ITRM20130727A1 - Nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide rivestite da un guscio idrofilo. - Google Patents

Description

< Nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide rivestite da un guscio idrofilo >

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda nanocostrutti comprendenti almeno una nanoparticella lipidica solida contenente almeno una sostanza farmacologicamente e, o nutraceuticamente attiva rivestita da un guscio di polimero reticolato e il loro uso per la somministrazione di integratori alimentari e farmaci.

Stato della tecnica

Molti farmaci e integratori alimentari dimostrano una prominente attività biologica in vitro ma non determinano effetti rilevanti quando somministrati in vivo. Questa differenza di attività è spesso imputabile ad una mancanza di biodisponibilità, dovuta ad assorbimento scarso, metabolismo rapido e/o bassa stabilità. Alcuni composti sono molto lipofilici e non sono efficacemente somministrati in preparazioni acquose. Altri composti sono molto idrofilici e quindi non riescono a diffondere attraverso le membrane cellulari ma necessitano di trasporto specifico (ad esempio trasportatori del glucosio). I problemi finora elencati possono essere risolti, del tutto o in parte, incorporando il principio attivo in dispersioni colloidali di dimensione nanometrica. Questi cosiddetti “nanosistemi” mantengono le sostanze in sospensione acquosa e nei fluidi biologici, rendendo possibile l’assorbimento da parte dell’organismo in diversi modi. Nell’ambito della nanotecnologia è presente un ampio ventaglio di formulazioni diverse per la somministrazione di farmaci/integratori. Le tipologie includono: nanocostrutti polimerici [US 2010/0303922; US 2007/0190160; US 2008/0248126; US 2008/0241257], nanocostrutti lipidici solidi (SLN) [US 2006/0222716; US 2008/0206341], nanoemulsioni [US 2007/0148194; US 2011/0045050; US 5,152,923], vescicole [US 2009/0011004; US 2010/0267846], liposomi [US 4356167; US 6761901], nanocapsule con un nucleo liquido [US 6713533] o composizioni ibride [US 2008/0102127]. Nanoemulsioni, vescicole e liposomi sono caratterizzati da una bassa stabilità. Nanocostrutti polimerici et similia spesso mostrano problemi di biocompatibilità dovuti a reazioni allergiche o ai prodotti di degradazione dei polimeri. Tra tutte queste preparazioni, le Solid Lipid Nanoparticles, SLN costituiscono un buon compromesso tra biocompatibilità e stabilità. Dette SLN possono essere preparate a partire da lipidi di tipo alimentare e quindi completamente biocompatibili e biodegradabili, possedendo al tempo stesso una maggior stabilità rispetto a nanoemulsioni, vescicole e liposomi. Le SLN allo stato dell’arte attuale sono tuttavia somministrate per via parenterale in quanto non sono in grado di resistere a condizioni estreme come la digestione. Un ulteriore punto debole delle SLN è dato dalla scarsa stabilità nello stoccaggio a temperatura non controllata a causa di fenomeni di aggregazione.

Un approccio più raffinato rispetto alla semplice SLN prevede un nucleo lipidico con uno strato adsorbito sulla superficie composto di polimeri lineari di policaprolattone [Frozza et al, J Biomed Nanotechnol, 2010, 6(6):694-703], polielettroliti (sodio polistirensulfonato, acido poliacrilico, polilisina) [US 2006/0083781], lectina [US 2007/0237826] o chitosano [M. Garcia-Fuentes, C. Prego, D. Torres, M.J. Alonso, Eur J Pharmaceutical Sci, Volume 25, Issue 1, May 2005, Pages 133-143]. In questi esempi i polimeri sono semplicemente adsorbiti sulla superficie delle SLN per mezzo di deboli interazioni idrofobiche o di interazioni elettrostatiche con un surfattante carico presente nel nucleo lipidico (in tal caso è necessario un accurato controllo del pH per mantenere una carica adeguata nello strato di copertura).

Il gruppo di Fessi ha formulato un interessante esempio di gocce di olio racchiuse in un guscio di poliurea o poliestere generati per policondensazione all’interfaccia olio/acqua [US 7,348,031]. Quest’ultimo tipo di composizione garantisce una buona stabilità nello stoccaggio; tuttavia la procedura descritta permette unicamente di ottenere un nucleo di tipo liquido. La procedura descritta in US 7,348,031 non è risultato applicabile ad un lipide solido: utilizzandola, infatti, non si ottengono nanocostrutti monodispersi.

