ITRM20100536A1 - Aptamero inibitore di egfr per uso in terapia e diagnosi - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Parte formante una domanda di brevetto dell?invenzione industriale dal titolo:
?APTAMERO INIBITORE DELL?EGFR DA UTILIZZARE COME TERAPIA E DIAGNOSI ?
Campo dell?invenzione
L?invenzione ? relativa all?identificazione di un aptamero e del suo bersaglio l?EGFR. ? stato dimostrato che l?aptamero ? un potente inibitore del recettore di EGFR, quindi ? particolarmente idoneo per uso nel trattamento e/o nella diagnosi di un tumore che esprime EGFR o un disordine indotto da EGFR.
Stato della tecnica
? stato scoperto che nel cancro un numero crescente di proteine coinvolte nella crescita cellulare, ivi inclusi fattori di crescita, recettori, mediatori intracellulari e fattori di trascrizione sono alterati tramite una serie di meccanismi di attivazione. La disregolazione della famiglia dei recettori del fattore di crescita epidermico umano (EGFR) mediante sovraespressione o attivazione costitutiva favorisce i processi tumorali, ivi inclusi l?angiogenesi e la metastasi, ed ? associata a scarsa prognosi in molti tumori maligni umani (Yarden Y, 2001; Mitsudomi T e Yatabe Y, 2010). La famiglia EGFR/ErbB di recettore tirosina chinasi (RTK) comprende i quattro membri: EGFR (noto anche come HER1 o ErbB1), ErbB2 (Neu, HER2), ErbB3 (HER3) e ErbB4 (HER4), che sono glicoproteine transmembrana di tipo I, contenenti una regione di legame del ligando extracellulare, una singola regione transmembrana (MSD) e un dominio intracellulare contenente tirosinachinasi. Diversamente dal resto della famiglia ErbB, ErbB3 non possiede attivit? tirosina chinasi ed ErbB2 non ha un ligando noto. EGF e il fattore di crescita trasformante ? si legano direttamente solo a EGFR, mentre le neureguline (note anche come ereguline) sono specifiche per ErbB3 e ErbB4 (Hynes NE e Lane HA, 2005). L?attivazione di EGFR indotta da ligando mediante la dimerizzazione media l?attivazione di vari percorsi di segnalazione a valle, vale a dire la proteina chinasi mitogeno-attivata (MAPK), la fosfatidilinositol 3chinasi (PI3K)/AKT, e i trasduttori di segnali e attivatori di trascrizione 3 (STAT 3), che hanno ruoli fondamentali negli eventi cellulari quali la proliferazione e la sopravvivenza (Schlessinger, 2004; Lurje e Lenz, 2009).
Due classi principali di inibitori di EGFR sono in uso clinico: gli anticorpi monoclonali anti-ErbB, che si legano al dominio extracellulare di EGFR, sulla superficie delle cellule tumorali, e gli inibitori della tirosina-chinasi a piccole molecole (TKI) che competono con l?ATP per il legame con il dominio della tirosina-chinasi del recettore (Li et al., 2005; Spicer J e Harper P, 2005; de La Motte Rouge et al., 2007; Card?-Vilaa et al., 2010). Il trattamento delle cellule tumorali con questi agenti influisce su molti percorsi intracellulari che sono essenziali per lo sviluppo e la progressione del cancro. Tuttavia, nonostante il successo clinico, la gran parte dei pazienti che ricevono questi trattamenti mostrano resistenza primaria o acquisita agli inibitori (Kruser TJ e Wheeler DL, 2010). Di conseguenza, vengono studiate nuove strategie per superare la resistenza a TKI e vi ? l?urgente necessit? di progettare nuovi farmaci che abbiamo come bersaglio EGFR, per una terapia tumorale pi? specifica e selettiva.
Una nuova gamma di molecole terapeutiche a bersaglio contro RTKs ? costituita da aptameri a base di acidi nucleici. Essi sono ligandi a RNA o DNA brevi a singolo filamento che si legano con elevate selettivit? e sensibilit?, grazie alla loro specifica forma tridimensionale, alle loro molecole bersaglio. Gli aptameri hanno un numero di vantaggi importante rispetto alle proteine come reagenti terapeutici (Cerchia et al., 2002; Cerchia e de Franciscis 2010). Infatti, sono sintetizzati del tutto chimicamente mediante un approccio in vitro che si basa sull?evoluzione chiamato SELEX (Systematic Evolution di Ligands by EXponential enrichment), evitando di conseguenza l?uso di cellule animali e assicurando un processo di produzione rapido con una elevata fedelt? del lotto di produzione. Inoltre, gli aptameri possono essere prontamente modificati dal punto di vista chimico mediante l?aggiunta di glicole polietilenico e altre parti di molecole per potenziare la loro biodisponibilit? e le farmacocinetiche. Gli aptameri non sono immunogenici e, inoltre, RNA fatti di pirimidine modificate in posizione 2?, che li rende resistenti alle nucleasi extracellulari, sono ancora meno immunogenici dell?RNA naturale.
