ITRM20120131A1 - Inibitori dell'interazione tcr/mhcii-collagene utili per il trattamento dell'artrite reumatoide. - Google Patents

Inibitori dell'interazione tcr/mhcii-collagene utili per il trattamento dell'artrite reumatoide. Download PDF

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ITRM20120131A1
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rheumatoid arthritis
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Rosa Maria Cristina De
Gianfranco Ferraccioli
Bruno Giardina
Chiara Nicolo
Davide Pirolli
Francesco Ria
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Consiglio Nazionale Ricerche
Uni Cattolica Del Sacro Cuor E
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Description

“Inibitori dell’interazione TCR/MHCII-Collagene utili per il trattamento dell’artrite reumatoide
DESCRIZIONE
Stato della tecnica anteriore
1. L’Artrite Reumatoide (AR) à ̈ una malattia cronica infiammatoria che interessa lo 0.5-1% della popolazione. E’ una malattia progressiva che conduce all’impotenza funzionale di numerose articolazioni. L’eziologia della malattia à ̈ sconosciuta, ma l’autoimmunità gioca un ruolo dominante nella sua patogenesi. Infatti, cellule T ed auto-anticorpi sono presenti nel sangue dei pazienti di AR. La maggior parte delle cellule T autoreattive sono specifiche per il collagene umano e possono essere ritrovate nelle articolazioni infiammate ove promuovono la risposta infiammatoria che alla fine conduce alla distruzione delle cartilagini. A conferma del ruolo delle cellule T, à ̈ stata dimostrata l’associazione della AR con gli alleli HLA-DR 1 e 4. I presenti inventori hanno riportato in letteratura che à ̈ possibile ritrovare cellule T specifiche per il collagene umano di tipo II nel contesto dell’allele HLA-DR4 nel sangue e nel liquido sinoviale dei pazienti, ed il livello delle cellule nel sangue varia in maniera parallela con l’attività di malattia (Ria et al, Arth Res Ther 2008, 10: R135). Infatti, abbiamo riportato che le cellule T specifiche per il peptide 261-273 del collagene di tipo II (huCollp261) sono presenti nel sangue in numero elevato all’esordio della malattia, diminuiscono durante le fasi di remissione clinica ed aumentano di nuovo al momento delle ricadute. Una parte di queste cellule à ̈ spontaneamente arricchita nel liquido sinoviale durante la sinovite. Dal punto di vista metodologico, il metodo utilizzato permette di identificare singole cellule T specifiche attraverso l’identificazione della sequenza della regione più variabile del recettore delle cellule T (TCR), la regione CDR3 della catena beta del TCR, mediante PCR. Il TCR riconosce l’antigene per cui à ̈ specifico come complesso di un peptide (di lunghezza in generale compresa tra 8 e 15 aminoacidi) con una molecola denominata HLA (“il peptide à ̈ presentato dalla molecola HLA al TCR†). Ogni individuo possiede tra 12 e 20 di queste molecole, ciascuna con proprie caratteristiche chimiche e ciascuna capace di legare un gruppo di peptidi che condividono la presenza, in certe posizioni, di alcuni aminoacidi. Ognuna delle molecole di HLA (che sono codificate in 6 loci genici diversi e contigui sul cromosoma 6) presenta una amplissima variabilità genetica, con centinaia di alleli. L’insieme delle molecole HLA di un individuo à ̈ denominato aplotipo. Come detto sopra, nella AR, il 50% dei pazienti ha nel proprio aplotipo l’allele HLA-DR4 o il DR1. Entrambe queste molecole di HLA presentano efficacemente il peptide huCollp261. Va aggiunto che anche l’allele HLA-DR7 presenta lo stesso tipo di peptidi presentati da HLA-DR4 e DR1. Noi stimiamo che circa il 70% delle cellule T individuate mediante la tecnica dell’immunoscope in ogni paziente siano effettivamente specifiche per il complesso DR4/huCollp261, sulla base del fatto che questa à ̈ la frazione di cellule che effettivamente condivide l’uso di TCR comuni, questa à ̈ la percentuale di cellule che prolifera solo in risposta a questo peptide e non in risposta anche ad altri peptidi di controllo (Ria et al Arth Res Ther 2008) e della osservazione che questa à ̈ la percentuale di cellule in grado di riconoscere questo peptide nel contesto di un’altra proteina cross-reattiva (osservazioni non pubblicate). Va d’altra parte evidenziato che anche pazienti non positivi per gli alleli HLA-DR4, 1 o 7 possono avere sporadicamente la presenza di cellule che proliferano in risposta al peptide huCollp261, ma in questo caso tale risposta non à ̈ collegata allo stato di malattia. L’utilizzo delle sequenze del TCR nella diagnosi e trattamento dell’AR in questi soggetti à ̈ stato anche oggetto di un precedente brevetto di proprietà di F. Ria e G.F. Ferraccioli (RM2007A000429 and international PCT: PCT/IB2008/053152). I presenti inventori hanno successivamente descritto l’interazione tridimensionale tra la catena beta del TCR ed il complesso formato dal peptide del collagene umano 261-273 (huCollp261) con HLA-DR4 (De Rosa et al, PloSOne 2010, 5:e11550), e questo lavoro rappresenta la base dell’oggetto della presente domanda di brevetto. Dal momento che l’eziologia della RA à ̈ sconosciuta, la terapia à ̈ concentrata sul comune meccanismo patogenetico, cioà ̈ l’infiammazione. I protocolli correnti di terapia includono diversi tipi di farmaci: FANS (farmaci anti-infiammatori non steroidei), steroidi e i cosiddetti DMARDs (farmaci modificanti le malattie reumatiche) che includono anche i modificatori della risposta biologica, anticorpi monoclonali capaci di bloccare il TNF-α e l’IL-1, le principali citokine coinvolte nella risposta infiammatoria. Il trattamento nella maggior parte dei casi include l’uso di più di uno di questi farmaci. Sebbene la terapia sia efficace nel diminuire la severità della malattia, nella maggior parte dei casi la progressione continua. A tal proposito, si vedano le linee guida della Società Italiana di Reumatologia su Clin Exp Rheumatol. 2011 (3 Suppl 66):S7-14. - Clin Exp Rheumatol.