Era pertanto sentito nello stato della tecnica il problema di ottenere SLN in grado di resistere a condizioni estreme come la digestione e, dunque, non necessariamente somministrabili per via parenterale, che possedessero una maggiore stabilità nello stoccaggio a temperatura non controllata, come detto limitato nelle particelle dello stato della tecnica da fenomeni di aggregazione, e che fossero producibili senza le limitazioni note dai procedimenti dello stato della tecnica.

Tale problema è stato risolto dagli inventori attraverso la presente invenzione che riguarda il nanocostrutto delle rivendicazioni indipendenti 1 e 2; ulteriori realizzazioni sono riportate nelle rivendicazioni dipendenti.

Breve descrizione delle figure

Alla presente descrizione sono allegate tre figure che rappresentano:

la Figura 1 un grafico della distribuzione dimensionale dei nanocostrutti lipidici solidi incapsulati dell’esempio 1;

la Figura 2: la concentrazione plasmatica di resveratrolo e resveratrolo solfato dopo la somministrazione di resveratrolo (cerchi e quadrati nel grafico) e dei nanocostrutti lipidici solidi incapsulati (triangoli nel grafico) dell’esempio 7 e

la Figura 3: concentrazione plasmatica di resveratrolo e resveratrolo solfato dopo la somministrazione di resveratrolo (cerchi e quadrati nel grafico) e dei nanocostrutti lipidici solidi incapsulati (triangoli nel grafico) dell’esempio 8.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

La presente invenzione riguarda un nanocostrutto comprendente una nanoparticella lipidica solida contente almeno una sostanza farmacologicamente attiva e, o nutriente (ingredienti attivi) racchiusa in un guscio composto di polimero reticolato. Il nucleo è composto da uno o più lipidi solidi a temperatura ambiente ed immiscibili con acqua. Gli ingredienti attivi sono dispersi all’interno del nucleo lipidico. Il guscio che circonda e racchiude il nucleo, non ottenibile con SLN secondo i metodi noti dallo stato della tecnica, deriva dalla reazione di monomeri, oligomeri, e/o polimeri alla superficie del nucleo. La reazione di formazione del guscio avviene all’interfaccia tra il nucleo e la soluzione acquosa senza che si realizzino legami chimici tra il nucleo ed il guscio. In tal modo si ottiene un polimero reticolato che conferisce resistenza ad aggregazione, degradazione, decomposizione e/o digestione. La presenza del guscio previene il contatto tra principi attivi ed enzimi rendendo possibile l’utilizzo di derivati bioreversibili dei principi attivi, in particolare derivati idrolizzabili con molta facilità e quindi scarsamente stabili come esteri, carbonati, silil eteri, ecc... Il guscio rappresenta una barriera contro coalescenza e sinterizzazione dei nanocostrutti, incrementando la loro stabilità all’aggregazione. La mancanza di reticolazione (polimero lineare adsorbito sulla SLN) provoca un aumento della polidispersità dei nanocostrutti nel tempo che è un indice di disgregazione.

Nella produzione dei nanocostrutti lipidici solidi (SLN) da inserire nei nanocostrutti, gli inventori della presente invenzione, per analogia con quanto riportato da Sanna e colleghi [V. Sanna, A.

M. Roggio, S. Siliani, M. Piccinini, S. Marceddu, A. Mariani, e M. Sechi Int J Nanomedicine.

2012; 7: 5501–5516], avevano considerato applicabile il metodo di nano precipitazione descritto da Fessi in US 7,348,031. Per conseguenza, si sarebbero ottenuti nanocostrutti – nel caso specifico descritto da Fessi in US 7,348,031 di lipide (solido) - contenenti resveratrolo e ricoperte da uno strato di chitosano reticolato. Sperimentalmente è stato osservato che la presenza di almeno un componente lipofilico necessario alla creazione del guscio esterno, non era compatibile con la presenza di lipidi solidi e quindi in ultima analisi con l’ottenimento di SLN.

Gli inventori hanno tuttavia sorprendentemente scoperto che operando il mescolamento ad una temperatura superiore alla temperatura di fusione del lipide utilizzato per la produzione della SLN e inferiore alla temperatura di ebollizione del solvente impiegato, era possibile superare il problema descritto. Rispetto ad US 7,348,031 la presente invenzione si differenzia anche per il fatto di poter utilizzare nella composizione del guscio anche polimeri di origine biologica, biocompatibili, biodegradabili e provenienti da fonti rinnovabili.

