ITRM20100418A1 - Vettore lentivirale ricombinante per la beta-globina e suoi usi in campo medico. - Google Patents

Description

Vettore lentivirale ricombinante per la beta-globina e suoi usi in campo medico

La presente invenzione concerne un vettore lentivirale ricombinante per la beta-globina e suoi usi in campo medico. In particolare, l'invenzione concerne un vettore lentivirale ricombinante per la beta-globina e suoi usi in campo medico nella terapia genica per la cura della beta-talassemia.

Le β—talassemie sono malattie ereditarie a trasmissione autosomica recessiva causate da mutazioni del gene β—globinico che codifica per le catene β dell'emoglobina, tetramero composto da 2 catene beta e 2 catene alfa (HbA, β2-α2).

La gravità della malattia dipende dalla natura della mutazioni che possono causare o la totale assenza di catene β -globiniche (mutazioni β°) o una ridotta formazione (mutazioni β·).

In entrambi i casi si genera uno squilibrio del normale rapporto alfa/beta con precipitazione degli aggregati di catene alfa in eccesso, modificazioni della membrana citoplasmatica dei globuli rossi (anisopoichilocitosi), eliminazione prematura negli organi emocateretici ed anemia ipocromica e microcitica.

L'unico trattamento disponibile per i pazienti talassemici è l'adozione di un regolare regime trasfusionale accompagnato da terapia ferro chelante. L'accumulo di ferro derivante dalle trasfusioni è la causa dei problemi clinici a carico soprattutto del sistema endocrino, del fegato e del cuore (Maggio A 2007 Br J Haematol).

L'unica cura al momento è il trapianto allogenico di midollo osseo ma è limitato alla possibilità di trovare un donatore HLA compatibile ed e<'>quindi applicabile ad un numero ridotto di pazienti (20-30%). Inoltre il trapianto è associato ad un alto tasso di mortalità (10% o superiore) dovuto al trattamento farmacologico (ablazione del midollo osseo con chemioterapici e terapie immunosoppressive post-trapianto), infezioni e complicanze immunologiche (insorgenza di GVHD).

La terapia genica è un approccio attraente per la cura di questa malattia perché applicabile in teoria a tutti i pazienti; essa consiste nel trapianto di cellule staminali ematopoietiche autologhe geneticamente modificate da vettori virali ricombinanti per il gene β—globinico. Nelle β-talassemie, la terapia genetica ha lo scopo di eliminare il fabbisogno trasfusionale attraverso la sintesi di catene β-globiniche prodotte dall'espressione del gene β esogeno. Tale gene è introdotto all'interno delle cellule staminali ematopoietiche dello stesso paziente (trapianto autologo) mediante l'utilizzo di vettori lentivirali che si integrano stabilmente nel genoma cellulare e che contengono sequenze minime virali per il trasferimento genico, il gene β—globinico ed elementi regolatori che assicurano un livello di espressione del gene adeguatamente elevato e specificatamente eritroide ( Sadelain M et al 2007 Hum Gene Ther). Il successo di questa terapia richiede un'efficiente trasferimento genico, alti livelli di espressione del transgene in maniera tessuto e stadio specifica, un'espressione indipendente dal sito di integrazione e vettori sicuri sotto il profilo della genotossicità.

In questi ultimi anni sono stati costruiti diversi vettori lentivirali contenenti geni globinici e regioni di controllo (LCR, locus control region) che con successo hanno corretto l'anemia nel modello murino di β-talassemia (May C., 2000; Pawliuk R., 2001; Imren S., 2002; May C., 2002; PersonsD.A. , 2003; Levasseur D.N., 2003; Rivella S., 2003.

Tuttavia la correzione genetica è stata ottenuta quando la maggior parte delle cellule staminali ematopoietiche è stata geneticamente modificata con 2-3 copie di trasgene per cellula. In contrasto, usando gli stessi modelli animali in studi di trapianto eterologo di midollo osseo, si è dimostrato che livelli di chimerismo pari a 30 a 40% tra cellule normali di donatore e cellule talassemiche di ricevente determina la completa correzione dei parametri ematologici (Kean L. S., 2003; Persons D. A., 2001) . Questa discrepanza può essere spiegata considerando che un certo numero di vettori che si integrano in siti della cromatina non permissivi per l'espressione genica (eterocromatina) vengono silenziati (Ellis J., 2005). Questo fenomeno viene definito effetto posizione (PE).

Gli elementi regolatori contenuti nel vettore potrebbero, a loro volta, influenzare l'espressione di geni adiacenti al sito d'integrazione e risultare genotossici (Cornetta, 1991). L'attivazione di oncogeni cellulari da parte di enhancers contenuti nel vettore retrovirale è stata la causa di casi di leucemia riportati in pazienti e in primati sottoposti a trasferimento genico, (Hacein Bey-Abina, 2003; Ott, 2006; Dunbar, 2007). Per queste ragioni negli ultimi anni alcuni elementi regolatori, definiti isolatori cromatinici sono stati considerati, per le loro caratteristiche funzionali, uno strumento utile da includere nei vettori ingegnerizzati a scopo terapeutico. Gli isolatori cromatinici sono elementi di DNA che in natura agiscono da elementi di confine tra domini funzionali diversi; agiscono da barriera contro il propagarsi della etero-cromatina proteggendo un trasgene dagli effetti posizione, quando situati in posizione fiancheggiante; inoltre bloccano l<'>azione potenziatrice di una sequenza enhancer su un promotore, quando situati tra questi due elementi.

Entrambe le funzioni rendono i vettori più sicuri: l'attività di barriera limiterebbe al minimo il numero di copie di vettori necessari per ottenere l'effetto terapeutico con conseguente minore rischio di mutagenesi; inoltre l'attività di blocco dell'enhancer contrasterebbe l'eventuale attivazione di oncogeni cellulari.

Gli isolatori cromatinici con entrambe le funzioni potrebbero potenziarne l<'>efficacia e la sicurezza dei vettori. Contrastando gli effetti PE, sarà necessario un minor numero di vettori per ottenere l'effetto terapeutico e, bloccando l'azione di enhancers interni al vettore, diminuirebbe il potenziale genotossico di questi.

L'isolatore cHS4 (1,2 Kb di lunghezza) del cluster dei geni globinici di pollo è uno di questi elementi che è stato studiato a tale scopo. Esso ha attività di blocco dell 'enhancer e di elemento di confine (isola un'unità trascri zionale quando posizionato alle sue estremità) (Pikaart M J, 1998; Bell A C e Felsenfeld G, 1999 Recillas-Targa F, 2004) . Questo elemento e<'>stato anche studiato in vettori retrovirali ricombinanti per la β-globina umana (Rivella S, 2000; Emery D, 2000; Yannaki E, 2002; Arumugam P, 2007).

Sebbene l'inclusione dell'isolatore cHS4 abbia incrementato la probabilità d'espressione di questi vettori, è stato riportato che questo elemento da solo non è sufficiente ma necessita della presenza di una sequenza SAR (scaffold attachment region) per ridurre significativamente l'effetto PE dei vettori (Ramezani, 2003). Walters et al. (1999) suggeriscono che l'attività di cHS4 non è dominante in tutti i siti di integrazione del genoma ed e<'>anche controversa la capacità di cHS4 di influenzare il livello d'espressione del transgene (Arumugam, 2007; Ramezani, 2003; Rivella, 2000; Yannaki, 2002) . Inoltre l'inserzione di questo elemento di 1.2 Kb all'interno della LTR (Long Terminal Repeat) del vettore abbassa notevolmente il titolo virale; infatti si osserva una riduzione dei titoli virali che correla con la dimensione degli elementi di DNA inseriti (Emery, 2000; Ramezani, 2003). Dato che vettori a titolo virale troppo basso non sono utilizzabili per transinfettare cellule staminali ematopoietiche, piu<'>recentemente e<'>stato utilizzata una parte di cHS4 di 0.4 Kb di lunghezza, che negli esperimenti sotto riportati sarà riferita come "isolatore 400-CHS4".

Alla luce di quanto sopra esposto risulta pertanto evidente l'esigenza di poter disporre di nuovi vettori in grado di superare gli svantaggi della tecnica nota.

In studi precedenti, gli autori della presente invenzione hanno caratterizzato una nuova sequenza dal DNA di riccio di mare che funziona da isolatore cromatinico sia nel sistema omologo che in cellule di altre specie comprese le cellule eritroidi murine ed umane.

Inizialmente è stato isolato un elemento di DNA, definito sns, localizzato all'estremità 3' del gene dell'istone H2A del riccio di mare Paracentrotus lividus, che mostrava caratteristiche comuni ad altri isolatori conosciuti. Questo elemento di 265 bp, come altri isolatori ben caratterizzati, e<'>capace di bloccare la trascrizione attivata da un enhancer in modo polare e direzionale, sia in riccio di mare che in cellule umane ed ha un ruolo neutrale nella trascrizione (Palla F, 1997; Di Simone P, 2001; Melfi, 2000). È stato inoltre dimostrato che sns interferisce con l'interazione tra la LCR della β-globina umana (potente enhancer eritroide) e il promotore γ-globinico in un contesto eritroide e che lega fattori di trascrizione eritroidi ed ubiquitari (GATA1, Octl ed Spi) (Acuto S, 2005). Recentemente, mediante analisi funzionale su embrioni transgenici di riccio di mare, è stato dimostrato che l'elemento sns non è sufficiente a regolare temporalmente la trascrizione del gene dell'istone H2A durante lo sviluppo del riccio di mare e che una sequenza più lunga di 445 bp, denominata sns5 e comprendente la sequenza sns, e<'>necessaria per il silenziamento del gene H2A allo stadio di gastrula, suggerendo che la funzione di confine e<'>contenuta nel frammento più grande (Di Caro D, 2004). Inoltre, è stata messa in evidenza la stretta correlazione esistente tra la struttura cromatinica (specifiche modificazioni istoniche) e la competenza trascrizionale nel sistema autologo. Gli stessi esperimenti evidenziano un ruolo dinamico dell'isolatore genomico sns5 nella regolazione dell'espressione del gene per l'istone precoce H2A.

