ITRM20130280A1 - Procedimento per la preparazione di eritrociti caricati con una o più sostanze di interesse farmaceutico. - Google Patents

Description

Procedimento per la preparazione di eritrociti caricati con una o più sostanze di interesse farmaceutico.

DESCRIZIONE

La presente invenzione à ̈ diretta ad un procedimento per preparare eritrociti caricati con uno o più principi attivi, alla popolazione di eritrociti caricati così ottenuti e a composizioni farmaceutiche comprendenti detta popolazione di eritrociti caricati.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE

I globuli rossi noti anche come eritrociti sono descritti nello stato della tecnica nota tra i veicoli (carrier) farmaceutici in grado di trasportare e rilasciare in circolo e/o indirizzare efficientemente principi attivi nei siti bersaglio di interesse. Il vantaggio nell’utilizzo degli eritrociti come carrier farmaceutici risiede principalmente nel fatto che il principio attivo può essere mantenuto in circolo per periodi di giorni o settimane e comunque per periodi molto più lunghi di quanto avvenga normalmente impiegando formulazioni orali, intravenose o sistemi di rilascio prolungato mediati da liposomi o altri carrier farmaceutici. Inoltre, tali veicoli, una volta svolta la loro funzione di trasporto del principio attivo, sono rimossi dal circolo secondo la via fisiologica di eliminazione dei globuli rossi nativi nel fegato e nella milza.

Numerose procedure sono state proposte per incapsulare nei globuli rossi umani o di altri mammiferi principi attivi o mezzi di contrasto per fini biomedicali e clinici.

In particolare, nel brevetto EP0882448 à ̈ stato descritto per la prima volta un procedimento per incapsulare medicamenti negli eritrociti in concentrazioni sufficienti a permettere l’ottenimento dell’effetto farmacologico desiderato. Il procedimento descritto nel brevetto anteriore di cui sopra, comprende una serie di passaggi operativi riassumibili in:

- un primo passaggio in cui gli eritrociti sono rigonfiati;

- un secondo passaggio in cui gli eritrociti rigonfiati sono lisati per consentire l’apertura sulla membrana di detti eritrociti di pori sufficientemente ampi da permettere l’ingresso nello spazio intracellulare dei principi attivi di interesse;

- un passaggio di concentrazione degli eritrociti lisati

- un passaggio di incapsulamento nel quale gli eritrociti sono messi in contatto con i principi attivi, seguito da un passaggio di chiusura/risigillamento degli eritrociti, che ha lo scopo di intrappolare i principi attivi nei globuli rossi stessi.

Il procedimento appena descritto ha permesso di poter ottenere eritrociti caricati con principi attivi e idonei ad essere utilizzati come carrier per medicamenti. Attualmente quindi la metodica di riferimento più efficace per incapsulare farmaci nei globuli rossi rimane, per il tecnico del settore, quella sopra descritta.

Nell’utilizzo di tale procedimento si à ̈ osservato tuttavia che nel passaggio di concentrazione degli eritrociti lisati alle condizioni operative definite nel brevetto sopra indicato, gli eritrociti lisati sono sottoposti a stress meccanico che può rendere difficoltoso il successivo passaggio di ricostituzione degli eritrociti caricati.

Tra le varie tecniche note per incapsulare sostanze attive negli eritrociti, quella descritta dal brevetto EP1773452-B1 prevede una correzione dei parametri di processo come il cambiamento del flusso della soluzione lisante e l'aggiustamento della sua osmolalità, al fine di ottenere la riproducibilità nell'incapsulamento della sostanza attiva al variare della Fragilità Osmotica (o resistenza globulare osmotica) del paziente.

Scopo della presente invenzione à ̈ quello di migliorare ulteriormente i risultati, per altro già soddisfacenti, raggiunti con il procedimento descritto in EP 0882448 al fine di ottenere un procedimento perfezionato per incapsulare sostanze di interesse farmaceutico negli eritrociti.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

La presente domanda si riferisce ad un procedimento per la preparazione di eritrociti caricati con una o più sostanze di interesse farmaceutico che, rispetto all’analogo procedimento descritto nello stato della tecnica nota, risulta essere migliorato in diversi aspetti.

In particolare tale procedimento comprende una serie di passaggi operativi che si caratterizzano per il fatto che il passaggio di concentrazione degli eritrociti à ̈ eseguito prima del passaggio di lisi cellulare necessario a consentire l’incapsulamento di molecole farmaceuticamente attive nei globuli rossi. Precisamente tale passaggio di lisi à ̈ eseguito durante la fase di contatto con una soluzione comprendente la sostanza da incapsulare.

Il procedimento dell’invenzione prevede che gli eritrociti di partenza siano sottoposti a due passaggi successivi di rigonfiamento cellulare, senza lisi, utilizzando idonee soluzioni ipotoniche, passaggi che, di fatto, sostituiscono il passaggio di rigonfiamento e quello di lisi secondo l’analogo procedimento dell’arte anteriore.

Pertanto formano oggetto della presente invenzione un procedimento di preparazione di eritrociti caricati con una o più sostanze di interesse farmaceutico, per esempio principi attivi, comprendente passaggi in cui:

a) si rigonfiano gli eritrociti utilizzando una prima soluzione ipotonica;

b) si rigonfiano ulteriormente, senza giungere a lisi, gli eritrociti ottenuti al passaggio a) utilizzando una seconda soluzione ipotonica detta seconda soluzione essendo più ipotonica di detta prima soluzione;

c) si concentrano gli eritrociti ottenuti al passaggio b);

d) si pongono gli eritrociti così concentrati a contatto con una soluzione lisante comprendente una o più sostanze di interesse farmaceutico e successivamente e) si aggiunge una soluzione di sigillamento allo scopo di ottenere una popolazione di eritrociti caricati con detta e dette sostanze di interesse farmaceutico. Il procedimento può vantaggiosamente comprendere un passaggio intermedio (a2) tra i passaggi (a) e (b) in cui si rimuove, almeno in parte, la prima soluzione ipotonica, prima di aggiungere la seconda soluzione ipotonica.

Formano ulteriori oggetti dell’invenzione la popolazione di eritrociti caricati con uno o più principi attivi ottenibile mediate il procedimento di cui sopra e le composizioni farmaceutiche comprendente una popolazione di eritrociti caricati come sopra definito.

