ITRM20100577A1

ITRM20100577A1 - Immunoterapia contro il recettore erbb-3

Info

Publication number: ITRM20100577A1
Application number: IT000577A
Authority: IT
Inventors: Luigi Aurisicchio; Gennaro Ciliberto; Rita Mancini; Emanuele Marra; Giuseppe Roscilli
Original assignee: Takis Srl
Priority date: 2010-11-02
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2012-05-03
Also published as: EP2635294A1; US20140017259A1; WO2012059224A1; US10745459B2; EP2635294B1; US9688738B2; US20170342123A1

Description

DESCRIZIONE

Le attività della ricerca in oncologia sono sempre più orientate ad identificare nuovi trattamenti specifici per i tumori colpendo bersagli molecolari ben precisi {targeted therapy ). Infatti molto frequentemente nei tumori si osserva che la deregolazione della crescita è dovuta a processi alterati di trasduzione del segnale dalla superfìcie della cellula che inducono proliferazione, inibiscono l’apoptosi e frequentemente coinvolgono l’overespressione e l’attivazione di recettori di superficie. La famiglia recettoriale di EGFR (altrimenti detta ErbB o HER) è costituita da quattro proteine trans membrana (EGFR/HERl, HER2, HER3 ed HER4) che svolgono molteplici ruoli sia in cellule normali che nello sviluppo e mantenimento dei tumori [1]. Tre meccanismi aberranti contribuiscono all'attività tumorigenica degli ErbB: sovraespressione dei recettori, spesso dovuta ad amplificazione genica; attivazione costitutiva a causa di mutazioni specifiche; sovraespressione dei ligandi. Dato il ruolo chiave nel signalling oncogenico da parte di questi recettori, sono stati sviluppati nuovi farmaci, sia anticorpi monoclonali che piccole molecole, aventi come bersaglio in particolare EGFR ed HER2 e che sono ampiamente utilizzati in protocolli clinici per la terapia di svariati tipi di tumore, prevalentemente polmone, colon e mammella. Tra questi, anticorpi come cetuximab, panitumumab (contro EGFR), trastuzumab e pertuzumab (contro HER2) e gli inibitori tirosino-chinasici (TKIs) gefitinib, erlotinib (contro EGFR) e lapatinib (contro EGFR/HER2) [1]. Tuttavia, nonostante questi progressi, l'efficacia clinica di questi agenti è inferiore alle aspettative e spesso si accompagna all'insorgenza di resistenza. Ad esempio le risposte oggettive osservate verso trastuzumab (Herceptin™) in pazienti con tumori mammari positivi ad HER2 sono basse (in genere il 15%) e di breve durata [2]. Inoltre, vari prototipi iniziali di vaccini antitumorali contro HER2 basati prevalentemente sull’uso di peptidi e proteine sono stati sviluppati negli ultimi anni e testati in studi clinici di fase I e H, tuttavia senza ottenere risultati significativi [3,4]. Tali vaccini venivano disegnati per indurre prevalentemente una risposta immune di tipo cellulo-mediata, con coinvolgimento principale di cellule CD8<+>citotossiche (CTL). La generazione di CTL correlava con la prevenzione e l’eradicazione delle cellule tumorali in modelli preclinici, ma non controllavano la diffusione di metastasi nell’uomo. Successivamente, alcuni studi hanno dimostrato che cellule tumorali trattate contemporaneamente con trastuzumab e con CTL derivate da pazienti vaccinati con peptidi venivano Usate più efficientemente [5], indicando che un vaccino antitumorale contro HER2 capace di indurre simultaneamente sia una risposta anticorpale che una citotossica dovrebbe mostrare un incremento significativo di efficacia terapeutica. Più recentemente, vaccini genetici contro HER2 basati sull’elettroporazione di DNA plasmidico nel muscolo e suU’uso di vettori Adenovirali ricombinanti hanno mostrato queste caratteristiche e dato risultati incoraggianti [6-8], essendo capaci di generare allo stesso tempo risposta innata, cellulo-mediata e soprattutto anticorpale ad alto titolo contro il recettore.

Una caratteristica distintiva della famigUa dei recettori ErbB è l'interdipendenza e la complementarità nelle loro funzioni. Mentre infatti HER2 è un noto oncogene e la sua sovraespressione, principalmente legata aU'ampUficazione genica in circa il 25% dei tumori al seno, è stata causalmente collegata allo sviluppo del tumore [9], per HER3 non sono state identificate mutazioni direttamente coinvolte neUa cancerogenesi. Tuttavia, la perdita di HER3 abolisce la capacità di trasformazione di HER2. Per tale motivo, HER3 può essere considerato un partner obbhgato nella trasformazione mediata da HER2

[1, 10]. Inoltre HER3 sembra svolgere un ruolo chiave nei meccanismi di resistenza agli attuali inibitori di EGFR ed HER2, probabilmente in seguito ad una sua sovraespressione ed aumentata localizzazione di membrana: il suo ruolo sembra essere legato alla formazione di eterodimeri con EGFR e con HER2 ed alla sua capacità di essere transfosforilato in sei residui di tirosina che servono come siti di legame di molecole coinvolte nella segnalazione a valle come p85, la subunità regolatoria di PI3K [11]. Anche ramplificazione di cMet è stata recentemente descrìtta in cellule resistenti a TKIs e, ancora, il meccanismo di resistenza sembra essere mediato dalla transfosforilazione di HER3 proprio da parte di cMet [12]. L'asse PI3K/Akt è fondamentale per la vitalità e il mantenimento delle cellule staminali tumorali del cancro al seno [13], della prostata [14], del polmone [15], del colon [16] e del cervello [17] così come nelle leucemie [18]. Dato il ruolo centrale di PI3K di segnalazione in cellule staminali e l'incapacità di HER2 di attivare l'asse PI3K in assenza di HER3, si può ipotizzare che HER3 possa avere un ruolo fondamentale per le cellule staminali/progenitrici tumorali. Pertanto la sua inibizione potrebbe essere una strategia per eliminare queste cellule e migliorare l'efficacia dei trattamenti attuali.

HER3 consiste in un dominio extracellulare al quale si lega il ligando (ECD), un dominio di dimerizzazione all’ interno di ECD, un dominio transmembrana (TM) e un dominio al C-terminale (ICD), che viene fosforilato. La Neuregulina (NRG) o altri ligandi si legano ad ECD e attivano la cascata di trasduzione del segnale promuovendo la dimerizzazione con altre RTKs e la transfosforilazione di ICD. Dato che HER3 non è una tirosina chinasi, la sua attività può essere inibita da anticorpi monoclonali specifici. In letteratura, esistono già delle evidenze che anticorpi anti-HER3 possono avere funzioni antitumorali.

Schoeberl e collaboratori [19, 20] hanno recentemente dimostrato in tumori primari e in linee cellulari che esprimono membri della famiglia ErbB e rispettivi ligandi, quindi con caratteristiche autocrine, che solamente anticorpi contro HER3 ma non contro EGFR (cetuximab) ed HER2 (trastuzumab e pertuzumab), sono in grado di inibire completamente Γ attivazione indotta da entrambi i ligandi, mentre cetuximab e trastuzumab potevano neutralizzare solo uno dei due ligandi in maniera specifica.