Alla luce di questi risultati, è stata valutata la capacità di questo elemento di contrastare gli effetti PE cui e<'>soggetto un vettore γ-retrovirale. A questo scopo è stato generato un ampio pannello di cellule eritroleucemiche di topo (MEL) contenenti vettori integrati fiancheggiati da isolatori ed è stata analizzata l'espressione del gene reporter GFP in esso contenuto. È stato dimostrato che sns5 possiede proprietà di elemento di confine, contrastando gli effetti posizione quando posizionato ai lati del vettore. Nello stesso studio abbiamo caratterizzato i fattori di trascrizione e le modifiche epigenetiche che co-localizzano sull'isolatore sns5 suggerendo che questo elemento induce modificazioni istoniche tipiche di uno stato eucromatico all'interno del locus del provirus (D'Apolito D, 2009).

Tutte le evidenze sperimentali finora riportate hanno implicazioni rilevanti per la sicurezza e per l'efficacia di vettori usati per terapia genica di malattie che riguardano le cellule eritroidi ed in particolare per vettori lentivirali ricombinanti per il gene della β—globina. Nel caso specifico di questi ultimi è necessario che siano presenti le sequenze che assicurano al gene β-globinico di essere espresso ad elevati livelli, in maniera eritroide specifica ed a lungo termine.

Gli autori della presente invenzione hanno ora preparato un nuovo vettore lentivirale avente una performance di espressione superiore rispetto allo stesso vettore non isolato o isolato con l'elemento cHS4 e che costituisce quindi un vettore più efficace rispetto ad altri vettori analoghi per la preparazione di un medicamento per la terapia genica nella cura della beta-talassemia.

In particolare, il vettore secondo la presente invenzione (TNS9.3mt) è schematizzato in figura 3 ed è derivato dal vettore TNS9 che è risultato, tra 10 vettori studiati contenenti diversi elementi regolatori nella cassetta trascrizionale della βglobina, essere il più efficace a curare la betatalassemia nel modello murino (May et al., 2000).

Il vettore TNS9.3mt rispetto al vettore TNS9 contiene la stessa cassetta di sequenze eritroidi (gene β-globinico/LCR) con una modifica per "marcare" la trascrizione del gene β-globinico incluso e così distinguerla dalla trascrizione del gene endogeno. TNS9.3mt contiene inoltre una serie di modifiche necessarie per rendere più sicuro il vettore e per marcare l'RNA messaggero beta globinico prodotto dal vettore.

Per marcare l'RNA messaggero beta globinico prodotto dal vettore, e così potere quantizzarlo rispetto a quello prodotto dalla cellula ricevente, è stata apportata una modifica che consiste nell'introduzione di 4 nucleotidi nel promotore del gene globinico, più precisamente tra sito di CAP e la prima tripletta di inizio lettura che è il sito ATG; in particolare sono stati introdotti 4 nucleotidi (TCTA)in posizione -10 dal sito ATG. In questa posizione i 4 nucleotidi in più faranno parte della regione non tradotta del messaggero pertanto esso risulterà più lungo e sarà tecnicamente distinguibile dall' mRNA endogeno quando questo vettore verrà espresso nelle cellule dei pazienti talassemici, ma la sequenza amminoacidica della β—globina che verrà prodotta non risulterà modificata perché i 4 nucleotidi non fanno parte della regione codificante il primo esone.

Questa modifica, assieme all'inclusione dell'isolatore sono aspetti unici di questa invenzione

Inoltre, nelle sequenze di origine virale, sono state introdotte modifiche per scopi di sicurezza; queste modifiche sono comuni ad altri vettori sperimentati a scopo terapeutico: È stato rimosso l'enhancer/promotore virale localizzato nella regione U3 della 3' LTR; per effetto del processo di retrocopiazione tale delezione viene copiata nella 5' LTR per cui il vettore che si integra sarà privo di enhancers virali e per questo definito SIN (self inactivating vector) e quindi meno propenso a causare oncogenesi inserzionale.

Infine, sono state create 4 mutazioni nella regione virale del frammento del gene GAG per evitare la formazione di lunghi peptidi con potenziale oncogeno.

I vettori isolati sono stati generati clonando l'isolatore chromatinico sns5 (502 bp) o l'isolatore c-HS4 di pollo (1.2 Kb) o una regione spaziatrice (Junk di 500 bp) proveniente dal cDNA del gene G6PD, nel sito unico di restrizione Nhel localizzato nella 3' LTR.

Da questa posizione i frammenti vengono retrocopiati nella 5' LTR durante il processo di retrotrascrizione e generano provirus fiancheggiati da isolatori cromatinici a entrambe le estremità. L'elemento sns5 è stato clonato in orientamento senso e reverse. Tali vettori sono stati denominati rispettivamente TNS9.3mt+sns5-senso e TNS9.3mt+sns5-reverse, TNS9.3mt+Junk e TNS9.3mt+l,2kb cHS4 (Fig. 2).

In fig.3 è rappresentato in dettaglio il vettore TNS9.3mt+sns5 nella conformazione che assume dopo retrocopiazione ed integrazione nel genoma della cellula ospite (forma provirale).

L'analisi in vitro dell'espressione del vettore lentivirale TNS9.3mt fiancheggiato dall'isolatore cromatinico sns~5 ha dimostrato che questo elemento conferisce una maggiore probabilità di espressione al vettore integrato in siti random della cromatina e pertanto rende il vettore meno soggetto agli effetti posizione dovuti all'invasione della eterocromatina in siti trascrizionalmente inattivi. Inoltre si osserva un incremento dell'espressione del gene beta-globinico umano pari a piu<'>di 2 volte rispetto al vettore non isolato o isolato con altri elementi di DNA. Questo risultato riveste grande importanza in terapia genica per la cura della talassemia in quanto, come premesso, la cura dell'anemia richiede un'elevata espressione del trasgene. In questi esperimenti II vettore TNS9mt+sns5-senso risulta avere una performance di espressione superiore al vettore TNS9mt+cHS4; fino ad ora l'elemento cHS4 è l'isolatore cromatinico meglio caratterizzato ed è l'unico ad essere stato studiato in vettori oncoretrovirali o lentivirali per terapia genica o per studi di transgenesi.

I risultati hanno inoltre evidenziato la direzionalità del meccanismo di azione dell'isolatore sns5 in quanto il vettore contenente sns~5 in orientamento reverse non ha generato gli stessi effetti. Sebbene i cloni cellulari contenenti il vettore isolato con il frammento Junk sono risultati essere in grado di esprimere il gene betaglobinico con una probabilità elevata e vicina a quelli contenenti il vettore isolato con sns5~sense, i livelli medi di espressione del gene sono risultati essere paragonabili al vettore non isolato. I dati ottenuti in vitro sono stati confermati in vivo in topi talassemici. Il vettore isolato con l'isolatore cromatinico sns-5 è risultato essere in grado di incrementare i livelli di espressione del gene beta-globinico di 2 volte rispetto al vettore non isolato; in particolare una copia di vettore TNS9mt+sns5-senso produce una quantità di β-globina pari a quella prodotta da 0,7 copie del gene beta endogeno. Anche a livello di proteina i risultati sono molto positivi infatti, la quantità di emoglobina chimerica beta-uomo prodotta da una copia di TNS9.3+sns5 è pari a quella prodotta da 1,5 - 2 copie del vettore non isolato.

Sulla base di queste evidenze scientifiche, pertanto, il vettore TNS9mt+sns5 secondo l'invenzione rappresenta un farmaco più efficace e potenzialmente più sicuro rispetto ad altri vettori simili che stanno entrando o sono già in trials clinici di fase 1 di terapia genica per la cura βtalassemia.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un vettore lentivirale ricombinante per la beta-globina comprendente le o consistente nelle seguenti sequenze transgeniche:

sequenza del gene beta-globinico avente numero di riferimento GenBank HUMHBB nella posizione 61524-64620;

sequenze dei siti ipersensibili HS della LCR del cluster beta-globinico umano aventi numero di riferimento GenBank HUMHBB nella posizione 8039-8911, HUMHBB nella posizione 3877-5177 e HUMHBB nella posizione 328-1390;

e nelle seguenti sequenze virali aventi numero di riferimento GenBank HIVPV22 nella posizione 463-1135, HIVPV22 nella posizione 7664-8521, HIVPV22 nella posizione 4826-4943 e HIVPV22 nella posizione 9094-9761 in cui sono stati deleti i nucleotidi 9167-9558;

detto vettore essendo caratterizzato dal fatto di comprendere la sequenza nucleotidica dell'insulator SNS5 di riccio di mare clonato in orientamento senso nel sito di restrizione Nhe 1 presente nella 3' LTR, detta sequenza nucleotidica dell'insulator SNS5 avendo la seguente sequenza SEQ ID NO: 13:

GCTTCTTGGAGGTGTGACCATCGCTCGAGGTGGTGTACTGCCCAACATCCAG GCTGTGCTGCTTCCCAAGAAGACCGGCAAATCAAGCTAAAGGTTTTGCACTC GCAAACCTCAACACCTCAACGGCCCTTATCAGGGCCACCAAATATACAAGAA AGAATAAAGTCTCTGTAATTCATAATAGTCTCTGTAATTCATAATAAACTCC TACTGCAACTACAACTCAGACGCAACCCCCTCTCCTCCTCCTCCTCCACCCC TCCTCCCCCCCCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTCTTCCCCAT TCCGGTTTTGTAGTTGTTGTCGATCATCCGATCTAATATGCCTATGCGAATA CAATCACAAATGTTATTATTATAAACATTCTGTTCTGTTCTGTTATTGCTTA TTGCTTACACGGATGAATAAAAGATACTCTGTGTCGCACAGT .