Li et al hanno realizzato una selezione in vitro contro il dominio extracellulare purificato di EGFR. Il risultante aptamero a RNA ? stato poi utilizzato per rilasciare nanoparticelle d?oro nel compartimento intracellulare delle cellule del cancro, offrendo uno studio pilota per ulteriori strategie di rilascio con questo aptamero (Li et al., 2010). Li et al non hanno associato alcuna funzionalit? all?aptamero. Nella presente invenzione ? stato identificato un aptamero a RNA neutralizzante che inibisce specificatamente l?EGFR.
Breve Descrizione dell?invenzione
La presente invenzione ? relativa ad un aptamero ad acido nucleico, chiamato CL442-81, costituito da 39 nucleotidi che si lega con elevata affinit? e specificit? e inibisce l?EGFR e al suo uso per scopi diagnostici e terapeutici, ivi inclusi il rilascio di farmaci.
Risulta perci? oggetto dell?invenzione un aptamero nucleotide avente essenzialmente la sequenza: 5?- GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3? per uso come trattamento e/o prevenzione o per la diagnosi di un disordine indotto da EGFR. Preferibilmente, l?aptamero nucleotide ? resistente alla nucleasi. Ancor pi? preferibilmente l?aptamero nucleotide ha almeno uno o tutti i residui di pirimidina che sono modificati in 2?-fluoropirimidine. Nella presente invenzione, i residui di pirimidina possono anche essere modificati come 2?-O-alchil nucleotidi, o cap all?estremit? 3? e acidi nucleici bloccati o come modifiche LNA per potenziare significativamente la stabilit? dell?RNA. Preferibilmente il disordine indotto da EGFR ? causato da, associato a, e/o accompagnato da iperfunzione di EGFR.
Ancor pi? preferibilmente, il disordine indotto da EGFR ? selezionato tra i disordini iperproliferativi.
In una forma di realizzazione preferita, il disordine iperproliferativo indotto da EGFR ? selezionato dal gruppo costituito da cancro o metastasi tumorale primaria.
Ancor pi? preferibilmente, il cancro o metastasi tumorale primaria ? selezionato dal gruppo di: cancro gastrointestinale, cancro della prostata, cancro dell?ovaio, cancro del seno, cancro della testa e del collo, cancro del polmone, cancro del polmone non a piccole cellule, cancro del sistema nervoso, cancro del rene, cancro della retina, cancro della pelle, cancro del fegato, cancro del pancreas, cancro uro-genitale e cancro della vescica.
Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? una composizione farmaceutica comprendente l?aptamero nucleotide come definito sopra per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di un disordine indotto da EGFR.
Preferibilmente la composizione farmaceutica comprende ulteriormente un altro agente terapeutico.
Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? un metodo per la diagnosi di un disordine indotto da EGFR in un paziente da cui ? stato ottenuto un campione comprendente:
-incubazione del campione con l?aptamero nucleotide come definito sopra; -misurazione del legame dell?aptamero nucleotide al campione.
Preferibilmente, il campione ? un campione di sangue, siero o saliva, una biopsia, urina o fluido cerebrospinale.
Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? un kit per la diagnosi di un disordine indotto da EGFR in un paziente da cui ? stato ottenuto un campione comprendente l?aptamero nucleotide della presente invenzione.
L?invenzione sar? ora illustrata mediante esempi non limitativi in riferimento alle seguenti figure.
Figura 1. Aptamero CL4 42-81. A) Sequenza nucleotidica dell?aptamero CL4 42-81. Tutte le pirimidine della sequenza sono 2?-fluoropirimidine (2?F-Py), evidenziate con una sottolineatura. B) Struttura secondaria predetta per aptamero CL442-81 usando il software MFOLD versione 3.1 (disponibile da http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/). Figura 2. Legame dell?aptamero CL4 42-81 dopo silenziamento/espressione del gene di EGFR A) Legame dell?aptamero CL4 42-81 su cellule NSCLC A549 transfettate (o meno) con uno specifico shRNA di EGFR. Un shRNA non associato (shRNActrl) che non ha come bersaglio EGFR ? stato usato come controllo. A1) Lisati di cellule da cellule A549 transfettate con uno specifico shRNA di EGFR o shRNA di controllo sono state sottoposte a immunoblotting con anticorpi anti-EGFR (EGFR). I filtri sono stati strippati e sondati nuovamente con anticorpi anti-?tubulina per confermare l?uguale carico. I valori sotto i blot indicano i livelli di segnale relativi al controllo arbitrariamente fissato a 1 (marcato con un asterisco). L?intensit? delle bande ? stata calcolata utilizzando il Programma di Immagine NIH su almeno due differenti esposizioni per assicurare la linearit? di ogni acquisizione. B) Legame dell?aptamero CL4 42-81 su cellule NIH3T3 o NIH3T3 stabilmente transfettate con EGFR umano (NIH/EGFR). B1) I lisati cellulari da cellule NIH3T3 o cellule NIH/EGFR sono stati sottoposti a immunoblotting con anticorpi anti-EGFR. Per confermare l?eguale carico, i filtri sono stati sondati nuovamente con anticorpi anti-?tubulina. In A e B) il legame ? stato realizzato incubando l?aptamero, marcato con [<32>P], sulle cellule nella stessa condizione a 100 nM. I risultati sono espressi relativamente al legame di fondo rivelato con un aptamero scrambled utilizzato come controllo negativo.