L’invenzione si basa sulla sorprendente scoperta che à ̈ possibile incapsulare principi attivi negli eritrociti sottoposti solo a rigonfiamento e concentrazione degli stessi senza precedente induzione dell’emolisi. Infatti l’apertura dei pori (emolisi) può essere efficacemente ottenuta, dopo concentrazione, con la stessa soluzione contenente le sostanze di interesse. Il nuovo procedimento risulta molto più efficace dei metodi precedenti e genera un prodotto finale (eritrociti contenenti almeno una sostanza farmaceuticamente attiva) molto simile agli eritrociti nativi (non sottoposti a procedimento).

Vantaggi offerti dall’invenzione

Le variazioni operative introdotte nel nuovo procedimento consentono sia di preservare al meglio la membrana plasmatica dei globuli rossi sia di concentrarli maggiormente al fine di rendere l’efficienza di incapsulamento molto più alta.

Nel procedimento dell’invenzione l’incapsulamento delle sostanze di interesse avviene con una resa migliore rispetto al procedimento descritto nello stato della tecnica nota. In particolare, gli inventori del presente procedimento hanno dimostrato che per raggiungere gli stessi livelli di principio attivo incapsulato à ̈ possibile utilizzare, nel procedimento dell’invenzione, un quantitativo significativamente più basso di principio attivo di partenza rispetto a quello attualmente utilizzato con il procedimento standard. In particolare, come riportato anche nella sezione sperimentale, per ottenere un incapsulamento fino a circa 11 mg, ad esempio di desametasone sodio fosfato, a parità di quantità di globuli rossi sottoposti al trattamento, sono necessari circa 500 mg di farmaco di partenza con la procedura dell’arte anteriore e solo 62,5 mg con il procedimento qui descritto.

Inoltre tale procedimento si à ̈ rivelato riproducibile ed affidabile nell’incapsulare nei globuli rossi quantitativi della sostanza di interesse in maniera proporzionale alla quantità iniziale della stessa sostanza: queste caratteristiche permettono l’utilizzo clinico di dosi differenti, consentendo di somministrare dosaggi commensurati alle differenti necessità cliniche, variando soltanto la quantità di principio attivo aggiunta durante il procedimento.

La maggiore efficienza di incapsulamento à ̈ stata dimostrata non solo con molecole attive aventi pesi molecolari bassi (ad esempio desametasone sodio fosfato come mostrato nell’esempio 1) ma anche con molecole aventi pesi molecolari elevati. Come riportato nell’esempio 5, sono state efficacemente incapsulate proteine aventi pesi molecolari dell’ordine di 110 kDa (dimeri di esochinasi Hk del lievito di 55 kDa) oppure dell’ordine di 60 kDa (timidina fosforilasi).

Grazie alla sequenza modificata delle fasi operative si sono ottenuti importanti miglioramenti anche nei parametri fisiologici relativi alla popolazione di eritrociti caricati e ottenuti con il procedimento dell’invenzione. In particolare, come mostrato negli esempi, gli eritrociti caricati con il procedimento qui descritto presentano parametri quali, volume cellulare medio e la vitalità cellulare (metabolismo) del tutto paragonabili a quelli degli eritrociti non trattati. Nel complesso i dati sperimentali dimostrano come il nuovo procedimento riesca a preservare meglio le dimensioni cellulari e il contenuto cellulare degli eritrociti di partenza rispetto alla procedura dell’arte anteriore, consentendo, di fatto, di ottenere una popolazione di eritrociti caricati significativamente più simile dal punto di vista fisiologico ad una popolazione di eritrociti non trattata.

Esperimenti comparativi condotti tra la popolazione di eritrociti caricati secondo l’invenzione o con l’analogo procedimento di arte anteriore hanno dimostrato, ad esempio, che il volume cellulare medio (MCV) dei globuli rossi à ̈ rispettivamente di circa 86 femtolitri (presente invenzione) e di circa 71 femtolitri (arte anteriore) laddove il valore di MCV per gli eritrociti non trattati à ̈ compreso tra 80-97 femtolitri. A questo si aggiunga che la quantità di emoglobina corpuscolare media (MCH) misurata nei globuli rossi sottoposti alla procedura qui in oggetto e quella descritta nello stato della tecnica nota à ̈ risultata essere rispettivamente di circa 21.2 picogrammi (molto più vicina alla norma) e di circa 14 picogrammi (arte anteriore) con un valore, per gli eritrociti non trattati, che normalmente varia tra 27.6-33.3.

La migliore sovrapposizione tra eritrociti caricati con la presente procedura ed eritrociti non trattati à ̈ confermata anche dalla maggiore vitalità (metabolismo) cellulare osservata. In particolare, come sarà meglio descritto successivamente, la vitalità degli eritrociti trattati in accordo alla presente invenzione à ̈ risulta essere significativamente migliore sia in termini di aumenta capacità metabolica sia in termini di ridotta presenza di marcatori di senescenza. Come discusso più in dettaglio di seguito, i dati relativi alla maggiore vitalità cellulare (maggiore metabolismo e minori marcatori di senescenza) consentono di affermare che il procedimento qui descritto à ̈, di fatto, in grado di produrre una popolazione di eritrociti caricati aventi un’emivita prevedibilmente maggiore rispetto agli eritrociti ottenuti con la procedura dell’arte anteriore. Ne consegue che la popolazione di eritrociti secondo l’invenzione consente di ottenere il trasporto delle sostanze incapsulate e/o il loro rilascio per un periodo di tempo più lungo rispetto a quanto consentito dagli eritrociti caricati ottenuti in accordo alla procedura descritta nella tecnica nota.

La presente invenzione, grazie agli accorgimenti tecnici descritti, permette di superare anche i limiti del metodo descritto in EP1773452-B1 e di ottenere un incapsulamento di sostanza attiva riproducibile senza correzione dei parametri di processo per ogni singolo paziente, poiché il processo risulta indipendente sia dalla diversa fragilità osmotica dei globuli rossi del paziente (come dimostrato nell'esempio 7) che dall’ematocrito iniziale (come dimostrato nell'esempio 8).

Descrizione delle Figure

Figura 1: La figura 1 à ̈ una rappresentazione schematica del procedimento qui descritto confrontato col procedimento dell’arte anteriore (EP0882448).

Figura 2. La figura 2 à ̈ un grafico relativo alla resistenza globulare osmotica (RGO) per due individui, valutata misurando l’emoglobina libera totale in funzione della osmolalità. La RGO viene anche espressa come osmolalità alla quale si osserva il 50% di emolisi ovvero 50% di emoglobina libera.

Figura 3: rappresentazione di un kit idoneo all’esecuzione del procedimento dell’invenzione quando impiegato congiuntamente ad un dispositivo medico come descritto in BO2010A000255.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

GLOSSARIO

Alcuni termini tipici del settore tecnico sono di seguito chiariti.