Secondo una particolare forma di realizzazione la sequenza nucleotidica dell 'insulator SNS5 comprende ulteriormente sequenze polylinker ed è la seguente sequenza SEQ ID N0:1:

etagcccgcgaattcactagtgattGCTTCTTGGAGGTGTGACCATCGCTCG AGGTGGTGTACTGCCCAACATCCAGGCTGTGCTGCTTCCCAAGAAGACCGGC AAATCAAGCTAAAGGTTTTGCACTCGCAAACCTCAACACCTCAACGGCCCTT ATCAGGGCCACCAAATATACAAGAAAGAATAAAGTCTCTGTAATTCATAATA GTCTCTGTAATTCATAATAAACTCCTACTGCAACTACAACTCAGACGCAACC CCCTCTCCTCCTCCTCCTCCACCCCTCCTCCCCCCCCCCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTGTCTTCCCCATTCCGGTTTTGTAGTTGTTGTCGATCAT CCGATCTAATATGCCTATGCGAATACAATCACAAATGTTATTATTATAAACA TTCTGTTCTGTTCTGTTATTGCTTATTGCTTACACGGATGAATAAAAGATAC TCTGTGTCGCACAGTaatcgaattcccgcggccg .

Preferibilmente, il vettore secondo la presente invenzione presenta una inserzione di 4 nucleotidi TCTA nella regione 5<'>UTR, e precisamente 10 nucleotidi prima del sito ATG di inizio traduzione, nella sequenza del gene beta-globinico avente numero di riferimento GenBank HUMHBB nella posizione 61524-64620.

Secondo una particolare forma di realizzazione, il vettore secondo la presente invenzione è mostrato in figura 3.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso del vettore come definito sopra per la preparazione di un medicamento per la terapia genica nella cura della beta-talassemia.

Inoltre, la presente invenzione concerne una cellula eucariota o procariota comprendente il vettore come definito sopra.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:

Fig. 1: Rappresentazione schematica del vettore lentivirale ricombinante per la β-globina (TNS9.3mt). Il vettore contiene: 5' e Δ3<'>LTR (long terminal repeat); RRE = REV responsive element; E = enhancer 3' del gene β; β-globin gene = frammento di 2,7 Kb del gene β-globinico umano contenente una delezione di 350 bp nella IVS-2 e una inserzione di 4 nt nella regione 5<'>UTR; P = frammento di 660 bp del promotore del gene β; LCR = locus control region del cluster β-globinico umano che comprende le regioni contenenti i siti ipersensibili HS2, 3 e 4.

Fig. 2: Vettori lentivirali ricombinanti per la β-globina contenenti gli isolatori cromatinici e la sequenza spaziatrice. Il vettore lentivirale TNS9.3mt è stato modificato per inserzione dell'isolatore cromatinico sns5 (B), la sequenza neutra Junk (C) e l'isolatore di pollo cHS4 di l,2kb(D) nel sito unico di restrizione Nhel della Δ3<'>LTR

Fig. 3: Provirus TNS9.3mt fiancheggiato dall'isolatore cromatinico sns5.

Il vettore TNS9 .3mt+sns-5 lentivirale ricombinante per la β-globina presenta una delezione nella regione U3 (ΔΙΙ3 ) della 3'LTR, è quindi un vettore SIN (self inactivating) ; Questa delezione rimuove i nucleotidi da 418 a 18 della giunzione U3-R e rende trascrizionalmente inattiva la LTR. L<'>isolatore sns-5 e<'>stato clonato nel sito di restrizione Nhel presente solo nella 3'LTR. In particolare l'isolatore sns5 clonato consiste di 502 bp di cui 458 bp provenienti dal DNA di riccio di mare e 44 bp di sequenza polilinker (vedere SEQ ID NO:l) . Inoltre il vettore contiene le seguenti sequenze dei siti ipersensibili HSs della LCR (locus control region) del cluster β-globinico umano: HS2 (840bp), HS3 (1308bp), ed HS4 (1069bp); contiene le sequenze del gene β-globinico sotto il controllo di 618bp di sequenze promotore (con una inserzione dei 4 nucleotidi TCTA nella regione 5<'>UTR, precisamente 10 nucleotidi a monte del sito ATG di inizio traduzione),e con una delezione di 770 bp nel secondo introne, IVS2. Il gene si estende fino alla sequenza enhancer presente al 3' del gene dopo il sito di poliadenilazione.

Fig. 4: L'inclusione dell'isolatore cromatinico sns5 aumenta la probabilità del vettore di essere espresso. Analisi di probabilità di espressione dei vettori isolati e non, espressa in funzione della percentuale dei cloni che trascrivono il gene globinico umano. Nell'analisi sono inclusi solo cloni contenenti una copia di vettore per cellula. Il numero (n) di cloni cellulari analizzati per ciascun vettore è indicato sopra ciascuna colonna Fig. 5: L'espressione del gene beta-globinico risulta aumentata nel vettore contenente l'isolatore cromatinico sns5 in orientamento senso. In ordinata sono riportati i valori dell'mRNA beta-globinico umano normalizzati per l'espressione del gene alfaglobinico endogeno in saggi di primer extension. L'analisi statistica è stata effettuata mediante il t-test di student e la significatività (valore p) è riportata sopra le rispettive colonne.

Fig. 6: Aspetti genotipici e fenotipici del modello murino di beta-talassemia : a) schematizzazione del cluster β-globinico di topo e della delezione knock-down effettuata per la creazione del modello murino eterozigote di βtalassemia (Hbbth3+/th3>);. b) fotografia di milze di topo eterozigote (con evidente aumento di volume) e di topo wild - tipe; c) striscio di sangue periferico; d) elettroforesi dell'emoglobina su acetato di cellulosa (m Hb= emoglobina di topo; h/m Hb= emoglobina ibrida uomo/topo); e) il fenotipo anemico nella progenie è evidente anche macroscopicamente .

Fig. 7: Analisi di espressione dei vettori in topi a 6 settimane dal trapiantato genico.

In ordinata sono riportati i valori di espressione espressa rispetto all'espressione dei geni aglobinici di topo; il numero dei topi analizzati per ogni vettore equivale al numero dei simboli nella rispettiva colonna. L'analisi statistica e' condotta con il test t-student e la significatività' riportata come valore P alla cima di ciascuna colonna .

Fig. 8. Analisi di espressione dei vettori e produzione di emoglobina ibrida umana/topo nel sangue periferico dei topi dopo 14 settimane e dopo 10 mesi dal trapianto di midollo osseo con cellule ematopoietiche trasdotte con i vettori isolati e non-isolati .

L'espressione dei vettori era analizzata nel sangue periferico a 14 settimane (A) e a 10 mesi (C) dal trapianto. In ordinata sono riportati In ordinata e' riportato quante volte una copia di transgene è espressa rispetto alle due copie di geni a-globinici di topo. In B (a 14 settimane) e D (a 10 mesi) sono riportati i livelli di emoglobina ibrida espressi come percentuale rispetto all'emoglobina totale (emoglobina ibrida+emoglobina di topo). L'analisi statistica e' condotta con il test t-student e la significatività' riportata come valore P sopra ciascuna colonna.

Fig. 9: Analisi di espressione del gene β—globinico umano contenuto nei vettori TNS9.3mt isolati con sns5 e con junk. Nella figura sono schematizzati i dati ottenuti dall'analisi dell'espressione del gene β-globinico umano (mediante la metodica di "primer extension") in colonie di milza a distanza di 12 giorni dal trapianto di midollo osseo (trapianto secondario). L'analisi è stata effettuata su un totale di 8 ed 11 colonie (contenenti una copia di vettore) rispettivamente per il vettore con il frammento Junk ed sns5. L'analisi statistica è stata effettuata mediante il t-test di student ed è riportata la significatività (valore p).

Figura 10 mostra il plasmide pGAG-POL.

Figura 11 mostra il plasmide pVSVG.

Figura 12 mostra il plasmide pREV.

Figura 13 mostra il plasmide Pgem Teasy-mAlb Gag.

Figura 14 mostra il plasmide pGEM Teasy-hAlb Gag.

Esempio 1: Preparazione dei vettori e analisi di espressione in vitro e in vivo

MATERIALI E METODI

Plasmidi utilizzati per la preparazione dei vettori Plasmide pGAG-POL

Il plasmide pGAG-POL è uno dei plasmidi "impacchettanti" utilizzati per la produzione dei vettori ricombinanti nella linea cellulare 293T.

Esso contiene:

<■>Un'origine di replicazione per E. coli.

Il gene lentivirale gag, che codifica per le proteine del core e della matrice.