2011 (3 Suppl 66):S15-27.- Clin Exp Rheumatol. 2011 (3 Suppl 66):S42-62). Inoltre, questi farmaci possono avere gravi effetti collaterali, generalmente proporzionali alla loro efficacia, e spesso il trattamento à ̈ seguito da immunodepressione che permette lo sviluppo di infezioni da germi opportunistici o la riattivazione di infezioni latenti che causano malattie quali tubercolosi e la leucoencefalopatia multifocale progressiva. Pertanto esiste la necessità di ottenere nuovi farmaci che interferiscano più specificamente con i meccanismi della risposta autoimmune, ma che preservino la capacità di controllo degli agenti infettivi.
Seguendo una idea originariamente proposta da L Adorini nel 1988, Liu Z, Li B, Li X, Zhang L, Lai L. hanno pubblicato un articolo relativo alla identificazione di molecole inibitrici del’interazione HLA-DR4-peptide, intitolato “Identification of small-molecule inhibitors against human leukocyte antigen-death receptor 4 (HLA-DR4) through a comprehensive strategy†J. Chem Inf Model. 2011 Feb 28;51(2):326-34. In questo lavoro vengono identificati scaffolds per composti in grado di occupare la tasca della molecola HLA-DR4 con affinità maggiore di altri peptidi utilizzati allo stesso scopo. Nell’ottica di utilizzare tale approccio per terapia dell’AR, il limite maggiore di tali prodotti consiste nella necessità di bloccare tutte le molecole HLA-DR4 per ottenere l’effetto terapeutico desiderato. Tale articolo à ̈ irrilevante ai fini del presente brevetto, poiché non presenta vantaggi di selettività del target e non interferisce con il riconoscimento del collagene da parte delle cellule T, ma con la presentazione di peptidi nel contesto di HLA-DR4. Infatti, per raggiungere un effetto terapeutico con i prodotti individuati da Liu e coll. si inibisce anche l’attività di tutte quelle cellule T che riconoscono altri peptidi, derivati da patogeni in complesso con HLA-DR4. L’obiettivo del prodotto da noi presentato à ̈ di focalizzare l’intervento terapeutico solo su questi complessi ed avere quindi vantaggi dal punto di vista della specificità, della selettività e della fattibilità farmacologica.
Breve descrizione dell’invenzione
Le cellule T specifiche per il collagene umano di tipo II, uno dei possibili autoantigeni, hanno un ruolo cruciale nello sviluppo dell’artrite reumatoide nel contesto HLA-DR4. Le interazioni proteinaproteina tra il recettore delle cellule T (TCR) e il collagene di tipo II legato all’allele MHC di classe II HLA-DR4 rappresentano quindi il target per lo sviluppo di nuovi farmaci contro l’artrite reumatoide. La presente invenzione nasce dalla ricerca di composti capaci di inibire la proliferazione delle cellule T a seguito d’interazione tra il recettore delle cellule T (TCR) e il collagene di tipo II legato all’allele HLA di classe II. Utilizzando PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) dei pazienti affetti da artrite reumatoide à ̈ stata innanzitutto esaminata in vitro l’eventuale tossicità di candidati inibitori e successivamente à ̈ stata dimostrata, la capacità di tali inibitori di bloccare in modo specifico la risposta al collagene umano nel contesto di HLA-DR4 e del simile HLA-DR7.
È stata così individuata una famiglia di molecole capaci di bloccare selettivamente soltanto la risposta immunitaria all’autoantigene, lasciando il resto del sistema immunitario intatto ed efficiente.
Pertanto sono oggetto dell’invenzione composti dotati di attività d’inibizione dell’interazione tra i TCR ed il complesso MHCII-Collagene umano di tipo II, o il complesso MHCII ed il frammento peptidico antigenico in posizione 261-273 del collagene umano tipo II (huCollp261), mentre sono ininfluenti sulle restanti funzioni del sistema immunitario .
In particolare oggetto della presente domanda sono composti aventi formula generale scelta tra le formule (I), (II) e (III) per uso nel trattamento dell’AR.
(I)
Fa parte dei composti di formula (I) il nuovo composto 9-[4-(3(R)-fenil-1(S)-propilpirrolidin-1-io-1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo e dei suoi analoghi. Fa parte dei composti di formula (II) il composto: (E)-3-(3,6-dicloro-9H-carbazol-9-il)-N'-(4-idrossibenziliden)propanidrazide e dei composti di formula (III) il composto N1,N5-bis(dibenzo[b,d]furan-3-il)glutarammide (formula III).
