ITRM20100529A1

ITRM20100529A1 - Dispositivo biomedico per testare la staminalità delle cellule

Info

Publication number: ITRM20100529A1
Application number: IT000529A
Authority: IT
Inventors: Porcellinis Stefano De; Pamela Mozetic; Alberto Rainer; Cristiano Spadaccio
Original assignee: Biomatica S R L
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2012-04-08

Description

Descrizione dell?invenzione avente per titolo:

?DISPOSITIVO BIOMEDICO PER TESTARE LA STAMINALIT? DELLE CELLULE?

DESCRIZIONE

Settore della tecnica

La presente domanda di brevetto per invenzione si riferisce in generale a un sistema di rilascio di farmaci, contente costrutti tridimensionali polimerici biologicamente attivi, per la valutazione della risposta biologica di colture cellulari nei confronti di differenti stimoli chimici e fattori ambientali e dei metodi di fabbricazione di detto sistema.

L?invenzione ? applicabile a qualsiasi settore, dove un tale tipo di sistema pu? essere vantaggiosamente utilizzato, ma preferibilmente questa riguarda il settore della biologia e pi? specificatamente della biologia cellulare.

Tecnica nota

Come ? noto, la terapia con le cellule staminali nonch? la medicina rigenerativa sono considerate tra i campi d?elezione della ricerca scientifica mondiale e stanno attraendo un incredibile numero di applicazioni cliniche in conseguenza del loro promettente potenziale per ci? che riguarda la rigenerazione o la sostituzione dei tessuti e degli organi danneggiati. L?interesse nei loro confronti ? dovuto, in particolar modo, agli incoraggianti risultati gi? ottenuti.

Tuttavia, un gran numero di interrogativi, riguardanti le migliori sorgenti di cellule staminali, il tipo, la loro sicurezza, il destino di queste cellule, le problematiche immunologiche connesse nonch? la loro armonica integrazione funzionale nell?organo bersaglio, rimangono ancora senza risposta.

Le questioni riguardanti la differenziazione delle cellule staminali o transdifferenziamento nelle applicazioni in vivo rappresentano ancora un tema di discussione, soprattutto per quanto riguarda l'integrazione funzionale delle cellule nell?ambiente ospite e, cosa pi? importante, la loro trasformazione in cellule maligne. Inoltre, l?individuazione costante di nuove fonti di cellule staminali o nicchie e di nuovi tipi di cellule progenitrici ? fonte di ulteriore confusione e preoccupazione per quanto riguarda l?individuazione delle cellule ottimali candidate per la medicina rigenerativa.

Chiaramente, la rigenerazione degli organi richiede una complessa cascata di eventi che va ben oltre la semplice iniezione nel sito idoneo dell?appropriato tipo di cellule. In questo senso, la caratterizzazione dei fattori presenti nel microambiente ostile del tessuto danneggiato, che ostacolano la sopravvivenza e l'integrazione funzionale delle cellule trapiantate, ? oltremodo essenziale.

Un reale approccio alla medicina rigenerativa dovrebbe considerare l'importanza della matrice extracellulare (ECM) e il forte segnale biologico da questa proveniente. L?ambiente del tessuto connettivo e il microambiente strutturale nel quale vengono immerse le cellule, esercitano un gran numero di stimoli che incidono sulle funzioni cellulari e supportano la proliferazione e il differenziamento delle cellule.

La maggior parte dei tipi cellulari dei mammiferi hanno dimostrato di essere dipendenti dall?effettiva adesione a un supporto e quindi, per avere successo, la medicina rigenerativa non pu? ignorare l'importanza della matrice extracellulare (ECM) come principale sostegno cellulare, in grado di offrire un forte segnale biologico per la rigenerazione del tessuto. Da qui nasce l?esigenza di reperire procedure di rigenerazione dei tessuti del corpo umano mediante la semina di cellule su strutture sempre pi? innovative, dette scaffolds, create da opportuni materiali e dotate di caratteristiche opportune e quindi la loro coltivazione in appositi reattori fino alla colonizzazione degli scaffolds stessi e alla produzione di nuovo tessuto (matrice extracellulare, ECM). La fabbricazione di tali supporti (scaffolds) realizzati di materiali in grado di offrire una superficie adatta per l?adesione cellulare, la proliferazione, la differenziazione e la migrazione e in cui appropriati stimoli biochimici possano guidare la crescita di neo-tessuto funzionale, ? dunque di fondamentale importanza. Tali concetti sono alla base dell?area della cos? detta ?ingegneria tissutale?, che contempla la combinazione di cellule e scaffolds biodegradabili per produrre costrutti tridimensionali utili per un successivo impianto in vivo e la rigenerazione di organi.