Ai fini della presente invenzione con l’espressione “rigonfiamento degli eritrociti†si intende un aumento del volume e della sfericità degli eritrociti dovuto ad aumento della pressione interna causata dall’ingresso principalmente di acqua, tuttavia senza fenomeni di apertura abnorme dei pori sulla membrana cellulare o rottura irreversibile della stessa. Normalmente il rigonfiamento, nell’intendimento del presente brevetto, non implica la fuoriuscita di materiale cellulare.

Ai fini della presente invenzione, e nello specifico campo tecnico, con i termini “lisi†o “emolisi†o “lisi parziale†si intende l’apertura reversibile dei pori sulla membrana cellulare con conseguente libero passaggio nei due sensi di materiali intra- e extracellulari. La lisi, pertanto, à ̈ un fenomeno di permeabilizzazione temporanea e reversibile e non di rottura totale irreversibile della membrana cellulare.

Ne consegue che l’espressione “eritrocita lisato†si riferisce ad un eritrocita che presenta sulla membrana plasmatica pori che possono essere richiusi in maniera tale che venga ripristinata l’integrità della membrana cellulare.

Ai fini della presente descrizione con l’espressione “soluzione di (ri)sigillamento†si intende una soluzione utilizzata in grado di consentire la chiusura dei pori presenti sulla membrana plasmatica degli eritrociti tramite principalmente fuoriuscita di acqua. Tale soluzione consente di incapsulare all’interno degli eritrociti la o le sostanze di interesse farmaceutico grazie all’apertura di detti pori.

Con l’espressione “eritrociti caricati†si intende nella presente descrizione eritrociti (indicati anche come globuli rossi) che incapsulano al loro interno quantità variabili di una o più sostanze di interesse.

Ai fini della presente invenzione con l’espressione “eritrociti sigillati†ci si riferisce a globuli rossi che, differentemente dell’eritrocita lisato, presentano una permeabilità della membrana plasmatica paragonabile (sovrapponibile) a quella dei globuli rossi non trattati.

Per attuare il procedimento dell’invenzione, gli eritrociti di partenza possono essere ottenuti mediante prelievo e isolamento dei globuli rossi da un campione ematico di un individuo. Preferibilmente il campione di partenza à ̈ trattato con un agente anti-coagulante, per esempio l’eparina, allo scopo di evitarne la coagulazione.

Opzionalmente, gli eritrociti, prima d’essere sottoposti al trattamento secondo l’invenzione, possono essere isolati e sottoposti a uno o più lavaggi con soluzione fisiologica al fine di ottenere una popolazione di eritrociti di partenza in cui non siano presenti, o siano presenti in concentrazioni trascurabili, eventuali contaminanti, ad esempio, plasma, piastrine, linfociti ecc.

Passaggio (a):

Come sopra indicato, il procedimento comprende un passaggio a) in cui la popolazione di eritrociti à ̈ rigonfiata inizialmente mediante l’utilizzo di una prima soluzione ipotonica.

In una forma di realizzazione dell’invenzione, la prima soluzione ipotonica ha una osmolalità compresa tra 230-150 mOsm/Kg, per esempio un’osmolalità preferita di 180 mOsm/Kg. In ogni caso l’osmolalità ed il volume della prima soluzione sono tali che il contatto con questa prima soluzione porti i globuli rossi ad una osmolalità compresa nell’intervallo da 250 a 200 mOsm/Kg. In particolare, la prima soluzione ipotonica può essere, ad esempio, ottenuta miscelando 5 volumi di soluzione salina fisiologica e 3 volumi di acqua distillata sterile. A scopo meramente esemplificativo e non limitativo, il passaggio (a) può essere eseguito mantenendo gli eritrociti in circa 300 mL della prima soluzione ad una concentrazione (ematocrito) di circa il 3-7%, per un tempo di circa 5 minuti a temperatura ambiente.

Il passaggio a) può essere opzionalmente seguito da un passaggio di rimozione, almeno in parte, della prima soluzione ipotonica dagli eritrociti rigonfiati. Tale rimozione può essere ottenuta, per esempio, per delicata centrifugazione degli eritrociti trattati e separazione del surnatante.

Passaggio (b):

Gli eritrociti rigonfiati ottenuti come sopra indicato sono successivamente sottoposti ad un ulteriore rigonfiamento mediante l’utilizzo di una seconda soluzione ipotonica (passaggio b). La seconda soluzione si caratterizza per il fatto di essere più ipotonica della prima soluzione. La tonicità della seconda soluzione à ̈ scelta in maniera tale da provocare l’ulteriore rigonfiamento degli eritrociti, senza tuttavia provocarne la lisi che ne causerebbe conseguente fuoriuscita di materiale intracellulare. Le condizioni di ipotonicità sono controllate in maniera tale da evitare l’induzione di un’eccessiva fragilità cellulare in vista del successivo passaggio di concentrazione degli eritrociti. I valori di osmolalità della seconda soluzione ipotonica sono determinati sperimentalmente in laboratorio e sono costanti nel procedimento. L’osmolalità della seconda soluzione à ̈ tale da portare i globuli rossi in uno stato di rigonfiamento senza tuttavia giungere all’apertura di pori sulla loro superficie, apertura che causerebbe la iniziale fuoriuscita di contenuto cellulare ed una eccessiva fragilità degli eritrociti.

La seconda soluzione ipotonica ha un’osmolalità compresa nell’intervallo da 80 a 170 mOsm/Kg. In una forma di realizzazione preferita, l’osmolalità della seconda soluzione à ̈ di circa 120 mOsm/Kg. In ogni caso l’osmolalità ed il volume della seconda soluzione sono tali che il contatto con questa seconda soluzione porta i globuli rossi ad una osmolalità compresa nell’intervallo da 200 a 170 mOsm/Kg.

La seconda soluzione ipotonica può essere ottenuta, ad esempio, miscelando 5 volumi di soluzione salina fisiologica e 7 volumi di acqua distillata sterile.

A scopo meramente esemplificativo, il passaggio (b) Ã ̈ eseguito mantenendo gli eritrociti in circa 64 mL della seconda soluzione ad una concentrazione (ematocrito) di circa 8-15%, per un tempo di circa 5 minuti e a temperatura ambiente.

Passaggio (c):

Gli eritrociti rigonfiati risultanti dai passaggi a) e b) di cui sopra sono poi sottoposti ad un passaggio c) di concentrazione. Qualsiasi tecnologia nota idonea alla concentrazione di un campione di eritrociti, per esempio emofiltrazione, centrifugazione o dialisi, può essere utilizzata per concentrare gli eritrociti rigonfiati. In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, la concentrazione à ̈ effettuata mediante emofiltrazione.