La presente invenzione consiste nella ideazione di nuovi metodi e strumenti per bloccare l’attività oncogenica di HER3 e dei recettori della famiglia ErbB. In un primo aspetto, l’invenzione consiste in un nuovo metodo per indurre in maniera attiva una risposta immunitaria contro HER3. In particolare, il metodo consiste in una vaccinazione genetica utilizzando un vettore genetico, ad esempio DNA plasmidico, contenente il cDNA ottimizzato di HER3 umano, che esprime la proteina con la mutazione H584F. Tale vettore viene somministrato intramuscolo e a seguire viene applicato un campo elettrico tramite un apparato per elettroporazione allo scopo di aumentare il livello di espressione dell’antigene e generare nell’ospite una risposta immune anticorpale e/o cellulomediata contro HER3. Tale vaccino, qui identificato, potrà trovare applicazione come monoterapia o in combinazione con chemioterapia (p.e. cisplatino, irinotecan, oxaliplatino), anticorpi monoclonali (p.e. Trastuzumab, Pertuzumab, Cetuximab, anticorpi anti-HER3), agenti TKI (p.e. gefitinib, erlotinib, lapatinib), immunomodulatori (p.e. agonisti dei TLR, MF-59, ipilimumab ed altri anti-CTLA4) e altri vaccini antitumorali (p.e. Provenge , GVAX™).

In un secondo aspetto, l’invenzione si riferisce ad anticorpi monoclonali antagonisti generati con il vaccino di cui sopra che si legano al dominio extracellulare di HER3 ed inibiscono la cascata di trasduzione del segnale recettoredipendente, come pHER3, pAKT e la proliferazione cellulare. Le sequenze (nucleotidica e aminoacidica) e i processi per la generazione di questi anticorpi vengono descritti. Vettori di espressione e cellule ospiti che li comprendano per la produzione degli anticorpi dell’invenzione sono anche indicati in dettaglio. Anche questi agenti biologici potranno trovare applicazione come monoterapia o in combinazione con chemioterapia, altri anticorpi, agenti TKI, immunomodulatorì e vaccini antitumorali. Un vantaggio rilevante dell’invenzione è basato sulla specificità degli anticorpi, aventi potenza nota. L’affinità degli anticorpi ottenuti con questa nuova tecnologia è sorprendentemente più alta di anticorpi già noti. Ci si aspetta che tali anticorpi possano essere efficaci nel trattamento di pazienti che hanno sviluppato resistenza a inibitori delle tirosina-chinasi, come TKIs, anticorpi anti-EGFR e anti-HER2 e agenti contro cMet.

Gli esempi che seguono illustrano l’invenzione in maggiore dettaglio:

ESEMPIO 1

Un vaccino zenetico contro una variante genetica di HER3

Allo scopo di ottenere una forte risposta immunitaria contro HER3 e in particolare per generare nell’organismo anticorpi anti-HER3 antagonisti neutralizzanti, è stato adottato un approccio di vaccinazione genetica basato sull’elettroporazione nel muscolo scheletrico (DNA-EP, ref. 21). Questa tecnologia consente di modificare l'antigene di interesse in maniera appropriata mediante tecniche di ingegneria molecolare e permette l’espressione endogena nel muscolo e nelle cellule presentanti l’antigene. E’ stato utilizzato un vettore plasmidico contenente una versione modificata con codoni ottimizzati presenti in proteine altamente espresse in cellule umane che esprime la forma mutata del recettore H584F descritta in SEQ ID: 1. La sequenza aminoacidica della proteina è riportata in SEQ ID: 2. In assenza di ligando, HER3 è presente sulla superfìcie cellulare in una conformazione chiusa che è tenuta insieme da legami intramolecolari. Quando è associato al ligando, HER3 adotta una conformazione estesa che espone i domini del recettore responsabili delTeterodimerizzazione con altri HER e altri partner RTK. Poiché il mutante H584F è costantemente aperto [22] anche in assenza di ligando, abbiamo ideato che Timmunizzazione con questa variante debba aumentare la probabilità di ottenere anticorpi neutralizzanti.

Il protocollo di immunizzazione consisteva in 2 iniezioni nel quadricipite di 50pg di pTKl-A-HER3-H584F-FLopt(Fig. 1A) e 2 iniezioni di 50pg di pTKl-A-HER3 -H5 84F -ECDopt(Fig. 1B), contenente il cDNA codificante il dominio ECD con mutazione H584F (SEQ ID: 3, sequenza aminoacidica in SEQ ID: 4) spaziate di 2 settimane l’una dall’altra. Il DNA era formulato in Phosphate Buffered Saline (PBS) alla concentrazione di lmg/ml. L’espressione degli antigeni era sotto il controllo del promotore del citomegalovirus (CMV), dell’introne A e del segnale di poliadenilazione bGH. La DNA-EP è stata effettuata con un elettroporatore Cliniporator ed elettrodi piatti (IGEA, Carpi, Italia) con le seguenti condizioni elettriche in modalità Electro-Gene-Transfer (EGT): 8 impulsi di 20 msec a 110V, 8Hz, 120msec di pausa tra gli impulsi. Tutti i topi BALB/c immunizzati (8 animali) hanno risposto al vaccino ed i loro sieri hanno mostrato una significativa attività di legame ad HER3 in saggi di tipo ELISA (Fig. 2).

Due settimane dopo la quarta immunizzazione, i topi sono stati sacrificati e milze e linfonodi rimossi. Dopo aver eseguito un protocollo standard di fusione con cellule di mieloma murino come descritto in Harlow et al, “Antibodies: a laboratory manual”, più di 100 cloni di ibridoma sono stati isolati per diluizione seriale e i loro sopranatanti sono stati testati nuovamente per le capacità di legame ad HER3 in vitro.

ESEMPIO 2

Analisi Biochimica e funzionale

Tra gli ibridomi su descritti, due anticorpi, A3 e A4, sono stati selezionati per ulteriore caratterizzazione biochimica e funzionale. In particolare, sono stati eseguiti i seguenti saggi:

• Analisi Biacore. L’affinità per HER3 e il km/koffsono stati determinati per Surface Plasmon Resonance utilizzando uno strumento Biacore TI 00. Un biosensor chip CM5 (GE Healthcare) è stato legato covalentemente con un anti-Fc (8000 RU) e poi trattato con gli anticorpi a diverse concentrazioni (<1000 RU). La proteina HER3-ECD-Fc ricombinante (RnD Systems) in HBS-EP buffer alla concentrazione di analiti 1:1 è stata iniettata per 2 minuti a 30 pL/min, seguita da una fase di dissociazione di 5 minuti.

• Cross-reattività col recettore di topo ed altri HER. Per valutare la potenziale cross-reattività dell’ anticorpo con altri recettori HER, cellule HER negative (ad esempio le CHO) sono state trasfettate in maniera transiente con vettori di espressione (pcDNA3) per HER3 umano o di topo, HER-l/EGFR, HER2 o HER-4. 5xl0<5>cellule sono state trasfettate in piastre da 6cm con 5pg di DNA usando la Lipofectamine 2000 (Gibco). Dopo 48 ore, le cellule sono state tripsinizzate, lavate in mezzo di coltura e incubate con 10pg/ml di ciascun anticorpo in FACS buffer (PBS, 1%FBS). Dopo un lavaggio in FACS buffer, è stato usato un anti-mouse IgG coniugato con Ficoeritrina (PE, Becton Dickinson) e le cellule sono state analizzate ad un FACSCalibur (Becton Dickinson).

• Saggio di blocco del ligando. Sono stati eseguiti esperimenti di competizione col ligando per quantificare la capacità degli anticorpi di inibire l'associazione NRG a HER3 tramite un saggio ELISA. In particolare, la proteina HER3-ECD-Fc è stata legata alla plastica di piastre Nunc Maxisorp ad lpg/ml in PBS a 4°C per la notte. Gli anticorpi anti-HER3 sono poi stati aggiunti per un’ora a 37°C, seguiti da un’incubazione di un’ora con 90ng/l ΟΟμΙ/pozzetto di NRG-Ιβ (RnD Systems, concentrazione finale IGnM). Dopo 2 lavaggi con PBS, 0.05% Tween20, il rilevamento del segnale è avvenuto mediante incubazione con un anticorpo biotinilato di capra anti-NRG-Ιβ (RnD Systems) e Streptavidina coniugata con perossidasi ed utilizzando un substrato HRP (Pierce). La lettura del saggio è stata eseguita ad un ELISA reader a 450nm.