In ambito generale la presente invenzione nasce nel campo della biologia cellulare e dell'ingegneria tissutale, dall'idea di un approccio biomimetico basato sulla simulazione della ECM e l?impiego di fattori di crescita, per guidare la differenziazione delle cellule staminali. L'idea di concentrare e organizzare spazialmente una citochina, o un altro mediatore biologico, all'interno di un ambiente tridimensionale, simulando l'istoarchitettura del tessuto nativo, ? stata recentemente messa in evidenza. Quest'approccio consente di sfruttare in pieno i vantaggi derivanti dall'uso delle cellule staminali nella medicina rigenerativa, consentendo la differenziazione delle cellule staminali in un microambiente tridimensionale preservando, al tempo stesso, le cellule dai fattori nocivi presenti nell'organo danneggiato. Oltre l'utilizzo in vivo, questo concetto ? rilevante anche per le applicazioni in vitro per quanto riguarda la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della differenziazione delle cellule staminali.

Studi precedenti hanno dimostrato l'induzione del processo di differenziazione delle cellule staminali all'interno di scaffolds funzionalizzati con fattori di crescita. L?idrossiapatite per la differenziazione osteocondrale e i glicosaminoglicani vaso-specifici, come l'eparina per il differenziamento in senso endoteliale, sono stati utilizzati in scaffolds tridimensionali in grado di mimare la ECM, fornendo con ci? una prova della possibilit? di produrre uno scaffold adatto alla semina di cellule staminali contenente gli appositi fattori per la differenziazione verso i fenotipi desiderati. Inoltre, i membri della superfamiglia TGF-B hanno dimostrato di essere efficaci nell'indurre la differenziazione muscolare.

Il brevetto KR20060127399 di Melvin S. Schindler et al., si riferisce a una struttura nanofibrillare per la coltura cellulare, ma non comprende n? i composti bioattivi n? i farmaci impiegati nella presente invenzione e non ? destinato allo screening delle capacit? differenziative delle cellule o della loro risposta biologica.

Il brevetto EP1989295 si riferisce a un metodo per indurre la differenziazione osteogenica nelle cellule staminali mesenchimali, tuttavia non considera l'impiego di idrossiapatite e di bifosfonati per indurre la differenziazione osteogenica.

Il brevetto US2003026786, da Pittenger MF et al., descrive un metodo per indurre la differenziazione condrogenica nelle cellule staminali mesenchimali, tuttavia, la presente invenzione si riferisce all'uso di ulteriori e diversi composti bioattivi.

Il brevetto AU2003234740 B2, da Pittenger et al., descrive un metodo per indurre la differenziazione adipogenica di cellule staminali mesenchimali, ma non considera l'aggiunta di ulteriori composti.

Il brevetto WO9639035, da Caplan et al., si riferisce a un metodo per indurre il differenziamento miogenico, ma non considera l'utilizzo di ulteriori composti. Il brevetto US2006003311, da Fulde et al., descrive un metodo per lo screening in vitro di eventi cellulari. Tuttavia questo fa riferimento a condizioni di coltura in vitro di cellule, in cui le cellule trasfettate contenenti costrutti promoterreporter sono coltivate in un ambiente tridimensionale simile ad un tessuto.

Descrizione dell?invenzione

Il concetto innovativo alla base della presente invenzione, che rappresenta un evidente strumento utile nelle mani del ricercatore, consiste nel prevedere la possibilit? di attuare uno screening rapido della staminalit? di un tipo cellulare e delle sue capacit? differenziative.

Pi? specificatamente la presente invenzione riferisce di un dispositivo, basato su costrutti polimerici tridimensionali biologicamente attivi, in grado di testare la staminalit? di colture o co-colture cellulari, di valutare la loro capacit? di differenziazione osteogenica, condrogenica, adipogenica, endoteliale e muscolare, di analizzare la risposta biologica ai composti chimici e infine ai metodi impiegati per la fabbricazione dello stesso.

Ancora pi? specificatamente la presente invenzione riferisce di un dispositivo biomedico costituito da gruppi di supporti polimerici tridimensionali funzionalizzati, in cui ciascun gruppo ? caratterizzato da una differente composizione o funzionalizzazione (secondo quanto riportato in seguito) ed ? in grado di promuovere il differenziamento cellulare verso uno specifico fenotipo (tra cui quello osteogenico, condrogenico, endoteliale, adipogenico e muscolare) oppure di permettere la valutazione della risposta biologica nei confronti della composizione chimica utilizzata nella funzionalizzazione.