<■>Il gene virale poi, che codifica per la trascrittasi inversa, la proteasi e l'integrasi

Plasmide pVSVG

Il plasmide pVSVG codifica per la glicoproteina di membrana VSVG. I virioni così pseudotipizzati possono essere concentrati per ultracentrifugazione aumentando il titolo virale di 1000 volte.

Esso contiene:

<■>Origine di replicazione per E. coli

<■>Il gene virale vsv-g, gene, derivato dal virus della stomatite vescicolare, che codifica la glicoproteina G del capside.

pREV

Il plasmide pREV è un altro plasmide necessario per 1'impacchettamento dei vettori. La proteina rev è necessaria per la stabilizzazione degli mRNA virali e quindi per il conseguimento di una produzione virale con un alto titolo. Esso contiene:

<■>Origine di replicazione per E. coli

<■>Gene virale rev, che permette l'export dei trascritti non maturi e parzialmente maturi dal nucleo al citoplasma.

Vettore plasmidico pTNS9.3mt ( Fig.: 1 e 3 ) pTNS9.3mt è il plasmide che contiene le sequenze del vettore lenti virale ricombinante per le sequenze β—globiniche. Esso contiene per la parte plasmidica di origine batterica:

Origine di replicazione per E. coli

<■>Gene di resistenza all'ampicillina

Sequenze del transgene:

<■>Il gene beta-globinico contenente 618 bp di sequenze promotore (con una inserzione dei 4 nucleotidi TCTA nella regione 5<'>UTR, precisamente 10 nucleotidi a monte del sito ATG di inizio traduzione), una delezione di 770 bp nel secondo introne, e la regione 3' UTR con l'enhancer eritroide specifico localizzato in un frammento di 300 bp a valle del sito di poliadenilazione

<■>La regione LCR (Locus Control Region) è composta da elementi core dei siti ipersensibili HS2 (840bp), HS3 (1308bp) ed HS4 (1069bp) della LCR del locus beta- globinico umano. Questa precisa combinazione è stata scelta per ottenere alti livelli di trascrizione eritroide specifica come dimostrato già in precedenti esperimenti (May C. 2000;)

Sequenze virali:

<■>Enhancer e promotore della regione dei geni early del citomegalovirus (CMV) (questa regione verrà deleta durante la retrotrascrizione, per cui non sarà presente nel provirus integrato).

<■>Sequenze della regione GAG del virus HIV-1 con quattro mutazioni generate al fine di impedire in tutte e tre le possibili reading-frames la generazione di lunghi polipeptidi, essi includono: la distruzione del sito di inizio, 2 mutazioni che creano altrettanti codoni di stop ed una mutazione che crea frameshift.

<■>Rev-responsive element (RRE) derivate dall'HIV-l;La sequenza RRE (857bp) del virus HIV1 è sito di riconoscimento per la proteina Rev che regola il processo post-trascrizionale delle proteine virali. La proteina Rev ha come target gli RNA unspliced o parzialmente spliced, contiene un dominio di riconoscimento per RRE; gli RNA che contengono la sequenza RRE complessati con Rev possono essere trasportati dal nucleo al citoplasma. In ultima analisi questo processo è necessario per 1'impacchett amento di genomi virali completi durante la fase di produzione dei vettori e quindi per aumentare il titolo virale e la stabilità dei genomi virali .

<■>Il tratto centrale di polipurine (cPPT) derivato da HIV—1

<■>La 3'LTR (Long Terminal Repeat)del virus HIV1 da cui sono state rimosse 391 bp che contenevano l'enhancer della regione U3 ed il promotore con il sito TATA. In questa maniera si è creato un vettore "self inactivated" (SIN vector). In questa regione sono stati inseriti 4 nucleotidi che creano il sito unico per clonare gli isolatori e per monitorare il processo di retro trascrizione e l'integrità dei prò virus .

<■>Gli isolatori cromatinici sns5 (502 bp), cHS4 (1200 bp), cHS4 (400 bp) e la sequenza Junk (500 bp) sono state clonate all'interno del vettore nel sito unico di restrizione Nhel.

In particolare la sequenza dell'isolatore cromosomale sns5 è stata inserita nel sito di restrizione Nhei della 3'LTR consiste di 502 bp di cui 458 bp provenienti dal DNA di riccio di mare Paracentrotus lividus (gene Bank accession n. M25281) e 44 bp di sequenza polylinker. La sequenza sns5 clonata è la seguente:

etagcccgcgaatt cactagtgattGCTTCTTGGAGGTGTGACCATCGCTCG AGGTGGTGTACTGCCCAACATCCAGGCTGTGCTGCTTCCCAAGAAGACCGGC AAATCAAGCTAAAGGTTTTGCACTCGCAAACCTCAACACCTCAACGGCCCTT ATCAGGGCCACCAAATATACAAGAAAGAATAAAGTCTCTGTAATTCATAATA GTCTCTGTAATTCATAATAAACTCCTACTGCAACTACAACTCAGACGCAACC CCCTCTCCTCCTCCTCCTCCACCCCTCCTCCCCCCCCCCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTGTCTTCCCCATTCCGGTTTTGTAGTTGTTGTCGATCAT CCGATCTAATATGCCTATGCGAATACAATCACAAATGTTATTATTATAAACA TTCTGTTCTGTTCTGTTATTGCTTATTGCTTACACGGATGAATAAAAGATAC TCTGTGTCGCACAGTaatcgaattcccgcggccg (SEQ ID NO:l)

In grassetto e a caratteri maiuscolo sono evidenziate 458 bp provenienti dal DNA di riccio di mare Paracentrotus lividus , in minuscolo sono indicate le 44 paia di basi di polylinker.

Plasmide Pgem Teasy-mAlb Gag

Il plasmide Plasmide PGEM T-easy mAlb-Gag è stato da noi creato per la costruzione delle curve standard utilizzate per la determinazione del VCN/cellula nei cloni di cellule Mei trasdotte e per l'analisi nelle cellule provenienti dai topi. Questo plasmide bivalente permette di ridurre al minimo gli errori di quantizzazione. Esso, oltre alle sequenze del plasmide pGEM T-easy, contiene:

<■>L'amplicone di 1665 bp del gene albumina di topo (m-Alb) ottenuto per amplificazione da DNA murino utilizzando primers specifici per il gene dell<'>albumina.

<■>Il frammento PstI - Ndel di 2122bp del gene virale GAG, ottenuto per digestione enzimatica del vettore TNS9.3

Plasmide pGEM T-easy hAlb-GAG

Il plasmide pGEM T-easy hAlb-GAG è stato da noi creato per la costruzione delle curve standard usate nell'analisi di Q-PCR di DNA genomico estratto da cellule umane; oltre che per la quantizzazione del numero medio di copie di vettore per cellula nelle colture eritroidi e nelle colonie di metilcellulosa, e<'>anche stato utilizzato per il calcolo del titolo virale in cellule HeLa. Esso contiene le stesse sequenze vettore specifeche GAG del plasmide pGEM Teasy-mAlb Gag con l'eccezione che l'amplicone del gene malb è stato sostituito con quello del gene per l<'>albumina umana halb (1051bp) ottenuto utilizzando primers specifici.

Linee Cellulari

♦ Cellule 293T (cellule embrio-renali umane). Le cellule sono state fatte crescere a 37°C in presenza di 5% C02in terreno DMEM (Dulbecco's modified eagles medium, Euroclone), addizionato di: 10% FBS (siero fetale bovino, Hyclone) inattivato al calore, 2mM Liglutammina (Seromed, Biochrom), 1% sodio piruvato, lOOU/ml penicillina e 100pgr/ml streptomicina. Le cellule sono state congelate in terreno DMEM contenente 90% FBS e 10% di DMSO.

♦ Cellule Mei 585 (cellule eritroleucemiche di topo allo stadio adulto). Le cellule sono state scongelate a 37°C in un bagnetto termostatico e lavate immediatamente con terreno completo (RPMI 10% Fetal Bovine Serum (FBS) 1% Lglutamina 1% Penicillina e Streptomicina). Le cellule sono state pellettate a 1200 rpm per 10 min. e risospese in terreno completo alla concentrazione appropriata. Per il congelamento le cellule sono state lavate con PBS lx, il supernatante è stato eliminato e le cellule risospese in terreno di congelamento costituito da 90% FBS 10% glicerolo. Per il congelamento non è stato utilizzato il DMSO in quanto questo composto è un induttore del differenziamento delle cellule Mei e potrebbe quindi interferire con le successive analisi.

Trasduzione delle cellule Mei. Le cellule sono state trasdotte alla concentrazione di lxlO<5>cellule/pozzetto in piastre a 24 pozzetti, in un volume totale di 400 μΐ ed in presenza di 16pg/ml di polibrene.

Induzione delle cellule Mei mediante uso di HMBA (hexamethylenebisacetamide) . Le cellule Mei sono cellule eritroleucemiche immortalizzate (contengono il virus della leucemia murina, virus di Friends) allo stadio di pro-eritroblasti, stadio al quale la trascrizione del geni beta globinici (endogeno ed esogeno) è minima; livelli ottimali si ottengono dopo un certo tempo, in genere 4-5 giorni di incubazione in presenza di agenti come il DMSO o l'HMBA. Le cellule Mei sono state piastrate in piastre a sei pozzetti alla concentrazione di 2xl0<6>/pozzetto in 1 mi di terreno completo contenente HMBA alla concentrazione di 0,1 gm/ml. A distanza di 72 ore è stato cambiato il terreno e le cellule sono state piastrate nuovamente in piastre a sei pozzetti per altre 48 ore. Dopo 5 giorni dall'inizio del differenziamento le cellule sono state raccolte e lavate con PBS lx, risospese in 1 mi di Triazol e conservate a -80°C per l'estrazione dell'RNA o congelati come pellet per 1<'>estazione del DNA.