• Saggio di attivazione/fosforilazione di HER3 ed Akt. Sono stati eseguiti esperimenti di ELISA per verificare se gli anticorpi fossero in grado di bloccare l'attivazione di HER-3 mediata da NRG. Tale attivazione viene rilevata dalla maggior fosforilazione in tirosina del recettore. Q saggio è stato eseguito su cellule MCF-7, seminate in piastre da 6cm e al 70% di confluenza e incubate per 12 ore in mezzo di coltura (RPMI) contenente 0.1% BSA. Le cellule sono state poi incubate per un’ora con l’anticorpo anti-HER3 e successivamente trattate con 3.3nM (100ng/ml) NRG1- β nel mezzo contenente 0.1% BSA per 20min a 37°C. Estratti e saggio ELISA sono stati eseguiti secondo le indicazioni dei kit DUOset IC Human Phospho-ErbB3 e Human Phospho-Akt (RnD Systems). La percentuale di inibizione è stata calcolata in riferimento ad una IgG di controllo.

• Saggio di internalizzazione/degradazione. La scomparsa di HER3 dalla superficie cellulare per intemalizzazione e/o degradazione del recettore interferisce con il signalling della cellula e quindi con la trasformazione e/o mantenimento della tumorigenicità delle cellule. 11 saggio è stato effettuato per FACS. In particolare, cellule MCF-7 sono state tripsinizzate, risospese in FACS buffer e contate. lxlO<6>cellule in ciascun tubo sono state incubate con gli anticorpi per 3 ore a 37°C usando un anticorpo isotipico come controllo. Dopo un lavaggio in FACS buffer, è stata poi eseguita un’incubazione con gli stessi anticorpi per 30 minuti a 4°C, seguita da una successiva incubazione con un anti-mouse IgG-PE alle stesse condizioni. Le cellule sono state poi fissate in PBS, 10% formaldeide ed analizzate ad un FACSCalibur. La percentuale di intemalizzazione viene calcolata in riferimento all’IgG di controllo.

• Saggio di proliferazione. Sono stati condotti esperimenti in vitro su cellule MCF-7 per determinare la capacità degli anticorpi di inibire la proliferazione di cellule stimolate con NRG. 2000 cellule/pozzetto sono state seminate in piastre da 96 pozzetti in mezzo di coltura contenente FBS per la notte. Poi le cellule sono state incubate in quadruplicati con gli anticorpi a 100pg/ml in mezzo contenente 0.5% FBS per 1 ora a 37°C, stimolate con 30ng/ml di NRG e lasciate crescere per 72 ore. Il colorante AlamarBlue (Biosource) è stato poi aggiunto nei pozzetti e dopo incubazione per 90 minuti, Γ assorbenza è stata misurata ad un ELISA reader a 590nm. La percentuale di inibizione della crescita viene riferita all’ anticorpo di controllo isotipico.

La seguente tabella riassume le caratteristiche degli anticorpi A3 ed A4:

ESEMPIO 3

Effetto deeli anticorpi anti-HER3 su linee di carcinoma ovarico

L’espressione di HER3 è riportata nel carcinoma ovarico [23], pertanto linee tumorali aventi questa origine possono essere utilizzate per verificare l’effetto di anticorpi anti-HER3. Allo scopo di selezionare le linee cellulari più idonee, è stato eseguito un Western Blot con un anticorpo anti-HER3 commerciale (1B2E, Celi Signalling) utilizzando estratti proteici derivanti da vari tipi di cellule: OvCar429, OvCar3, OvCar4, OvCar8, Skov3 ed Igrov. 50pg di ciascun estratto sono stati caricati su un gel NuPage 4-12% (Invitrogen) e trasferiti su nitrocellulosa. Dopo blocking per 30 minuti con PBS, 5% latte, 0.5% Tween20, è stato usato Γ anticorpo anti-HER3, incubato per tutta la notte a 4°C. Dopo vari lavaggi, il filtro è stato incubato con un anticorpo secondario anti-rabbit IgG coniugato con perossidasi per un’ora a temperatura ambiente, lavato e trattato con substrato ECL (Amersham). I risultati nella Fig. 3 mostrano che le linee OvCar3 e OvCar8 presentano i maggiori di livelli di espressione di HER3.

Per verificare l’effetto degli anticorpi A3 ed A4 sulla trasduzione del segnale in OvCar3 e OvCar8, le cellule sono state seminate in piastre da 6cm, portate al 70% di confluenza e tenute per 20 ore in RPMI, 0.05% BSA. Quindi, è stato aggiunto l’anticorpo A3 o A4 alle concentrazioni di 250nM, 83nM e 28nM per 90 min. A questo punto, le cellule sono state stimolate con NRG ad 80ng/ml per 20 minuti e gli estratti proteici immediatamente preparati. Un anti-pHER3 e un anti-pAKT (Celi Signalling) sono stati usati per verificare l’effetto sulla trasduzione del segnale. Le Fig. 4 e 5 mostrano che l’inibizione di pHER3 e pAKT è dose-dipendente in entrambe le linee cellulari. Per verificare l’effetto di A3 e A4 su HER3 totale in entrambe le linee, è stato utilizzato Γ anticorpo anti-HER3 per Western Blot descritto in precedenza. Il risultato indica che sia A3 che A4 inducono una forte degradazione del recettore in queste linee cellulari (Fig. 6).

ESEMPIO 4

Espressione dei ■ membri ErbB in sferoidi di cellule tumorali primarie di polmone

E’ stato recentemente dimostrato che le effusioni maligne della pleura (Malignant Pleural Effusione - MPE) rappresentano una delle migliori sorgenti di cellule tumorali primarie, poiché possono facilmente essere propagate in vitro ed in vivo e riproducono la naturale eterogeneità dei tumori [24]. La preparazione di colture primarie da MPE è stata effettuata da versamenti ottenuti da pazienti affetti da adenocarcinoma polmonare. Il liquido del versamento è stato centrifugato per 10 min a 1500 rpm in una centrifuga Heraeus Sepatech Omnifuge 2.0 RS, per recuperare le cellule. Il pellet cellulare è stato lavato una volta in PBS e risospeso in l%BSA/2mM EDTA/PBS. La sospensione è stata stratificata su di una soluzione di Histopaque (Sigma-Aldrich) la cui densità è stata ridotta a 1,065 g/ml tramite aggiunta di PBS ed il gradiente così formato è stato centrifugato a 800g per 20 minuti a temperatura ambiente. La fase superiore, contenente ridotta quantità di linfociti ed eventuali cellule tumorali, è stata raccolta fino alPinterfase (35 mi circa) e dopo un lavaggio in l%BSA/2mM EDTA/PBS, le cellule sono state risospese nel terreno appropriato per la coltura di sferoidi (vedi sotto). Il pellet proveniente dal gradiente, composto da eritrociti, linfociti e un minor numero di cellule tumorali, è stato risospeso ed incubato in buffer ACK allo scopo di Usare gli eritrociti per 15 min a temperatura ambiente. Dopo la lisi, le cellule sono state centrifugate e lavate in PBS. Quindi, le cellule sono state messe in coltura nelle condizioni per la coltura --in aderenza (indicate qui sotto).