L'unicit? e la non-ovviet? di tale invenzione si basa sull'uso della combinazione di agenti bioattivi (cocktails), rivelati per la prima volta in questa invenzione, dispersi nelle fibre degli scaffold polimerici tridimensionali, al fine di realizzare un test di differenziazione in grado di indurre il differenziamento delle cellule verso gli specifici e predetti fenotipi osteogenici, condrogenici, endoteliali, adipogenici e muscolari.

Il miglioramento rispetto ai test di differenziamento sviluppati nell?arte nota, si basa, principalmente, sulla presenza di costrutti polimerici tridimensionali, la cui struttura ? realizzata in modo da costituire una matrice in grado di mimare quella extracellulare (ECM), esaltando la somiglianza biologica dell'ambiente di coltura con quello nativo, in cui le cellule si trovano normalmente, rispetto ai substrati bidimensionali comunemente utilizzati in vitro. La capacit? di valutare la staminalit? delle colture senza la necessit? di impiegare terreni di coltura appositamente realizzati ? dovuta alla presenza di fattori differenziativi all?interno dei supporti stessi.

L'invenzione ? quindi utile per valutare la risposta biologica di vari tipi di cellule e pu? trovare impiego in diverse applicazioni, tra cui: l?identificazione e la caratterizzazione di staminali e cellule progenitrici; la valutazione della risposta a composti farmacologici di cellule cancerose differenziate o staminali; la valutazione di resistenza ai farmaci da parte di cellule staminali, di cellule differenziate, di batteri o di virus.

Nella realizzazione della presente invenzione, la semplicit? d?impiego e la migliorata adesione e sopravvivenza cellulare mostrata dai supporti oggetto dell?invenzione stessa, rispetto alle condizioni di coltura dei comuni supporti non tridimensionali, permettono l'applicazione diretta di biopsie tissutali contenenti cellule staminali o di escissioni tumorali intraoperatorie al sistema oggetto dell?invenzione, in seguito ad una lieve dissociazione enzimatica tissutale, al fine di ottenere un rapido screening delle capacit? differenziative di cellule staminali potenziali o della resistenza a composti farmacologici di cellule tumorali.

Modi preferiti di realizzazione dell?invenzione

Si vuole sottolineare come nel seguito saranno illustrate, a titolo esemplificativo ma non limitativo, soltanto alcune delle possibili forme di realizzazione della presente invenzione, essendo possibile descriverne molte altre sulla base delle particolari soluzioni tecniche individuate.

In un aspetto pi? specifico la presente invenzione si riferisce a un sistema a rilascio controllato di farmaco in grado di testare la staminalit? di colture cellulari o co-colture valutandone, simultaneamente, la capacit? di differenziazione osteogenica, condrogenica, adipogenica, endoteliale e muscolare unitamente alla risposta biologica nei confronti di diversi composti chimici.

In un aspetto ancora pi? specifico, l'invenzione si riferisce a un supporto tridimensionale e biologicamente attivo, in cui il materiale ? rappresentato da un polimero sintetico o da una miscela di polimeri contenenti almeno uno tra i seguenti: acido polilattico (PLA), acido poliglicolico (PGA), policaprolattone (PCL), polistirene o una loro combinazione e in cui il PLA rappresenta la composizione preferita; oppure da un polimero naturale contenente almeno uno tra collagene, chitosano, alginato o una loro combinazione e in cui il collagene rappresenta la composizione preferita. Si riferisce anche alle miscele contenenti i polimeri derivati sinteticamente o naturalmente dai materiali sopra descritti.

Nella realizzazione preferita la presente invenzione si riferisce a scaffold tridimensionali e realizzati con il metodo dell?elettrofilatura, in cui il supporto tridimensionale biologicamente attivo include fibre non tessute che presentano un diametro medio compreso tra 30 nanometri e 500 micron e pi? preferibilmente tra 0,5 e 5 micron. In ulteriori realizzazioni della presente invenzione, il supporto tridimensionale ? ottenuto con altre tecniche di fabbricazione, comprendenti l?utilizzazione di porogeni, di separazione di fase, di liofilizzazione e di tecniche di stereo litografia (es. modellazione per deposizione da fuso).