Inoltre, rispetto al metodo utilizzato da Garcia-Fuentes [M. Garcia-Fuentes, C. Prego, D. Torres, M.J. Alonso, Eur J Pharmaceutical Sci, Volume 25, Issue 1, May 2005, Pages 133-143], la presente invenzione non richiede l’utilizzo di solventi estremamente lipofilici e tossici come il diclorometano, né l’utilizzo di apparecchiature sofisticate come generatori di ultrasuoni, rendendo il procedimento più facilmente applicabile dall’industria.

La presenza di un guscio di polimero reticolato nei nanocostrutti secondo la presente invenzione, anziché di un guscio di polimero lineare, comporta una maggiore stabilità dei nanocostrutti rispetto a fenomeni di disgregazione e riaggregazione. Tali fenomeni avvengono spontaneamente durante la conservazione dei nanocostrutti, sia a temperatura ambiente sia in caso di refrigerazione, in particolare in sospensione e contribuiscono al deterioramento della nano struttura e quindi del suo contenuto.

La produzione dei nanocostrutti oggetto dell’invenzione prevede la predisposizione di una soluzione organica e una soluzione acquosa ed il loro mescolamento. La soluzione organica contiene uno o più solventi organici miscibili con acqua, uno o più lipidi ed uno o più ingredienti attivi (sostanze farmacologicamente attive e, o nutrienti), uno o più tensioattivi, uno o più reticolanti, monomeri, oligomeri o polimeri (componente lipofilica del guscio) e può contenere uno o più conservanti e coadiuvanti. La soluzione acquosa contiene uno o più surfattanti e uno o più reticolanti idrosolubili, monomeri, oligomeri o polimeri (componente idrofilica del guscio). In una soluzione alternativa dell’invenzione, tali uno o più reticolanti idrosolubili, monomeri, oligomeri o polimeri (componente idrofila del guscio) vengono aggiunti dopo il mescolamento delle soluzioni organica e acquosa. Sia dopo il mescolamento della soluzione organica e acquosa, sia dopo l’aggiunta separata della componente idrofila del guscio nel caso della soluzione alternativa, il mescolamento viene mantenuto per 1 -5 ore. Tali reticolanti sono composti idrosolubili in grado di avere reazioni di reticolazione (ad esempio tramite policondensazione) con i reticolanti della soluzione lipofila. Il rapporto tra i volumi della soluzione organica e della soluzione acquosa può variare tra 2:1 e 1:10.

La procedura di produzione prevede il mescolamento della soluzione organica con la soluzione acquosa sopra descritte ad una temperatura superiore a quella di fusione dei lipidi contenuti nella soluzione organica e al di sotto della temperatura di ebollizione del solvente impiegato in modo da ottenere una emulsione nanometrica del tipo olio in acqua. Come detto, una soluzione alternativa al problema della presente invenzione è quella di aggiungere tali uno o più reticolanti idrosolubili dopo il mescolamento delle soluzioni organica e acquosa.

Come solventi organici miscibili con acqua, possono essere citati acetone, acetonitrile, acido acetico, acido formico, acido piruvico, bis-(2-idrossipropil)-etere, 1,4-butandiolo, 2,3-butandiolo, butandione, 2-(2-butossietossi)-etanolo, butirrolattone, N,N-dietilformammide, N,N-dimetilacetammide, 2-(dimetilammino)etanolo, N,N-dimetilformammide, dimetilsolfossido, 1,4-diossano, 1,3-diossolano, 1,2-etanediolo, etanolo, 2-etossietanolo, 2-(2-etossietossi)etanolo, 2-(2-etossietossi)etil acetato, etil lattato, N-etilmorfolina, esametilfosforammide, 2,5-esandione, glicerolo, idrossiacetone, 3-idrossi-2-butanone, isopropanolo, metanolo, N-metilformammide, 2-metil-2-propanolo, N-metilpirrolidina, N-metil-2-pirrolidinone,3-metossi-1-butanolo, 2-metossietanolo, 2-(2-metossietossi)etanolo, 2-metossietil acetato, 1,3-propandiolo, tetraetilenglicole, tetraidrofurano, tetraidropirano, 1,1,3,3-tetrametil-urea, trietilenglicole, tripropilenglicole metil etere. La temperatura di ebollizione di tali solventi si colloca tra 55 e 290°C.