I composti di formula (II) e (III) presentano attività di inibizione minore dei composti di formula (I), ma ciononostante utilizzabile in terapia. Tra questi composti, alcuni sono stati sintetizzati per la prima volta dai presenti inventori. Pertanto un secondo oggetto dell’invenzione sono nuovi composti che ricadono nelle formule generiche (I), (II) e (III).
Un terzo oggetto dell’invenzione sono composizioni farmaceutiche contenenti tutti i composti di formula (I), (II) e (III) ed eccipienti farmaceuticamente idonei.
Un quarto oggetto dell’invenzione à ̈ un metodo di preparazione chimica dei composti più efficaci, di formula (I).
I composti dell’invenzione possono essere vantaggiosamente utilizzati nel trattamento terapeutico, anche sintomatico, dell’artrite reumatoide.
Descrizione delle figure
Fig. 1: La figura illustra i risultati di un test di proliferazione di cellule T stimolate dal peptide antigenico 261-273 da collagene umano (huCollp261). Il test à ̈ stato eseguito in assenza di antigene (ag-),in presenza di antigene (ag+) ed in presenza di ag+ e di un composto candidato inibitore (2S, 1S e 3S). Il composto 2S, cioà ̈ (9-[4-(3(R)-fenil-1(S)-propilpirrolidin-1-io-1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo) à ̈ in grado di deprimere fortemente (circa 100%) il Tasso di Stimolazione Specifica (RSI) nel contesto HLA-DR4 e HLA-DR7. Il composto 1S (i.e. (E)-3-(3,6-dicloro-9H-carbazol-9-il)-N'-(4-idrossibenziliden) propanidrazide) deprime fortemente (circa 100%) l’RSI nel contesto HLA-DR11, mentre i composti 2S e 3S, cioà ̈ (N1,N5-bis(dibenzo[b,d]furan-3-il) glutarammide), deprimono meno efficacemente, ma pur tuttavia significativamente (quasi del il 20%), l’RSI nel contesto HLA-DR11.
.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
I composti dell’invenzione sono composti accomunati dalla stessa attività farmacologica, vale a dire d’inibizione dell’interazione tra i TCR ed il complesso MHCII-Collagene umano di tipo II, o il complesso MHCII ed il frammento peptidico antigenico in posizione 261-273 del collagene umano tipo II (huCollp261), pur essendo ininfluenti sulle restanti funzioni del sistema immunitario.
Chimicamente i derivati dell’invenzione sono molecole che condividono alcune strutture chimiche biologicamente equivalenti come il gruppo fluorene, il gruppo carbazolo, il gruppo dibenzofurano e aventi formula generale scelta tra la formula (I), (II) e (III).
In particolare sono oggetto dell’invenzione derivati del 9 idrossifluorene di formula generale (I)
(I)
ove R à ̈ un sostituente scelto tra idrogeno, C1-C5 alchile lineare o ramificato, aril-C1-C5-alchile anche alogeno sostituito sul gruppo fenilico, e R<1>à ̈ un sostituente scelto tra fenile, alogeno orto-, meta- o para-sostituito fenile, dove, in tutti i casi, alogeno à ̈ scelto tra cloro, bromo o iodio, oppure R<1>à ̈ un gruppo 2’- o 3’- o 4’-piridinico.
In una forma di realizzazione dell’invenzione, R à ̈ scelto tra idrogeno, un gruppo metilico, etilico, propilico lineare o ramificato, butilico lineare o ramificato, feniletilico anche orto alogeno sostituito, per esempio o-cloro o o-iodo. R1 à ̈ scelto tra i gruppi: fenilico, 2’-piridinico, 3’-piridinico, 4’-piridinico, o-iodofenilico, m-iodofenilico, piodofenilico, o-clorofenilico, m-clorofenilico, p-clorofenilico.
Specifici composti di formula (I) sono i composti 1 a 15 sotto riportati.
<â– ch>2 ,CH.
Tra questi, il composto 1 Ã ̈ il 9-[4-(3-fenil-1-propilpirrolidin-1-io-1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo, in forma di miscela di diasteroisomeri.
Tutti i composti di formula (I) comprendono due centri di asimmetria in posizione 1 e 3 del gruppo pirrolidinico. Sono parte integrante della presente invenzione le miscele diasteroisomere (RR)/(SS) e (RS)/(SR) o delle singole miscele racemiche o dei singoli enantiomeri (RS), (SR), (RR), (SS). Tutti i composti di formula (I) possono essere in forma di sali di ammonio, per esempio cloruro, bromuro, ioduro.
La tabella sottostante riporta i valori dell’affinità di legame dei singoli stereoisomeri del 9-[4-(3-fenil-1-propilpirrolidin-1-io-1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo calcolati mediante il programma di docking molecolare Autodock (Morris et al. J. Computational Chemistry, 19: 1639-1662, 1998). Tali valori sono forniti dalla funzione di “scoring†del programma. Il processo di docking consiste nel riprodurre, virtualmente, l’associazione tra una proteina e un ligando, selezionando, tra tutti quelli possibili, il complesso energeticamente favorito, vale a dire quello avente valore di energia di interazione (kcal/mol) minore. I programmi di docking si caratterizzano per il tipo di algoritmo usato e per la funzione di “scoring†impiegata. In un virtual screening le funzioni di scoring sono utilizzate per selezionare la miglior conformazione della molecola all’interno del sito e, al termine del processo, per stimare l’affinità di legame dei complessi formati dai vari candidati ligandi.