In ulteriori aspetti, la presente invenzione si riferisce alla sopra menzionata piattaforma polimerica tridimensionale in combinazione con miscele preformate di composti bioattivi in grado di testare selettivamente le capacit? di differenziazione delle cellule verso i fenotipi osteogenici, condrogenici, adipogenici, endoteliali e muscolari o alla valutazione della risposta biologica delle cellule nei confronti di altri composti farmacologici. In alcune realizzazioni, detti supporti sono combinati con tali composti bioattivi per mezzo di almeno una delle successive tecniche:

- legame chimico che coinvolge gruppi amminici primari, gruppi carbossilici, gruppi tiolici sulla superficie dei polimeri forniti con gruppi amminici primari, gruppi carbossilici, gruppi tiolici appartenenti a dette molecole bioattive, in presenza o in assenza di catalizzatori;

- miscelazione normotermica in soluzioni dei polimeri utilizzando solventi organici o inorganici, come diclorometano, tetraidrofurano, cloroformio, acido acetico, acido trifluoroacetico, acido lattico, esafluoropropanolo, etanolo, metanolo, o miscele dei suddetti, e in cui la miscela di clorometano/metanolo (80:20 v/v) rappresenta il solvente preferito;

- assorbimento di dette molecole sul polimero per mezzo di microspray o elettrospray con o senza successivo legame chimico. A differenza del brevetto KR20060127399, citato in precedenza, il dispositivo qui riferito include l?impiego di composti bioattivi e medicinali ed ? finalizzato alla verifica delle abilit? differenziative di cellule o della risposta biologica delle cellule.

Deve altres? riferirsi, che la presente invenzione prevede di seguito alcune ulteriori forme di realizzazione in corrispondenza delle seguenti varianti qualitative e quantitative riguardanti i costituenti del cocktail di funzionalizzazione dei predetti scaffolds tridimensionali bioattivi.

In una realizzazione del processo di produzione della presente invenzione i sopra menzionati scaffolds tridimensionali bioattivi sono funzionalizzati utilizzando un cocktail di funzionalizzazione composto di: 1-20% di FBS (con la composizione preferita pari al 10%), 3,5-10 mM di b-glicerofosfato (con la composizione preferita pari a 3,5 mM), 0,1-10 ?M di desametasone (con la composizione preferita pari a 0,1 ?M), 50 ?M di ascorbat-2-fosfato, 1-25% di idrossiapatite (con la composizione preferita pari al 10%), bifosfonati azotati e non azotati per indurre il differenziamento osteogenico (con l?impiego di 10-100 ?M di zoleandronato nella composizione preferita). Differentemente dall?EP1989285, riferito sopra, il dispositivo qui riferito considera l?impiego di idrossiapatite e bifosfonati per l?induzione del differenziamento osteogenico.