Preparazione virale

I vettori virali sono stati preparati mediante cotrasfezione della linea cellulare 293T con quattro plasmidi ricombinanti: il plasmide contenente il vettore ricombinante TNS9.3mt (e derivati del TNS9.3mt contenente gli isolatori cromatinici) e i plasmidi impacchettanti (pGAG-POl, pREV e pVSVG) che forniscono in trans le proteine necessarie alla produzione delle particelle virali.

Le cellule 293T sono state espanse in 50-100 piastre passandole ogni giorno da una piastra a 70% di confluenza in tre piastre. Il giorno prima della trasfezione le cellule sono state passate in piastre ricoperte di poly-L-Lisina. La trasfezione, mediante precipitazione con sali di calcio fosfato e<'>stata effettuata quando le cellule hanno raggiunto una confluenza dell<'>80%. A distanza di 16 ore dalla transfezione è stato cambiato il terreno ed il supernatante contenente i vettori è stato raccolto a distanza di 48 (prima raccolta) e 72 ore (seconda raccolta) dalla transfezione.

Il supernatante virale, centrifugato e filtrato per eliminare i detriti cellulari, e<'>stato concentrato 1000 volte per ultracentrifugazione a 20.000 rpm per 90 min. a 4°C. Il pellet virale ottenuto è stato risospeso nel terreno di coltura, aliquotato e criopreservato a -80°C.

Valutazione del titolo virale

Le cellule Hela sono state piastrate in piastre a sei pozzetti alla concentrazione di lx0<5>/pozzetto. Il giorno dopo le cellule sono state infettate in 1 mi di terreno completo in presenza di 8 pg/ml di polibrene con Imi di terreno contenente diluizioni seriali di supernatante virale. Il terreno è stato cambiato a distanza di 16 ore dalla infezione e le cellule sono state raccolte dopop 14 giorni per l'estrazione del DNA genomico. Il titolo virale è stato valutato mediante SouthernBlot ed ibridazione con sonde specifiche del vettore o mediante Real-Time PCR.

Estrazione del DNA genomico

Il pellet cellulare è stato risospeso in 400 μΐ di Soluzione A (10 mM Tris/HCl pH 8.00, 400 mMNaCl, 2 Mm EDTA), sono stati aggiunti 60 μΐ di Protenasi K mix (30 μΐ Protenase K solution (14-22 mg/ml in 10 mM Tris/HCl pH 7,5) 15 μΐ SDS 20% 15μ1 H20) ed incubato O/N a 56°C. È stata eseguita una estrazione Fenolo/Cloroformio (v/v 1:1) ed una con Cloroformio ed il DNA è stato precipitato con Etanolo assoluto e pellettato a 14.000 rpm per 10 min. Il pellet è stato lavato con Etanolo 70% e il DNA risospeso a 37°C in 50 μΐ di Η20 sterile. Concentrazione e purezza del DNA ottenuto sono stati valutati allo spettrofotometro .

Southern Blot

10 pg di DNA genomico sono stati digeriti con l'enzima di restrizione appropriato (Ncol, che taglia una sola volta all<'>interno del vettore, per la valutazione del numero di copie di vettore per cellula nei cloni cellulari e BamHl, che taglia due volte, per la determinazione del titolo virale in HeLa) e i frammenti separati su gel d'agarosio 1%.

11 DNA è stato trasferito in una membrana di nitrocellulosa, ibridato con sonda marcata P32 a 65°C O/N, lavato ed esposto con lastre autoradiografiche per la rilevazione del segnale (le condizioni adottate sono quelle riportate sul manuale di laboratorio Current Protocol. ( Wiley J & Songs, Ine. ).

Il frammento vettore-specifico, usato come sonda radioattiva, è stato preparato digerendo il plasmide TNS9.3 con gli enzimi di restrizione NcoI/BamHl e purificato da gel d'agarosioall'1% mediante gel estrazione (QIAGEN) . La marcatura è stata effettuata con a-<32>P dCTP in accordo al protocollo suggerito dalla ditta Amersham.

RealTime PCR

lOOng di DNA gnomico sono stati amplificati utilizzando oligonucleot idi e probes specifici per la sequenza d'interesse (gag, albumina umana e albumina di topo). Il DNA è stato amplificato in presenza di 0,8ul di oligo 25uM, 2ul di probe 2,5uM e lx Universal PCR Master Mix (Roche). L'analisi del titolo virale mediante trasduzione di cellule HeLa è stata anche effettuata mediante quantificazione assoluta, utilizzando differenti diluizioni a concentrazione nota di plasmidi per la costruzione della curva stndard. Come controllo e<'>stato utilizzato il DNA genomico estratto da un clone cellulare Mei a numero di copie di vettore conosciuto .

GagForward 5 '-GGAGCTAGAACGATTCGCAGTTA (SEQ ID NO:2) gag Reverse 5'-GGTTGTAGCTGTCCCAGTCTTTGTC (SEQ ID NO:3)

GAG Probe FAM-ACA GCC TTC TGA TGT TTC TAA CAG GCC AGG-TAMRA (SEQ ID NO:4)

hAlbuminaForward 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT (SEQ ID NO:5)

hAlbumina Reverse 5 '-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT (SEQ ID NO:6)

ALB Probe VIC-TGC TGA AAC ATT CAC CTT CCA TGC AGA-TAMRA (SEQ ID NO:7)

mAlbumina Forward 5'-GGAAAAGTGCTGCGCTGAAG-3 ' (SEQ ID NO:8)

mAlbumina Reverse 5 '-TTGGCTCATGGAAACCTACCA-3' (SEQ ID NO:9)

ALB Probe VIC-AATCCTCCCGCATGCTACGGCA-TAMRA (SEQ ID NO:10)

Preparazione del U sato cellulare per PCR quantitativa e screening di cloni cellulari Mei

Le cellule sono state raccolte e lavate una volta con PBS lx. Il pellet è stato risospeso in 25 μΐ di soluzione di lisi (105 mMKCl, 14 mM Tris/HCl pH 8,3, 2.5 mM MgC12, 0,3 mg/ml gelatina, 0,45% NP-40, 0,45% Tween 20, 100 pg/ml Protenasi K) e U sato a 56°C per 1 ora, seguito da un ciclo di inattivazione dell'enzima a 96°C per 15 min.

La reazione di PCR è stata eseguita su 7 μΐ di lisato cellulare nel buffer di PCR (105 mM KC1, 14 mM Tris/HCl pH 8,3, 2,5 mM MgC12, 0,3 mg/ml gelatina, 0,45% NP-40, 0,45% Tween 20, 10 mMdNTP, 12.5 pM/oligo, lx Taq Buffer, 1,25 ulTaq Polimerasi). È stata eseguita una denaturazione iniziale a 95°C per 5 min. e sono stati eseguiti 30 cicli di denaturazione a 95°C per 1 min., appaiamento a 62°C per 45 sec. ed estensione 72°C per 2 min. È stato eseguito un ciclo finale di estensione a 72°C per 10 min. ed I prodotti PCR sono stati analizzati dopo elettroforesi su gel d'agarosio all'1%.

Estrazione dell'RNA e Primer extension.

L'RNA è stato estratto seguendo il protocollo del reagente Triazol (Sigma). Le cellule sono state scongelate in ghiaccio e l'RNA è stato estratto mediante aggiunta di 200 μΐ di Cloroformio, seguita da 3 min. di incubazione a temperatura ambiente e centrifugazione a 4°C, a 12.000 rpm per 15 min. Recuperata la fase acquosa l'RNA è stato precipitato con 500 μΐ di Isopropanolo ed incubato a temperatura ambiente per 10 min. e centrifugato 4°C, a 12.000 rpm per 10 min. Il pellet è stato lavato con Etanolo al 75%, risospeso in 20 μΐ di acqua sterile e conservato a -80°C.

Per la reazione di primer extension sono stati usati 20pmol di sonda (marcata con γ<32>!! dATP) specifici per la β-globina umana e per Ι'α-globina di topo. Le sonde sono state preparate incubando 20 pM di ciascun oligo con 10 u di enzima T4-Poli Nucleotide Kinasi, 3 μΐ di γ-<32>Ρ ATP e PNK buffer a 37°C per 10 min. ed è stato effettuato un ciclo di inattivazione dell'enzima a 90°C per 2 min. I campioni di RNA sono stati retrocopiati in presenza di trascrittasi inversa, mediante una reazione di annilazione a 50°C per 30 min. ed estenzione a 42°C per 30 min. una volta ottenuto il cDNA questo è stato denaturato a 90°C per 10 min. in presenza del colorante di caricamento. I campioni così ottenuti sono stati fatti correre in un gel denaturante di acrilamide all'8%, a 1200 volt per 2 ore circa.

Primer α-globina di topo: GTCTTGTCGGCAGGAACAG (SEQ ID NO:11)

Primer β-globina umana: CAGTAACGGCAGACTTCTCCTC (SEQ ID NO:12)

Espansione e selezione di topi talassemici C57BL6Hbb<Th3+/_>

Topi wild tipe C57BL6 sono stati incrociati con topi eterozigoti C57BL6Hbb<Th3+/~>. I topi ottenuti sono stati analizzati a distanza di 4 settimane dalla nascita per la determinazione del genotipo mediante analisi di uno striscio di sangue periferico su un vetrino da microscopia.