Composto Affinità di legame (kcal/mol)
9-[4-(3(R)-fenil-1(S)-propilpirrolidin-1-io- -8.52
1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo
9-[4-(3(S)-fenil-1(S)-propilpirrolidin-1-io- -5.92
1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo
9-[4-(3(S)-fenil-1(R)-propilpirrolidin-1-io- -7.26
1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo
9-[4-(3(R)-fenil-1(R)-propilpirrolidin-1-io- -6.98
1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo
In particolare, l’isomero preferito del composto 1 di figura (I) à ̈ 9-[4-(3(R)-fenil-1(S)-propilpirrolidin-1-io-1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo, avente tra tutti i composti analizzati la più alta affinità di legame sul recettore delle cellule T (TCR) evidenziata dalla più bassa energia di interazione (-8,52 kcal/mol).
Si riportano le affinità di legame per tutti i composti di formula (I) calcolate dal programma Autodock
Composti di formula (I)
Affinità di legame
Composto (kcal/mol)
1 -8.52
2 -8.37
3 -8.31
4 -8.27
5 -8.09
6 -7.59
7 -8.21
8 -6.67
9 -8.47
10 -6.33
11 -7.48
12 -6.17
13 -8.51
14 -7.66
15 -7.24
In una forma di realizzazione alternativa i composti dell’invenzione sono composti aventi formula (II),
in cui R à ̈ un sostituente scelto tra idrogeno ed alogeno, scelto tra cloro, bromo e iodio; R<1>à ̈ un sostituente scelto tra idrogeno o alogeno, scelto tra cloro, bromo o iodio; R<2>à ̈ un sostituente scelto tra idrossile o C1-3 alchile (metile; etile, n-propile, isopropile); R<3>à ̈ un gruppo scelto tra –N= e –CH= ed R<4>à ̈ gruppo scelto tra N o CH. Composti preferiti di formula (II) sono i composti da 1 a 15 sotto riportati, compreso il composto (E)-3-(3,6-dicloro-9H-carbazol-9-il)-N'-(4-idrossibenziliden) propanidrazide (composto 1).
ι.
a —CI H = — Bi R = R = — H R<l>= — Cì R* = Bt R = — H H<2>= — OH —OH -OH R = —OH R<5>= — N R<3>- R = — N fi s — N
NS
\ \
R = N — R<4>= R = N- R = N —
/
e. 7.
R =. - Gl R = -Br R = — | R = — H
_ 1
H » —CI -8i R = - I R = — H
= — CHj-CHaR = -CH, — CH3
R' _ — N R<8>=T --N R<3>= H = — N
\>
\ \
fl = N— R = N — R = N — R = N — f /
10. 11. 12.
R = —CI R = “Bl R = R = — H
« = —CI -Br fi<1>* — H
—OH OH —OH R* . —OH
R = — CH R®_ CH R = — CH R“=— CH
\ a \
N — 4 \ \
R = N- R = N — R = N —
/ i /
13. 14. 1S.
R = —CI R = — Bi
R = — CI R<(>= — Bi R — - — i
R = -OH<R>* = -OH<R>* = —OH
R = R<3>= — N R<a>=^
4 \
R = CH- R = CH- R = CH
Tutti i composti di formula (II) possono essere in forma salificata su uno degli atomi di azoto, per esempio come cloruro, bromuro, ioduro. Nel caso in cui R<4>sia “=CH-†ed R ed R<1>siano differenti, R<4>risulta un centro di asimmetria. In tal caso, fanno parte dell’invenzione sia la miscela racemica che i singoli enantiomeri (R) o (S) separati che una miscela arricchita di uno degli enantiomeri.
Si riportano le affinità di legame per tutti i composti di formula (II) calcolate dal programma Autodock
Composti di formula (II)
Affinità di legame
Composto (kcal/mol)
1 -7.82
2 -5.57
3 -6.34
4 -7.59
5 -7.44
6 -7.23
7 -7.59
8 -7.76
9 -7.80
10 -6.24
11 -5.83
12 -7.29
13 -7.23
14 -6.01
15 -6.07
In una forma di realizzazione alternativa i composti dell’invenzione sono composti aventi formula (III)
in cui R Ã ̈ un sostituente scelto tra idrogeno ed alogeno, scelto tra cloro, bromo e iodio; R<1>Ã ̈ un sostituente scelto tra idrogeno o alogeno, scelto tra cloro, bromo o iodio; R<2>Ã ̈ scelto tra O, NH, CH2; R<3>Ã ̈ scelto tra O e S. Tutti i composti di formula (III) possono essere in forma salificata su uno degli atomi di azoto, per esempio come cloruro, bromuro, ioduro.
Composti preferiti di formula (III) sono i composti da 1 a 15 sotto riportati. Il comoposto (1) à ̈ l’N1,N5-bis(dibenzo[b,d]furan-3-il) glutarammide.
