ITRM20120214A1 - Metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi. - Google Patents

Metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi. Download PDF

Info

Publication number
ITRM20120214A1
ITRM20120214A1 IT000214A ITRM20120214A ITRM20120214A1 IT RM20120214 A1 ITRM20120214 A1 IT RM20120214A1 IT 000214 A IT000214 A IT 000214A IT RM20120214 A ITRM20120214 A IT RM20120214A IT RM20120214 A1 ITRM20120214 A1 IT RM20120214A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
seq
protein
endometriosis
concentration
group
Prior art date
Application number
IT000214A
Other languages
English (en)
Inventor
Alfonso Baldi
Pietro Giulio Signorile
Original Assignee
Alfonso Baldi
Pietro Giulio Signorile
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alfonso Baldi, Pietro Giulio Signorile filed Critical Alfonso Baldi
Priority to IT000214A priority Critical patent/ITRM20120214A1/it
Priority to US14/400,884 priority patent/US20150141276A1/en
Priority to PCT/IB2013/053875 priority patent/WO2013171655A1/en
Priority to ES13731914.1T priority patent/ES2641367T3/es
Priority to EP13731914.1A priority patent/EP2850436B1/en
Publication of ITRM20120214A1 publication Critical patent/ITRM20120214A1/it

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4728—Details alpha-Glycoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/364—Endometriosis, i.e. non-malignant disorder in which functioning endometrial tissue is present outside the uterine cavity

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)