Trapianto di midollo osseo - preparazione delle cellule staminali di topo

Topi C57BL6Hbb<Th3+/~>di età compresa fra 10 e 20 settimane sono stati sacrificati mediante dislocazione del collo e sono stati estratti entrambi i femori e le tibie. Le ossa sono state disgregate con lo scopo di liberare le cellule del midollo in terreno di coltura RPMI mediante l'utilizzo di un mortaio sterile. I detriti ossei e muscolari sono stati eliminati mediante filtrazione utilizzando filtri di nylon da 40um (BD Falcon) e le cellule sono state lavate 2 volte a 4°C con PBS lx contenente 0,5% FBS e 2mM EDTA. Le cellule staminali sono state purificate mediante selezione negativa utilizzando il kit di selezione Lineage Celi Depletion kit mouse (MACS) in accordo al protocollo di purificazione. Le cellule staminali sono state separate dai progenitori cellulari marcati magneticamente mediante l'uso di una colonna di separazione MACS . Immediatamente dopo selezione, le cellule sono state centrifugate a 1000 rpm per 5 min. e risospese in terreno di pre-stimolazione composto daX-vivo 15 (Lonza) contenente 100ng/ml rmTPO (recombinant mouse Trombopoiet in, R&D) e rmSCF (recombinant mouse Stem Celi Factor, R&D) alla concentrazione di 2x0<6>cellule/ml.

Trapianto di midollo osseo - trasduzione delle cellule staminali di topo

Dopo 24 ore di prestimolazione le cellule staminali murine sono state raccolte, contate e trasferite in piastre a 24 pozzetti ricoperte di Retronectina (3ug/cm<2>) . La trasduzione con i vettori lentivirali è stata effettuata utilizzando una MOI (Molteplicità di Infezione) pari a 100 per 8 ore, alla concentrazione di 0,5xl0<6>cellule in 400ul di terreno di coltura in presenza di 2ul di Polybrene (8ug/ml ).

Trapianto di midollo osseo - preparazione dei topi riceventi

I topi riceventi sono stati irradiati da una fonte di cesio 2 volte a distanza di 4 ore con una dose totale pari a 12.5Gy (2 volte 6.25Gy). Il trapianto di midollo osseo è stato effettuato dopo la seconda dose di irradiazione.

Elettroforesi su gel di acetato di cellulosa per la tipizzazione dell'emoglobina

Il sangue periferico di topo è stato U sato con acqua distillata a differenti diluizioni (1:2, 1:3, 1:4) in maniera tale da consentire il rilascio di emoglobina. Sono staticaricati 7 μΐ di U sato cellulare in ciascun pozzetto di un applicatone (Helena laboratories) e trasferiti su gel di acetato di cellulosa (precedentemente imbibito per 5' in buffere TBE lx) mediante un secondo applicatone mobile. Il gel è stato sottoposto ad elettroforesi ed i campioni fatti migrare dal polo negativo a quello positivo a 275 V per 30 min. Terminata la migrazione, il gel è stato colorato con una soluzione di Ponceau S per 10 min al buio. Sono stati effettuati tre lavaggi di 5 min ciascuno con Acido Acetico al 5%, uno con Etanolo al 100% per 10 min ed uno con Metanolo/Acido Acetico (7v:3v) per 5 min. Il gel è fatto essiccare a 55°C per 6-8 min e conservato in una pellicola trasparente.

Preparazione dei vettori e titolazione

I supernatanti contenenti le particelle virali sono stati preparati mediante transfezione della linea cellulare 293T con il vettore plasmidico e con i plasmidi accessori contenenti i geni necessari per 1'impacchettamento; il titolo virale è stato valutato in cellule HeLa ed è risultato essere dell'ordine di IO<8>particelle infettanti (IP)/mi eccetto che per il vettore contenente il frammento di 1,2 kb dell'isolatore di pollo cHS4 il cui titolo non superava IO<7>, rendendolo non ideale per gli esperimenti in vivo. Questo risultato è in accordo con dati ottenuti da diversi gruppi che hanno dimostrato che il titolo è inversamente proporzionale alla lunghezza dei frammenti inseriti nella LTR (Urbinati F. et al., 2009; Hanawa H, et al., 2009). Per questo motivo è stato anche generato il TNS9.3mt+400bp cHS4 che contiene un frammento piu<'>piccolo di 400bp (Emery 2007); è stato così possibile preparare tale vettore ad un titolo dell'ordine di IO<8>particelle infettanti (IP)/mi.

I risultati di questi esperimenti di titolazione indicano che l'inclusione della sequenza sns5 non inficia il titolo virale che è risultato essere paragonabile a quello ottenuto con il vettore non isolato. Questo è un requisito fondamentale per i vettori che s'intendono usare in terapia genica.

Analisi di espressione dei vettori isolati nella linea cellulare eritroleucemica murina (Mei)

La linea cellulare eritroleucemica di topo (Mei) è stata trasinfettata utilizzando una MOI (molteplicità d'infezione) molto bassa con lo scopo di ottenere cloni cellulari contenenti una singola copia di vettore per cellula. Per questo motivo sono state settate condizioni sperimentali tali da avere nel pool cellulare un numero di vettore medio per cellula di 0.2-0.4 come determinato mediante PCR quantitativa (Q-PCR). A distanza di 48 ore dalla trasduzione è stato effettuato il subclonaggio ed i cloni cellulari espansi ed analizzati per la presenza del vettore, per la determinazione del numero di copie e per l'espressione del transgene βglobinico.

Un minimo di 200 cloni sono stati valutati per ciascun vettore sia per la presenza del provirus mediante PCR che per il numero di copie di vettore per cellula e solo i cloni contenenti una singola copia sono stati ulteriormente espansi per l'analisi di espressione del transgene dopo induzione a differenziamento eritroide terminale in presenza di HMBA per 4 giorni.

Dai dati riportati risulta che l'isolatore cromatinico sns5 protegge il vettore lentivirale TNS9.3mt_ dal_ silenziamento_ dovuto_ al_ sito d'integrazione in quanto il 94% dei cloni cellulari trasinfettati con TNS9 .3mt+sns5 in orientamento senso esprimono il gene beta globinico umano. Di contro, il vettore non isolato TNS9.3mt è espresso solo nel 45% dei cloni. Analogo grado di silenziamento è stato rilevato con il vettore isolato con lo stesso frammento sns5 clonato in orientamento reverse (il 50 % dei cloni contiene il vettore silenziato) dimostrando che questo elemento esibisce la capacità di proteggere il trasgene dagli effetti posizione solo in orientamento senso. Anche il vettore isolato con l'isolatore di pollo c-HS4 ha un grado elevato di silenziamentro, mentre sorprendentemente la maggior parte dei cloni cellulari contenenti il vettore fiancheggiato dalla sequenza junk esprime il transgene anche se a livelli molto piu<'>bassi rispetto al vettore contenente sns5-senso (fig 5).

Nei diversi cloni cellulari è stato valutato il livello di trascrizione del trasgene β-globinico umano mediante primer extension e normalizzato per l'espressione del gene alfa globinico di topo.

L'analisi effettuata ha dimostrato che l'inserzione dell 'isolatore_ cromat inico_ sns5_ nel_ vettore lentivirale TNS9.3mt aumenta notevolmente (2,5 volte) l'espressione del transgene nei_ cloni cellulari contenenti una singola copia di vettore. I livelli di espressione risultano aumentati soltanto con il vettore TNS9.3mt+sns5-senso, tutti gli altri vettori mostrano livelli di espressione paragonabili al vettore non isolato, seppure esibiscono una variabilità clonale ridotta come evidenziato dalla deviazione standard.

Analisi dell'espressione del TNS9 .3mt+sns5 nel modello murino di beta-talassemia

Gli studi in vivo sono stati effettuati in topi talassemici C57BL6 Hbb<Th3+/~>creati da topi C57BL6 mediante knock-down del gene beta-globinico (Yang B. et al., 1995) (Fig. 6).

Topi omozigoti per questa delezione (C57BL6Hbb<th3~/h3~>) muoiono in utero mostrando un fenotipo simile alla più severa forma di anemia di Coley nell'uomo (betatalasemia major) mentre topi eterozigoti per questa delezione presentano un profilo ematologico con caratteristiche tipiche della beta-talasemia intermedia nella sua forma più severa: anemia, drammatico incremento di ret icolocit i, danni a tessuti e organi come deformazioni ossee, aumento di volume della milza e incremento della concentrazione di ferro in milza, polmoni e reni.

Topi eterozigoti sono stati ottenuti mediante incrocio di maschi C57BL6 Hbb<Th3+/~>con femmine wild tipe (C57BL6). Il trapianto genico è stato effettuato ex-vivo utilizzando come donatori di cellule staminali topi maschi C57BL6 Hbb<Th3+>. Le cellule staminali (lineage negative cells, lin<~>) sono state selezionate dal midollo osseo estratto dai femori e dalle tibie, prestimolate per 16-18 ore in presenza di citochine murine (rm TPO e rm SCF) e trasdotte per 8 ore con i vettori TNS9.3mt e TNS9.3mt fiancheggiati dalle sequenze sns5, Junk e 400bp cHS4. Il trapianto di midollo è stato effettuato mediante iniezione nella vena caudale di topi riceventi subito dopo due cicli di irradiazione a dosi letali per distruggere il sistema ematopoietico .