Condizioni di aderenza: RPMI medium/GlutaMax con 10% FBS e ImM Pen/Strep. In queste condizioni, le cellule primarie formano un monostrato sulla plastica della piastra.

Condizioni per sferoidi: le cellule sono state risospese alla densità di 100,000 per mi in Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 (Invitrogen) supplementato con 1%BSA, 0,5% Glucosio, 20pg/ml insulina (Sigma-Aldrich), 15mM Hepes, B27 senza acido retinoico (Invitrogen), 4 pg/ml eparina (Sigma-Aldrich), 20 ng/mL di epidermal growth factor (EGF) e 20 ng/mL di fibroblast growth factorbasic (bFGF) e poste in piastre non trattate per colture cellulari (Falcon) o in piastre Ultra-Low binding (Corning). In queste condizioni, cellule cancerose con caratteristiche di staminalità possono formare strutture tridimensionali dette sfere o sferoidi. I fattori di crescita (EGF e bFGF) sono stati aggiunti ogni 2-3 giorni e il mezzo di coltura è stato sostituito ogni settimana. Dopo la loro formazione, le sfere sono disgregate meccanicamente o tramite incubazione in Accumax (Innovative Celi Technologies, Ine). La sospensione cellulare è stata poi piastrata in fiasche nelle stesse condizioni su riportate.

Da cellule derivanti da MPEs e coltivate in condizioni di aderenza o come sferoidi, sono stati preparati estratti proteici e analizzati per Western Blot. In particolare, 25 μ§ di estratti sono stati sono stati caricati su un gel NuPage 4-12% (Invitrogen) e trasferiti su membrana di nitrocellulosa. Per verificare l’espressione di HER3, è stato utilizzato l’anticorpo anti-HER3 (Santa Cruz). Inoltre, anche l’espressione di EGFR e di HER2 è stata misurata per Western con gli anticorpi anti-EGFR (Sant Cruz) ed anti-HER2 (RnD Systems). Come controllo degli esperimenti, sono stati utilizzati estratti di cellule di tumore endometriale HeLa. L’espressione di HER3 risulta circa 5 volte superiore quando le cellule si presentano nella forma di sferoidi rispetto alle condizioni di aderenza (Fig. 7). Allo stesso modo, anche l’espressione di uno dei ligandi di HER3, l’eregulina-α, β (HRG-a, β misurata con anti-HRG, NeoMarkers) aumenta nello stato di sferoidi. Al contrario, l’espressione di EGFR e di HER2 viene completamente spenta nello stato tridimensionale. Questo dato suggerisce che HER3 e la cascata di trasduzione del segnale PI3K/AKT potrebbero avere un ruolo importante per le proprietà di staminalità delle cellule tumorali di polmone.

ESEMPIO 5

Inibizione di sisnalling , proliferazione e capacità di formare sferoidi di cellule tumorali primarie di polmone

Per verificare l’effetto degli anticorpi anti-HER3 su cellule derivanti da MPEs, le cellule primarie sono state piastrate in condizioni di coltura per sferoidi in assenza di FBS e trattate con l’anticorpo A3 o A4 alla concentrazione di 10pg/ml per un’ora prima di preparare gli estratti proteici. L’effetto sulla fosforilazione di HER3 è stato verificato per Western Blot usando un antipHER3 (Celi Signaling). Come mostrato in Fig. 8, gli anticorpi A3 ed A4 erano in grado di ridurre del 23 e del 67%, rispettivamente, la fosforilazione di HER3. Un anticorpo isotipico di controllo non aveva invece alcun effetto.

Per verificare l’effetto degli anticorpi sulla capacità delle cellule di proliferare in condizioni di aderenza, le cellule derivanti da MPE sono state messe in coltura con A3 o A4 alla concentrazione di 10 pg/ml, 2 pozzetti per ogni punto sperimentale, dopo 10 giorni le cellule sono state staccate e colorate con Trypan Blue (Sigma), il numero di cellule vive è stato determinato ad un microscopio Zeiss Axjovert 25 (Jena, Germania). I risultati sono mostrati nella figura 9 ed indicano che la proliferazione delle cellule tumorali viene inibita con A3 ed A4 del 22 e 36%, rispettivamente.

Infine, l’effetto di A3 e A4 di inibire la formazione di sferoidi, è stata determinata in uno spheroid forming assay in cui, dopo tripsinizzazione, le cellule derivanti da MPE sono state seminate in piastre da 24 pozzetti in condizioni per sferoidi in presenza di A3, A4 o anticorpo isotipico, tre pozzetti per ogni punto sperimentale, alla concentrazione di 10 μg/ml e tenute in coltura per 10 giorni. A questo punto, il numero di sfere formate è stato determinato ad un microscopio Zeiss Axjovert 25 (Jena, Germania) contando il numero totale di sfere contenute in ogni pozzetto ed effettuando la media delle conte dei tre pozzetti. La conta è stata effettuata da 2 operatori differenti, con risultati comparabili. La figura 10 mostra che sia A3 che A4 sono in grado di ridurre significativamente il numero di sfere del 22 e 46%, rispettivamente.

ESEMPIO 6

Effetto antitumorale su tumori di pancreas in topi nudi

Per verificare il potenziale terapeutico degli anticorpi anti-HER3, A3 ed A4 sono stati testati in topi nudi CD1 con tumori palpabili derivanti dalla linea cellulare tumorale umana BxPC3. Come controllo, sono stati usati topi trattati con PBS o con un anticorpo isotipico di controllo. In particolare, lxl 0<7>cellule BxPC3 sono state inoculate sotto cute sul fianco destro di ciascun topo in presenza di matrigel (Reduced growth factor matrigel, BD Bioscience). Dopo 7 giorni, quando i tumori hanno raggiunto le dimensioni di 200mm , i topi sono stati distribuiti in gruppi omogenei per dimensioni del tumore e trattati con 3 iniezioni distanziate di una settimana di A3, A4 o anticorpo di controllo alla -dose di 25mg/Kg per via intraperitoneale. I risultati sono indicati nella figura 11 e mostrano che sia A3 che A4 sono in grado di bloccare la progressione del tumore pancreatico.

ESEMPIO 7

Effetto antitumorale su tumori spontanei di mammella in topi transsenici Nella maggior parte degli studi, l’effetto di molecole terapeutiche viene effettuato in topi immunodepressi recanti tumori umani sotto cute, come descritto nell’esempio precedente. Tuttavia tali modelli, per quanto consentano di verificare l’efficacia su cellule tumorali umane, hanno la limitazione di non permettere la valutazione terapeutica nella tumorigenesi spontanea e l’impatto che il sistema immunitario può svolgere nel sistema di interesse.

Per questo motivo, è stato utilizzato il modello dei topi BALB/neuT. Questi animali esprimono la forma oncogenica del recettore HER-2/«ew di ratto specificamente nella ghiandola mammaria, che progredisce dallo stadio di iperplasia alla 10<ma>settimana di vita circa ad adenocarcinoma tra la 15™ e la 20<ma>settimana di vita [25]. Varie evidenze in letteratura suggeriscono che in topi transgemei per HER-2/new, HER-3 sia espresso ed abbia un ruolo attivo nella formazione e aggressività del tumore mammario [26]. Inoltre, studi di vaccinazione utilizzando cellule esprimenti membri ErbB, tra cui anche HER3, hanno dimostrato efficacia antitumorale in questo modello murino [27].