In particolare nell’emofiltrazione può essere utilizzato un qualsiasi emofiltro (oppure anche un filtro dializzante), noto agli esperti nell’arte, atto a separare la parte cellulare dal liquido in cui à ̈ sospesa al fine di ridurre il volume di sospensione e quindi concentrare gli eritrociti rigonfiati. In generale, minore à ̈ il volume dell’emofiltro (taglie per uso neonatale o pediatrico ad esempio) e più elevato sarà il livello di emoconcentrazione che si può raggiungere.

Preferibilmente l’emoconcentrazione à ̈ condotta a temperatura ambiente per un tempo variabile tra 15 e 35 minuti. In generale la concentrazione degli eritrociti (ematocrito) ottenuta alla fine del passaggio c) à ̈ superiore al 30%, per esempio 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%. In questa fase di concentrazione la osmolalità della sospensione di eritrociti à ̈ pressoché costante, variando soltanto di poche unità di mOsm/Kg rispetto alla osmolalità ottenuta dopo il contatto con la seconda soluzione ipotonica utilizzata nel precedente passaggio b).

Dal momento che, il passaggio di concentrazione à ̈ effettuato su globuli rossi rigonfiati ma essenzialmente integri nella loro struttura, cioà ̈ non lisati, il procedimento qui descritto consente di ridurre significativamente il rischio di ottenere eritrociti irreversibilmente danneggiati al punto tale da non poter più essere efficacemente utilizzati come carrier farmacologico. Infatti la finalità ottimale del procedimento à ̈ quella d’ottenere una popolazione di eritrociti caricati e “ricostituiti†con caratteristiche quanto più vicine possibili alle caratteristiche fisiologiche della popolazione di partenza e comunque in grado di svolgere il ruolo di carrier in maniera efficiente e per periodi di tempo prolungati.

Passaggio (d):

Successivamente, gli eritrociti così concentrati sono posti a contatto con una soluzione ipotonica lisante comprendente una o più sostanze di interesse farmaceutico (passaggio d). Tale soluzione ha la caratteristica di abbassare la osmolalità dei globuli rossi fino a causarne la loro lisi temporanea, cioà ̈ l’apertura reversibile dei pori sulla membrana cellulare. La soluzione contenente i principi attivi può essere per esempio una soluzione acquosa a bassa osmolalità.

In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, la soluzione lisante ha un’osmolalità compresa da 10 a 100 mOsm/Kg. In ogni caso l’osmolalità ed il volume della soluzione lisante sono tali che il contatto con la soluzione lisante porti i globuli rossi ad una osmolalità compresa nell’intervallo da 150 a 110 mOsm/Kg.

Tale soluzione, oltre ad essere ipotonica, contiene la o le sostanze di interesse da incapsulare. La permeabilizzazione della membrana plasmatica degli eritrociti favorirà quindi la loro diffusione all’interno della cellula.

A titolo esemplificativo, il passaggio (d) può essere eseguito mantenendo gli eritrociti, ad una concentrazione (ematocrito) del 30-65%, a contatto con la soluzione lisante contenente le sostanze attive, per un tempo di circa 10 minuti a temperatura ambiente.

Passaggio (e):

Allo scopo di incapsulare la o le molecole di interesse all’interno degli eritrociti à ̈ utilizzata una soluzione di sigillamento, finalizzata a riportare i parametri degli eritrociti trattati quanto più vicino possibile alle condizioni fisiologiche. La soluzione di sigillamento à ̈ soluzione ipertonica con una osmolalità compresa nell’intervallo da 300 a 5000 mOsm/Kg.

In una forma specifica di realizzazione dell’invenzione la soluzione di sigillamento impiegata à ̈ una soluzione di Fosfato-Inosina-Glucosio-Piruvato-Adenina (PIGPA). E’ possibile comunque ottenere un effetto di chiusura analogo tramite qualunque soluzione ipertonica composta, ad esempio, di acqua distillata e sali minerali o altri nutrienti utilizzati dai globuli rossi. Tuttavia la soluzione ipertonica PIGPA à ̈ da preferirsi dal momento che comprende sostanze nutrienti che aiutano la cellula a ripristinare parte del contenuto andato perduto e le funzioni metaboliche cellulari. In tal senso viene facilitata la richiusura dei pori e ristabilita la normale struttura di membrana (reannealing).

A scopo esemplificativo, la soluzione sigillante preferibilmente ha la seguente composizione: 33 mM NaH2PO4; 1.606 M KCl; 0.194 M NaCl; 0.1 M inosina; 5 mM adenina; 20 mM ATP; 0.1 M glucoso; 0.1 M piruvato; e 4 mM MgCl2.. In maniera esemplificativa, possono essere usati circa 3 mL della soluzione sigillante per un volume di circa 35-55 mL di eritrociti lisati ad una concentrazione (ematocrito) di circa 15-40%. In particolare il contatto della soluzione sigillante con gli eritrociti può ad esempio essere condotto per circa 30 minuti, preferibilmente alla temperatura di 37° C. In questa fase la sospensione di globuli rossi à ̈ portata ad una osmolalità almeno uguale o superiore a quella fisiologica. Benché la temperatura di 37°C non sia essenziale, essa contribuisce al rapido e ottimale ripristino dei processi metabolici all’interno della cellula.

Le sostanze di interesse farmaceutico da incapsulare, da sole o in combinazione, nei globuli rossi potranno essere scelte tra quelle note a seconda delle particolari esigenze di trattamento richieste.

In una forma di realizzazione dell’invenzione, le sostanze di interesse farmaceutico sono scelte dai seguenti gruppi: principi attivi scelti tra peptidi, oligopeptidi, polipeptidi, proteine; principi attivi scelti tra oligonucleotidi, analoghi nucletidici, nucleosidi, analoghi nucleosidici; principi attivi scelti tra ormoni, immunosoppressori, anti-tumorali, corticosteroidi, glucocorticoidi, anti-retrovirali antiinfiammatori non steroidei, citochine, tossine, sostanze con attività vaccinante; mezzi di contrasto per la diagnostica; particelle o nanoparticelle scelte tra nanoparticelle contenenti un metallo, nanoparticelle magnetiche, nanoparticelle superparamagnetiche (SPIO), complessi nanoparticella-molecola attiva.

Per esempio, le sostanze possono essere scelte tra 6-mercaptopurina, fludarabina fosfato, azidotimidina fosfato, dideossicitosina, dideossiinosina, glutatione, bisfosfonati, prednisolone, prednisolone fosfato, desametasone, desametasone fosfato, betametasone, betamatasone fosfato, timidina fosforilasi, fenilalanina ammonioliasi, verde di indocianina, particelle super-paramagnetiche.