Insieme con le cellule staminali sono state iniettate anche cellule di supporto (cellule eritroidi, linfoidi, etc.) precedentemente selezionate dal midollo di un topo donatore per fornire la protezione immunitaria necessaria per proteggere l'animale da infezioni durante il tempo di aplasia tra le irradiazioni e l'attecchimento del nuovo midollo osseo trapiantato.

A distanza di 6 settimane dal trapianto, nel sangue periferico sono stati determinati il numero medio di copie di vettore/cellula (VCN) ottenuto mediante Real-Time PCR utilizzando primer specifici per la sequenza virale gag e l'espressione del gene βglobinico umano misurata mediante analisi di primer exstention (Fig 7). Il VCN è risultato essere compreso fra 0.25 e 0.75 nei vari topi analizzati e si è mantenuto stabile per tutta la durata di vita degli animali (circa un anno).

L'espressione del transgene del vettore isolato con sns5 aumenta in vivo di 2 volte rispetto al vettore non isolato; mentre valori lievemente superiori sono osservati con il vettore isolato con l'elemento cHS4.

L'espressione del transgene e la produzione di emoglobina chimerica (uomo/topo) valutata mediante elettroforesi su acetato di cellulosa sono stati misurati anche a 14 settimane e a 10 mesi dal trapianto (Fig 8).

Questa analisi a lungo termine conferma i dati ottenuti nella prima osservazione 6 settimane dopo il trapianto: il gene β—globinico del vettore TNS9.3mt+sns-5 e<*>espresso due volte di piu<*>rispetto a quello osservato per i vettori TNS9.3mt and TNS9.3mt+Junk. L<*>inclusione di sns5 determina un aumento del 50% di produzione di emoglobina uomo/topo (piu<*>di 3gr/dl per copia di vettore) nel modello murino di β—talassemia.

Analisi clonale in vivo: saggio di formazione delle colonie di milza (saggio CFU-S)

È stata condotta un'analisi di espressione in colonie di milza di topi con trapianto secondario; tale saggio consente di valutare l'espressione di un gene della β-globina umana in un sistema clonale in vivo sfruttando la capacità delle cellule staminali ematopoietiche di dare origine a noduli discreti (colonie) nella milza. Le colonie emergono sulla superficie della milza a distanza di 8-12 giorni dal trapianto di midollo osseo e le cellule presenti in ciascuna colonia sono la progenie di una singola cellula staminale. L'esperimento è stato effettuato utilizzando come donatori topi precedentemente trapiantati con cellule staminali ematopoietiche trasdotte con il TNS9.3mt+sns5-senso e con TNS9.3mt+junk . I topi riceventi sono stati irradiati letalmente ed hanno ricevuto due dosi di cellule staminali in maniera tale da essere sicuri di ottenere colonie discrete e facilmente separabili. Sono state ottenute 36 CFU-S per il vettore contenente la sequenza Junk e 37 per il TNS9.3+sns5 e la presenza del virus ed il numero di copie di vettore per ogni colonia è stato determinato mediante Reai Time PCR. Tutte le colonie contenenti una copia di vettore sono state analizzate mediante primer extension per determinare i livelli di espressione del gene β-globinico. I dati ottenuti sono schematizzati nella fig. 9.

I risultati del saggio clonale in vivo mopstrano un incremento di espressione del gene beta-globinico fiancheggiato dall'isolatore cromatinico sns5 di 6 volte_ rispetto_ all<">espressione_ del_ vettore TNS9.3mt+Junk . Inoltre il vettore TNS9.3mt+sns5 è meno soggetto agli effetti posizione in quanto il gene β—globinico è espresso nell'82% delle colonie vs_ il 62% delle colonie contenenti il vettore TNS9 .3mt+Junk . Inoltre, l'espressione del trasgene si mantiene elevata anche dopo trapianto di topi in seconda generazione e può quindi essere definita espressione a lungo termine.

Vettore plasmidico pTNS9.3mt (Fig.: 1 e 3)

pTNS9.3mt è il plasmide che contiene le sequenze del vettore lenti virale ricombinante per le sequenze β—globiniche . Esso contiene per la parte plasmidica di origine batterica:

<■>Origine di replicazione per E. coli

<■>Gene di resistenza all'ampicillina

Sequenze del transgene:

<■>Il gene beta-globinico contenente 618 bp di sequenze promotore con una inserzione di 4 nt nella regione 5<'>UTR, una delezione di 770 bp nel secondo introne, e la regione 3' UTR con l'enhancer eritroide specifico localizzato in un frammento di 300 bp a valle del sito di poliadenilazione

<■>La regione LCR (Locus Control Region) è composta da elementi core dei siti ipersensibili HS2 (840bp), HS3 (1308bp) ed HS4 (1069bp) della LCR del locus beta- globinico umano. Questa precisa combinazione è stata scelta per ottenere alti livelli di trascrizione eritroide specifica come dimostrato già in precedenti esperimenti (May C. 2000;)

Sequenze virali :

<■>Enhancer e promotore della regione dei geni early del citomegalovirus (CMV) (questa regione verrà deleta durante la retrotrascrizione, per cui non sarà presente nel provirus integrato) .

<■>Sequenze della regione GAG del virus HIV-1 con quattro mutazioni generate al fine di impedire in tutte e tre le possibili reading-f rames la generazione di lunghi polipeptidi, essi includono: la distruzione del sito di inizio, 2 mutazioni che creano altrettanti codoni di stop ed una mutazione che crea frameshift.

<■>Rev-responsive element (RRE) derivate dall'HIV-l;La sequenza RRE (857bp) del virus HIV1 è sito di riconoscimento per la proteina Rev che regola il processo post-trascrizionale delle proteine virali. La proteina Rev ha come target gli RNA unspliced o parzialmente spliced, contiene un dominio di riconoscimento per RRE; gli RNA che contengono la sequenza RRE complessati con Rev possono essere trasportati dal nucleo al citoplasma. In ultima analisi questo processo è necessario per 1'impacchett amento di genomi virali completi durante la fase di produzione dei vettori e quindi per aumentare il titolo virale e la stabilità dei genomi virali .

<■>Il tratto centrale di polipurine (cPPT) derivato da HIV—1

<■>La 3'LTR (Long Terminal Repeat)del virus HIV1 da cui sono state rimosse 391 bp che contenevano l'enhancer della regione U3 ed il promotore con il sito TATA. In questa maniera si è creato un vettore "self inactivated" (SIN vector). In questa regione sono stati inseriti 4 nucleotidi che creano il sito unico per clonare gli isolatori e per monitorare il processo di retro trascrizione e l'integrità dei prò virus.

<■>Gli isolatori cromatinici sns5 (500 bp), cHS4 (1200 bp), cHS4 (400 bp) e la sequenza Junk (500 bp) sono state clonate all'interno del vettore nel sito unico di restrizione Nhel.

BIBLIOGRAFIA

Acuto S, Di Marzo R, Calzolari R, Baiamonte E, Maggio A, Spinelli G (2005) "Funtional characterization of thè sea urchin sns chromatin insulator in erythroid cells" Blood cells, molecules and deseases 35: 339-344.

Aker M, tubb J, Groth AC, BuKovsky AA; Bell AC , Felsenfeld G, Kiem HP, Stamatoyannopoulos G, emery DW. "Extended core sequences from thè cHS4 insulator are necessary for protecting retroviral vectors from silencing position effects" Human Gene Ther (2007) Apr.: 18(4): 333-43

Arumugam PI, Scholes, J, Perelman, N, Xia, P, Yee, JK and Malik P (2007). "Improved human beta-globin expression from self-inactivating lentiviral vectors carrying thè chicken hypersensitive site-4 (cHS4) insulator element". Mol Ther 15: 1863-1871

Bell A C, and Felsenfeld G (1999) "Stopped at thè border: boundaries and insulators" Current Opin. Genet. Dev.; 9: 191-198

Cornetta K, Morgan RA, Anderson WF "Review.Safety issues related to retroviral-mediated gene transfer in human".Hum Gene Ther. (1991) Spring; 2(1):5-14. D'Apolito D, Baiamonte E, Bagliesi M, Di Marzo R, Calzolari R, Ferro L, Franco V, Spinelli G, Maggio A, Acuto S (2009) "The sea urchin sns5 insulator protects retroviral vectors from chromosomal position effects by maintaining active chromatin structure." Mol Ther. (8): 1434-41

Di Caro D, Melfi R, Alessandro C, Serio G, Di Caro V, Cavalieri V, Palla F, Spinelli G (2004) "Downregulation of Early Sea Urchin Histone H2A Gene Relies on cis Regulative Sequences Located in thè 5' and 3' Regione and Including thè Enhancer Blocker sns" J.M.B. 342: 1367-1377.

Di Simone P, Di Leonardo A, Costanzo G, Melfi R, Spinelli G (2001) "The Sea Urchin sns Insulator Blocks CMV Enhancer following Integration in Human Cells" Biochemical and Biophysical Research Communications 284: 987-992.

Dunbar CE "The yin and yang of stem celi gene therapy: insights into hematopoiesis, leukemogenesis and gene therapy safety". Hematology Am Soc Hemat Educ Program 2007: 460-5

Ellis J (2005) "Siiencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors." Hum Gene Ther. 16(11): 1241-6.

Emery DW, Yannaky, E, Tubb, J and Stamatoyannopoulos G (2000). A chromatin insulator protects retrovirus vectors from position effects. Proc Nati Acad Sci USA 97:9150-9155.