Description

"METODO IN VITRO PER LA DIAGNOSI DI ENDOMETRIOSI”
DESCRIZIONE
La presente descrizione riguarda un metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi, un metodo in vitro per il monitoraggio di una terapia contro l’endometriosi e un kit per la diagnosi di endometriosi e/o per il monitoraggio di una terapia contro l’endometriosi in un soggetto.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
L'endometriosi è una condizione patologica caratterizzata dalla presenza di tessuto endometriale al di fuori dell'utero ed è associata a dolore pelvico e infertilità (Giudice LC , and Kao LC: Endometriosis. The Lancet, 364: 1789-1799, 2004). La sua incidenza è stimata a circa il 10% della popolazione femminile in età riproduttiva (Houston DE: Evidence for thè risk of pelvic endometriosis by age, race, and socioeconomic status. Epidemiol Rev, 6: 167-191 , 1984.). I sintomi sono, in genere, poco specifici e spesso sono erroneamente attribuiti ad altre patologie che provocano dolori cronici, di conseguenza la diagnosi di endometriosi è difficilmente effettuata nelle primissime fasi della malattia. Inoltre, la diagnosi di certezza può essere effettuata solo attraverso un approccio invasivo consistente in una ispezione laporoscopica ed analisi istologica delle lesioni sospette. Pertanto, la diagnosi di endometriosi viene posta sempre con significativo ritardo: le stime attuali indicano un intervallo di tempo di 8-12 anni fra la comparsa dei sintomi e la diagnosi di endometriosi (Hadfield R, Mardon H, Barlow D, Kennedy S. Delay in thè diagnosis of endometriosis: a survey of women from thè USA and thè UK. Hum Reprod 1996, 11 : 878-880.). Attualmente non esiste la possibilità di effettuare una diagnosi precoce di endometriosi attraverso l'utilizzo di metodi meno invasivi. Una recente revisione della letteratura sull'argomento ha evidenziato come, nonostante il gran numero di pubblicazioni scientifiche sull'argomento, non esista ad oggi un marcatore biologico o un gruppo di marcatori biologici che si siano mostrati clinicamente efficaci per porre la diagnosi di endometriosi mediante l’utilizzo di metodologie non invasive come, ad esempio, un campione di sangue periferico (May KE, Conduit-Hulbert SA, Villar J, Kirtkley S, Kennedy SH, Becker CM: Peripheral biomarkers of endometriosis: a systematic review. Hum Reprod 2010, 16: 651-674). Un recentissimo lavoro di Fassbender et al. (Fassbender A, Waelkens E, Verbeeck N, Kyama CM, Bokor A, Vodolazkaia A, Van de Plas R, Meuleman C, Peeraer K, Tomassetti C, Gevaert O, Ojeda F, De Moor B, D'Hooghe T : Proteomics analysis of plasma for early diagnosis of endometriosis. Obstet Gynecol 2012, 119: 276-285) ha individuato, attraverso analisi proteomiche basate sulla metodologia MALDI-TOFF, un gruppo di picchi polipeptidici la cui espressione nel sangue sembra correlare con la presenza o meno dell’endometriosi. Tuttavia, gli autori pur osservando una variazione nell’andamento dei picchi di circa 10 peptidi/proteine diverse in diversi stadi dell’endometriosi (dallo stadio minimo al severo) non identificano l’origine di tali proteine che rimangono pertanto sconosciute e, in quanto tali, non utilizzabili per definire un gruppo di marcatori biologici la cui variazione d’espressione possa essere considerata vantaggiosa a fini diagnostici.
E’ quindi molto sentita l’esigenza nello stato della tecnica nota di individuare strumenti diagnostici non invasivi che consentano una diagnosi accurata e, possibilmente precoce, di endometriosi allo scopo di definire una strategia terapeutica già nelle prime fasi di sviluppo della malattia.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La presente descrizione riguarda un metodo in vitro e un kit per la diagnosi di endometriosi.
La presente invenzione si basa sulla scoperta che l’espressione di un gruppo di proteine, dettagliate nella sezione successiva, varia in maniera statisticamente significativa in pazienti affetti da endometriosi rispetto alla popolazione di controlli sani.
In particolare, l’osservazione degli inventori circa la differenza quantitativa dell’espressione delle proteine in oggetto in soggetti anche nei primissimi stadi della patologia rispetto a pazienti sani di controllo, ha permesso di definire per la prima volta un metodo per valutare la presenza di detta patologia. Uno dei vantaggi della presente invenzione consiste, quindi, nella possibilità di giungere ad una diagnosi con significativo anticipo rispetto all’insorgenza dei sintomi tipici di questa patologia.
Pertanto, l’osservazione della variazione della concentrazione di tali proteine può essere vantaggiosamente utilizzata per la definizione di un metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi in soggetti femminili. Tale variazione d’espressione si osserva in modo particolare su campioni ematici di soggetti con endometriosi. Quindi, ancora più vantaggiosamente, tale metodo, in una sua forma di realizzazione, è attuato in maniera assolutamente non invasiva grazie al fatto che la determinazione della concentrazione delle proteine d’interesse può essere effettuata su un campione ematico. In special modo, tenuto conto che, per una diagnosi certa di endometriosi sono disponibili allo stato attuale metodi che prevedono pratiche chirurgiche invasive, volte all’ottenimento di un campione di tessuto endometriale, si può affermare che, rispetto allo stato della tecnica nota, in una forma di realizzazione, il metodo diagnostico qui descritto raggiunge un considerevole avanzamento tecnico consistente in un aumento notevole della compliance da parte dei soggetti sotto esame.
Forma pertanto un primo oggetto della presente domanda:
- un metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi in un soggetto comprendente i seguenti passaggi:
a) determinare la concentrazione di almeno una proteina comprendente o consistente in una sequenza scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 o loro mutanti e/o varianti posttraduzionali in un campione biologico di detto soggetto e in un campione controllo; b) comparare dette concentrazioni in detto campione biologico e detto campione controllo
in cui un aumento della concentrazione di detta almeno una proteina comprendente o consistente in una sequenza scelta nel gruppo di SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6 e/o una diminuzione della concentrazione di detta almeno una proteina comprendente o consistente in una sequenza scelta nel gruppo di SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 rispetto alla medesima proteina in detto controllo è indicativo di endometriosi.
Un secondo oggetto della presente descrizione è:
- un metodo in vitro per il monitoraggio di una terapia contro l'endometriosi in un soggetto sottoposto a detta terapia comprendente i seguenti passaggi:
a) determinare la concentrazione di almeno una proteina comprendente o consistente in una sequenza scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 o loro mutanti e/o varianti posttraduzionali in un primo e in un secondo campione biologico, ottenuti a tempi diversi, di detto soggetto,
b) comparare detta concentrazione ottenuta per detto primo e secondo campione.