In una forma di realizzazione della presente invenzione, i principi attivi possono comprendere anche pro-farmaci ovvero precursori di ingredienti biologicamente attivi. A titolo esemplificativo e non limitante, tale pro-farmaco può essere desametasone sodio fosfato (oppure desametasone-21 fosfato) che, una volta incapsulato nella cellula dell’eritrocita e somministrato al paziente, à ̈ convertito, mediante un meccanismo di attivazione endogeno (defosforilazione), nella forma di farmaco anti-infiammatorio attivo desametasone. Alternativamente, la conversione da pro-farmaco a farmaco può essere ottenuta, nel caso non sia presente un meccanismo di attivazione endogeno, mediante co-somministrazione dell’idoneo attivatore, nel medesimo eritrocita.

Forma ulteriore oggetto della presente invenzione una popolazione di eritrociti caricati con uno o più sostanze di interesse farmaceutico ottenibile mediante il procedimento sopra descritto.

Come già indicato, la popolazione di eritrociti ottenuti col procedimento della presente invenzione mostra una maggiore vitalità (metabolismo e sopravvivenza) cellulare rispetto all’analoga popolazione ottenuta con il procedimento descritto in letteratura. In particolare, gli eritrociti trattati secondo la presente invenzione hanno una emivita cellulare, valutata in termini di percentuale di fosfatidilserina misurata con il saggio dell’Annessina V, molto simile a quella degli eritrociti nativi. Il saggio dell’Annesina V à ̈ effettuato nella pratica di laboratorio dal tecnico del settore, à ̈ già stato descritto in letteratura (Canonico B. et al. 2010) e pertanto non necessita in questa sede di particolari approfondimenti. Detto saggio misura la percentuale di eritrociti che esprimono la fosfaditilserina sulla superficie esterna della membrana plasmatica la cui presenza à ̈ indice di danno e accelerata senescenza cellulare tramite il naturale meccanismo di eliminazione. In generale, i globuli rossi con fosfatidilserina esposta sono soggetti a fagocitosi e sono eliminati dal circolo sanguigno più rapidamente rispetto agli eritrociti che non presentano tale proteina sulla membrana esterna. Ne consegue che, tanto minore à ̈ la percentuale di eritrociti con fosfatidilserina esposta tanto maggiore sarà prevedibilmente l’emivita degli eritrociti messi in circolo nel corpo umano. L’aumentata emivita si riflette in tempi di rilascio del medicamento o di trasporto in circolo più lunghi. Nella popolazione di eritrociti caricati con il procedimento dell’invenzione, si osservano percentuali medie di fosfatidilserina esposta al di sotto del del 10%, per esempio 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, mentre il corrispondente valore di fosfatidilserina esposta su eritrociti trattati con altre procedure può superare il 20-40%. Questi risultati dimostrano che il procedimento dell’invenzione permette di ottenere eritrociti-carrier che, essendo dotati di emivita prevedibilmente pressoché naturale, trasportano in circolo e/o rilasciano le sostanze incapsulate per un periodo di tempo sufficientemente lungo da rispondere alle esigenze farmacologiche più comuni.

L’ottima vitalità della popolazione di eritrociti qui descritti à ̈ confermata anche dalla valutazione della capacità metabolica degli eritrociti ottenuti. La valutazione della capacità metabolica, come noto al tecnico del settore, à ̈ indice della capacità della cellula di preservare le funzioni biochimiche necessarie per la sua sopravvivenza. I globuli rossi sono cellule la cui produzione di energia à ̈ essenzialmente basata sulla via biochimica della glicolisi di cui il lattato rappresenta il prodotto finale. Per la popolazione di eritrociti oggetto della presente domanda à ̈ stato dimostrato che la quantità media di lattato prodotta per ogni 10<6>eritrociti à ̈ maggiore di 0.100 nmol/h ovvero molto simile a quella degli eritrociti nativi.

Le caratteristiche biochimiche/molecolari sopra descritte, relative alla popolazione di eritrociti oggetto della presente domanda indicano che tale popolazione può essere utilizzata come carrier per principi attivi più efficientemente rispetto alla popolazione di eritrociti descritta nello stato della tecnica nota, dal momento che essa à ̈ caratterizzata da una maggiore vitalità e da un’emivita prevedibilmente più lunga.

Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ una composizione farmaceutica comprendente eritrociti caricati ottenuti secondo l’invenzione e un eccipiente farmacologicamente accettabile.

Le composizioni qui descritte sono composizioni idonee per la somministrazione di eritrociti ed idonee a raggiungere il sito bersaglio di interesse farmacologico. Pertanto sono composizioni per somministrazione parenterale preferibilmente in soluzione fisiologica, ma anche, ad esempio, sospensioni acquose (anche glucosate) o formulate secondo quanto descritto nella tecnica nota. A titolo esemplificativo e non limitante, come eccipienti farmacologicamente accettabili possono essere utilizzati acqua o tamponi, integrati con conservanti, stabilizzanti, zuccheri e sali minerali ecc. Tali composizioni possono anche essere in forma liofilizzata per la conservazione e ricostituiti in un veicolante idoneo prima dell’uso.

Il procedimento oggetto della presente domanda può essere eseguito con qualsiasi apparecchiatura nota idonea alla emo-filtrazione con movimentazione di soluzioni differenti e controllo dei flussi, delle osmolalità e dei volumi. Preferibilmente, l’apparecchiatura ed il processo sono gestiti in automatico sulla base di idoneo programma, per esempio utilizzando un’apparecchiatura elettromedicale detta Red Cell Loader.

Un esempio di kit per la conduzione del processo rivendicato, da utilizzarsi congiuntamente ad apparecchiatura descritta nella precedente domanda di brevetto Italiana BO2010A000255, Ã ̈ illustrato nella Figura 3. Il kit contiene i seguenti elementi strutturali numerati:

(1) Connettore spike per soluzione ipotonica 1

(2) Connettore spike per soluzione ipotonica 2

(3) Connettore spike per sacca da 2 Litri di soluzione salina iniettabile (Lavaggio) (4) Connettore per sacca scarto

(5) Connettore luer per ingresso 50 mL sangue del paziente (siringa da 50 mL) (6) Sacca raccolta finale (final collection bag)

(7) Sacca scarto (waste bag)

(8) Sacca transfer (transfer bag)

(9) Connettore per pompa al Red Cell Loader (lato dx macchina, lato stativo) (10) Reservoir ( per ultrafiltrato)

(11) Filtro emoconcentratore

(12) Bowl (campana di separazione e lavaggio sangue)

(13) Punto perforabile (per ingresso farmaco e soluzione risigillante PIGPA)

ESEMPI

L’invenzione à ̈ di seguito descritta con tutti i dettagli sperimentali nei seguenti esempi, che hanno finalità puramente descrittiva, e non limitativa della presente invenzione.