R ·
R . — ci
=ti|H
H
— Q
* -<â– >=CH'==CH;
R.
Si riportano le affinità di legame per tutti i composti di formula (III) calcolate dal programma Autodock
Composti di formula (III)
Affinità di legame
Composto (kcal/mol)
1 -8.20
2 -6.89
3 -6.54
4 -8.12
5 -7.61
6 -6.43
7 -6.41
8 -6.53
9 -6.42
10 -7.47
11 -6.43
12 -6.90
13 -7.96
14 -7.56
15 -7.53
I composti dell’invenzione sono stati identificati e selezionati la prima volta attraverso un approccio di “structure-based drug design†basato sulla struttura tridimensionale del complesso ternario TCR/huCoII261/HLA-DR4.
Per altro, alcuni dei composti dell’invenzione sono disponibili commercialmente attraverso opportuni produttori. In particolare, il composto di formula generale (I) la molecola 1 può essere acquistato dal sito www.ibscreen.com utilizzando il codice identificativo: STOCK2S-15693, le molecole 2-5, possono essere acquistate online dal sito www.molport.com utilizzando i rispettivi codici identificativi: MolPort-001-993-760, MolPort-001-991-570, MolPort-002-558-653, MolPort-002-559-198.
Per il composto di formula generale (II) le molecole 1, 4 e 8, possono essere acquistate on-line dal sito www.ibscreen.com utilizzando i rispettivi codici identificativi: STOCK1S-19103, STOCK1S-01057 e STOCK3S-37745.
Per il composto di formula generale (III) la molecola 1, può essere acquistata on-line dal sito www.ibscreen.com utilizzando il codice identificativo: STOCK3S-02896
Tutte le molecole note possono essere anche acquistate dalle ditte: www.aurorafinechemicals.com, www.chemir.com, www.cyanta.com.
Diversamente dai precedenti, i composti da 6 a 15 di Formula generale (I), i composti 2 e 3, da 5 a 7, da 9 a 15 di Formula generale (II) ed i composti da 2 a 15 di Formula generale (III): sono composti nuovi, sintetizzati dai presenti inventori. Tali composti, in quanto tali, le loro miscele di diasteroisomeri o miscele conformazionali o racemiche o singoli enantiomeri isolati, o loro corrispondenti sali costituiscono ulteriore oggetto della presente domanda.
Tutti, i composti di formula (I) possono essere riprodotti attraverso il metodo di sintesi schematizzato e descritto nell’esempio 1, che si compone di passaggi e reazioni in sé ben note e descritte in letteratura. Tale metodo à ̈ esemplificato in relazione allo specifico composto (1) in Formula (I), precisamente il 9-[4-(3-fenil-1-propilpirrolidin-1-io-1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo.
Tutti i composti elencati in Formula (I) possono essere sintetizzati seguendo lo stesso metodo utilizzando i corrispondenti idonei intermedi.
Nel caso dei composti di formula (I), il metodo di preparazione può comprendere il passaggio addizionale di risoluzione della miscela di diasteroisomeri (RR)/(SS) e (RS)/(SR) nelle singole miscele racemiche oppure di separazione dei singoli enantiomeri (RR), (SS), (RS) o (SR).
la separazione può essere effettuata attraverso metodi noti all’esperto, quale la separazione mediate elettroforesi zonale (Capillary Zone Electropheresis CZE) utilizzando selettori chirali quali le ciclo-destrine.
I composti di formula generale (II) e (III) sono anch’essi sintetizzabili seguendo metodi noti all’esperto.
Sono oggetto dell’invenzione anche le composizioni farmaceutiche che contengono uno o più composti dell’invenzione in qualità di principio attivo assieme ad un eccipiente farmaceuticamente accettabile ed eventualmente additivi e stabilizzanti usuali nella farmaceutica.
Tale composizioni sono idonee per uso sistemico o locale e possono essere tanto in formulazione liquida, che in formulazione solida, o semi-solida o di supposta.
Esempi di formulazioni liquide sono soluzione, sospensione, emulsione, idonee per esempio per somministrazione parenterale o parenterale locale, orale o anche in forma di spray. Esempi di formulazioni solide sono compresse, confetti, capsule, granulato, liofilizzato, idonee per somministrazione orale. Esempi di formulazioni semisolide sono paste, pomate, gel, unguenti, idonee per un’applicazione topica.
Ognuna di queste formulazioni conterrà una quantità del composto attivo variabile tra 10 microgrammi a 1000 mg, preferibilmente tra 100 microgrammi a 100 mg, o tra 100 microgrammi a 50 mg, per esempio tra 420 microgrammi a 42 milligrammi, per esempio 0,5, 1, 10, 30 mg per unità di dosaggio (sulla base delle concentrazioni utilizzate nei test di tossicità).
Il lavoro sperimentale alla base della presente invenzione ha permesso di selezionare molecole in grado di inibire in parte o di bloccare totalmente la proliferazione delle cellule T causata dalla presenza del corrispondente antigene: nel presente caso causata da collagene umano di tipo II, e più precisamente suoi frammenti antigenici, quale il frammento 261-273 (huCoIIp261). Per inibizione parziale si intende un qualsiasi grado di inibizione minore del 100%, compreso tra 10% e 99%, per esempio 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%.