I solventi previsti nella produzione possono essere eliminati parzialmente o completamente per dialisi, evaporazione, liofilizzazione o centrifugazione dei nanocostrutti. La scelta dei solventi opportuni è preferibilmente orientata verso quelli a bassa tossicità e con una elevata tensione di vapore. I solventi preferiti sono acido acetico, acetone, dimetilsolfossido, etanolo e tetraidrofurano. Particolarmente preferito è l’acetone.

Dopo la formazione del guscio all’interfaccia dell’emulsione e quindi dopo la formazione completa del nanocostrutto, la temperatura viene riportata a temperatura ambiente.

La soluzione organica comprende uno o più lipidi solidi a temperatura ambiente ed immiscibili con acqua che presentano una temperatura di fusione inferiore a quella di ebollizione del solvente organico miscibile con acqua impiegato. A titolo di esempio, possono essere citati mono- di- e tri-gliceridi; acidi grassi; alcoli, aldeidi o chetoni a catena lunga, esteri di acidi grassi, cere, steroli, e simili. Esempi di detti composti lipidi sono: monocaprina, monocaprilina, monolaurina, monomiristina, monopalmitina, monostearina, monoelaidina, monooleina, monoerucina, glicerol behenato, dilaurina, dimiristina, dipalmitina, stearopalmitina, stearomiristina, oleomiristina, oleopalmitina, distearina, dielaidina, dimontanilglicerolo, arachidostearina, behenopalmitina, arachidobehenina, dicapropalmitina, dicaprostearina, dilaurocaprina, dilauromiristina, dilauropalmitina, dilaurostearina, sorbodimiristina, dimiristocaprina, laurodimiristin, dimiristopalmitina, dimiristostearina, dipalmitocaproina, dipalmitocaprina, dipalmitolaurina, dipalmitostearina, dipalmitoelaidina, dipalmitobehenina, distearocaproina, distearocaprina, distearolaurina, distearomiristina, distearooleina, distearopalmitina, distearoelaidina, dielaidopalmitina, dielaidostearina, palmitomiristolaurina, trilaurina, trimiristina, tripalmitina, tristearina, trimargarina, trielaidina, tribrassidina, trinonadecanoina, triparinarina, triarachidina, tribehenina, tripentadecanoina, tripetroselaidina, trilignocerina, tritridecanoina, acido laurico, acido tridecanoico, acido miristico, acido pentadecanoico, acido palmitico, acido metilpalmitico, acido margarico, acido stearico, acido isostearico, acido anteisononadecanoico, acido arachidico, acido eneicosanoico, acido behenico, acido lignocerico, acido cerotico, acido eptacosanoico, acido montanico, acido nonacosanoico, acido melissico, acido parinarico, acido petroselaidico, acido nervonico, acido cicloesanundecanoico, acido angelico, acido tiglico, acido vaccenico, acido calendico, acido jacarico, acido cibarico, acido lumequico, acido margarolico, acido punicico, traumatina, acido ximenico, acido cerebronico, acido idrossipalmitico, arachidil alcol, melissil alcol, montanil alcol, sapiolo, stenolo, behenil alcol, eicosanolo, eptadecanolo, ceril alcol, lignoceril alcol, eptacosanediolo, laccerolo, 15-entriacontanolo, eptacosandione, tritriacontil ottacosanoato, octacosil triacontanoato, tetratriacontil ottacosanoato, etil lignocerato, metil stearato, metil behenato, metil lignocerato, lauril stearato, cetil palmitato, dotriacontil idrossicinammato, metil idrossimiristato, eugenil palmitato, cetil miristoleato, gliceridi di acidi 3-ossoalcanoici, sitosterolo, campesterolo, brassica sterolo, stigmasterolo, ergosterolo, stigmastanolo. Particolarmente preferiti sono: trilaurina, trimiristina.