Figura 3. Legame dell?aptamero CL4 42-81 su differenti cellule di cancro. A e B) I lisati cellulari dalle linee cellulari indicate sono stati sottoposti a immunoblotting con anticorpi anti-EGFR (EGFR), anti-ErbB2 (ErbB2), anti-ErbB3 (ErbB3), anti-ErbB4 (ErbB4). I filtri sono stati strippati e ri-sondati con anticorpi anti-?tubulina per confermare il carico uguale. Se indicato, sono stati riportati due differenti tempi di esposizione (bassa esposizione, low ex. e alta esposizione, high ex). A1 e B1) Legame dell?aptamero CL442-81 sulle linee cellulari indicate ? stato realizzato incubando aptamero marcato con [<32>P] sulle cellule nella stessa condizione a 100 nM. I risultati sono espressi relativamente al legame di fondo rivelato con l?aptamero scrambled utilizzato come controllo negativo. Figura 4. Legame sul recettore di EGFR purificato. L?aptamero CL4 42-81 ? stato incubato con il dominio extracellulare solubile di EGFR (EC-EGFR) o ErbB3 (EC-EGFR) con o senza trattamento DTT come riportato in Materiali e Metodi. I risultati sono espressi relativamente al legame di fondo rivelato con la sequenza scrambled.
Figura 5. L?aptamero CL4 42-81 inibisce l?attivit? di EGFR. A) Le cellule sono state private di siero, lasciate non trattate oppure trattate per 3 ore con 200nM di CL4, CL442-81 corto o l?aptamero scrambled e poi stimolate con EGF da solo o in presenza degli aptameri indicati. I lisati cellulari sono stati sottoposti a immunoblotting con anti-(fosfo)-EGFR (pEGFR), anti-EGFR (EGFR) come indicato. I filtri sono stati strippati e sondati nuovamente con anticorpi anti-?tubulina (Tub) per confermare il carico uguale. I valori sotto ai blot indicano i livelli di segnali relativi ai controlli stimolati con EGF arbitrariamente fissati a 1 (marcato con asterisco). Le intensit? di bande sono state calcolate utilizzando il Programma di Immagini NIH su almeno due differenti esposizioni, per assicurare la linearit? di ogni acquisizione. B) Effetto sulla vitalit? cellulare. Le cellule NSCLC A549 e del carcinoma epidermoide A431 sono state lasciate non trattate o trattate per 24 ore con CL4 42-81 o con l?aptamero scrambled come controllo negativo a concentrazione finale 200nM. La vitalit? cellulare ? stata analizzata come riportato in Materiali e Metodi mediante saggio MTT. I risultati sono espressi relativamente a cellule non trattate arbitrariamente fissate al 100% di vitalit? e sono rappresentativi di almeno tre differenti esperimenti. C) Le cellule A549 sono state lasciate non trattate o trattate con CL4 42-81 o con l?aptamero scrambled come controllo negativo per 24 ore o 48 ore. L?incorporazione di PI a seguito dell?analisi FACS ? stata utilizzata per determinare la percentuale di cellule apoptotiche. In B e C) ?C? indica cellule non trattate.
Figura 6. Per determinare l?attivazione di caspasi-3, le cellule A549 sono state lasciate non trattate o trattate con CL442-81 o con l?aptamero scrambled come controllo negativo per 6 ore. L?attivit? di caspasi-3 o caspasi-8 ? stata valutata mediante misurazione di idrolisi del loro specifico substrato fluorogenico come riportato in Materiali e Metodi. L?attivazione ? stata espressa relativamente a cellule non trattate, (indicate come ?C?) arbitrariamente fissate a 1.
Figura 7. L?aptamero CL4 42-81 inibisce la crescita tumorale. L?aptamero CL4 42-81 o l?aptamero scrambled sono stati somministrati intratumoralmente in un modello di topo xenograft che porta le cellule del carcinoma epidermoide A431 che sovraesprimono EGFR. ?C? ? il controllo, gruppo di topi non trattati. Le curve di crescita sono messe in grafico come volume del tumore in media s.e.m.