Hacein-Bey-Abina S, Von Ralle C, Schmidt M (2003) "A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency" N. Engl. J. Med.; 348:255-256

Hanawa H, Yamamoto M, Zhao H, Shimada T, Persons D A (2009) "Optimized Lentiviral Vector Design Improves Titer and Transgene Expression of Vectors Containing thè Chicken β—Globin Locus HS4 Insulator Element" Molecular Therapy 17 (4), 667-674

Imren S, Payer E, Westerman K A (2002) "Permanent and panerythroid correction of murine beta thalassemia by multiple lentivirali integration in hematopoietic stem cells" Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A.; 99: 14380-14385

Kean L S, Manci E A, Perry J (2003) "Chimerism and cure : hematologic and pathologic correction of murine sickle celi disease" Blood 102: 4582-4593 Levasseur D N, Ryan T M, Pawlik K M and Townes T M (2003) "Correction of a mouse model of sickle celi disease: lentiviral/antisickling beta-globin gene transduction of unmobilized, purified hematopoietic stem cells" Blood 102: 4312-4319

Li C. and Emery DW (2008) "The cHS4 chromatin insulator reduces gammaretroviral vector silencing by epigenetic modification of integrated provirus" Gene Therapyl5: 49-53

Maggio A. "Light and shadows in thè iron chelation treatment of haematological diseases". Br J Haematol. 2007 Aug;138(4):407-21.

May C, Rivella S, Callegari J, Heller G, Gaensler KM, Luzzatto L, Sadelain M (2000) "Therapeutic hemoglobin synthesis in betathalassemic mice expressing lentivirus-encoded human beta-globin" Nature 406: 82-86

May C, Rivella S, Chadburn A, Sadelain M (2002) "Successfull treatment of murinepthalassemiaintermedia by transfer of thè human βglobin gene" Blood 99: 6.

Melfi R, Palla F, Di Simone P, Alessandro C, Cali L, Anello L, Spinelli G (2000) "Functional Characterization of thè Enhancer Blocking Element of thè Sea Urchin Early Histone Gene Cluster Reveals Insulator Properties and Three Essential cis-acting Sequences" J. Mol. Biol. 304: 753-763.

Ott MG, Schmidt, M, Schwarzwaelder, K, Stein, S, Siler, U, Koehl, U et al. (2006). "Correction of X-linked chronic granulomatous disease by gene therapy, augmented by insertional activation of MDS1-EVI1, PRDM16 or SETBP1". Nat Med 12: 401-409. Palla F, Melfi R, Anello L, Di Bernardo M, Spinelli G (1997) "Enhancer blocking activity located near the 3 end of thè sea urchin early H2A histone gene" Proc Nati Acad Sci USA 94(6): 2272-2277

Pawliuk R, Westerman K A, Fabbri M E (2001) "Correction of sickle celi disease in transgenic mouse models by gene therapy" Science 294: 2368-2371 Persons D A, Allay E R, Sabatino D E (2001) "Functional requirements for phenotypic correction of murine beta-thalassemia: implications for human gene therapy" Blood 97: 3275-3282

Persons D A, Hargrove P W, Allay E R, Hanawa H and Nienhuis A W (2003) "The degree of phenotypic correction of murine beta-thalassemiaintermedia following lentiviralimediated transfer of a human gamma-globin gene is influenced by chromosomal position effects and vector copy number" Blood 101: 2175-2183

Pikaart M J, Recillas-Targa F, Felsenfeld G (1998) "Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methylation and histonedeacetylation and is prevented by insulators"Genes Dev. 12(18): 2852-2862

Ramezani A, Hawley, TS and Hawley, RG (2003). "Performance- and safety-enhanced lentiviral vectors containing thè human interieron-beta scaffold attachment region and thè chicken beta-globin insulator". Blood 1101: 4717-4724.

Recillas-Targa F, Valadez-Graham V, Farrell CM (2004) "Prospects and implications of using chromatin insulators in gene therapy and transgenesis" Bioessays.26(7):796-807

Rivelia S, May C, Chadburn A, Riviere I, Sadelain M (2003) "A novel murine model of Cooley anemia and its rescue by lentiviral-mediated human β-globin gene fransier"Blood 101: 8.

Rivelia, S, Callegari, JA, May, C, Tan, CW and Sadelain, M (2000). "The cHS4 insulator increases thè probability of retroviral expression at random chromosomal integration sites". J Virol 74: 4679-4687.

Sadelain M, Boulad F, Galanello R, Giardina P, Locatelli F, Maggio A, Rivella S, Riviere I, Tisdale J. "Therapeutic options for patients with severe beta-thalassemia : thè need for globin gene therapy."Hum Gene Ther. 2007 Jan;18(l) :1—9. Review. No abstract available

Urbinati F, Arumugam P, Higashimoto T, Perumbeti A, Mitts K, Xia P, Malik P (2009) "Mechanism of reduction in titers from lentivirus vectors carrying large inserts in thè 3'LTR" Molecular Therapy 17(9): 1527-36

Walters MC, Fiering, S, Bouhassira, EE, Scalzo, D, Goeke, S, Magis, W et al. (1999). "The chicken betaglobin 5'HS4 boundary element blocks enhancermediated suppression of silencing". Mol Celi Biol 19: 3714-3726.

Yang B, Kirby S, Lewis J, Detloff P J, Maeda M, Smithies 0 (1995) "A mouse model for bo-Thalassemia" PNAS 92: 11608-11612

Yannaki E, Tubb, J, Aker, M, Stamatoyannopoulos , G and Emery, DW (2002) . "Topological constraints governing thè use of thè chicken HS4 chromatin insulator in oncoretrovirus vectors". Mol Ther 5: 589-598 .

Claims (2)

1. RIVENDICAZIONI 1) Vettore lentivirale ricombinante per la betaglobina comprendente le o consistente nelle seguenti sequenze transgeniche: sequenza del gene beta-globinico avente numero di riferimento GenBank HUMHBB nella posizione 61524-64620; sequenze dei siti ipersensibili HS della LCR del cluster beta-globinico umano aventi numero di riferimento GenBank HUMHBB nella posizione 8039-8911, HUMHBB nella posizione 3877-5177 e HUMHBB nella posizione 328-1390; e nelle seguenti sequenze virali aventi numero di riferimento GenBank HIVPV22 nella posizione 463-1135, HIVPV22 nella posizione 7664-8521, HIVPV22 nella posizione 4826-4943 e HIVPV22 nella posizione 9094-9761 in cui sono stati deleti i nucleotidi 9167-9558; detto vettore essendo caratterizzato dal fatto di comprendere la sequenza nucleotidica dell'insulator SNS5 di riccio di mare clonato in orientamento senso nel sito di restrizione Nhe 1 presente nella 3' LTR, detta sequenza nucleotidica dell'insulator SNS5 avendo la seguente sequenza SEQ ID NO: 13: GCTTCTTGGAGGTGTGACCATCGCTCGAGGTGGTGTACTGCCCAACATCCAG GCTGTGCTGCTTCCCAAGAAGACCGGCAAATCAAGCTAAAGGTTTTGCACTC GCAAACCTCAACACCTCAACGGCCCTTATCAGGGCCACCAAATATACAAGAA AGAATAAAGTCTCTGTAATTCATAATAGTCTCTGTAATTCATAATAAACTCC TACTGCAACTACAACTCAGACGCAACCCCCTCTCCTCCTCCTCCTCCACCCC TCCTCCCCCCCCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTCTTCCCCAT TCCGGTTTTGTAGTTGTTGTCGATCATCCGATCTAATATGCCTATGCGAATA CAATCACAAATGTTATTATTATAAACATTCTGTTCTGTTCTGTTATTGCTTA TTGCTTACACGGATGAATAAAAGATACTCTGTGTCGCACAGT .
2. 2) Vettore secondo la rivendicazione 1, in cui la sequenza nucleotidica dell'insulator SNS5 comprende ulteriormente sequenze polylinker ed è la seguente sequenza SEQ ID N0:1: etagcccgcgaattcactagtgattGCTTCTTGGAGGTGTGACCATCGCTCG AGGTGGTGTACTGCCCAACATCCAGGCTGTGCTGCTTCCCAAGAAGACCGGC AAATCAAGCTAAAGGTTTTGCACTCGCAAACCTCAACACCTCAACGGCCCTT ATCAGGGCCACCAAATATACAAGAAAGAATAAAGTCTCTGTAATTCATAATA GTCTCTGTAATTCATAATAAACTCCTACTGCAACTACAACTCAGACGCAACC CCCTCTCCTCCTCCTCCTCCACCCCTCCTCCCCCCCCCCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTGTCTTCCCCATTCCGGTTTTGTAGTTGTTGTCGATCAT CCGATCTAATATGCCTATGCGAATACAATCACAAATGTTATTATTATAAACA TTCTGTTCTGTTCTGTTATTGCTTATTGCTTACACGGATGAATAAAAGATAC TCTGTGTCGCACAGTaatcgaattcccgcggccg 3) Vettore secondo la rivendicazione 1, in cui nella sequenza del gene beta-globinico avente numero di riferimento GenBank HUMHBB nella posizione 61524-64620 sono stati inseriti 4 nucleotidi TCTA nella regione 5<'>UTR, 10 nucleotidi prima del sito ATG di inizio traduzione. 4) Vettore secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3 mostrato in figura 3. 5) Uso del vettore come definito in ognuna delle rivendicazioni 1-4 per la preparazione di un medicamento per la terapia genica nella cura della beta-talassemia . 6) Cellula eucariota o procariota comprendente il vettore come definito in ognuna delle rivendicazioni 1-4