La soluzione organica comprende uno o più principi attivi quali un farmaco, un profarmaco, un parafarmaco od una loro miscela, un nutriente o una miscela di nutrienti, un estratto vegetale, tutti cumulativamente indicati come sostanze farmacologicamente attive e/o sostanze nutrienti (PA), disciolte in un solvente organico quale sopra indicato. La sostanza farmacologicamente attiva e/o nutritiva prescelta deve essere solubile nel solvente organico (o miscela) prescelto e scarsamente solubile in acqua. La strutturazione dei nanocostrutti lipidici solidi incapsulati rende possibile l’utilizzo di derivati facilmente idrolizzabili e quindi altamente bioreversibili. Il PA non deve reagire con i precursori del guscio. Nel caso di PA altamente idrofilici e/o reattivi è desiderabile utilizzare derivati protetti in maniera bioreversibile, nella fattispecie: alcoli, fenoli ed acidi carbossilici sottoforma di esteri; ammine sottoforma di ammidi; alcoli, fenoli ed ammine sottoforma di carbammati e tutti quei derivati noti a chi ha una comprovata esperienza tecnica nel settore farmaceutico/nutraceutico. L’incapsulamento di estratti vegetali può essere fatto con facilità quando l’estrazione dalla pianta viene effettuata in un solvente miscibile con acqua, in quanto tale estratto può essere utilizzato direttamente come base della soluzione organica. Nella presente descrizione si presentano a scopo esemplificativo applicazioni in cui i PA sono resveratrolo e/o suoi derivati tra i quali sono preferiti il trisetossimetossi derivato, il triacetato e il tristearato.

La soluzione organica comprende uno o più tensioattivi solubili nel solvente organico scelto. I surfattanti possono essere anionici, cationi, zwitterionici o non-ionici, per esempio: sodio/potassio/magnesio/calcio/alluminio caprato, sodio/potassio/magnesio/calcio/alluminio laurato, sodio/potassio/magnesio/calcio stearato, sodio oleato, sodio stearoil 2-lattilato, lauroil arginato, betaine, fosfatidilcolina e lecitine, sorbitan trioleato, sorbitan tristearato, polietileneossido sorbitan stearato, polipropilenglicole stearato, sorbitan monooleato, polipropilenglicole laurato, sorbitan monostearato, sorbitan monopalmitato, polietileneossido dioleato, poliepropileneossido mannitolo dioleato, stearil citrato. Particolarmente preferita è la fosfatidilcolina.

La soluzione organica comprende uno o più reticolanti, monomeri, oligomeri o polimeri (componente lipofilica del guscio) caratterizzati da due o più gruppi funzionali per molecola; scelti in modo da non reagire con il solvente organico, con il principio attivo e con il lipide (o miscele di essi) utilizzati e tra di loro. I gruppi funzionali della componente lipofilica del guscio possono essere identici o diversi e devono essere selezionati per reagire selettivamente ed in condizioni blande con i reticolanti, monomeri, oligomeri o polimeri della soluzione acquosa (componente idrofilica del guscio). La componente lipofilica del guscio è composta da una molecola o più molecole che portano due o più gruppi funzionali elettrofilici come i gruppi isocianato, isotiocianato, alogenuro acilico, estere attivato, aldeide o acetale, alogenuro alchilico, epossido, anidride, carbonato. Le componenti lipofiliche del gruppo preferite sono: 1,1,3,3-tetraetossipropano, aldeide isoftalica, aldeide adipica, aldeide muconica, genipina, isoforone diisocianato, lisina disocianato, poli(propilenglicole) terminato con toluen 2,4-diisocianato (CAS # 9057-91-4), poli(etilene adipato) terminato con toluen 2,4-diisocianato (CAS # 9019-92-5), bis(4-isotiocianatobutil) disolfuro, tetraglicidil 4,4'diamino difenilmetano, resorcinolo-diglicidil-etere, bisepossimentene, limonene diossido. Particolarmente preferiti reticolanti per la componente lipofila del guscio sono poli[(fenil isocianato)-co-formaldeide], poli(etilene adipato) terminato con toluen 2,4-diisocianato, bromoacetilbromuro, tetraglicidil 4,4'diamino difenilmetano, resorcinolo-diglicidil-etere. La componente idrofilica del guscio, in grado di reagire con i composti della componente lipofilica del guscio appena riportati è composta da una molecola o più molecole che portano due o più gruppi funzionali nucleofilici come i gruppi ammino, idrazide, alcol e tiolo. Le componenti idrofiliche del gruppo preferite sono: diammine, oligoammine, peptidi, proteine e amminozuccheri oligomerici o polimerici. Particolarmente preferiti sono tetraetilenepentaammina, cistammina solfato idrato, spermina, lisina, arginina, polilisina, poliarginina, albumina, sieroalbumina bovina, caseina, gelatina, lattoalbumina e chitosano.