Allo scopo di verificare l’eventuale efficacia terapeutica degli anticorpi anti-HER3 nel modello BALB/neuT, sono stati formati 2 gruppi di 4 topi in cui le dimensioni di un tumore mammario riferimento fossero di circa 40mm<3>secondo misurazione effettuata con uno strumento ecografico VEVO 770 (VisualSonics) e una media inferiore a 2 tumori per topo. Il primo gruppo è stato trattato con l’ anticorpo isotipico di controllo, méntre il secondo è stato trattato con l’anticorpo A3. L’anticorpo A4 non è stato utilizzato poiché non cross-reagisce con HER-3 murino. Le iniezioni sono state effettuate 2 volte la settimana per via intraperitoneale alla dose di 25mg/Kg. Ogni 7 giorni le dimensioni del tumore di riferimento sono state determinate per ecografia e la molteplicità dei tumori ottenuta per palpazione delle masse. La figura 12 mostra che l’anticorpo A3, paragonato aH’anticorpo isotipico, è in grado di rallentare la progressione del tumore di riferimento. Inoltre, la figura 13 mostra un effetto significativo sulla molteplicità dei tumori mammari (p<0.01) nel tempo. Ad ulteriore conferma di questi dati, alla fine dello studio (settimana 4) tutti i tumori sono stati espiantati dagli animali e ne è stato determinato il peso.

La tabella seguente mostra le differenze tra i due gruppi sperimentali:

ESEMPIO 8

Effetto sinergico dì A3 ed A4 con Herceptin ™

In letteratura, ci sono evidenze che combinazioni di mAbs contro EGFR e HER2 possono portare ad aumentata attività anti-tumorale come conseguenza deirinibizione simultanea dei complessi eterodimerici che provocano la trasformazione [28]. Per verificare se gli anticorpi A3 ed A4 possano avere un’attività sinergica con Γ anticorpo Herceptin , è stato effettuato un esperimento di combinazione su cellule MCF-7. 2000 cellule/pozzetto sono quindi state seminate in piastre da 96 pozzetti in mezzo di coltura contenente 10% FBS per la notte. Poi le cellule sono state lavate con PBS ed incubate in quadruplicati con gli anticorpi a 10pg/ml, da soli o in combinazione con Herceptin<™>alla stessa concentrazione, in mezzo contenente 1% FBS per 1 ora a 37°C, stimolate con 30ng/ml di NRG e lasciate crescere per 6 giorni. Il colorante MTT (Sigma) è stato poi aggiunto nei pozzetti e dopo incubazione per 60 minuti, l’assorbanza è stata misurata ad un ELISA reader a 570nm. I risultati nella Figura 14 mostrano che la proliferazione delle MCF-7 in condizioni di basso siero e in presenza di NRG non viene alterata da Herceptin<™>. Invece, sia A3 che A4 inibiscono la proliferazione delle cellule di circa il 30 e 40%, rispettivamente. L’inibizione aumenta ad oltre il 50% quando Herceptin™ viene aggiunta ad A3 o A4.

ESEMPIO 9

Sequenza del CDR

Per costruire un anticorpo per uso terapeutico umano, la sequenza degli anticorpi A3 ed A4 è stata determinata tramite sequenziamento del cDNA ottenuto dai rispettivi ibridomi. Da un pellet costituito da IO<7>cellule degli ibridomi A3 e A4 è stato estratto RNA totale utilizzando PRNeasy mini kit della Qiagen (Cat No: 74104). L’RNA è stato poi eluito in 50μ1 di acqua e controllato su un gel di agarosio all’1,2%. I cDNA per le regioni VHe VKsono stati preparati con dei primers specifici per le IgG e le regioni kappa costanti. Il cDNA è stato quindi amplificato per PCR usando degli oligonucleotidi che appaiavano nella sequenza segnale. Il DNA amplificato è stato purificato da gel e clonato nel vettore pGem-T-Easy (Promega). Il DNA estratto dai cloni VHe VKcosì ottenuti è stato sequenziato in entrambe le direzioni. La localizzazione delle complementarity determining regions (CDRs) nelle sequenze è stata determinata in riferimento ad sequenze di altri anticorpi [29].

Antìcorpo A3

La sequenza delle regioni VKe VHè indicata nella SEQ ED: 5 e 6. Le sequenze aminoacidiche dedotte sono mostrate nella SEQ ED: 7 e 8. 5 cloni indipendenti hanno dato le stesse identiche sequenze.

Anticorpo A4

La sequenza delle regioni VKe VHè indicata nella SEQ ID: 9 e 10. Le sequenze aminoacidiche dedotte sono mostrate nella SEQ ID: 11 e 12. 6 cloni indipendenti hanno dato le stesse identiche sequenze, con l’eccezione i una singola sostituzione aminoacidica in uno dei cloni.

ESEMPIO 10

Umanizzazione dell ’anticorpo A4

Allo scopo di generare un anticorpo umanizzato, è stato scelto il metodo della super-umanizzazione descritto in Hwang èt al. [30]. Secondo il metodo, P anticorpo A4 è stato classificato in questo modo: light chain kappa, con combinazione di Canonical structures (CS) 6-1-1; Heavy chain , con combinazione di CS 1-2-x. L’assegnazione del segmento J è JK2 per la light chain kappa, JH4 per la heavy chain. Poiché il residuo 71 è una vaiina, per il CDR-H2 è stata assegnata una CS2. É’ stata scelta la germiine umana VH1-2*02 per la heavy chain poiché ci sono evidenze che la VHl-2*02 dovrebbe avere una combinazione CS 1-2-x. Inoltre, i CDR della sequenza VHl-2*02 (CDR-H1 e CDR-H2) appaiono i più simili alla sequenza CDR dell’anticorpo murino. Per la light chain la scelta è stata la germiine umana IGKV3-20*01 (CSs 6-1-1).

Dal confronto tra le CDR murine di A4 e i CDR delle germiine umane, sono state disegnate le sequenze indicate in SEQ_ID: 13 e 14 ( Light ed Heavy Chain, rispettivamente), e i geni sintetici sono stati generati per assemblaggio di oligonucleotidi sintetici e PCR, secondo il metodo descritto in Stemmer et al.

[31], le cui sequenze sono indicate in SEQ ID: 15 e 16. 1 geni sintetici sono stati quindi clonate per ricombinazione, usando il sistema Gateway (Invitrogen) nei plasmidi pBS-EFla-HCl e pBS-EFla-LCK contenenti rispettivamente i geni sintetici codificanti per la Heavy Chain type 1 e la Light Chain kappa umane, rispettivamente. I vettori così ottenuti sono stati denominanti pHCl-humA4 e pLCK-humA4.

ESEMPIO 11

Espressione e specificità dell ’ anticorpo Hum-A4

Un totale di 5pg dei plasmidi pHCl-humA4 e pLCK-humA4 è stato trasfettato con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in cellule 293-EBNA (Invitrogen), seminate in piastre da 6cm di diametro in rapporto molare di 7:3. Come controlli, sono stati clonati in pBS-EFla e utilizzati: i cDNA sintetici di un immunoglobulina di controllo (specifica per PCSK9); i cDNA originali dell’ anticorpo A4 murino.

Dopo la trasfezione, le cellule sono state incubate per una settimana prima di recuperare il sopranatante. Le immunoglobuline sono state quantizzate con un biosensore ForteBio (CA, US) ed analizzate per Coomassie in condizioni native e denaturanti (Fig.15). Tutte le immunoglobuline venivano prodotte in quantità comparabili.

Per verificare la capacità delle IgG di legare la proteina HER3, è stato eseguito un saggio ELISA usando quantità di IgG che andavano da 5 a 0.04pg per pozzetto. I risultati in Fig.16 mostrano che humA4 è in grado di legare HER3 comparabilmente all’ anticorpo murino.