E’ altresì oggetto della presente descrizione un kit per la diagnosi di endometriosi e/o per il monitoraggio di una terapia contro l'endometriosi in un soggetto comprendente:
-almeno un’aliquota di uno o più reagenti necessari alla determinazione della concentrazione di almeno una proteina comprendente o consistente in una sequenza scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 o loro mutanti e/o varianti post-traduzionali in un campione biologico di detto soggetto.
Ulteriori vantaggi, così come le caratteristiche e le modalità di impiego della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di alcune forme di realizzazione preferite, presentate a scopo meramente esemplificativo e non limitativo.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
Le figure 1 A, 1 B, 1 C, 1 D. 1 E e 1 F mostrano istogrammi relativi alla differente espressione rispettivamente delle proteine di SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 in campioni sierici di pazienti con endometriosi (gruppo 2) rispetto ai campioni sierici di una popolazione controllo (gruppo 1). CV= coefficiente di variazione, AVG= valore medio, Fac= fattore di regolazione.
Le figure 2A-F mostrano un gel bidimensionale in cui sono visibili i diversi livelli di espressione delle proteine di rispettivamente SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 in campioni controllo e in campioni di pazienti con endometriosi.
DESCRIZIONE DELLE SEQUENZE
SEQ ID NO 1 Proteina corrispondente all’apolipoproteina E mutante E3K umana (numero di accesso in GenBank Gl 1506383A; 317 amminoacidi): mkvlwaallv tflagcqakv kqavetepep elrqqtewqs gqrwelalgr fwdylrwvqt Iseqvqeell ssqvtqelra Imdetmkelk aykseleeql tpvaeetrar Iskelqaaqa rlgadmedvc grlvqyrgev qamlgqstee Irvrlashlr klrkrllrda ddlqkrlavy qagaregaer glsairerlg plveqgrvra atvgslagqp Iqeraqawge rlrarmeemg srtrdrldev keqvaevrak leeqaqqirl qaeafqarlk swfeplvedm qrqwaglvek vqaavgtsaa pvpsdnh.
SEQ ID NO 2 Proteina corrispondente alla catena A del complesso Ni antitrombina umana (numero di accesso in GenBank Gl 999513 1ATFI_A; 432 amminoacidi):
hgspvdicta kprdipmnpm ciyrspekka tedegseqki peatnrrvwe Iskansrfat tfyqhladsk ndndniflsp Isistafamt klgacndtlq qlmevfkfdt isektsdqih fffaklncrl yrkanksskl vsanrlfgdk sltfnetyqd iselvygakl qpldfkenae qsraainkwv snktegritd vipseainel tvlvlvntiy fkglwkskfs pentrkelfy kadgescsas mmyqegkfry rrvaegtqvl elpfkgddit mvlilpkpek slakvekelt pevlqewlde leemmlwhm prfriedgfs Ikeqlqdmgl vdlfspeksk Ipgivaegrd dlyvsdafhk aflevneegs eaaastavvi agrslnpnrv tfkanrpflv firevplnti ifmgrvanpc vk.
SEQ ID NO 3 Proteina corrispondente alla catena A dell’albumina sierica umana (numero di accesso in GenBank Gl 122920512 2I2Z A; 585 amminoacidi): dahksevahr fkdlgeenfk alvliafaqy Iqqcpfedhv klvnevtefa ktcvadesae ncdkslhtlf gdklctvatl retygemadc cakqeperne cflqhkddnp nlprlvrpev dvmctafhdn eetflkkyly eiarrhpyfy apellffakr ykaafteccq aadkaacllp kldelrdegk assakqrlxc aslqkfgera fkawavarls qrfpkaefae vsklvtdltk vhtecchgdl lecaddradl akyicenqds issklkecce kpllekshci aevendempa dlpslaadfv eskdvcknya eakdvflgmf lyeyarrhpd yswlllrla ktyettlekc caaadphecy akvfdefkpl veepqnlikq ncelfeqlge ykfqnallvr ytkkvpqvst ptlvevsrnl gkvgskcckh peakrmpcae dylswlnql cvlhektpvs drvtkcctes Ivnrrpcfsa levdetyvpk efnaetftfh adictlseke rqikkqtalv elvkhkpkat keqlkavmdd faafvekcck addketcfae egkklvaasq aalgl.
SEQ ID NO 4 Proteina corrispondente al precursore C3 del complemento (Homo sapiens; numero di accesso in GenBank Gl 115298678 NP 000055; 1663 amminoacidi):
mgptsgpsll llllthlpla Igspmysiit pnilrlesee tmvleahdaq gdvpvtvtvh dfpgkklvls sektvltpat nhmgnvtfti panrefksek grnkfvtvqa tfgtqwekv vlvslqsgyl fiqtdktiyt pgstvlyrif tvnhkllpvg rtvmvnienp egipvkqdsl ssqnqlgvlp Iswdipelvn mgqwkirayy enspqqvfst efevkeyvlp sfevivepte kfyyiynekg levtitarfl ygkkvegtaf vifgiqdgeq rislpeslkr ipiedgsgev vlsrkvlldg vqnpraedlv gkslyvsatv ilhsgsdmvq aersgipivt spyqihftkt pkyfkpgmpf dlmvfvtnpd gspayrvpva vqgedtvqsl tqgdgvakls inthpsqkpl sitvrtkkqe Iseaeqatrt mqalpystvg nsnnylhlsv Irtelrpget Invnfllrmd raheakiryy tylimnkgrl Ikagrqvrep gqdlwlpls ittdfipsfr Ivayytliga sgqrewads vwvdvkdscv gslwksgqs edrqpvpgqq mtlkiegdhg arvvlvavdk gvfvlnkknk Itqskiwdvv ekadigctpg sgkdyagvfs dagltftsss gqqtaqrael qcpqpaarrr rsvqltekrm dkvgkypkel rkccedgmre npmrfscqrr trfislgeac kkvfldccny itelrrqhar ashlglarsn Idediiaeen ivsrsefpes wlwnvedlke ppkngistkl mniflkdsit tweilavsms dkkgicvadp fevtvmqdff idlrlpysvv rneqveirav lynyrqnqel kvrvellhnp afcslattkr rhqqtvtipp ksslsvpyvi vplktglqev evkaavyhhf isdgvrkslk vvpegirmnk tvavrtldpe rlgregvqke dippadlsdq vpdtesetri llqgtpvaqm tedavdaerl khlivtpsgc geqnmigmtp tviavhylde teqwekfgle krqgalelik kgytqqlafr qpssafaafv krapstwlta yvvkvfslav nliaidsqvl cgavkwlile kqkpdgvfqe dapvihqemi gglrnnnekd maltafvlis Iqeakdicee qvnslpgsit kagdfleany mnlqrsytva iagyalaqmg rlkgpllnkf Ittakdknrw edpgkqlynv eatsyallal Iqlkdfdfvp pwrwlneqr yygggygstq atfmvfqala qyqkdapdhq elnldvslql psrsskithr ihwesasllr seetkenegf tvtaegkgqg tlsvvtmyha kakdqltcnk fdlkvtikpa petekrpqda kntmileict ryrgdqdatm sildismmtg fapdtddlkq langvdryis kyeldkafsd rntliiyldk vshseddcla fkvhqyfnve liqpgavkvy ayynleesct rfyhpekedg klnklcrdel crcaeencfi qksddkvtle erldkacepg vdyvyktrlv kvqlsndfde yimaieqtik sgsdevqvgq qrtfispikc realkleekk hylmwglssd fwgekpnlsy iigkdtwveh wpeedecqde enqkqcqdlg aftesmvvfg cpn.
SEQ ID NO 5 Proteina isolata da Homo sapiens (numero di accesso in GenBank Gl 194380608 BAG58457; 763 amminoacidi):
mrllwgliwa ssfftlslqk prlllfspsv vhlgvplsvg vqlqdvprgq wkgsvflrn psrnnvpcsp kvdftlsser dfallslqvp Ikdakscglh qllrgpevql vahspwlkds Isrttniqgi nllfssrrgh Iflqtdqpiy npgqrvryrv faldqkmrps tdtitvmven shglrvrkke vympssifqd dfvipdisep gtwkisarfs dglesnsstq fevkkyvlpn fevkitpgkp yiltvpghld emqldiqary iygkpvqgva yvrfgllded gkktffrgle sqtklvngqs hislskaefq daleklnmgi tdlqglrlyv aaaiiespgg emeeaeltsw yfvsspfsld Isktkrhlvp gapfllqalv remsgspasg ipvkvsatvs spgsvpevqd iqqntdgsgq vsipiiipqt iselqlsvsa gsphpaiarl tvaappsggp gflsierpds rpprvgdtln Inlravgsga tfshyyymil srgqivfmnr epkrtltsvs vfvdhhlaps fyfvafyyhg dhpvanslrv dvqagacegk lelsvdgakq yrngesvklh letdslalva Igaldtalya agskshkpln mgkvfeamns ydlgcgpggg dsalqvfqaa glafsdgdqw tlsrkrlscp kekttrkkrn vnfqkainek Igqyasptak rccqdgvtrl pmmrsceqra arvqqpdcre pflsccqfae slrkksrdkg qeglgspsar spa.
SEQ ID NO 6 Proteina corrispondente alla glicoproteina Zn-alpha2 isolata da Homo sapiens (numero di accesso in GenBank Gl 38026 CAA42438; 302 amminoacidi):
mwasmsrmlp vllslllllg pavpqenqdg rysltyiytg Iskhvedvpa fqalgslndl qffrynskdr ksqpmglwrq vegmedwkqd sqlqkaredi fmetlkdive yyndsngshv Iqgrfgceie nnrssgafwk yyydgkdyie fnkeipawvp fdpaaqitkq kweaepvyvq rakayleeec patlrkylky sknildrqdp pswvtshqa pgekkklkcl aydfypgkid vhwtragevq epelrgdvlh ngngtyqswv wavppqdta pyschvqhss laqplwpwe as.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La presente invenzione fornisce un metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi di endometriosi in un soggetto.