Esempio 1: Procedimento di caricamento degli eritrociti

Il procedimento di caricamento degli eritrociti à ̈ stato effettuato utilizzando l’apparato descritto nella domanda di brevetto (IT) BO2010A 000255 & US 61/373,018 secondo quanto di seguito dettagliato.

Gli eritrociti separati a partire da 50 mL di sangue intero, tramite un sistema centrifugo del tipo “Latham Bowl†in rotazione a 5600 rpm, sono lavati con 750 mL di soluzione salina ad una velocità di lavaggio di 225 mL/min e trasferiti nella sacca di trasferimento. Alla sacca di trasferimento sono aggiunti 300 mL di una prima soluzione ipotonica avente osmolalità di 200 mOsm/Kg che à ̈ poi incubata su una piastra di agitazione a temperatura ambiente per 5 minuti. Successivamente la prima soluzione ipotonica à ̈ allontanata mediante centrifugazione (Bowl) fino a raggiungere circa 80 mL di volume. Gli eritrociti così concentrati sono trasferiti di nuovo nella sacca di trasferimento alla quale sono poi aggiunti 64 mL di una seconda soluzione ipotonica con osmolalità di 180 mOsm/Kg.

La sacca à ̈ poi incubata a temperatura ambiente su una piastra in agitazione per 5 minuti. Al termine dell’incubazione gli eritrociti sono concentrati tramite un emofiltro e circa 80 mL di ultrafiltrato viene raccolto nel reservoir al quale viene applicato un leggero vuoto tramite una pompa da vuoto. Gli eritrociti così concentrati sono poi recuperati e trasferiti in una sacca di trasferimento. Il farmaco di interesse, in questo esempio il Desametasone sodio fosfato (25 mg/mL), à ̈ stato pre-miscelato ad 11 mL circa di acqua per soluzioni iniettabili (la preparazione ha osmolalità di circa 20 mOsm/Kg) ed aggiunto agli eritrociti concentrati mediante iniezione nella sacca di trasferimento. Tale operazione deve essere effettuata in 5 minuti. Il contenuto della sacca di trasferimento à ̈ poi incubato a temperatura ambiente su una piastra di agitazione per 10 minuti. Successivamente sono aggiunti 3 mL di una soluzione sigillante (con osmolalità 3800 mOsm/kg). Tale aggiunta deve essere effettuata in 5 minuti. La sacca di trasferimento à ̈ incubata per 30 minuti a 37°C± 2 sulla piastra d’agitazione. Gli eritrociti sono poi trasferiti nella campana di centrifugazione (Bowl) e lavati abbondantemente con 1100 mL di soluzione salina ad una portata di 225 mL/min. Infine, gli eritrociti caricati così ottenuti sono trasferiti in una sacca di raccolta finale. Il tempo totale della proceduta à ̈ di circa 1h e 30 min.

Esempio 2: Efficacia di incapsulamento

Il procedimento descritto nella presente invenzione permette un’efficienza di incapsulamento (introduzione) del principio attivo (desametasone sodio fosfato, in questo esempio) quasi 10 volte superiore al procedimento noto (procedimento 1), come mostrato in tabella 1.

In particolare, sono stati usati 50 mL di sangue intero come materiale di partenza. Nella fase di caricamento del principio attivo, (passaggio d) del metodo sopra descritto, sono aggiunti 20 mL di DSP (desametasone sodio fosfato) 25 mg/mL per il procedimento noto (procedimento 1), e solo 2.5 mL della stessa soluzione di DSP addizionati di 11 mL di acqua iniettabile nel procedimento della presente invenzione (procedimento 2). L’analisi del contenuto di DSP presente negli eritrociti caricati secondo il procedimento 1 o 2 à ̈ stata effettuata tramite strumentazione HPLC dopo estrazione del principio attivo dall’interno delle emazie mediante bollitura e diluizione in acqua e metanolo. I risultati sono riportati in Tabella 1.

Tabella 1

Procedimento noto Procedimento oggetto della 500mg di dose presente domanda 62.5 mg iniziale di DSP di dose iniziale di DSP

DSP

incapsulato a

mg/sacca 8.9 11.2

fine procedura

(media)

Esempio 3: Produzione di lattato negli eritrociti

E’ stata utilizzata una sacca di sangue intero proveniente da un donatore sano. Un’aliquota iniziale dei suoi globuli rossi à ̈ stata utilizzata come campione non trattato.

50 mL di sangue intero sono stati processati utilizzando il procedimento oggetto della presente invenzione. Al termine, della procedura sono stati prelevati 30 mL di eritrociti trattati e portati al 40% di ematocrito tramite centrifugazione. Successivamente ad ogni campione à ̈ stato aggiunto glucosio ed à ̈ stato incubato a 37<0>C per 3 ore, analizzando ogni 30 minuti l’accumulo di lattato nel surnatante (trasformazione del glucosio in lattato tramite la via metabolica glicolitica). L’analisi à ̈ stata eseguita attraverso l’uso di un emogas analizzatore.

La produzione di lattato degli RBC (eritrociti) non trattati à ̈ paragonabile alla produzione di lattato degli RBC prodotti con il procedimento qui descritto. Questo risultato indica che i globuli rossi ottenuti con il procedimento oggetto della presente invenzione sono in grado di mantenere la funzionalità metabolica principale (glicolisi) trasformando il glucosio in lattato con una efficienza simile ai globuli rossi non trattati (controllo), come mostrato in tabella 2.

Tabella 2

Procedimento qui RBC non trattati descritto 250mg DSP quantità iniziale Produzione di lattato nmol 106RBC/h 0.138 0.130

Esempio 4: Emivita degli eritrociti caricati

La presumibile emivita degli eritrociti caricati secondo il procedimento qui descritto à ̈ stata valutata mediante la misurazione dell’Annessina V sulla superficie cellulare, nota per essere un marcatore della morte cellulare (senescenza) come di seguito dettagliato.

In particolare à ̈ stata utilizzata una sacca di sangue intero proveniente da un donatore sano. Una aliquota iniziale dei suoi globuli rossi à ̈ stata utilizzata come campione non trattato. 50 mL di sangue intero sono stati processati utilizzando il procedimento oggetto della presente invenzione. 10<6>eritrociti sono stati prelevati dal prodotto finale del procedimento e dal campione non trattato; essi sono stati diluiti nel buffer di reazione per annessina V, aggiunti 3 µl di Annessina V coniugata con il fluorocromo FITC e si à ̈ proceduto con l’analisi al citofluorimetro.