Le relative osservazioni sono riportate in Fig. 1 e Tab.I nell’esempio 2. Nell’esperimento riportato in Fig.1, PBMC da quattro pazienti (uno DR4+, uno DR7+ e due negativi per alleli HLA-DR associati ad AR) sono stati coltivati in assenza o in presenza di huCollp261 (10 microM) e in quest’ultimo caso anche in presenza di ciascuno dei tre candidati inibitori (I)-1 (2S), (II)-1 (1S) e (III)-1 (3S) alla stessa concentrazione. I risultati indicano chiaramente come 2S sia in grado di bloccare la proliferazione delle cellule che rispondono a huCollp261 nei soggetti DR4+ o DR7+. In accordo con l’osservazione che questi composti sono privi di effetti tossici fino alla concentrazione di 100 microM, la proliferazione delle sporadiche cellule T che rispondono allo stesso peptide ma nel contesto di molecole HLA diverse da DR41 o 7 resta intatta. Nell’esperimento riportato in Tab. I, abbiamo esaminato la capacità di 1S, 2S e 3S di inibire la proliferazione di cellule T specifiche per huCollp261 in un numero maggiore di pazienti DR4. In totale abbiamo esaminato 4 pazienti DR4+ ed osservato le risposte di 15 diverse cellule T. Il composto 1S inibisce il 13% di queste cellule, 2S il 60% e 3S il 45%, indicando che tutti e tre i composti possiedono attività inibitoria. È importante notare che i tre composti hanno attività inibitoria sullo stesso gruppo di cellule T; in altre parole le cellule inibite da 1S sono inibite anche da 2S e 3S, e le cellule inibite da 3S sono anche inibite da 2S. Ciò indica che tutti e tre i composti hanno lo stesso meccanismo di azione nonostante siano strutturalmente non identiche. Infine si sottolinea che le cellule inibite da 2S sono anche quelle capaci di cross-riconoscimento del peptide (vedi sopra).
Senza voler limitare l’invenzione a specifiche teorie scientifiche, si ritiene che l’inibizione della proliferazione delle cellule T da parte dei composti dell’invenzione sia la conseguenza di un’interferenza inibitoria sui meccanismi d’interazione tra i recettori delle cellule T (TCR) ed il complesso HLA DR-Collagene.
Questa ipotesi à ̈ sostenuta dalle seguenti osservazioni: 1. I composti non manifestano tossicità sui PBMC; 2. Nonostante i composti siano strutturalmente non identici, essi inibiscono la proliferazione di cellule appartenenti funzionalmente ad uno stesso gruppo, indicando che il meccanismo che sottostà all’inibizione à ̈ lo stesso; 3. Le cellule T che sono soggette all’azione inibitoria sono le stesse che hanno la capacità di cross-riconoscere il peptide di altra origine. Pertanto l’azione dei composti à ̈ specificamente limitata ad un omogeneo gruppo di cellule T che condividono le basi molecolari del riconoscimento del complesso huCollp261 in complesso con HLA-DR4, DR1 e DR7. In aggiunta, i dati di modeling molecolare non fanno ritenere probabile che i composti agiscano bloccando la tasca di legame della molecola HLA per il peptide huCollp261.
Pertanto si può ragionevolmente affermare che le molecole dell’invenzione blocchino selettivamente soltanto la risposta immunitaria all’autoantigene, cioà ̈ il peptide 261-273 del Collagene umano tipo II, lasciando il resto del sistema immunitario intatto ed efficiente.
Le concentrazioni dei composti testate per la tossicità sono dell’ordine delle micromoli/l. Per esempio 1, 5, 10, 20, 50, 100 micromoli/l. La concentrazione testata per l’attività à ̈ circa 10 micromoli/l.
I risultati sperimentali dimostrano che la molecola (2S): 9-[4-(3-fenil-1-propilpirrolidin-1-io-1-il)-but-2-inil]fluoren-9-olo blocca completamente la proliferazione delle cellule T specifiche per il frammento di collagene huCollp261 nel contesto DR4 (Fig.1), che la molecola (1S): (E)-3-(3,6-dicloro-9H-carbazol-9-il)-N'-(4-idrossibenziliden) propanidrazide) deprime fortemente (circa 100%) l’RSI nel contesto HLA-DR11, mentre i composti 2S (sopra) e 3S: N1,N5-bis (dibenzo[b,d]furan-3-il) glutarammide, deprimono la proliferazione delle cellule T nel contesto DR11 in maniera statisticamente significativa, se pur meno efficacemente
L’invenzione sarà di seguito illustrata in dettaglio nei seguenti esempi, che hanno finalità esemplificativa, ma non limitativa.
Esempi
Esempio 1: sintesi del composto 9-[4-(3-fenil-1-propilpirrolidin-1-io-1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo. La sintesi à ̈ avvenuta secondo lo schema seguente:
schema di sintesi
I) Il composto 1a (3 g,1.66·10<-2>mol), disponibile commercialmente, viene solubilizzato in Et2O (etere dietilico) (250ml). Ad esso viene aggiunta una soluzione eterea di t-BuPh2SiOCH2CCCH2MgBr (bromuro di {4-[(terz-butildifenilsilil)-ossi]-2-butin-1-il}magnesio), (1.66·10<-2>mol in 250ml) (Tetrahedon Letters 1993, 5467).