Lo scopo del metodo qui descritto è quello di consentire la diagnosi preferibilmente precoce di endometriosi in soggetti femminili in assenza o in presenza anche solo di lievi sintomi associabili alla malattia. In particolare, è possibile effettuare la diagnosi non solo in ognuno dei convenzionali quattro stadi di malattia ma anche prima della sua rappresentazione clinica.
In particolare, il metodo si caratterizza per la determinazione della concentrazione di almeno una proteina comprendente o consistente in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 in un campione biologico di un soggetto sotto esame. Infatti, come detto in precedenza, gli autori della presente invenzione hanno dimostrato che la variazione della concentrazione di almeno una delle proteine di cui sopra, correla solo con la presenza o assenza di endometriosi.
In special modo, detta almeno una proteina di cui bisogna determinare la concentrazione è una proteina che comprende all’interno della sua sequenza amminoacidica o la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 2 o la SEQ ID NO 3 o la SEQ ID NO 4 o la SEQ ID NO 5 o la SEQ ID NO 6. In altri termini quindi, secondo il metodo qui descritto, le proteine rilevabili e/o rilevate sono le proteine (indicate schematicamente come proteine A-F) di cui sotto:
- proteina A comprendente o consistente in SEQ ID NO 1 ,
- proteina B comprendente o consistente in SEQ ID NO 2,
- proteina C comprendente o consistente in SEQ ID NO 3,
- proteina D comprendente o consistente in SEQ ID NO 4,
- proteina E comprendente o consistente in SEQ ID NO 5 e/o
- proteina F comprendente o consistente in SEQ ID NO 6.
In particolare, in una forma di realizzazione preferita dell’invenzione le proteine rilevabili e/o rilevate hanno una sequenza amminoacidica che consiste esclusivamente in: SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 6
Le proteine rilevabili e/o rilevate ai fini della presente invenzione possono essere in numero di una oppure due, tre, quattro, cinque o sei e secondo una qualsiasi delle combinazioni possibili. A titolo meramente esemplificativo, quando le proteine da rilevare e/o rilevate sono tre, queste possono essere la proteina A (SEQ ID NO 1), la proteina D (SEQ ID NO 4) e la proteina F (SEQ ID NO 5) oppure la proteina B (SEQ ID NO 2), la proteina C (SEQ ID NO 3) e la proteina F (SEQ ID NO 6) o ancora la proteina A (SEQ ID NO 1), la proteina C (SEQ ID NO 3) e la proteina F (SEQ ID NO 6). Appare chiaro che qualsiasi combinazione possibile delle 6 proteine sopra definite può essere utilizzata ai fini del presente metodo e, quindi, in quanto tale compreso nell’ambito di protezione dell’invenzione qui descritta.
Inoltre, compresi nell’ambito di protezione qui definito rientrano anche sequenze mutate e/o varianti post-traduzionali delle sequenze definite dalle SEQ ID NO 1-6.
Per sequenze mutate nella presente invenzione si intende una sequenza amminoacidica X che presenta, rispetto alla sequenza amminoacidica indicata in SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 6, almeno il 90% di omologia. In altri termini almeno il 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % della sequenza amminoacidica potrà essere identica a ciascuna delle SEQ ID sopra definite.
Per varianti post-traduzionali s’intendono invece sequenze amminoacidiche che differiscono dalle sequenze di SEQ ID NO 1-6 o loro mutanti per la presenza di uno o più amminoacidi su cui sono stati aggiunti gruppi funzionali come, a titolo esemplificativo e non limitativo, gruppi glucidici, fosfato, acetile.
Di conseguenza, nell’eseguire il metodo qui descritto possono essere anche rilevate proteine comprendenti o consistenti in sequenze mutate e/o varianti posttraduzionali delle SEQ ID NO 1-6.
La determinazione della concentrazione delle proteine di cui sopra può essere effettuata secondo uno qualsiasi dei metodi ritenuti dal tecnico del settore idonei a tale scopo. Tali metodi sono ampiamente noti in letteratura e descritti nel dettaglio nella maggior parte dei manuali di laboratorio, pertanto non risulta necessario approfondirli ulteriormente in questa sede.
A titolo meramente esemplificativo, la concentrazione delle proteine di cui sopra in un campione, rispetto ad un campione controllo, può essere determinata mediante metodi immunometrici quantitativi e semiquantitativi. In particolare, tali metodi si basano sul riconoscimento da parte di anticorpi specifici delle sequenze rappresentate dalle SEQ ID NO 1-6.
Lo sviluppo di un anticorpo in grado di riconoscere in maniera selettiva una determinata sequenza amminoacidica rientra ormai tra le tecniche convenzionali di laboratorio ed infatti, tale sviluppo non solo è descritto in manuali di laboratorio ma anche effettuato su richiesta come servizio da numerose aziende biotecnologiche. Quindi, è oggi possibile sviluppare un anticorpo, sia del tipo policlonale che monoclonale, ad esempio, contro le SEQ ID NO 1-6 semplicemente fornendo ad una ditta come, ad esempio, l’Antibody Resource (http://www.antibodyresource.com/customantibody.html) le sequenze di interesse al fine di ottenere un anticorpo specifico per ciascuna delle SEQ ID NO 1-6.
Preferibilmente, gli anticorpi sviluppati secondo la presente invenzione sono anticorpi monoclonali.
Per maggiore completezza d’informazione, si ricorda anche che per realizzare l’anticorpo primario di tipo monoclonale, sarà sufficiente qualsiasi tecnica standard per 10 sviluppo di anticorpi monoclonali, come, ad esempio quella messa a punto da Koler e Mirstaein nel 1967: va ricordato qui brevemente che ogni specifico anticorpo, che riconosce uno specifico determinante antigenico (epitopo), è prodotto da uno specifico linfocita B. L'isolamento e la coltura in vitro di una cellula capace di produrre un singolo anticorpo rappresenta una fonte di anticorpi monoclonali (quindi anticorpi monospecifici). Tuttavia i linfociti B, quando sono coltivati in vitro, muoiono dopo brevissimo tempo, e quindi non possono essere una fonte per la produzione a lungo termine di anticorpi.
La tecnologia dell'anticorpo monoclonale comprende l'isolamento di questi linfociti B, e la loro successiva fusione con cellule trasformate (cellule mielomatose), utili per le loro caratteristiche di maggior crescita e sopravvivenza. Molte delle risultanti cellule ibride (o ibridomi), che vengono coltivate in vitro, manterranno l'immortalità, oltre a produrre grandi quantità dell'anticorpo monoclonale.
La fusione tra i linfociti B (provenienti dalla milza e dai linfonodi di un animale immunizzato) e il mieloma di topo (l'animale più usato), viene ottenuta per intervento di un promotore di fusione di membrana, come il polietilenglicole.
11 terreno su cui sono allevati gli ibridi è di tipo selettivo conosciuto con il nome di HAT, che proprio per la sua composizione, inibisce la crescita sia dei mielomi che delle cellule della milza non fuse, ma non dell’ibridoma che completa le due linee parenterali. Gli ibridomi vengono sottoposti a screening per la ricerca degli anticorpi specifici d’interese e quelli scelti vengono avviati alla conservazione o alla produzione in massa.