Alternativamente, la componente lipofilica del guscio può essere composta da una molecola o più molecole che portano due o più gruppi funzionali nucleofilici come il gruppo ammino o idrazide. Componenti lipofiliche del guscio preferite sono 1,6-diammino-esano, diidrazide adipica, zeina. Particolarmente preferita è la diidrazide adipica. Detta componente lipofilica è in grado di reagire con una componente idrofilica composta da una molecola o più molecole che portano due o più gruppi funzionali elettrofilici come i gruppi aldeidico, estere attivato, epossidico. Componenti idrofiliche del guscio preferite sono: polisaccaridi ossidati con periodato, polisaccaridi modificati con epicloroidrina, pectina attivata con 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide. Particolarmente preferita è la pectina attivata con 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide.

La soluzione acquosa deve contenere uno o più tensioattivi idrofilici comunemente noti come ad esempio: polossameri (copolimeri PEO-PPO-PEO), polietileneossido monostearato, polietileneossido lauril etere, polietileneossido monooleato, polivinil alcol (PVA), polivinilpirrolidone, amido ed amido modificato, destrina, alginato, cellulosa, metilcellulosa, carbossimetilcellulosa, furcellerano, gomma di guar, gomma karaya, albumina, gelatina, caseina. Tensioattivi preferiti sono il Pluronix e il polivinilpirrolidone.

Esempi

Esempio 1: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate

La fase acquosa è preparata sciogliendo 12 mg di Pluronic<®>F127 in 8 mL di acqua demineralizzata e scaldando alla temperatura di 53°C. La soluzione organica è preparata sciogliendo 5 mg di poli[(fenil isocianato)-co-formaldeide] (Mn≈ 340), 22 mg di poli(etilene adipato) terminato con toluen 2,4-diisocianato (Mn≈ 2700), 10 mg di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo) e 50 mg di trilaurina in 4 mL di acetone e scaldando il tutto a 53°C. Le due soluzioni vengono mescolate insieme e subito dopo vengono aggiunti 200 microlitri di tetraetilenepentaammina (25% in acqua) mantenendo sotto agitazione a 53°C per almeno 3 ore. Le misure di Dinamic Light Scattering di una dispersione diluita SLN incapsulate indica un diametro medio di 217 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,128 come si può vedere dal grafico di figura 1.

Esempio 2: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano reticolato

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1. La soluzione organica è preparata sciogliendo 140 mg di bromoacetilbromuro, 10.2 mg di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo) e 43 mg di trilaurina, in 4 mL di acetone e scaldando il tutto a 53°C. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, vengono aggiunti 4 mL di chitosano allo 0.5% in acido acetico all’ 1.0% in acqua ed il tutto viene mantenuto sotto agitazione a 53°C per almeno 3 ore. Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 176 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,100.

Dopo dieci mesi di stoccaggio in sospensione acquosa a temperatura ambiente ed in assenza di additivi, le nanocapsule dimostrano una elevata integrità strutturale, il diametro medio delle stesse è di 189 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,071.

Esempio 3: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di sieroalbumina reticolata

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1. La soluzione organica è preparata sciogliendo 137 mg di bromoacetilbromuro, 10 mg di L-α -fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo) e 43 mg di trilaurina, in 4 mL di acetone e scaldando il tutto a 53°C. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, vengono aggiunti 4 mL di sieroalbumina bovina all’1,3% in acqua ed il tutto è mantenuto sotto agitazione a 53°C per almeno 3 ore. Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 145 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,094.

Esempio 4: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di pectina reticolata

La fase acquosa è preparata sciogliendo 12 mg di Pluronic<®>F127, 21 mg di pectina (da buccia di agrumi) e 40 mg di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide in 8 mL di acqua demineralizzata e scaldando alla temperatura di 53°C. La soluzione organica è preparata sciogliendo 15,5 mg di diidrazide adipica, 13 mg di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo) e 46 mg di trilaurina, in 4 mL di acetone e scaldando il tutto a 53°C. Le due soluzioni vengono mescolate insieme e la miscela è tenuta sotto agitazione a 53°C per almeno 3 ore.

Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 238 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,226.