II) La soluzione viene addizionata di NH4Cl (cloruro di ammonio), lasciata sotto agitazione per 15 minuti e quindi estratta con AcOEt (etile acetato). La fase organica viene concentrata sotto vuoto e purificata mediante cromatografia a gravità [silica gel, CHCl3(cloroformio)-MeOH(metanolo) (98:2)]. Il prodotto 1b viene ottenuto con una resa del 70%.
III) Ad una soluzione di 1b (5.67g, 1.162·10<-2>mol) e PPTS (piridinio p-toluensolfonato) (0.117g, 4.6·10<-4>mol) in CH2Cl2(diclorometano) (500ml) viene aggiunta una soluzione di DHP (diidropirano) (3.2ml, 3.5·10<-2>mol) goccia a goccia. La reazione viene lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 4h, viene lavata con una soluzione satura di NaHCO3(bicarbonato di sodio) ed estratta con CH2Cl2..
La fase organica viene anidrificata con Na2SO4(solfato di sodio),filtrata e concentrata sotto vuoto.
IV) Il crudo viene solubilizzato in THF (tetraidrofurano) anidro. Tale soluzione viene portata ad una temperatura di 0°C, viene aggiunto TBAF (tetrabutilammoniofloruro) (2.63g, 1.3·10<-2>mol) e viene posta in agitazione a temperatura ambiente per 45min. La miscela risultante viene diluita con CH2Cl2e spenta con H2O (acqua).
La fase organica viene lavata con brine (soluzione satura di cloruro di sodio), anidrificata con Na2SO4e concentrata sotto vuoto.
V) Ad una soluzione del composto 1c (3.88g, 1.162·10<-2>mol ) e di Et3N (trietilamina) (4.8ml, 3.2·10<-2>mol) in THF anidro (500ml) viene aggiunto PBr3(tribromuro di fosforo) (1.5ml, 1.162·10<-2>mol) ad una temperatura di -20°C. La reazione viene lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 4h al termine delle quali viene aggiunta H2O. La miscela così ottenuta viene estratta con AcOEt. La fase organica viene lavata con brine (soluzione satura di cloruro di sodio), anidrificata con Na2SO4e concentrata sotto vuoto. Il crudo viene purificato mediante cromatografia a gravità [silica gel, Esano- AcOEt (70:30)]. Il prodotto 1d viene ottenuto con una resa del 50%.
VI) Ad una soluzione del composto 1d (2.3g, 5.8·10<-3>mol ) e di Et3N (0.725ml, 1.16·10<-2>mol ) in THF anidro (380ml) viene aggiunto il composto 3 (0.848g, 5.8 ·10<-3>mol ) (Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal, 25(4), 60-2; 1991) ad una temperatura di -20°C. La reazione viene lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 4h al termine delle quali viene aggiunta H2O. La miscela così ottenuta viene estratta con AcOEt. La fase organica viene lavata con brine (soluzione satura di cloruro di sodio), anidrificata con Na2SO4e concentrata sotto vuoto.
VII) Il crudo viene solubilizzato a caldo in THF e alla soluzione viene aggiunto n-PrBr (0.528 ml, 5.8·10<-3>mol) (propil bromuro).La reazione viene lasciata a ricadere per 2h e concentrata sotto vuoto.
VIII) Il crudo viene solubilizzato in THFdry , la soluzione viene portata a 0°C, acidificata con AcOH 1M (acido acetico)e lasciata in agitazione per 3h a temperatura ambiente. La soluzione viene concentrata sotto vuoto.
Esempio 2: test di proliferazione di cellule T
Cellule mononucleate (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) sono state isolate da quattro pazienti affetti da artrite reumatoide mediante gradiente di densità. Un paziente era DR4+, uno DR7+ (DR4, DR7 e DR1 presentano gli stessi peptidi e la risposta al peptide 261-273 del collagene umano ristretta da questi alleli utilizza gli stessi TCR); due pazienti erano negativi per DR4, DR1 o DR7. Le PBMC sono state coltivate alla concentrazione di 5x106 cellule/ml nelle piastre da 24 pozzetti in mezzo RPMI 1640 addizionato come descritto (Arth Res Ther, 2008) senza (ag-) o con il peptide antigenico (10 µg/ml, ag+) o con la stessa concentrazione di peptide in presenza di una concentrazione equimolare della miscela commerciale di diasteroisomeri di 9-[4-(3-phenyl-1-propylpyrrolidin-1-ium-1-yl)but-2-ynyl]fluoren-9-ol (2S) comprendente l’enantiomero attivo 9-[4-(3(R)-phenyl-1(S)-propylpyrrolidin-1-ium-1-yl)but-2-ynyl] fluoren-9-ol, in un volume finale di 1 ml. Dopo tre giorni, le cellule sono state raccolte ed à ̈ stata effettuata l’analisi di “immunoscope†come descritto in precedenza. Questa analisi permette l’identificazione di cellule T che proliferano in risposta all’antigene. Tale proliferazione à ̈ indicata come RSI (tasso di stimolazione specifica) con un valore 1 corrispondente al campione non stimolato. Nel grafico si mostra la capacità del 9-[4-(3-fenil-1-propilpirrolidin-1-io-1-il)but-2-inil]fluoren-9-olo di bloccare la proliferazione delle cellule T che rispondono alla presenza del peptide antigenico 261-273 (huCollp261) solo nel contesto HLA-DR4 o DR7 (vedi punti rossi in figura) che condividono largamente la capacità di legare peptidi.