Gli anticorpi, sia policlonali che monoclonali, specifici per le sequenze amminoacidiche sopra definite, sono quindi anticorpi (primari) che riconoscono in maniera specifica ciascuna delle sequenze di cui sopra, e che a loro volta possono poi riconosciuti da un idoneo anticorpo secondario, ovviamente specifico per l’organismo nel quale è stato sviluppato l’anticorpo primario. Tale anticorpo secondario potrà essere marcato, ad esempio, con qualsiasi fluorocromo comunemente utilizzato nella marcatura di anticorpi secondari quale, ad esempio, sostanze fluorescenti (a titolo illustrativo :FITC, Cy3, Cy5, Alexa 488, PEe) oppure enzimi o sostanze rilevabili mediante citochimica enzimatica (ad esempio perossidasi di rafano) per consentire così la rivelazione dell’anticorpo primario e, quindi, della(e) proteina(e) di interesse secondo metodiche di rilevamento convenzionali.
Preferibilmente, quindi, la determinazione della concentrazione di almeno una delle proteine sopra indicate può essere effettuata a tiolo esemplificativo mediante western-blot, ELISA (enzyme-linked Immunoasobent assay), RIA (radioimmunoassay), immunochimica o array proteici.
In particolare, un array proteico è costituito da un supporto solido sul quale diversi reagenti tra cui, ad esempio, anticorpi specifici per le proteine qui descritte sono depositati (“spottati”, in gergo tecnico) in maniera ordinata e ad una specifica e definita densità. Ognuno di questi anticorpi legando la propria proteina bersaglio e isolandola così da una miscela complessa, quale può essere, ad esempio, un lisato cellulare, consente, sulla base delle interazioni proteina(antigene)-proteina (anticorpo) verificatosi, di evidenziare e quantificare la particolare proteina d’interesse.
Alternativamente, la determinazione della concentrazione di almeno una delle proteine qui descritte può essere effettuata mediante spettrometria di massa.
Successivamente, il valore relativo alla concentrazione di detta almeno una proteine di interesse presente in un campione biologico del soggetto sotto esame è comparato con il valore controllo, cioè il valore della concentrazione ottenuto per la medesima proteina in un campione appartenente ad un soggetto sano. Come apparirà chiaro al tecnico del settore, il valore controllo sarà preferibilmente il valore medio della concentrazione di detta almeno una proteina calcolato rispetto ad una coorte di soggetti sani.
Secondo il metodo per la diagnosi e/o la valutazione del rischio di sviluppo deN’endometriosi qui descritto, la variazione della concentrazione di detta almeno una proteina comprendente una sequenza scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 o loro mutanti e/o varianti post-traduzionali nel campione del soggetto sotto esame rispetto al valore controllo fornirà informazioni circa la presenza deN’endometriosi o del rischio di sviluppo d’endometriosi.
In particolare, se almeno una proteina comprendente una tra SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 risulta avere una concentrazione statisticamente minore rispetto alla medesima proteina analizzata nel campione controllo, al soggetto sotto esame sarà diagnosticata endometriosi o rischio di sviluppo d’endometriosi.
Inoltre, se almeno una proteina comprendente una tra SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID 6 risulta avere una concentrazione statisticamente maggiore rispetto alla medesima proteina nel campione controllo, al soggetto sotto esame sarà diagnosticata endometriosi o rischio di sviluppo d’endometriosi.
Quindi, riassumendo, secondo il metodo qui descritto una diminuzione della concentrazione di detta almeno una proteina comprendente una tra SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e/o un aumento della concentrazione di detta proteina comprendente SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6 rispetto a detto controllo è indicativo dell’endometriosi o del rischio di sviluppo d’endometriosi. In particolare, a titolo esemplificativo, anche la sola osservazione che una sola o due, tre tra le SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6 sono in aumento e/o o una sola o due, tre tra SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 sono in diminuzione rispetto al controllo, è indicativa della presenza d’endometriosi..
Al fine di facilitare, la determinazione della concentrazione, preferibilmente, il metodo qui descritto può anche comprende un passaggio preliminare in cui è ottenuto un estratto proteico a partire dal campione biologico da analizzare.
Come sopra evidenziato, l’ulteriore problema tecnico risolto dalla presente invenzione è lo sviluppo di una metodica non invasiva per la diagnosi deN’endometriosi. Gli autori hanno osservato una modulazione dell’espressione delle proteine di cui sopra nei campioni sierici dei pazienti affetti. Quindi, in una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, il campione biologico è rappresentato da un campione di sangue o siero del paziente sotto esame.
Inoltre, come evidente dal tipo di patologia in oggetto ovvero l’endometriosi, il paziente sotto esame è un soggetto di sesso femminile, preferibilmente un soggetto umano. Tuttavia, qualsiasi animale nel quale sia possibile osservare endometriosi in maniera analoga all’essere umano, come ad esempio, nei cavalli, può essere considerato il “soggetto” secondo quanto qui descritto.
Ulteriore oggetto della presente descrizione è un metodo in vitro per il monitoraggio delTendometriosi in un soggetto. Con il termine “monitoraggio” s’intende, in questa sede, il controllo dell’andamento dello stato patologico di un paziente nel tempo. Quindi, per monitoraggio s’intendono controlli seriali nel tempo delle variazioni quantitative delle proteine in un soggetto rispetto ai valori quantitativi della medesima o medesime proteine nei controlli. Preferibilmente, tale monitoraggio può essere, senza essere ad esso limitato, un monitoraggio di di unaterapia contro l'endometriosi .Lo scopo di questo caso è, quindi, quello di valutare prima, durante e/o dopo un generico intervallo di tempo o un percorso terapeutico, l’eventuale miglioramento o peggioramento, dello stato patologico che nel caso specifico in cui il paziente sia sottoposto a terapia corrisponde all’eventuale benefico o meno della terapia prescritta per curare e/o rallentare e/o prevenire l'endometriosi.
In particolare, detto metodo di monitoraggio comprende il passaggio chiave di determinazione della concentrazione di almeno una proteina comprendente una sequenza scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6. Analogamente a quanto già detto per il metodo di diagnosi di cui sopra, la determinazione della concentrazione di detta almeno una proteina può essere relativa sia a proteine comprendenti che consistenti esclusivamente nelle SEQ ID NO 1-6 sia a loro mutanti e/o varianti post-traduzionali. In particolare, gli aspetti tecnici relativi alle proteine da analizzare, come anche le metodologie per la determinazione della concertazione proteica, utili ai fini del metodo di monitoraggio, sono da considerarsi analoghi a quelli già sopra descritti per il metodo di diagnosi. Quindi, in particolare, il metodo potrà ulteriormente comprendente un passaggio di ottenimento di un estratto proteico da detti campioni biologici che, preferibilmente sono campioni di sangue o siero.