Le modifiche con 2?-fluoro (amino) pirimidina, 2?-O-alchil nucleotidi, cap all?estremit? 3? e acidi nucleici locked, modifiche con LNA, sono le modifiche che potenziano significativamente la stabilit? dell?RNA e possono essere utilizzate nella presente invenzione.
L?aptamero CL4 42-81 e una sequenza scrambled utilizzata come controllo negativo sono stati acquistati da Sigma (Sigma, St. Louis, MO).
Cellule e transfezione con shRNA
Le cellule A549 NSCLC di uomo, A431 di carcinoma epidermoide, U87MG e T98G di glioma, SKBr3, MCF7 e T47D del seno e NIH3T3 di fibroblasti di topo (tutti da American Type Culture Collection, Manassas, VA) sono state fatte crescere in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) supplementato con siero di feto di bovino al 10% (FBS) e L-glutammina 2 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA). Le cellule NIH3T3 transfettate stabilmente con EGFR di uomo (NIH/EGFR) sono state fatte crescere in DMEM con 10% FBS e L-glutammina 2 mM supplementato con 50 ?g/ml di Gentamicina.
Transfezione con shRNA
Il silenziamento del gene EGFR in cellule NSCLC A549 ? stato stabilito mediante transfezione di breve RNA a forcina ad elevata prestazione (shRNA) il cui bersaglio specifico ? EGFR (da Expression Arrest<TM >Human shRNA Collection, Open Biosystems, Huntsville, AL). Le cellule (3,5x10<5 >cellule per piastra da 6 cm) sono state fatte crescere e ricoperte con le miscele di transfezione contenenti lo shRNA (6?g) contro EGFR (indicato con shRNAEGFR) e Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) in mezzo a base di siero ridotto Opti-MEM I (Invitrogen). Dopo 5 ore di incubazione, il mezzo di coltura completo ? stato aggiunto alle cellule e l?incubazione ? stata prolungata fino a 72 ore. I controlli sono stati realizzati utilizzando un shRNA non associato (shRNActrl) che non porta alla degradazione specifica dell?mRNA di EGFR. Per i saggi di legame le cellule transfettate sono state piastrate in piastre a 24 pozzetti dopo 24 ore dalla transfezione.
Saggi di legame
Gli esperimenti di legame sono stati realizzati con RNA 5?-[<32>P]-marcato. Per la marcatura di RNA 2?-F-Py sono stati defosforilati all?estremit? 5? utilizzando fosfatasi alcalina batterica (Invitrogen, Carlsbad, CA) prima dell?estremit? 5? marcata con [<32>P] utilizzando T4 chinasi (Invitrogen) e GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden) secondo le istruzioni del fornitore.
Per gli esperimenti di legame su cellule, 3,5x10<4 >cellule sono state piastrate in piastre a 24 pozzetti in triplice copia e sono state incubate con l?aptamero CL4 42-81, la sequenza scrambled utilizzata come controllo negativo a concentrazione 100nM in 200 ?l di DMEM privo di siero per 20 min a temperatura ambiente in presenza di 100 ?g/ml di poli-inosina come competitore non specifico (Sigma, St. Louis, MO). Dopo cinque lavaggi con 500 ?l di DMEM, le sequenze di legame sono state recuperate in 300 ?l di SDS 1%, e la quantit? di radioattivit? registrata ? stata contata.
La capacit? degli aptameri di legarsi a EGFR o al dominio extracellulare solubile ErbB3 (EC-EGFR e EC-ErbB3) ? stata studiata mediante legame al filtro mettendo in grafico la frazione di RNA legata al filtro di nitrocellulosa in funzione della concentrazione di proteina, utilizzando la seguente equazione:
in cui Bmax ? la quantit? massima estrapolata di RNA:complesso proteina che sar? legato.
1nM di aptameri radiomarcati (aptamero CL4 42-81 o la sequenza scrambled) sono stati incubati con 1, 3.2, 10, 32, 100, 320 e 1000nM di EC-EGFR e EC-ErbB3 (tutti da R&D Systems, Minneapolis, MN) per 15 min a 37? in salina con tampone fosfato (PBS) supplementata con 0,01% di albumina di siero bovino.
Allo scopo di testare il legame per proteine dimeriche e monomeriche, 1nM di aptameri radiomarcati (CL4 42-81 o scrambled) sono stati incubati con 20nM di EC-EGFR e EC-ErbB3 senza o con 5mM DTT.
Dopo incubazione, la miscela aptamero-proteina ? stata passata attraverso un filtro a membrana di nitrocellulosa (Millipore Co., Bedford, MA) e il filtro ? stato contato. In tutti i saggi di legame i valori di fondo ottenuti con l?RNA scrambled sono stati sottratti dai valori ottenuti con l?aptamero CL442-81.