REFERENZE CITATE

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30) Hwang WY et al. Methods 2005, 36:35

31) Stemmer WP et al. Gene 164:49-53

Lista delle sequenze

SEQ ID: 1

atgagggccaacgacgccctgcaggtgctgggcctgctgttcagcctcgctaggggcagcga ggtcggcaacagccaggccgtgtgcccaggcacactgaacggcctgagcgtgactggcgacg ctgagaaccagtaccagaccctgtacaagctgtacgagagatgcgaggtggtgatgggcaac ctggaaatcgtgctgaccggccacaacgccgacctgagcttcctgcagtggatcagagaggt gaccggctacgtcctggtcgccatgaacgagttcagcaccctgccactgcccaatctcaggg tcgtgcgcggcacccaggtgtacgacggcaagttcgccatcttcgtgatgctgaactacaac accaacagcagccacgccctgaggcagctgaggctgacccagctgaccgagatcctgtctgg Gggcgtgtacatcgagaagaacgacaagctgtgccacatggacaccatcgactggcgggaca tcgtgagggacagggacgccgagatcgtggtgaaggacaacggcagaagctgccccccctgc cacgaggtctgcaagggcagatgctggggccctggcagcgaggactgccagaccctgaccaa gaccatctgcgcccctcagtgcaacggccactgcttcggccccaaccccaaccagtgctgcc acgacgagtgcgctggcggctgtagcggacctcaggacaccgactgcttcgcctgcagacac ttcaacgacagcggcgcctgcgtgcccaggtgcccccagcccctggtgtacaacaagctgac cttccagctggaacccaacccccacaccaagtaccagtacggcggcgtgtgcgtggccagct gccctcacaacttcgtggtggaccagaccagctgcgtgagagcctgcccccctgacaagatg gaagtggacaagaacggactgaagatgtgcgagccctgtggcggcctgtgccccaaggcctg cgagggcaccggcagcggcagcaggttccagaccgtggacagcagcaacatcgacggcttcg tgaactgcaccaagatcctgggcaatctggacttcctgatcaccggcctgaacggcgacccc tggcacaagatccccgccctggaccccgagaagctgaacgtgttcaggaccgtgagagagat caccggctacctgaacatccagagctggccccctcacatgcacaacttcagcgtgttcagca acctgaccaccatcggcggcagaagcctgtacaacaggggcttcagcctgctgatcatgaag aacctgaacgtgaccagcctgggcttcagaagcctgaaagagatcagcgccggcaggatcta catcagcgccaacaggcagctgtgctaccaccacagcctgaactggaccaaggtgctgaggg gccccaccgaggaaaggctggacatcaagcacaacaggcccaggcgggactgtgtggctgag ggcaaagtctgcgaccccctgtgcagcagcggcggctgttggggaccaggcccaggccagtg tctgagctgcaggaactacagcaggggcggagtctgtgtcacccactgcaactttctgaatg gcgagcccagagagttcgcccacgaggccgagtgcttcagctgccaccccgagtgccagccc atggaaggcaccgccacctgcaacggcagcggctccgacacctgcgcccagtgcgcccactt cagggacggccctttctgcgtgagcagctgtccccacggcgtgctgggcgcaaagggaccca tctacaagtaccccgacgtgcagaacgagtgcaggccttgccacgagaactgcacccagggc tgcaaaggcccagagctgcaggactgtctgggccagacactggtgctgatcggcaagaccca cctgaccatggccctgaccgtgatcgccggcctggtggtgatctttatgatgctgggcggca ccttcctgtactggcggggcagaaggattcagaacaagagggccatgagaagatacctggaa aggggcgagagcatcgagcccctggaccctagcgagaaggccaacaaggtgctggccaggat cttcaaagagacagagctgaggaagctgaaggtgctgggaagcggcgtgttcggcaccgtgc acaagggcgtgtggattcccgagggcgagtccatcaagatccctgtgtgcatcaaggtgatc gaggacaagagcggcaggcagtccttccaggccgtgaccgaccacatgctggccatcggcag cctggaccacgcccacatcgtgagactgctgggactgtgccctggctccagcctgcagctgg tgacccagtacctgcccctgggcagcctgctggaccacgtgaggcagcacagaggcgccctg ggcccccagctgctgctgaattggggagtgcagatcgccaagggcatgtactacctggaaga gcacggcatggtgcacaggaacctggcagcaaggaacgtgctgctgaagagccccagccagg tgcaggtggccgacttcggagtggcagatctcctgccacccgacgacaagcagctgctgtac agcgaggccaagacccccatcaagtggatggccctggaaagcatccacttcggcaagtacac ccaccagagcgacgtgtggagctacggcgtgaccgtgtgggagctgatgaccttcggcgccg agccctacgccggcctgaggctggccgaggtgccagacctgctggaaaagggcgagcggctg gctcagccacagatctgcaccatcgacgtgtacatggtgatggtgaagtgctggatgatcga cgagaacatcaggcccaccttcaaagagctggccaacgagttcaccaggatggccagggacc cccctagatacctggtgatcaagagagagagcggccctggaatcgcccctggccccgagcct cacggcctgaccaacaagaagctggaagaggtcgagctggaaccagagctggacctggatct ggacctggaagccgaggaagataacctggccaccaccaccctgggctccgctctgtctctgc ctgtcggcacactgaacagacccagaggatctcagagcctcctgtcccccagcagcggctac atgcccatgaaccagggaaacctgggcgagagctgtcaggaaagcgccgtcagcggcagctc cgagaggtgccccaggcccgtgagcctgcaccccatgcccaggggctgcctggccagcgagt ccagcgagggccacgtgaccggcagcgaggccgaactccaggaaaaggtgtcaatgtgcaga agcaggtccagaagcagaagccccagacccaggggcgacagcgcctaccacagccagaggca ctccctgctgacccccgtgacccccctgagccctcccggcctggaagaggaagatgtgaacg gatacgtgatgcccgacacccacctgaagggcacccctagcagcagagagggcaccctgagc agcgtgggcctgtcctccgtgctgggcaccgaggaagaggatgaggacgaggaatacgagta catgaacaggcggagaaggcacagcccccctcacccccccagacctagctctctggaagagc tgggctatgagtacatggacgtgggcagcgacctgagcgcctctctgggcagcacacagagc tgccctctgcaccccgtgcctatcatgcccaccgccggcaccacccccgatgaggattacga atatatgaatagacagagggatggcggcggaccaggcggcgactatgccgcaatgggcgcct gtcccgccagcgagcagggatacgaggaaatgagggccttccagggcccaggccaccaggcc ccccacgtgcactacgccaggctgaaaaccctgagaagcctggaagccaccgactccgcctt cgacaaccccgactactggcacagcaggctgttccctaaggccaacgcccagaggacctgat ga