La determinazione della concentrazione proteica ai fini del monitoraggio dovrà essere effettuata in un primo campione biologico e in almeno un secondo campione biologico di un soggetto ottenuti rispettivamente ad un tempo t=0 e t>0. Il soggetto sotto esame può essere, in particolare, sia un soggetto sottoposto a terapia contro l’endometriosi sia un soggetto monitorato nel tempo senza necessariamente essere sotto ad alcun tipo di terapia. In altri termini quindi, il primo campione biologico ottenuto al tempo t=0 può essere un campione acquisito, in un soggetto sottoposto a terapia contro l’endometriosi, ad esempio, prima dell’inizio della terapia stessa, ed invece in un soggetto non sottoposto a terapia, acquisito ad un generico tempo t=0a Diversamente, ilsecondo campione biologico può essere acquisito ad uno o più intervalli di tempo a partire da detto tempo t=0, pertanto definiti come tempi t>0, ad esempio, ogni 15, 20, 30 giorni. Preferibilmente, il primo e il secondo campione sono rispettivamente ottenuti prima dell’inizio di una terapia contro l’endometriosi e durante e/o dopo detta terapia. Successivamente, il confronto tra la concentrazione ottenuta in detto primo e detto almeno secondo campione per una stessa proteina, tra quelle qui indicate, fornirà informazioni circa l’andamento dello stato patologico del paziente..
La variazione della concentrazione di almeno una delle proteine comprendente o consistente nelle SEQ ID NO 1-6 tra i due campioni analizzati è, quindi, lo strumento che consente al clinico la valutazione dell’efficacia o meno della strategia terapeutica scelta. In particolare, una diminuzione della concentrazione di detta almeno una proteina comprendente o consistente in SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 e/o un aumento della concentrazione di detta proteina comprendente o consistente in SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 6 in detto primo campione rispetto a detto almeno secondo è indicativo della progressione dell’endometriosi, in altri termini quindi di una terapia poco efficace. Viceversa, un aumento della concentrazione di detta almeno una proteina comprendente consistente in SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5 e/o una diminuzione della concentrazione di detta proteina comprendente consistente in SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 6 in detto primo campione rispetto a detto almeno secondo è indicativo dell’efficacia della terapia contro l’endometriosi. Alternativamente, una non variazione della concentrazione delle proteine di cui sopra in detti campioni, potrebbe indicare un rallentamento e/o arresto della progressione dell’endometriosi nel paziente,
Come già evidenziato, il tipo di terapia da monitorare è una generica terapia contro l’endometriosi. In particolare, la terapia può essere anche un trattamento di tipo chirurgico
Oggetto della presente descrizione, è anche un kit per la diagnosi di endometriosi e/o per il monitoraggio dell’endometriosi in un soggetto. Preferibilmente, il kit può essere un kit per il monitoraggio di una terapia contro l’endometriosi. In particolare, tale kit comprende almeno un’aliquota di uno o più reagenti necessari alla determinazione della concentrazione di almeno una proteina comprendente o consistente in una sequenza scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 o loro mutanti e/o varianti posttraduzionali in un campione biologico di detto soggetto.
Preferibilmente, il kit secondo l’invenzione potrà contenere una o più aliquote di almeno un anticorpo monoclonale o policlonale primario specifico contro una delle sequenze definite in SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 o SEQ ID NO. 6. Il kit potrà anche contenere una o più aliquote di un anticorpo secondario marcato o non marcato, detto anticorpo secondario essendo, ovviamente specifico per il sistema immunitario da cui è stato realizzato l’anticorpo primario. Quindi, se l’anticorpo primario è realizzato in topo, il secondario sarà antimouse, se realizzato in coniglio sarà anti-rabbit e così via.
Il kit potrà ulteriormente contenere controlli negativi e/o controlli positivi. In particolare, il kit può contenere come controllo positivo una o più aliquote comprendenti una o più sequenze amminoacidiche scelte nel gruppo tra: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6.
Inoltre, il kit può comprendere opportuni reagenti e mezzi per la procedura di rivelazione delle proteine di cui sopra mediante l’utilizzo di anticorpi, quali il tampone PBS o altri reagenti comunemente utilizzati per la rivelazione di anticorpi.
I seguenti esempi e risultati sperimentali hanno lo scopo di indicare delle vie di realizzazione della presente descrizione senza essere tuttavia limitativi della stessa.
ESEMPI
Esempio 1 : Raccolta e conservazione del materiale biologico
Sono stati raccolti e conservati congelati alla temperatura di -80ºC dieci campioni di plasma, rispettivamente da 5 pazienti con endometriosi accertata, dopo il prelievo sierico, con chirurgia ed esame istologico e da 5 pazienti sane di controllo. In dettaglio, i prelievi di sangue effettuati tramite puntura di una vena periferica, sono stati centrifugati a 3.000 rpm per 10 minuti a 4ºC e il p lasma ottenuto aliquotato e conservato a -80ºC
Esempio 2: Analisi proteomica tramite metodica del gel bidimensionale
I campioni di plasma sono stati preventivamente depletati delle proteine più abbondanti presenti nel siero (albumina, IgG, antitripsina, IgA, transferrina e aptoglobina), in maniera da poter evidenziare con maggiore chiarezza proteine diversamente espresse nei due gruppi di pazienti. Successivamente, sono state estratte le proteine dai 10 campioni di plasma e tali proteine sono state separate tramite elettroforesi su gel bidimensionali (20x 30 cm 2DE gel). Le proteine sono state evidenziate sul gel tramite una colorazione a base d'argento, idonea ad una successiva applicazione di Spettrometria di Massa. Tramite l'utilizzo di software dedicati, le immagini dei diversi gel sono state confrontate per individuare spot espressi in maniera costantemente e significativamente diversa nei due gruppi di pazienti. Opportuni test statistici sono stati utilizzati per confermare la validità statistica di queste differenze. Tale analisi ha individuato 5 spot significativamente e costantemente espressi in maniera diversa nei pazienti con endometriosi rispetto ai pazienti sani di controllo.