Analisi Immunoblot
Per valutare gli effetti degli aptameri sull?attivit? EGFR, cellule A549 (1,5 x10<5 >cellule per piastra da 3,5 cm) sono state private di siero per tutta la notte, pretrattate con 200nM di aptamero CL4 42-81 o aptamero scrambled utilizzato come controllo negativo per 3 ore e poi stimolate per 30 min con 50ng/ml EGF (R&D Systems, Minneapolis, MN) da sole o in presenza di ogni aptamero. Gli aptameri sono stati sottoposti ad una breve fase di denaturazione-rinaturazione (85?C per 5 min, raffreddati su ghiaccio per 2 min, e riscaldati fino a 37?C) prima di ogni trattamento.
Per preparare gli estratti cellulari, le cellule sono state lavate due volte in PBS raffreddato con ghiaccio, e lisate in tampone A (50 mM di tampone Tris-HCl pH 8,0 contenenti 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mg/ml aprotinina, 1 mg/ml pepstatina, 2 mg/ml leupeptina, 1 mM Na3VO4). La concentrazione di proteina ? stata determinata mediante saggio di Bradford utilizzando albumina di siero bovino come standard. I lisati cellulari sono stati sottoposti a SDS-PAGE. I gel sono stati sottoposti ad electroblotting in membrane di polivinilidene difluoruro (Millipore Co., Bedford, MA), e i filtri sono stati saggiati con gli anticorpi primari indicati: anti-EGFR e anti-fosfo-EGFR (Tyr1062), anti-fosfo-44/42 MAP chinasi (E10) (anche indicati come p-Erk), anti-fosfo-Akt, anti-Akt e anti-fosfo-STAT3 (Tyr705), anti- ErbB2 (tutti da Cell Signaling, Beverly, MA, United States); anti-Erk1, anti-EGFR, anti-ErbB3, anti-ErbB4 (C-16) (Santa Cruz Biotechnology, California, Stati Uniti); anti-?tubulina (DM 1A) (Sigma, St. Louis, MO).
Le proteine sono state visualizzate con anticorpi secondari coniugati alla perossidasi utilizzando il sistema di chemiluminescenza potenziato (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Svezia). Dove indicato, i filtri sono stati strippati in 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 con 100 mM 2-mercaptoetanolo e 2% SDS per 30 min a 54?C, e saggiati nuovamente.
Saggio di vitalit? cellulare
La vitalit? cellulare ? stata valutata con il saggio CellTiter 96<? >AQueous One Solution Cell Proliferation (Promega, Madison,WI) secondo le istruzioni del fornitore. Le cellule (4x10<3 >cellule/pozzetto) sono state piastrate in piastre a 96 pozzetti in triplice copia e sono state trattate per 24 ore con CL442-81 denaturato con calore o con l?aptamero scrambled a una concentrazione 3 ?M. Sono state determinate le concentrazioni di RNA per assicurare la presenza continua di una concentrazione di almeno 200 nM, che prende in considerazione la semivita di 6 ore dell?aptamero in 10% di siero. La densit? ottica (OD) ? stata misurata utilizzando un contatore Multilabel (Bio-Rad) ad una lunghezza d?onda di 490 nm e la vitalit? cellulare ? stata calcolata mediante la seguente formula: Vitalit? cellulare (%) = (OD cellule trattate /OD cellule controllo)?100%.
Analisi FACS
Per il saggio di apoptosi, l?analisi del contenuto di DNA ? stata realizzata mediante colorazione con ioduro di propidio (PI) e analisi delle cellule mediante citometria a flusso (FACS).
Le cellule A549 sono state piastrate in piastre a 96 pozzetti (5,0x10<3 >cellule/ogni pozzetto) e trattate con CL442-81 o l?aptamero scrambled ad una concentrazione 3 ?M per 24 ore e 48 ore rinnovando il trattamento ogni 24 ore. Le cellule sono state incubate con 2 ?g/ml ioduro di propidio (PI, Sigma, St. Louis, MO) per 30 min a 4?C e recuperate. La proporzione relativa di cellule con contenuto di DNA indicativo di apoptosi (ipoploide) ? stata determinata mediante FACS.
Saggio di attivit? della caspasi
Le cellule A549 sono state trattate con CL4 42-81 200nM o l?aptamero scrambled per 6 ore. Per determinare l?attivit? caspasi, i lisati cellulari (50?g) sono stati incubati a 37?C per 1 ora con 50 ?M di uno specifico substrato fluorometrico (Ac-DEVD-AFC per caspasi-3, Ac-IETD-AFC per caspasi-8, entrambi da Alexis Bichemicals, San Diego, CA). Il clivaggio del substrato fluorometrico ? stato determinato utilizzando un Fluorometro, con eccitazione a 400 nm ed emissione a lunghezza d?onda 505 nm.