In un?ulteriore realizzazione del processo di produzione della presente invenzione i sopra menzionati scaffolds tridimensionali bioattivi sono funzionalizzati utilizzando un cocktail di funzionalizzazione composto di: IMDM ad alto glucosio, 1% di FBS, 0,1-10 ?M di desametasone (con la composizione preferita pari a 0,1 ?M), 50-200 ?g/ml di acido ascorbico (con la composizione preferita pari a 50 ?g/ml), 100 ?g/ml di sodio piruvato, 40 ?g/ml di prolina, 100-700 ng/ml di proteina morfogenica dell?osso-6 (con la composizione preferita pari a 500 ng/ml), 0,1-10 ng/ml di TGF-?3 (con la composizione preferita pari a 10 ng/ml) (oppure 10 ng/ml di TGF-?1), 10-150 mg/ml di ITS (con la composizione preferita pari a 50 mg/ml) premix (6,25 ?g/ml di insulina, 6,25 ?g/ml di transferrina, 6,25 ng/ml di acido selenioso, 1,25 mg/ml di albumina da siero bovino e 5,35 mg/ml di acido linoleico), 1-20% di acido ialuronico (con la composizione preferita pari al 10%), 1-10% di condroitina solfato (con la composizione preferita pari al 5%), 0,25-12,5 mg/ml di bevacizumab (con la composizione preferita pari a 5 mg/ml) per indurre il differenziamento condrogenico. A differenza di US2003026786, riferito sopra, la presente invenzione fa riferimento all?impiego di differenti composti bioattivi (in particolare 1-20% di acido ialuronico (con la composizione preferita pari al 10%), 1-10% di condroitina solfato (con la composizione preferita pari al 5%), 0,25-12,5 mg/ml di bevacizumab (con la composizione preferita pari a 5 mg/ml). In ancora un'ulteriore realizzazione del processo di produzione della presente invenzione i sopra menzionati scaffolds tridimensionali bioattivi sono funzionalizzati utilizzando un cocktail di funzionalizzazione composto di: 1-15% di FBS (con la composizione preferita pari al 10%), 1-20% di siero di coniglio (con la composizione preferita pari al 5%), 0,1-10 ?M di desametasone (con la composizione preferita pari a 1 ?M), 50-300 mM di indometacina (con la composizione preferita pari a 200 mM), 1-20 ?M di insulina (con la composizione preferita pari a 10 ?M), tiazolidinedione, agonista dei recettori attivati dalla proliferazione dei perossisomi (PPAR) (preferibilmente 1-100 ?M di troglitazone), 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina per indurre il differenziamento adipogenico. A differenza di AU2003234740B2, riferito sopra, il dispositivo qui riferito considera l?aggiunta di differenti composti, in particolare tiazolidinedioni, per indurre i recettori attivati dalla proliferazione perossisomiale (PPAR) e stimolare le vie differenziative mediate dalla leptina. In ancora un?ulteriore realizzazione del processo di produzione della presente invenzione i sopra menzionati scaffolds tridimensionali bioattivi sono funzionalizzati utilizzando un cocktail di funzionalizzazione composto di: 20-200 UI/ml di eparina, 50 ng/ml di VEGF, 0,01-100 ?g/ml di eritropoietina, 1-50 ng/ml di estratto cerebrale bovino, 1-100 ?M di un fibrato (specialmente clofibrato) per indurre il differenziamento endoteliale. A differenza dell?EP2188370, riferito sopra, la presente invenzione fa riferimento all?impiego di differenti composti, in particolare di un fibrato (preferibilmente clofibrato) per stimolare le vie differenziative mediate dall?ossido nitrico attraverso la Proteina-Kinasi-C.

In ancora un?ulteriore realizzazione del processo di produzione della presente invenzione i sopra menzionati scaffolds tridimensionali bioattivi sono funzionalizzati utilizzando un cocktail di funzionalizzazione composto di: 1-5 ng/ml di TGF-?1 (con la composizione preferita pari a 2,5 ng/ml), 1-5 ng/ml di PDGFBB (con la composizione preferita pari a 5 ng/ml), 1-3 ?mol/l di 5-azacitidina (con la composizione preferita pari a 3 ?mol/l) per indurre il differenziamento miogenico.

In ancora un'ulteriore realizzazione della presente invenzione si fa riferimento a supporti polimerici tridimensionali allocati all?interno di almeno un contenitore plastico compartimentalizzato per la valutazione, simultanea ma isolata, delle risposte biologiche delle cellule nei confronti di differenti composizioni chimiche, della multi potenzialit? delle cellule candidate e del grado di staminalit?, cio? la capacit? di differenziare verso differenti linee cellulari. A differenza del US2006003311, riferito sopra, il dispositivo della presente invenzione contiene fattori in grado di indurre nelle cellule la risposta biologica oggetto dell?analisi e non richiede l?aggiunta di composti farmacologici nel mezzo di coltura, dato che le caratteristiche intrinseche dei supporti funzionalizzati sono in grado di indurre, da sole, le volute risposte biologiche. Inoltre, il dispositivo biomedico qui rivelato non richiede la trasfezione delle cellule con geni reporter.