Mentre limitatamente a questo esperimento le due altre molecole (1S e 3S) testate mostrano capacità d’inibizione e specificità più modeste, in un esperimento eseguito su un gruppo più grande di pazienti, i cui risultati sono riportato in Tab. I, anche 1S e 3S mostrano una capacità significativa di inibire la proliferazione delle cellule T specifiche per il Collagene di tipo II nel contesto DR4+.
Tabella I
PBMC da 4 soggetti affetti da AR HLA-DR4+ sono stati stimolati con huCollp261 in presenza di ciascuno dei 3 composti oggetto del presente brevetto.
Composto Numero di Cellule Numero di %
T specifiche cellule inibite
1S 15 2 13
2S 15 9 60
3S 11* 5 45
*in un paziente non à ̈ stato possibile testare questo composto per il numero insufficiente di cellule ottenute dal prelievo.

Claims (12)

  1. Rivendicazioni 1. Inibitore dell’interazione tra le cellule T ed il complesso tra MHC-II ed il collagene umano tipo II o suo frammento antigenico, per uso nel trattamento della artrite reumatoide, caratterizzato dal fatto che tale inibitore ha formula chimica scelta tra le formule (I), (II), (III), (I) in cui, R à ̈ scelto tra idrogeno, un gruppo metilico, etilico, n-propilico, iso-propilico, n-butilico, iso-butilico, ter-butilico, feniletilico anche ocloro o-bromo o o-iodo sostituito; R1 à ̈ scelto tra i gruppi: fenilico, 2’-piridinico, 3’-piridinico, 4’-piridinico, o-iodofenilico, m-iodofenilico, piodofenilico, o-clorofenilico, m-clorofenilico, p-clorofenilico, ed à ̈ in forma di miscela di diasteroisomeri o di miscela racemica o di enantiomero isolato o loro sali; in cui R e R<1>sono scelti indipendentemente l’uno dall’altro tra idrogeno, cloro, bromo o iodio; R<2>à ̈ un sostituente scelto tra idrossile, metile; etile, n-propile, isopropile; R<3>à ̈ scelto tra N e CH ed R<4>à ̈ scelto tra N o CH, ed à ̈ in forma di miscela racemica o di enantiomeri isolati o loro sali; in cui R ed R<1>sono scelti indipendentemente l’uno dall’altro tra idrogeno, cloro, bromo e iodio; R<2>à ̈ scelto tra O, NH, CH2; R<3>à ̈ scelto tra O e S, anche in forma salificata.
  2. 2. Inibitore secondo la rivendicazione 1 per uso nel trattamento della artrite reumatoide, in cui il frammento antigenico del collagene umano tipo II Ã ̈ il peptidico 261-273.
  3. 3. Inibitore secondo le rivendicazioni 1 o 2, per uso nel trattamento della artrite reumatoide, in cui l’inibitore à ̈ scelto tra i composti 1 a 15 di formula (I) oppure 1 a 15 di formula (II) oppure 1 a 15 di formula (III).
  4. 4. Inibitore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, per uso nel trattamento della artrite reumatoide, scelto tra: 9-[4-(3(R)-fenil-1(S)-propilpirrolidin-1-io-1-il)-but-2-inil]fluoren-9-olo; (E)-3-(3,6-dicloro-9H-carbazol-9-il)-N'-(4-idrossibenziliden) propanidrazide o N1,N5-bis(dibenzo[b,d]furan-3-il) glutarammide o loro sali.
  5. 5. Inibitore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, per uso nel trattamento della artrite reumatoide, in cui il paziente à ̈ HLA-DR4 e/o HLA-DR7 positivo.
  6. 6. Composizione farmaceutica comprendente, come principio attivo, un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4 ed un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
  7. 7. Composizione secondo la rivendicazione 6 per uso nel trattamento dell’artrite reumatoide.
  8. 8. Metodo di preparazione dei composti di formula (I) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, comprendente almeno uno dei passaggi elencati nello schema seguente:
  9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 8 comprendente il passaggio addizionale di risoluzione della miscela di diasteroisomeri (RR)/(SS) e (RS)/(SR) nelle singole miscele racemiche oppure della risoluzione dei singoli enantiomeri (RR), (SS), (RS) o (SR).
  10. 10. Composti di formula generale (I), (I) in forma di miscela di diasteroisomeri (RR)/(SS) e (RS)/(SR) o delle singole miscele racemiche o dei singoli enantiomeri (RS), (SR), (RR), (SS), o loro sali, scelti tra i seguenti composti:
  11. 11. Composti di formula generale (II) o loro sali scelti tra i seguenti composti — -CI B = — § — OH fi 5 — H — OH H = — N
  12. 12. Composti di formula generale (III) o loro sali, scelti tra i seguenti composti — ci — ΠΉ — Bf — Gl R = * — Br
IT000131A 2012-03-30 2012-03-30 Inibitori dell'interazione tcr/mhcii-collagene utili per il trattamento dell'artrite reumatoide. ITRM20120131A1 (it)

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