Esperimenti in vivo
Topi nudi atimici (nu/nu) sono stati mantenuti in un ambiente sterile secondo le linee guida per la cura degli animali. I topi sono stati inoculati con 3 10<6 >(in 100 l) cellule A431 propagate in vitro iniettate sottocute in ogni fianco. Approssimativamente 24 tumori non necrotici per ogni tipo di tumore, di circa 1 cm di diametro, sono stati casualmente divisi in tre gruppi di otto topi per gruppo di trattamento come segue: gruppo 1, nessun trattamento; gruppo 2, trattati con RNA scrambled come controllo negativo (200 pmol/iniezione); gruppo 3, trattati con CL442-81 (200 pmol/iniezione). I composti sono stati iniettati nel tumore in volumi di 100 ?l tre volte alla settimana per due settimane. Il giorno 0 indica il primo giorno di iniezione. Gli aptameri possono anche essere somministrati per via sistemica, in particolare se ottimizzati mediante aggiunta di glicole polietilenico (PEG). I volumi delle iniezioni sono abbastanza piccoli da evitare che i composti siano forzati all?interno delle cellule a causa di una iniezione con elevata pressione non specifica. I tumori sono stati misurati ogni 3 giorni con calibri in tre dimensioni. La seguente formula ? stata utilizzata per calcolare il volume del tumore: VT = (WXLXH)X0,5236 (W, la dimensione pi? corta; L, la dimensione pi? lunga; H, la dimensione intermedia). Le curve di crescita sono messe in grafico come volume di tumore medio s.e.m. L?analisi statistica dei dati della dimensione del tumore ? stata effettata utilizzando una ANOVA ad una via. Un valore P di 0.05 o meno ? stato considerato indicativo di una differenza significativa.
RISULTATI
Identificazione di un RNA-Aptamero che interagisce specificatamente con il dominio extracellulare dell?EGFR
L?aptamero CL4 42-81 ? un aptamero RNA con 2?-fluoropirimidina (2?F-Py), resistente alla nucleasi costituito da 39 nucleotidi (Fig. 1). ? stato ottenuto mediante riduzione della lunghezza di un aptamero (chiamato CL4) che gli autori hanno precedentemente generato mediante un approccio cell-SELEX differenziale su cellule A549 di carcinoma al polmone non a piccole cellule resistente alla chemio (NSCLC). La strategia di selezione adottata ? stata pi? o meno la stessa che ha permesso agli autori di selezionare gli aptameri ad RNA cos? specifici e ligandi di affinit? per linee cellulari di glioma altamente tumorale (Cerchia et al, 2009 PLoS One; 4(11):e7971, Domanda di Brevetto Internazionale WO 2010/023327).
L?aptamero CL4 42-81 ? stato ottenuto sulla base delle strutture secondarie predette e la presenza di siti di legame potenziale nell?intera sequenza dell?aptamero CL4 (92 nt). Gli autori hanno trovato che rimuovendo 42 nucleotidi dall?estremit? 5? e 11 nucleotidi dall?estremit? 3? della sequenza lunga si conservava una struttura secondaria di 39 nucleotidi di lunghezza (vedere Fig. 1). Questa minima variante (qui chiamata CL442-81) ? sufficiente per legarsi alle cellule A549 bersaglio mostrando una Kd di 38 nM e distinguerle dalle cellule H460 (vedere Fig.3). Il valore Kd per la sequenza CL4 ? 46 nM. Gli autori hanno identificato il recettore di EGFR come bersaglio dell?aptamero CL442-81. La capacit? dell?aptamero CL4 42-81 di legarsi alle cellule A549 ? significativamente ridotta al diminuire dell?espressione di EGFR mediante un shRNA specifico (Figura 2A). Viceversa, CL4 42-81 si lega alle cellule NIH3T3 stabilmente transfettate con EGFR umano (NIH/EGFR) mentre non si lega alle cellule parentali NIH3T3 (Fig.2B).
Di conseguenza, l?analisi del legame con l?aptamero CL442-81 su NSCLC e linee cellulari di cancro non correlate mostra che il legame dell?aptamero correla con una elevata espressione di EGFR nelle cellule analizzate (Figura 3).
Infatti, tra gli NSCLC testati, CL442-81 si lega a cellule A549 positive a EGFR e Calu1, mentre non si lega a cellule H460 che esprimono un basso livello di recettore EGFR (Fig. 3A1). Inoltre, CL4 42-81 non si lega a U87MG di glioma umano, MCF7 del seno e T47D che sono tutte caratterizzate da una espressione molto bassa di EGFR (Fig. 3B, 3B1), mentre si lega a cellule T98G di glioma, SKBR3 del seno e A431 di carcinoma epidermoide che esprimono un elevato livello di EGFR (Fig.3B, 3B1).
In accordo con relazioni precedenti (Amann et al., 2005), l?espressione di ErbB2 e ErbB4 ? stata non rivelabile in tutte queste linee cellulari, mentre ErbB3 ? stato individuato ad un livello molto basso in cellule A549 e Calu1 (Fig. 3A). Non ? stata trovata alcuna correlazione tra il legame dell?aptamero CL4 42-81 e il livello di espressione di ErbB2, ErbB3 o ErbB4 nelle linee cellulari analizzate (vedere Fig.3A).
