare il fuoco del sistema (OBI) di focalizzazione all'ingresso di una fibra monomodale, la quale è montata all'altra estremità su un sistema meccanico miniaturizzato che comprende un sistema per la suzione e l'ancoraggio al campione (S) ed un controllo piezoelettrico per la scansione della fibra rispetto al campione (S), in particolare detti mezzi potendo essere accoppiati a sistemi endoscopie! .
- 10) Microscopio secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, caratterizzato dal fatto che il sistema (OBI) di focalizzazione è atto a raccogliere la luce riflessa dal campione (S), la quale attraversa il divisore di fascio (BS) ed è convogliata attraverso un sistema ottico (M) in grado di mantenere 1'acromaticità del fascio e quindi è acromaticamente focalizzata attraverso un secondo obiettivo (OB2) su un pinhole (PH) la cui apertura è variabile e controllabile in maniera continua e ripetibile tramite mezzi di controllo piezoelettrici.
- 11) Microscopio secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detto secondo obiettivo (OB2) di focalizzazione del fascio in uscita dal campione sul pinhole è di tipo riflettivo e presenta un design di Cassegrain-Schwarzschild.
- 12) Microscopio secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detto pinhole (PH) comprende o è costituito da una coppia di lamine (110,120) con un corpo principale (111,121) ed una coda di rondine (112,122) opportunamente lavorate disposte con le code di rondine (112,122) affacciate e a contatto simmetricamente da una parte e dall'altra di un piano (200), le lamine di detta coppia di lamine essendo atte ad essere mosse in maniera continua lungo il piano (200) rispetto al loro centro comune (130), delimitando in tal modo un foro romboidale (140) di diametro variabile tra 0 e 200 μπι.
- 13) Microscopio secondo la rivendicazione 10 o 12, caratterizzato dal fatto che il pinhole (PH) è accoppiato otticamente ad un sistema di raccolta che, attraverso una fibra ottica o un libero cammino, convoglia il segnale ad un sistema di dispersione cromatica ed a una successiva sezione di acquisizione ed analisi spettrometrica lineare (AS) formata da uno o più sensori ad array o matriciali.
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