Esempio 5: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate contenenti un derivato di resveratrolo

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1. La soluzione organica è preparata sciogliendo 25 mg di poli[(fenil isocianato)-co-formaldeide] (Mn≈ 340), 11 mg di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo), 42 mg di trilaurina e 21 mg di resveratrolo tristearato in 4 mL di acetone e scaldando il tutto a 53°C. Le due soluzioni vengono mescolate insieme e subito dopo vengono aggiunti 400 microlitri di tetraetilenepentaammina (25% in acqua). Si mescola a 53°C per almeno 3 ore. La SLN incapsulate hanno un diametro medio di 301 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,150. L’efficienza di incapsulamento, misurata tramite spettrometria UV, è dell’85%.

Esempio 6 Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate contenenti beta-sitosterolo ed un derivato di resveratrolo

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1.

La soluzione organica è la stessa dell’esempio 5 eccetto per l’utilizzo di 30 mg di resveratrolo tristearato e l’aggiunta di 23 mg di beta-sitosterolo. Le due soluzioni vengono mescolate insieme e subito dopo vengono aggiunti 400 microlitri di tetraetilenepentaammina (25% in acqua). Si mescola a 53°C per almeno 3 ore.

Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 284 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,229. L’efficienza di incapsulamento, misurata tramite spettrometria UV, è del 96%.

Esempio 7: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano reticolato contenenti un derivato del resveratrolo - I

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1.

La soluzione organica è preparata sciogliendo 8,5 mg di 1,1,3,3-tetraetossipropano, 15 mg di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo), 25,3 mg di resveratrolo triacetato e 35 mg di trilaurina, in 4 mL di acetone e scaldando il tutto a 53°C. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, vengono aggiunti 4 mL di chitosano allo 0.5% in acido acetico all’ 1.0% in acqua ed il tutto viene mantenuto sotto agitazione a 53°C per almeno 3 ore.

Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 228 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,257. L’efficienza di incapsulamento, misurata tramite HPLC, è del 90%.

Esempio 8: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano reticolato contenenti un derivato del resveratrolo - II

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1.

La soluzione organica è preparata sciogliendo 26,1 mg di resveratrolo triacetato, 3,1 mg di aldeide isoftalica, 10 mg di complesso picolina-borano, 10 mg di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo) e 43 mg di trilaurina, in 4 mL di etanolo e scaldando il tutto a 53°C. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, vengono aggiunti 4 mL di chitosano allo 0.5% in acido acetico all’ 1.0% in acqua ed il tutto mantenuto sotto agitazione a 53°C per almeno 3 ore. Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 220 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,148. L’efficienza di incapsulamento, misurata tramite HPLC, è del 97%.

Esempio 9: Studio farmacocinetico

Le nanocapsule dell’esempio 7 e dell’esempio 8 sono state somministrate per via intragastrica a ratti maschi di razza Wistar in quantità tale da fornire 0,088 mmol/kg. Campioni di sangue sono stati prelevati a tempi prestabiliti, trattati ed analizzati tramite HPLC per quantificare la presenza di resveratrolo e resveratrolo solfato, il principale metabolita. I dati ottenuti sono mostrati in tabella I (esempio 7) ed in tabella II (es.8).

TABELLA I

tempo (ore) 0 0,17 0,5 1 2 4 8 24

resveratrolo 0 0,343 1,34 1,77 1,21 1,08 0,115 0 solfato

(microM)

TABELLA II

tempo 0 0,17 0,5 1 2 4 8 10 14 17 24

(ore)

resveratrolo 0 0,124 0,286 1,03 1,24 0,468 0,223 0,162 0,185 0,155 0,0943 solfato

(microM)

resveratrolo 0 0,0203 0,0383 0,0680 0,0744 0,029 0 0 0 0 0

(microM)

I risultati di tabella I e II sono paragonati con le concentrazioni plasmatiche di resveratrolo e

resveratrolo solfato (metabolita del resveratrolo che presenta una attività biologica significativa

se pur inferiore a quella resveratrolo stesso) ottenute somministrando una quantità equivalente

di resveratrolo nei grafici di figura 2 e figura 3. Sommando le concentrazioni di resveratrolo e

resveratrolo solfato si ottiene un’area sotto la curva per le formulazioni di resveratrolo triacetato

incapsulato degli esempi 7 ed 8 pari a 8,17 µM•h e 7,44 µM•h, entrambe notevolmente superiori

a quella per la semplice somministrazione di resveratrolo in soluzione, che è pari a 3,55 µM•h.