L?aptamero CL4 42-81 riconosce specificatamente l?EGFR espresso sulla superficie delle cellule di cancro cos? come il dominio extracellulare purificato solubile del recettore (Figura 4). Infatti una analisi di legame su filtro realizzata con il dominio extracellulare solubile di EGFR e ErbB3 umani come bersaglio (indicati con EC-EGFR e EC-ErbB3, rispettivamente) ha confermato una forte affinit? di CL4 42-81 per EC-EGFR (Kd di 10 nM). Per quando riguarda il legame al dominio extracellulare di ErbB3 (proteina EC-ErbB3), con la concentrazione di proteina utilizzata, non ? stato possibile calcolare alcun valore di Kd, il che indica che l?aptamero non si lega EC-ErbB3 o si lega alla proteina ma con una affinit? di una grandezza di almeno 10<3 >inferiore. Il dominio EC purificato utilizzato per i saggi di legame ? un omodimero legato con ponti disolfuro, di conseguenza pu? essere trasformato in un monomero mediante l?aggiunta di 5 mM DTT. Come mostrato in Fig.4, l?aptamero CL442-81 ha una affinit? simile sia per il dimero che per il monomero di EGFR in vitro.
L?aptamero CL4 42-81 inibisce i percorsi di segnale mediati da EGFR
Come passaggio successivo, gli autori hanno studiato se CL4 42-81 poteva influenzare l?attivazione di EGFR a seguito della stimolazione con EGF di cellule A549 bersaglio. Come mostrato in Fig 5A, il trattamento con CL4 42-81 riduce drasticamente la fosforilazione dipendente da EGF di EGFR raggiungendo un?inibizione del 60% dopo 5 min dalla stimolazione di EGFR. Non ? stato osservato alcun effetto in presenza dell?aptamero scrambled utilizzato come controllo negativo.
Come conseguenza dell?inibizione di EGFR, il trattamento con CL4 42-81 diminuisce la fosforilazione indotta da EGF degli effettori a valle di trasduttore del segnale antiapoptotico e attivatore della trascrizione proteina 3 (STAT 3) e di ERK (non mostrato). L?identificazione di un aptamero che lega e inibisce specificatamente EGFR, ostacolando il percorso di STAT3 anti-apoptotico, porta agli ovvi interrogativi se questo aptamero possa interferire con la sopravvivenza delle cellule bersaglio positive a EGFR. Come mostrato in Figura 5B, un trattamento di 24 ore delle cellule A549 e A431 con aptamero CL442-81 inibiva fortemente la vitalit? cellulare a circa il 60% rispetto a cellule non trattate o trattate con l?aptamero scrambled. Allo scopo di analizzare il meccanismo molecolare di riduzione della vitalit? cellulare indotto da CL4 42-81, gli autori hanno analizzato l?apoptosi in cellule A549 dopo trattamento con aptamero. Le cellule sono state trattate con l?aptamero CL4 42-81 o l?aptamero scrambled (concentrazione finale 200 nM) ed ? stato analizzato il picco apoptotico sub-G1. In modo rilevante, gli autori hanno trovato che la percentuale di cellule apoptotiche era circa il 30% dopo 24 ore di trattamento con CL4 42-81 raggiungendo il 40% dopo 48 ore (Fig.5C). Non ? stato osservato alcun effetto in presenza dell?aptamero scrambled come controllo negativo.
Inoltre, CL4 42-81 ? in grado di indurre fortemente l?attivazione di caspasi-3 e caspasi-8 (Fig. 6).
CL4 42-81 sopprime la crescita tumorale in vivo
Gli autori hanno investigato se l?aptamero CL4 42-81 poteva interferire con la crescita tumorale in vivo. Topi nudi sono stati inoculati con la linea cellulare di carcinoma epidermoide A431 che esprime livelli elevati di EGFR e i tumori sono stati lasciati crescere fino al raggiungimento di un diametro di circa 1 cm nella dimensione pi? lunga. I tumori sono stati poi iniettati (Giorno 0) con 100 ?l (200 pmoli) di aptamero CL442-81 o di RNA scrambled utilizzato come controllo negativo. Le iniezioni sono state somministrate tre volte alla settimana per le successive due settimane. I tumori sono stati misurati ogni tre giorni. Come mostrato in Figura 7, ? stata osservata una marcata riduzione del volume tumorale per tumori A431 trattati con l?aptamero CL442-81. Infatti, dal giorno 9 al giorno 15 i tumori trattati con CL442-81 arrestavano la crescita e subivano una riduzione del volume. La riduzione del volume tumorale era specifica del gruppo trattato con CL442-81 e non ? stata osservata con l?RNA di controllo.