Come mostrato nella tabella 3 di cui sotto, l’aumento di Annessina V dallo 0.75% del controllo non trattato al 6.26% dei globuli rossi ottenuti con il procedimento qui descritto à ̈ indice di una ancora elevata capacità di questi ultimi di rimanere in circolo per lungo tempo. Infatti, la letteratura riporta per prodotti basati su globuli rossi ad uso trasfusionale valori di Annessina V analoghi a quelli ottenuti per i globuli rossi caricati ottenuti con il procedimento qui descritto (Relevy H. et al., 2008).

Tabella 3

Procedimento qui descritto

RBC non trattati

250mg DSP quantità iniziale Annessina V % 0.75 6.26

Esempio 5 : Variazione dose incapsulata

Il procedimento oggetto della presente invenzione permette di incapsulare dosi di principio attivo, come ad esempio DSP (desametasone sodio fosfato), in un intervallo terapeutico molto ampio semplicemente variando la dose iniziale di farmaco utilizzata, come mostrato nella Tabella 4 sotto.

In particolare per ogni esperimento e per ogni quantità iniziale di DSP sono stati usati 50 mL di sangue intero. Per il caricamento del DSP secondo il procedimento noto sono stati aggiunti 20 mL di DSP 25 mg/mL.

Nel caso del procedimento qui descritto sono stati aggiunti per le dosi da 250, 125, 62.5 e 50, rispettivamente 10 mL, 5mL, 2.5 mL e 2 mL di DPS 25 mg/mL, premiscelati ciascuno a 11 mL di acqua iniettabile. L’analisi del DSP incapsulato nei globuli rossi prevede dapprima una diluizione 1:10 in acqua distillata, una fase di bollitura del campione per far denaturare le proteine, successiva centrifugazione ed estrazione in acqua e metanolo. L’analisi del DSP incapsulato à ̈ stata effettuata tramite HPLC. I risultati sono riportati in Tabella 4.

Tabella 4

Procedimento noto Procedimento qui descritto Quantità iniziale DSP mg 500 250 125 62.5 50 DSP dose incapsulata mg 8.9 29.4 18.3 11.2 9.9

Esempio 6 Incapsulamento di principi attivi ad elevato peso molecolare

Il procedimento oggetto della presente descrizione permette di incapsulare anche proteine ad elevato peso molecolare come l’Esochinasi (HK) con un’efficienza superiore al 15% di incapsulamento del prodotto iniziale, come mostrato in Tabella 5 sotto.

In particolare, sono stati usati 50 mL di sangue intero da donatore sano che sono stati sottoposti al procedimento di incapsulamento qui descritto. Il principio attivo incapsulato à ̈ stata la proteina Esochinasi. Nella fase di aggiunta del principio attivo sono stati inseriti 200 mg di HK disciolti in 14 mL di acqua iniettabile.

Tabella 5

Procedimento qui descritto

Quantità iniziale di

IU/totali 10000

proteina HK

Esochinasi (HK)

incapsulata a fine IU/totali 1600

processo

Esempio 7: Influenza della resistenza osmotica globulare sul caricamento degli eritrociti.

Ogni individuo possiede una propria resistenza globulare osmotica (RGO) che potrebbe influenzare l’esito del procedimento di caricamento. I dati rappresentati sotto indicano che donatori con resistenze osmotiche diverse tra loro mantengono caricamenti di farmaco molto simili. Pertanto il processo oggetto della presente invenzione dimostra di non essere significativamente influenzato dalla RGO iniziale del paziente come evidente dai dati in tabella 6, diversamente da quanto indicato per analoghi procedimenti noti.

Per determinare la variabilità del caricamento di prodotto all’interno dei globuli rossi al variare della RGO di vari individui si à ̈ utilizzato il procedimento decritto nella presente invenzione con una dose iniziale di DSP (desametasone sodio fosfato) pari a 50 mg. Sono state eseguite 5 prove partendo da 50 mL di sangue intero proveniente da 5 individui differenti con differenti RGO.

La resistenza globulare osmotica di ogni individuo à ̈ stata misurata diluendo una porzione del loro sangue intero in soluzioni con concentrazione decrescente di NaCl (8 diversi valori di osmolalità), misurando l’emoglobina libera in ciascuna delle soluzioni e costruendo il grafico dell’emoglobina libera totale in funzione della osmolalità (si veda figura 1). E’ stato successivamente ottenuto il valore di RGO (corrispondente all’osmolalità al 50% di emolisi ovvero 50% di emoglobina libera), per interpolazione di dette curve ottenute. L’emoglobina rilasciata à ̈ stata quantificata tramite il reattivo di Drabkin con lettura allo spettrofotometro (Drabkin DL. Med Sci 1949). L’analisi del DSP (desametasone sodio fosfato) caricato negli eritrociti finali à ̈ stata compiuta dopo lisi degli stessi tramite bollitura, estrazione in acqua-metanolo e metodica HPLC. I risultati sono riportati in tabella 6.

Tabella 6

RGO (Emolisi RGO (Emolisi

50%) 50%) Caricamento DSP

Concentrazione

Campione mOsm/Kg di NaCl g/dL mg/sacca

1 153 0.47 9.6

2 143 0.44 10.5

3 151 0.47 9.8

4 141 0.43 10.2

5 143 0.44 9.9

Media 146 ± 5 0.45 ± 0.02 10.0 ± 0.4

Come mostrato nella tabella 6 di cui sopra, nel procedimento qui descritto il caricamento di desametasone sodio fosfato (DSP) nei globuli rossi di individui con RGO iniziali differenti (da 141 a 153 mOsm/Kg) non mostra cambiamenti tali per cui si possa ipotizzare un effetto farmacologicamente diverso (media caricamento 10.0 ± 0.4 mg/sacca). La variazione di DSP incapsulato al variare della RGO dell’individuo descritto in questi esempi à ̈ trascurabile dal punto di vista farmacologico.

Esempio 8: Influenza della variazione di ematocrito iniziale sul caricamento degli eritrociti.