SEQ ID: 2

MRANDALQVLGLLFSLARGSEVGNSQAVCPGTLNGLSVTGDAENQYQTLYKLYERCEW MGN LEIVLTGHNADLSFLQWIREVTGYVLVAMNEFSTLPLPNLRW RGTQVYDGKFAIFVMLNYN TNSSHALRQLRLTQLTEILSGGVYIEKNDKLCHMDTIDWRDIVRDRDAEIW KDNGRSCPPC HEVCKGRCWGPGSEDCQTLTKTICAPQCNGHCFGPNPNQCCHDECAGGCSGPQDTDCFACRH FNDSGACVPRCPQPLVYNKLTFQLE PNPHTKYQYGGVCVASCPHNFW DQTSCVRACPPDKM EVDKNGLKMCEPCGGLCPKACEGTGSGSRFQTVDSSNIDGFVNCTKILGNLDFLITGLNGDP WHKIPALDPEKLNVFRTVREITGYLNIQSWPPHMHNFSVFSNLTTIGGRSLYNRGFSLLIMK NLNVTSLGFRSLKEISAGRIYISANRQLCYHHSLNWTKVLRGPTEERLDIKHNRPRRDCVAE GKVCDPLCSSGGCWGPGPGQCLSCRNYSRGGVCVTHCNFLNGEPREFAHEAECFSCHPECQP MEGTATCNGSGSDTCAQCAHFRDGPFCVSSCPHGVLGAKGPIYKYPDVQNECRPCHENCTQG CKGPELQDCLGQTLVLIGKTHLTMALTVIAGLW IFMMLGGTFLYWRGRRIQNKRAMRRYLE RGESIEPLDPSEKANKVLARIFKETELRKLKVLGSGVFGTVHKGVWIPEGESIKIPVCIKVI EDKSGRQSFQAVTDHMLAIGSLDHAHIVRLLGLCPGSSLQLVTQYLPLGSLLDHVRQHRGAL GPQLLLNWGVQIAKGMYYLEEHGMVHRNLAARNVLLKSPSQVQVADFGVADLLPPDDKQLLY SEAKTPIKWMALES IHFGKYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAEPYAGLRLAEVPDLLEKGERL AQPQICTIDVYMVMVKCWMIDENIRPTFKELANEFTRMARDPPRYLVIKRESGPGIAPGPEP HGLTNKKLEEVELEPELDLDLDLEAEEDNLATTTLGSALSLPVGTLNRPRGSQSLLSPSSGY MPMNQGNLGESCQESAVSGSSERCPRPVSLHPMPRGCLASESSEGHVTGSEAELQEKVSMCR SRSRSRSPRPRGDSAYHSQRHSLLTPVTPLSPPGLEEEDVNGYVMPDTHLKGTPSSREGTLS SVGLSSVLGTEEEDEDEEYEYMNRRRRHSPPHPPRPSSLEELGYEYMDVGSDLSASLGSTQS CPLHPVPIMPTAGTTPDEDYEYMNRQRDGGGPGGDYAAMGACPASEQGYEEMRAFQGPGHQA PHVHYAR SEQ ID: 3

atgagggccaacgacgccctgcaggtgctgggcctgctgttcagcctcgctaggggcagcga ggtcggcaacagccaggccgtgtgcccaggcacactgaacggcctgagcgtgactggcgacg ctgagaaccagtaccagaccctgtacaagctgtacgagagatgcgaggtggtgatgggcaac ctggaaatcgtgctgaccggccacaacgccgacctgagcttcctgcagtggatcagagaggt gaccggctacgtcctggtcgccatgaacgagttcagcaccctgccactgcccaatctcaggg tcgtgcgcggcacccaggtgtacgacggcaagttcgccatcttcgtgatgctgaactacaac accaacagcagccacgccctgaggcagctgaggctgacccagctgaccgagatcctgtctgg cggcgtgtacatcgagaagaacgacaagctgtgccacatggacaccatcgactggcgggaca tcgtgagggacagggacgccgagatcgtggtgaaggacaacggcagaagctgccccccctgc cacgaggtctgcaagggcagatgctggggccctggcagcgaggactgccagaccctgaccaa gaccatctgcgcccctcagtgcaacggccactgcttcggccccaaccccaaccagtgctgcc acgacgagtgcgctggcggctgtagcggacctcaggacaccgactgcttcgcctgcagacac ttcaacgacagcggcgcctgcgtgcccaggtgcccccagcccctggtgtacaacaagctgac cttccagctggaacccaacccccacaccaagtaccagtacggcggcgtgtgcgtggccagct gccctcacaacttcgtggtggaccagaccagctgcgtgagagcctgcccccctgacaagatg gaagtggacaagaacggactgaagatgtgcgagccctgtggcggcctgtgccccaaggcctg cgagggcaccggcagcggcagcaggttccagaccgtggacagcagcaacatcgacggcttcg tgaactgcaccaagatcctgggcaatctggacttcctgatcaccggcctgaacggcgacccc tggcacaagatccccgccctggaccccgagaagctgaacgtgttcaggaccgtgagagagat caccggctacctgaacatccagagctggccccctcacatgcacaacttcagcgtgttcagca acetgaccaccatcggcggcagaagcctgtacaacaggggcttcagcctgctgatcatgaag aacctgaacgtgaccagcctgggcttcagaagcctgaaagagatcagcgccggcaggatcta catcagcgccaacaggcagctgtgctaccaccacagcctgaactggaccaaggtgctgaggg gccccaccgaggaaaggctggacatcaagcacaacaggcccaggcgggactgtgtggctgag ggcaaagtctgcgaccccctgtgcagcagcggcggctgttggggaccaggcccaggccagtg tctgagctgcaggaactacagcaggggcggagtctgtgtcacccactgcaactttctgaatg gcgagcccagagagttcgcccacgaggccgagtgcttcagctgccaccccgagtgccagccc atggaaggcaccgccacctgcaacggcagcggctccgacacctgcgcccagtgcgcccactt cagggacggccctttctgcgtgagcagctgtccccacggcgtgctgggcgcaaagggaccca tctacaagtaccccgacgtgcagaacgagtgcaggccttgccacgagaactgcacccagggc tgcaaaggcccagagctgcaggactgtctgggccagacactggtgctgatcggcaagaccca ctgatga

SEQ ID: 4

MRANDALQVLGLLFSLARGSEVGNSQAVCPGTLNGLSVTGDAENQYQTLYKLYERCEW MGN LEIVLTGHNADLSFLQWIREVTGYVLVAMNEFSTLPLPNLRW RGTQVYDGKFAIFVMLNYN TNSSHALRQLRLTQLTEILSGGVYIEKNDKLCHMDTIDWRDIVRDRDAEIW KDNGRSCPPC HEVCKGRCWGPGSEDCQTLTKTICAPQCNGHCFGPNPNQCCHDECAGGCSGPQDTDCFACRH FNDSGACVPRCPQPLVYNKLTFQLE PNPHTKYQYGGVCVASCPHNFW DQTSCVRACPPDKM EVDKNGLKMCEPCGGLCPKACEGTGSGSRFQTVDSSNIDGFVNCTKILGNLDFLITGLNGDP WHKIPALDPEKLNVFRTVREITGYLNIQSWPPHMHNFSVFSNLTTIGGRSLYNRGFSLLIMK NLNVTSLGFRSLKEISAGRIYISANRQLCYHHSLNWTKVLRGPTEERLDIKHNRPRRDCVAE GKVCDPLCSSGGCWGPGPGQCLSCRNYSRGGVCVTHCNFLNGEPREFAHEAECFSCHPECQP MEGTATCNGSGSDTCAQCAHFRDGPFCVSSCPHGVLGAKGPIYKYPDVQNECRPCHENCTQG CKGPELQDCLGQTLVLIGKTH

SEQ ID: 5

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCAT CTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTTATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACC TGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGG GTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCATTCACGTTCG GCACGGGGACAAAATTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA

SEQ ID: 6

CAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGAAATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGAC TTGTTCTTTTTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTATGGTATGGGTGTAGGTTGGATTCGTCAGC CTTTAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCCAACATTTGGTGGAATGATGATAAGTACTATAAT TCAGCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAACAACCAGGTTTTCCTCAA GATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATGCTGCCACATACTACTGTGTTCAAATAGCTAACCCCT ATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACA CCC

SEQ ID: 7

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSYGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGTGTKLEIKRADAAPTV

SEQ ID: 8

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SEQ ID: 9

CAGATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCAT GACCTGCAGGGCCAGGTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GATCTTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAATCTGGCTTTAGGAGTCCCAGCTCGC TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGTAGTGTGGAGGCTGAGGA TGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTATGATAGTTCCCCATTCACGTTCGGCACGGGGACAA AATTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA

SEQ ID : 10

CAGGTCCAACTGCAGCAACCTGGGTCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGTC CTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCACCATCTTCTGGATCCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTG GACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTTATCCTGGTAGTGGTGGAACTAACTACGATGAG AAAT TCAAGAGCAAGGC CACAC TGACTGTAGACACAT TTTCC AGCACAGCCTACAT GCAGC T CAGTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGATGGGGGACTGGGAAGG ACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCAAAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCÙ SEQ ID : 11

QIVLTQS PAIMSAS PGEKVTMTCRARS SVSSS YLHWYQQKPGSS PKLWIYSTSNLALGVPAR FSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYDSSPFTFGTGTKLEIKRADAAPTV SEQ ID : 12

QVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTIFWIHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSGGTNYDE KFKSKATLTVDTFSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRWGTGKDYWGQGTTLKVSSAKTTP SEQ ID: 13

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDSSPFTFGQGTKLEIKR SEQ ID : 14

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTIFWMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSGGTNYAQ KFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTW YYCTRWGTGKDYWGQGTLVTVSS SEQ ID : 15

gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccct ctcctgcagggccagtagcagtgttagcagcagctacttacactggtaccagcagaaacctg gccaggctcccaggctcctcatctatagtacgtccaacagggccactggcatcccagacagg ttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaaga ttttgcagtgtattactgtcagcagtatgacagctcacctttcacttttggccaggggacca agctcgagatcaaacgt

SEQ ID: 16

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctc ctgcaaggcttctggatacaccttcaccatcttttggatgcactgggtgcgacaggcccctg gacaagggcttgagtggatgggaaacatctaccctggcagtggtggcacaaactatgcacag aagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagct gagcaggctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtacgagatggggaacgggcaagg actactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctca

Claims

Rivendicazioni 1. Un acido nucleico che comprenda una sequenza nucleotìdica codificante la proteina mutante ErbB3 H584F, detta proteina che contenga una sequenza aminocidica descritta in SEQ ID NO:2 o un frammento funzionale da essa derivato, in cui uno o più codoni nucleotidici che codifichino la proteina e presenti con bassa frequenza in proteine espresse nell’uomo siano stati sostituiti con codoni nucleotidici presenti su acidi nucleici che codifichino proteine altamente espresse.
2. Un vettore di espressione che comprenda l’acido nucleico della rivendicazione 1 operativamente legato ad un promotore o ad un elemento trascrizionale regolatorio e che appartenga preferenzialmente ma non limitatamente alle seguenti classi: plasmidi batterici, adenovirus, poxvirus, vaccinia virus, fowlpox, herpes virus, adeno-associated virus (AAV), alphavirus, lentivirus, fago lambda, virus della coriomeningite lymphocitaria, Listeria sp, Salmonella sp 3. Metodo per prevenire, trattare o rallentare tumori in un mammifero, il quale metodo comprenda la somministrazione ad un mammifero, per il quale tale trattamento di prevenzione e rallentamento è necessario o desiderabile, di un acido nucleico codificante la proteina mutante Erbb
3 H584F della rivendicazione 1, ovvero un suo frammento funzionale, in conseguenza del quale ima risposta immunitaria è generata contro detto tumore e detto tumore viene prevenuto, curato o rallentato.
4. Metodo della rivendicazione 3, dove il mammifero è l’uomo.
5. Metodo della rivendicazione 3, dove il mammifero è il cane
6. Metodo della rivendicazione 3, dove l’acido nucleico codificante Erbb3 H584F e il suo dominio extracellulare comprenda un acido nucleico come indicato in SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3.
7. Metodo della rivendicazione 3, che inoltre comprenda la somministrazione dell’acido nucleico per elettroporazione del DNA nel muscolo ovvero in situ nel tumore.
8. Metodo della rivendicazione 3, che inoltre comprenda la somministrazione di un potenziatore della risposta immune al mammifero.
9. Metodo della rivendicazione 3, dove l’acido nucleico sia somministrato con un carrier o un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
10. Metodo della rivendicazione 3, dove l’acido nucleico sia somministrato in combinazione con un regime terapeuico notoanti-neoplastico.
11. Metodo della rivendicazione 9, dove l’agente antineoplastico sia selezionato da un gruppo consistente di un agente anti-angiogenico, un agente alchilante, un antimetabolita, un prodotto naturale, un complesso di coordinazione del platino, un antracenedione, un urea sostituita, un derivativo della metilidrazina, un inibitore adrenocorticale, un ormone, un antagonista, un inibitore oncogenico, un gene o una proteina di un oncosoppressore, un anticorpo terapeutico e un oligonucleotide contro un oncogene.
12. Metodo della rivendicazione 3, dove la neoplasia da essere prevenuta, trattata o rallentata è selezionata da un gruppo consistente in tumori di ghiandola adrenale, ano, nervo uditivo, dotti biliari, vescica, ossa, cervello, seno, sistema nervoso centrale, cervice, colon, orecchio, endometrio, esofago, occhio, palpebre, tuba di falloppio, tratto gastrointestinale, testa-collo, cuore, rene, laringe, fegato, polmone, mandibola, condile mandibolare, maxilla, bocca, nasofaringe, naso, cavità orale, ovaio, pancreas, ghiandola parotidea, pene, pinna, pituitaria, ghiandola prostatica, retto, retina, ghiandole salivari, pelle, intestino tenue, colonna vertebrale, stomaco, testicolo, tiroide, uretra, vagina, nervo vestibolococleare e vulva.
13. Anticorpo generato col metodo della rivendicazione 3, il quale anticorpo si leghi ad un epitopo nel dominio extracellulare della proteina ErbB3, ovvero un suo frammento funzionale ed esibisca una o più delle seguenti proprietà: i. Inibizione della trasduzione del segnale mediata da eregulina, epiregulina, betacellulina, epigenina o biregulina via ErbB3; ii. Inibizione della proliferazione di cellule che esprimano ErbB3; rii. Capacità di diminuire I livelli di ErbB3 sulle superimi cellulari; iv. Inibizione della secrezione di VEGF da parte di cellule che esprimano ErbB3; v. Inibizione della migrazione di cellule che esprimano ErbB3; vi. Inibizione della crescita di sferoidi di cellule che esprimano ErbB3.
14. Anticorpo della rivendicazione 12, che sia un anticorpo policlonale o monoclonale.
15. Anticorpo della rivendicazione 12, che sia un anticorpo umano o umanizzato.
16. Anticorpo monoclonale isolato della rivendicazione 14, dove la porzione legante dell’anticorpo comprenda una catena leggera contentente ima sequenza aminoacidica almeno 80% identica alla sequenza della regione variabile della catena leggera indicata in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13.
17. Anticorpo monoclonale isolato della rivendicazione 14, dove la porzione legante dell’anticorpo comprenda una catena pesante contentente una sequenza aminoacidica almeno 80% identica alla sequenza della regione variabile della catena pesante indicata in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14.
18. Composizione farmaceutica che comprenda un anticorpo della rivendicazione 12 e un carrier o un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
19. Composizione farmaceutica della rivendicazione 17, che inoltre comprenda un agente antineoplastico.
20. Composizione farmaceutica della rivendicazione 17, che inoltre comprenda un anticorpo contro proteine oncogeniche o stromali.
21. Un kit, il quale kit comprenda un frammento isolato di acido nucleico della rivendicazione 1 in un contenitore e istruzioni per usare il frammento isolato di acido nucleico allo scopo di prevenire, trattare o rallentare una neoplasia.