Tramite una metodica di spettrometria di massa (LC ESI MS/MS), sono state identificate le proteine corrispondenti a tali spot differenzialmente espressi. L'identificazione delle proteine corrispondenti agli spot identificati tramite 2D gel è stata effettuata tramite la teconologia nanoLC-ESI-MS/MS. L'apparato di MS consiste di un sistema Agilent 1100 nanoLC System (Agilent, Waldbronn, Germany), un NanoMate 100 (Advion, Ithaca, USA) e uno spettofotometro di massa Finnigan LTQ-FT (ThermoFisher, Bremen, Germany). Gli spoto proteici sono stati digeriti direttamente nel gel con tripsina (Promega, Mannheim, Germany) e applicati al sistema nanoLC ESI-MS/MS. I peptidi prodotti dalla digestione degli spot proteici sono stati intrappolati su una specifica colonna di arrichimento (Zorbax SB C18, 0.3 x 5 mm, Agilent) per cinque minuti, usando 1% acetonitrile/0.5% acido formico come eluente; successivamente i peptidi sono stati separati su di una colonna Zorbax 300 SB C18, 75 μm x 150 mm (Agilent) usando un gradiente di acetonitrile/0.1 % acido formico da 5% a 40% di acetonitrile per un periodo di 40 minuti. Gli spettri di massa sono stati automaticamente registrati dallo spettometro di massa seguendo le condizioni di utilizzo indicate dalla casa produttrice per le analisi di nanoLC-ESI-MSMS. Le proteine corrispondenti sono state, poi, identificate utilizzando il sistema di ricerca MS/MS del motore di ricerca Mascot (Matrix Science, London, England) e l'opportuno database proteico (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA).
Le proteine individuate attraverso tale metodica sono rispettivamente:
1) Proteina corrispondente all’apolipoproteina E mutante E3K umana (SEQ ID NO:1);
2) Proteina corrispondente alla catena A del complesso Ni antitrombina umana (SEQ ID NO:2);
3) Proteina corrispondente alla catena A dell’albumina sierica umana (SEQ ID NO:3);
4) Proteina corrispondente al precursore C3 del complemento (SEQ ID NO:4); 5) Proteina isolata da Homo sapiens (SEQ ID NO:5);
6) Proteina corrispondente alla glicoproteina Zn-alpha 2 (SEQ ID NO:6) Nelle figure 1A-F sono mostrati gli istogrammi esprimenti la differente
espressione delle proteine di cui sopra in un campione sierico di pazienti con
endometriosi rispetto ai campioni sierici di una popolazione controllo.
BIBLIOGRAFIA
- Fassbender A, Waelkens E, Verbeeck N, Kyama CM, Bokor A, Vodolazkaia A, Van de Plas R, Meuleman C, Peeraer K, Tomassetti C, Gevaert O, Ojeda F, De Moor B, D'Hooghe T: Proteomics analysis of plasma for early diagnosis of endometriosis. Obstet Gynecol 2012, 119: 276-285.
- Giudice LC , and Kao LC: Endometriosis. The Lancet, 364: 1789-1799, 2004.
- Hadfield R, Mardon H, Barlow D, Kennedy S. Delay in thè diagnosis of endometriosis: a survey of women from thè USA and thè UK. Hum Reprod 1996, 11 : 878-880.
- Houston DE: Evidence for thè risk of pelvic endometriosis by age, race, and socioeconomic status. Epidemiol Rev, 6: 167-191 , 1984.
- May KE, Conduit-Hulbert SA, Villar J, Kirtkley S, Kennedy SH, Becker CM: Peripheral biomarkers of endometriosis: a systematic review. Hum Reprod 2010, 16: 651-674.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi in un soggetto comprendente i seguenti passaggi: a) determinare la concentrazione di almeno una proteina comprendente una sequenza scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 o loro mutanti e/o varianti post-traduzionali in un campione biologico di detto soggetto e in un campione controllo; b) comparare dette concentrazioni in detto campione biologico e detto campione controllo in cui una diminuzione della concentrazione di detta almeno una proteina comprendente una sequenza scelta nel gruppo di SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e/o un aumento della concentrazione di detta almeno una proteina comprendente una sequenza scelta nel gruppo di SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6 rispetto alla medesima proteina in detto controllo è indicativo di endometriosi.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 , ulteriormente comprendente un passaggio di ottenimento di un estratto proteico da detto campione biologico.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto campione biologico è sangue o siero
  4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazione 1-3, in cui detta determinazione è effettuata mediante western-blot, ELISA (enzyme-linked Immunoasobent assay), RIA (radioimmunoassay), immunochimica, array proteici, spettrometria di massa.
  5. 5. Metodo in vitro per il monitoraggio dell’endometriosi in un soggetto comprendente i seguenti passaggi (ho ampliato la tutela visto che, come giustamente avete fatto notare, il monitoraggio può essere anche non legato al fatto che il paziente è sottoposto a terapia) a) determinare la concentrazione di almeno una proteina comprendente una sequenza scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 o loro mutanti e/o varianti post-traduzionali in un primo e in un secondo campione biologico, ottenuti rispettivamente al tempo t=0 e t>0, di detto soggetto, b) comparare detta concentrazione ottenuta per detto primo e secondo campione.
  6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui una diminuzione della concentrazione di detta almeno una proteina comprendente una sequenza scelta nel gruppo di SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e/o un aumento della concentrazione di detta proteina comprendente una sequenza scelta nel gruppo di SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6 in detto primo campione rispetto a detto secondo è indicativo della progressione dell’endometriosi.
  7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 5 o 6, in cui detto primo e secondo campione sono rispettivamente ottenuti prima dell’inizio di una terapia e durante e/o dopo detta terapia.
  8. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 7, ulteriormente comprendente un passaggio di ottenimento di un estratto proteico da detti campioni biologici.
  9. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 8, in cui detti campioni biologici sono sangue o siero.
  10. 10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 9, in cui detta terapia è un trattamento chirurgico.
  11. 11. Kit per la diagnosi di endometriosi e/o per il monitoraggio dell’endometriosi in un soggetto comprendente: -almeno un’aliquota di uno o più reagenti necessari alla determinazione della concentrazione di almeno una proteina comprendente una sequenza scelta nel gruppo di: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 o loro mutanti e/o varianti post-traduzionali in un campione biologico di detto soggetto.
  12. 12. Kit secondo la rivendicazione 11 , ulteriormente comprendente almeno un’aliquota di un controllo positivo comprendente una o più sequenze amminoacidiche scelte nel gruppo tra: SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6.
IT000214A 2012-05-14 2012-05-14 Metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi. ITRM20120214A1 (it)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000214A ITRM20120214A1 (it) 2012-05-14 2012-05-14 Metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi.
US14/400,884 US20150141276A1 (en) 2012-05-14 2013-05-13 In vitro method for diagnosis of endometriosis
PCT/IB2013/053875 WO2013171655A1 (en) 2012-05-14 2013-05-13 An in vitro method for diagnosing of endometriosis
ES13731914.1T ES2641367T3 (es) 2012-05-14 2013-05-13 Un método in vitro para el diagnóstico de endometriosis
EP13731914.1A EP2850436B1 (en) 2012-05-14 2013-05-13 An in vitro method for diagnosing of endometriosis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000214A ITRM20120214A1 (it) 2012-05-14 2012-05-14 Metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ITRM20120214A1 true ITRM20120214A1 (it) 2013-11-15