Per determinare la variabilità del caricamento degli eritrociti al variare dell’ematocrito del sangue iniziale, si à ̈ utilizzato il procedimento decritto nella presente invenzione con una dose iniziale di DSP (desametasone sodio fosfato) pari a 62,5 mg. Sono state eseguite 10 prove con 5 individui differenti (1 prova con ematocrito circa 40% ed 1 prova con ematocrito circa 50% per ogni donatore). La standardizzazione dell’ematocrito per ogni donatore à ̈ stata effettuata tramite centrifugazione o diluizione del sangue iniziale. L’analisi del DSP caricato negli eritrociti finali à ̈ stata compiuta dopo lisi degli stessi tramite bollitura, estrazione in acqua-metanolo e metodica HPLC. I

risultati sono riportati in Tabella 7.

Tabella 7

HCT sangue iniziale aggiustato 40% HCT sangue iniziale aggiustato 50% Campione

HCT HCT DSP caricato DSP caricato (mg/sacca finale)

(%) (%) (mg/sacca finale)

1 39.9 11.48 49.9 13.04

2 40.0 11.72 50.1 10.76

3 39.3 10.94 50.0 10.52

4 40.8 11.75 50.0 11.70

5 40.0 11.16 50.1 9.92

Media 40.0 ± 0.5 11.41 ± 0.65 50.0 ± 0.1 11.19 ± 1.22

Come evidente dai dati riportati nella tabella 7, il caricamento di desametasone sodio

fosfato nei globuli rossi di individui con ematocriti iniziali differenti (ematocriti dal 40% al 50%) risulta essere estremamente costante (da 11.41 a 11.19 mg/sacca finale) e non

presenta variazioni con significatività statistica (p> 0.05 con t-Student test per dati

accoppiati) senza necessitare della variazione di parametri del procedimento ivi

descritto. La variazione di DSP incapsulato al variare del 10% dell’ematocrito iniziale, che al contrario à ̈ una variazione fortemente significativa (p< 0,001 con t-Student test

per dati accoppiati) degli individui descritti in questi esempi à ̈ trascurabile dal punto di vista farmacologico.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per preparare eritrociti caricati con uno o più principi attivi comprendente i seguenti passaggi: a) rigonfiare gli eritrociti utilizzando una prima soluzione ipotonica; b) rigonfiare ulteriormente, senza giungere a lisi, gli eritrociti ottenuti al passaggio a) utilizzando una seconda soluzione ipotonica, più ipotonica della prima soluzione; c) concentrare gli eritrociti ottenuti al passaggio b); d) porre gli eritrociti concentrati a contatto con una soluzione lisante comprendente uno o più sostanze di interesse farmaceutico, e successivamente e) aggiungere una soluzione di sigillamento allo scopo di ottenere una popolazione di eritrociti caricati con detto uno o più principi attivi.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detta prima soluzione, porta gli eritrociti ad una osmolalità compresa tra 250-200 mOsm/Kg.
3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta seconda soluzione ipotonica porta gli eritrociti ad una osmolalità compresa tra 200 e 170 mOSm/Kg.
4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, che comprende tra i passaggi (a) e (b), un passaggio addizionale in cui si rimuove almeno in parte la prima soluzione ipotonica prima di aggiunta della seconda soluzione ipotonica.
5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto passaggio di concentrazione (c) Ã ̈ effettuato mediante emofiltrazione, emodialisi o centrifugazione.
6. 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui la soluzione lisante al passaggio (d) porta gli eritrociti ad una osmolalità compresa nell’intervallo tra 150 e 110 mOsm/Kg.
7. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 , in cui la soluzione di sigillamento al passaggio (e) Ã ̈ una soluzione ipertonica da 300 a 5000 mOsm/kg.
8. 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 , in cui le sostanze di interesse farmaceutico sono scelte dai seguenti gruppi: principi attivi scelti tra: peptidi, oligopeptidi, polipeptidi, proteine; principi attivi scelti tra: oligonucleotidi, analoghi nucletidici, nucleosidi, analoghi nucleosidici; principi attivi scelti tra: ormoni, immunosoppressori, anti-tumorali, corticosteroidi, glucocorticoidi, anti-retrovirali antiinfiammatori non steroidei, citochine, tossine, sostanze con attività vaccinale; mezzi di contrasto per la diagnostica; particelle e nanoparticelle scelte tra: nanoparticelle contenenti un metallo, nanoparticelle magnetiche, particelle super-paramagnetiche (SPIO), complessi nanoparticella-molecola attiva.
9. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui dette sostanze di interesse farmaceutico sono scelte tra 6-mercaptopurina, fludarabina fosfato, azidotimidina fosfato, dideossicitosina, dideossiinosina, glutatione, bisfosfonati, prednisolone, prednisolone fosfato, desametasone, desametasone fosfato, betametasone, betamatasone fosfato, timidina fosforilasi, fenilalanina ammonioliasi, verde di indocianina, particelle super-paramagnetiche.
10. 10. Popolazione di eritrociti caricati con una o più sostanze di interesse farmaceutico ottenibile mediate il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9.
11. 11. Popolazione secondo la rivendicazione 10, in cui la percentuale di fosfatidilserina prodotta dagli eritrociti, misurata con il saggio dell’Annessina V à ̈ minore del 10%.
12. 12. Popolazione secondo le rivendicazioni 10 o 11 in cui la quantità di lattato prodotta per ogni 10<6>eritrociti à ̈ maggiore di 0.100 nmol/h.
13. 13. Popolazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 12, in cui detta una o più sostanze di interesse farmaceutico sono scelte dai seguenti gruppi: principi attivi scelti tra: peptidi, oligopeptidi, polipeptidi, proteine; principi attivi scelti tra: oligonucleotidi, analoghi nucletidici, nucleosidi, analoghi nucleosidici; principi attivi scelti tra: ormoni, immunosoppressori, anti-tumorali, corticosteroidi, glucocorticoidi, anti-retrovirali anti-infiammatori non steroidei, citochine, tossine, sostanze con attività vaccinante; mezzi di contrasto per la diagnostica; particelle o nanoparticelle scelte tra: nanoparticelle contenenti un metallo, nanoparticelle magnetiche, particelle superparamagnetiche (SPIO), complessi nanoparticella-molecola attiva.
14. 14. Popolazione secondo la rivendicazione 13, in cui dette una o più sostanze di interesse farmaceutico sono scelte tra: 6-mercaptopurina, fludarabina fosfato, azidotimidina fosfato, dideossicitosina, dideossiinosina, glutatione, bisfosfonati, prednisolone, prednisolone fosfato, desametasone, desametasone fosfato, betametasone, betametasone fosfato, timidina fosforilasi, fenilalanina ammonioliasi, verde di indocianina, particelle superparamagnetiche.
15. 15. Composizione farmaceutica comprendente una popolazione di eritrociti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 14 e uno o più eccipienti farmacologicamente accettabili.