DISCUSSIONE
La disregolazione dei percorsi ErbB/HER nell?uomo mediante sovraespressione o attivazione costitutiva pu? favorire i processi tumorali ivi inclusi angiogenesi e metastasi ed ? associata a scarsa prognosi in molti tumori maligni nell?uomo. Di conseguenza, la famiglia di recettori ErbB, i cui membri principali sono EGFR e ErbB2, rappresentano un bersaglio validato per la terapia anti-cancro.
Nella presente invenzione, gli autori hanno identificato un RNA-aptamero resistente alla nucleasi (chiamato CL4 42-81) che si lega specificatamente al dominio extracellulare dell?EGFR umano.
L?aptamero CL4 42-81 riconosce specificamente il recettore di EGFR espresso sulla superficie di cellule positive a EGFR (NSCLC, seno, carcinoma epidermoide, glioma, NIH/EGFR) cos? come il dominio extracellulare solubile purificato del recettore sia in forma monomerica che dimerica. D?altro lato, non si lega ad altri membri della famiglia di ErbB: ErbB2, ErbB3 o ErbB4.
Il trattamento di cellule tumorali positive a EGFR con l?aptamero influisce fortemente su molti percorsi intracellulari che sono essenziali per lo sviluppo e la progressione del cancro. Il meccanismo di azione di CL442-81 come inibitore dell?EGFR ? stato studiato in profondit?: il legame dell?aptamero a EGFR esposto sulla superficie cellulare d? luogo al blocco dell?attivazione del recettore, sia se indotto da omodimerizzazione che da eterodimerizzazione con ErbB2 o ErbB3, ostacolando quindi a sua volta i percorsi di segnale a valle dipendenti da EGFR (il percorso di STAT3 antiapoptotico e il percorso di ERK coinvolti nella proliferazione cellulare). L?aptamero non si lega e, di conseguenza, non funziona in cellule che non esprimono EGFR.
Come conseguenza dell?inibizione di EGFR, CL4 42-81 induce fortemente la morte selettiva delle cellule in cellule positive a EGF come confermato dalla riduzione della vitalit? cellulare e dall?aumento del picco apoptotico sub-G1. Inoltre, l?aptamero CL4 42-81 ? in grado di inibire fortemente la crescita tumorale in vivo in topi atimici che hanno tumori derivati da cellule di cancro umane che sovraesprimono EGFR.
La presente invenzione offre evidenza convincente per lo sviluppo clinico dell?aptamero CL4 42-81 come agente antitumorale in tumori umani EGFR-positivi.
In conclusione, l?identificazione dell?aptamero CL442-81 che colpisce specificatamente il recettore di EGFR apre la strada allo sviluppo di strategie innovative per la diagnosi e la terapia del cancro.
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Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1- Un aptamero nucleotide avente essenzialmente la sequenza 5? GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC 3? per uso nel trattamento e/o nella prevenzione o per la diagnosi di un disordine indotto da EGFR. 2- Il nucleotide secondo la rivendicazione 1 essendo resistente alla nucleasi. 3- Il nucleotide secondo la rivendicazione 2 in cui le pirimidine sono 2?-fluoropirimidina. 4- L?aptamero nucleotide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui il disordine indotto da EGFR ? causato da, associato a e/o accompagnato da iperfunzione di EGFR. 5- L?aptamero nucleotide secondo la rivendicazione 4, in cui il disordine indotto da EGFR ? selezionato tra i disordini iperproliferativi. 6- L?aptamero nucleotide secondo la rivendicazione 5, in cui il disordine iperproliferativo indotto da EGFR ? selezionato dal gruppo costituito da cancro o metastasi tumorale primaria. 7- L?aptamero nucleotide secondo la rivendicazione 6 in cui il cancro o metastasi tumorale primaria ? selezionato dal gruppo di: cancro gastrointestinale, cancro della prostata, cancro ovarico, cancro del seno, cancro della testa e del collo, cancro del polmone, cancro del polmone non a piccole cellule, cancro del sistema nervoso, cancro del rene, cancro della retina, cancro della pelle, cancro del fegato, cancro del pancreas, cancro uro-genitale e cancro della vescica. 8- Una composizione farmaceutica comprendente l?aptamero nucleotide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, per uso come trattamento e/o prevenzione di un disordine indotto da EGFR. 9- La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, comprendente ulteriormente altro agente terapeutico. 10- Un metodo per la diagnosi di un disordine indotto da EGFR in un paziente da cui ? stato ottenuto un campione comprendente: -incubazione del campione con l?aptamero nucleotide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7; -misurazione del legame dell?aptamero nucleotide al campione. 11- Il metodo secondo la rivendicazione 10, in cui il campione ? un campione di sangue, siero o saliva, una biopsia, urina o fluido cerebrospinale. 12- Un kit per la diagnosi di un disordine indotto da EGFR in un paziente da cui ? stato ottenuto un campione comprendente un aptamero nucleotide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7.
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