Family

ID=46210347

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
IT000214A ITRM20120214A1 (it) 2012-05-14 2012-05-14 Metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi.

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20150141276A1 (it)
EP (1) EP2850436B1 (it)
ES (1) ES2641367T3 (it)
IT (1) ITRM20120214A1 (it)
WO (1) WO2013171655A1 (it)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001032920A2 (en) * 1999-11-03 2001-05-10 Metris Therapeutics Limited Agents implicated in endometriosis
US20020119143A1 (en) * 2001-01-17 2002-08-29 Robinson C. Jane Antithrombin III for disorders caused by angiogenesis
WO2005008251A2 (en) * 2003-07-11 2005-01-27 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of endometriosis

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3395900A (en) * 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
EP2065707A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-03 Laboratorios S.A.L.V.A.T., S.A. Detection of endometrial secretion markers for assesment of endometriosis
US20090220994A1 (en) * 2008-02-28 2009-09-03 Children's Medical Center Corporation Methods for diagnosis of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome
GB0914330D0 (en) * 2009-08-17 2009-09-30 Univ Dublin City A method of predicting response to thalidomide in multiple myeloma patients
CN103068400A (zh) * 2010-06-25 2013-04-24 阿斯顿大学 具有脂类动员性质的糖蛋白及其治疗用途
UY33826A (es) * 2010-12-22 2012-07-31 Abbott Lab Proteínas de unión con dominios trivariables y sus usos

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001032920A2 (en) * 1999-11-03 2001-05-10 Metris Therapeutics Limited Agents implicated in endometriosis
US20020119143A1 (en) * 2001-01-17 2002-08-29 Robinson C. Jane Antithrombin III for disorders caused by angiogenesis
WO2005008251A2 (en) * 2003-07-11 2005-01-27 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of endometriosis

Also Published As

Publication number Publication date
EP2850436B1 (en) 2017-07-05
US20150141276A1 (en) 2015-05-21
WO2013171655A1 (en) 2013-11-21
EP2850436A1 (en) 2015-03-25
ES2641367T3 (es) 2017-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10184943B2 (en) Multiple biomarker set for breast cancer diagnosis, method of detecting the same, and diagnosis kit for breast cancer using antibody against the same
ES2951899T3 (es) Identificación y monitorización de inmunoglobulinas monoclonales por masa molecular
US9188582B2 (en) Method for predicting the presence of reproductive cells in TESTIS
DK2510359T3 (en) METHODS AND REAGENTS FOR IMPROVED DETECTION OF AMYLOID-BETA PEPTIDES
Shan et al. Abnormal partitioning of hexokinase 1 suggests disruption of a glutamate transport protein complex in schizophrenia
Hosseinkhani et al. Direct detection of nano-scale extracellular vesicles derived from inflammation-triggered endothelial cells using surface plasmon resonance
JPWO2008120684A1 (ja) 急性中枢神経障害の予後判定方法
Landi et al. A functional proteomics approach to the comprehension of sarcoidosis
US20150072360A1 (en) Biomarkers of pulmonary hypertension
JPWO2019004430A1 (ja) 大腸がんを検出するためのバイオマーカー
EP3088899B1 (en) Biomarkers for psychiatric diseases including cognitive impairment and methods for detecting psychiatric diseases including cognitive impairment using the biomarkers
JP2015105951A (ja) 血液由来の癌診断用ペプチドマーカー及びそれを用いた癌診断方法
JP7457300B2 (ja) 神経変性疾患の診断用ペプチドマーカー
JP5641471B2 (ja) 統合失調症マーカー及びその利用
US20090130662A1 (en) Method for Diagnosis of Prostate Cancer
US20100080803A1 (en) Labor biomarkers, methods comprising same, and methods targeting same
US20220196670A1 (en) Endometrial receptivity determination
ITRM20120214A1 (it) Metodo in vitro per la diagnosi di endometriosi.
US20220178924A1 (en) Systems and methods for identifying subtype, prognosis, and monitoring of breast cancer
EP3342861A1 (en) Specifically purified anti-presepsin antibody
EP3908841B1 (en) In vitro method for the diagnosis or prognosis of neurodegenerative disorders
CN111971561A (zh) 同种异体移植受体分型的生物标记物
KR102141546B1 (ko) 난청 예후 예측방법 및 이를 이용한 키트
JP2012018160A (ja) 精神障害の診断方法および診断薬キット
KR101431065B1 (ko) 유방암 진단용 단백질 마커 신경세포 접착분자 ｌ1 유사 단백질, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트