La presente invenzione ? stata descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo alcune forme di realizzazione preferite, ma ? da intendersi che eventuali variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti del settore senza per questo esulare dal relativo ambito di protezione, cos? come definito dalle seguenti rivendicazioni dipendenti.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo biomedico caratterizzato da supporti tridimensionali polimerici biologicamente attivi in grado di valutare simultaneamente la staminalit? di una coltura oppure di una co-cultura cellulare e valutare la loro capacit? differenziativa verso il fenotipo osteogenico, condrogenico, adipogenico, endoteliale e muscolare e la risposta biologica a diversi tipi di composti chimici; detti supporti comprendendo almeno un composto selezionato tra un acido polilattico (PLA), un acido poliglicolico (PGA), un policaprolattone (PCL), un polistirene (PS), un collagene, un chitosano, un alginato, un acido ialuronico oppure una combinazione dei suddetti.
2. Dispositivo biomedico secondo la rivendicazione 1, in cui detti supporti sono fabbricati attraverso almeno una delle seguenti tecniche di formatura: impiego di porogeni, oppure preferibilmente liofilizzazione, o pi? preferibilmente stereolitografia, in cui detti supporti comprendono una struttura porosa avente pori compresi nell?intervallo tra 1 e 500 ?m ed elementi strutturali con un diametro medio compreso nell?intervallo tra 1 e 500 ?m, oppure molto pi? preferibilmente elettrofilatura comprendendo fibre non tessute organizzate casualmente con un diametro medio compreso tra 30 nm e 500 ?m.
3. Dispositivo biomedico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dall?essere allocato all?interno di almeno un contenitore plastico compartimentalizzato per le valutazioni multiple ma separate della risposta biologica.
4. Dispositivo biomedico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detti supporti sono funzionalizzati con una combinazione di agenti bioattivi in grado di elicitare una risposta biologica ed in cui predetta funzionalizzazione ? ottenuta per mezzo di almeno una delle seguenti tecniche, comprendenti il legame chimico tra gruppi amminici primari, carbossilici e tiolici sulla superficie di detti polimeri e gruppi amminici primari, carbossilici, tiolici appartenenti a dette molecole bioattive in presenza o in assenza di catalizzatori; la miscelazione normotermica in una soluzione del polimero; l?assorbimento di dette molecole per mezzo di microspruzzatura o elettrospruzzatura con o senza successivo legame chimico.
5. Dispositivo biomedico secondo la rivendicazione 4, in cui la predetta combinazione di agenti bioattivi di funzionalizzazione in grado di indurre il differenziamento osteogenico ? composta di 1-20% di FBS, 3,5-10 mM di bglicerofosfato, 0,1-10 ?M di desametasone, 50 ?M di ascorbat-2-fosfato, 1-25% di idrossiapatite e bifosfonati azotati e non azotati.
6. Dispositivo biomedico secondo la rivendicazione 4, in cui la predetta combinazione di agenti bioattivi di funzionalizzazione in grado di indurre il differenziamento condrogenico ? composta di IMDM ad alto glucosio, 1% di FBS, 0,1-10 ?M di desametasone, 50-200 ?g/ml di acido ascorbico, 100 ?g/ml di sodio piruvato, 40 ?g/ml di prolina, 100-700 ng/ml di proteina morfogenica dell?osso-6, 0,1-10 ng/ml di TGF-?3 (o 10 ng/ml di TGF-?1), 10-150 mg/ml di ITS premix (6,25 ?g/ml di insulina, 6,25 ?g/ml di transferrina, 6,25 ng/ml di acido selenioso, 1,25 mg/ml di albumina da siero bovino e 5,35 mg/ml di acido linoleico), 1-20% di acido ialuronico, 1-10% di condroitina solfato e 0,25-12,5 mg/ml di bevacizumab.
7. Dispositivo biomedico secondo la rivendicazione 4, in cui la predetta combinazione di agenti bioattivi di funzionalizzazione in grado di indurre il differenziamento adipogenico ? composta di 1-15% di FBS, 1-20% di siero di coniglio, 0,1-10 ?M di desametasone, 50-300 mM di indometacina, 1-20 ?M di insulina, tiazolidinedione, agonista dei recettori attivati dalla proliferazione dei perossisomi (PPAR) (preferibilmente 1-100 ?M di troglitazone) e 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina.
8. Dispositivo biomedico secondo la rivendicazione 4, in cui la predetta combinazione di agenti bioattivi di funzionalizzazione in grado di indurre il differenziamento endoteliale ? composta di 20-200 UI/ml di eparina, 50 ng/ml di VEGF, 0,01-100 ?g/ml di eritropoietina, 1-50 ng/ml di estratto cerebrale bovino e 1-100 ?M di fibrato (specialmente clofibrato).
9. Dispositivo biomedico secondo la rivendicazione 4, in cui la predetta combinazione di agenti bioattivi di funzionalizzazione in grado di indurre il differenziamento miogenico ? composta di 1-5 ng/ml di TGF-?1 (con la composizione preferita pari a 2,5 ng/ml), 1-5 ng/ml di PDGFBB (con la composizione preferita pari a 5 ng/ml) e 1-3 ?mol/l di 5-azacitidina (con la composizione preferita pari a 3 ?mol/l).
10. Dispositivo biomedico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, utilizzato in combinazione con biopsie tissutali provenienti da organo contenente potenziali cellule staminali o escissioni tumorali intraoperatorie, per valutare le capacit? differenziative di potenziali cellule staminali oppure la resistenza di cellule tumorali a composti farmacologici.
11. Dispositivo biomedico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato da un sistema a rilascio controllato di farmaco.