Inoltre è evidente in entrambi gli esempi uno spostamento del picco plasmatico a tempi più

lunghi.

La somministrazione tramite le nanocapsule oggetto dell’invenzione consente quindi, rispetto

alla somministrazione in soluzione, sia l’assorbimento di dosi maggiori di principio attivo che un

rallentamento delle farmacocinetiche relative.

Esempio 10: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide

incapsulate con un guscio di chitosano reticolato contenenti un derivato del resveratrolo

– III

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1.

La soluzione organica è preparata sciogliendo 27 mg di trisetossimetossi-resveratrolo, 10 mg di

dodecandioil-dicloruro, 13 mg di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo) e 41 mg di trilaurina, in 4 mL di acetone e scaldando il tutto a 53°C. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, vengono aggiunti 4 mL di chitosano allo 0.6% in acido acetico all’ 1.0% in acqua ed il tutto mantenuto sotto agitazione a 53°C per almeno 3 ore.

Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 654 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,590. L’efficienza di incapsulamento, misurata tramite HPLC, è del 76%.

Esempio 11: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano reticolato contenenti quercetina

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1.

La soluzione organica è preparata sciogliendo 18 mg di tetraetossipropano, 9 mg di L-αfosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo), 17 mg di quercetina e 44 mg di trilaurina, in 4 mL di acetone e scaldando il tutto a 53°C. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, vengono aggiunti 4 mL di chitosano allo 0.5% in acido acetico all’ 1.0% in acqua ed il tutto viene mantenuto sotto agitazione a 53°C per almeno 3 ore. Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 309 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,294.

Esempio 12: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di sieroalbumina reticolata II

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1.

La soluzione organica è preparata sciogliendo 100 microlitri di tetraglicidilmetilenedianilina soluzione al 16% in tetraidrofurano, 14 mg di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo) e 54 mg di trilaurina, in 3.9 mL di acetone e scaldando il tutto a 53°C. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, vengono aggiunti 4 mL di sieroalbumina bovina all’1,3% in acqua ed il tutto è mantenuto sotto agitazione a 53°C per 20 ore.

Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 178 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,161.

Esempio 13: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano reticolato II

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 1 e la soluzione organica è la stessa dell’esempio 12.

Dopo il mescolamento delle due soluzioni, vengono aggiunti 4 mL di chitosano allo 0.6% in acido acetico all’ 1.0% in acqua ed il tutto è mantenuto sotto agitazione a 53°C per 20 ore.

Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 254 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,255.

Esempio 14: confronto tra il comportamento di nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano reticolato e nanoparticella lipidiche solide con chitosano adsorbito sulla superficie

Sono stati preparati due nanocostrutti differenti.

Lotto A: lo stesso dell’esempio 13.

Lotto B: lo stesso dell’esempio 13 omettendo il reticolante tetraglicidilmetilenedianilina.

Dopo aver misurato l’indice di polidispersità (PDI) dei due costrutti, i due lotti sono stati conservati in sospensione acquosa al riparo dalla luce e alla temperatura di 4°C per 44 giorni. Dopo questo tempo è stata ripetuta la misura del PDI. Nel caso del lotto A non sono state osservate variazioni, mentre nel caso del lotto B il PDI ha subito un aumento del 39,5%, il quale può essere associato a fenomeni di disgregazione e riaggregazione delle particelle con guscio non reticolato.

Esempio 15: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano reticolato III

La fase acquosa è preparata sciogliendo 3 milligrammi di Pluronic F127 in 2 millilitri d’acqua. La soluzione organica è preparata sciogliendo 2,1 milligrammi di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo), 9,6 milligrammi di trilaurina, 1,6 milligrammi di resorcinolo-diglicidil-etere in 1 millilitro di acetone. Le due soluzioni vengono riscaldate a 56°C e mescolate assieme.

Dopo il mescolamento delle due soluzioni, viene aggiunto 1 mL di chitosano allo 0.5% in acido acetico all’ 1.0% in acqua, anch’esso a 56°C. Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 187 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,139.

Esempio 16: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano reticolato IV

La fase acquosa è preparata sciogliendo 10 milligrammi di polivinilpirrolidone (peso molecolare medio di 58 kDa) in 2 millilitri d’acqua. La soluzione organica è la stessa dell’esempio 15. Le due soluzioni vengono riscaldate a 56°C e mescolate assieme. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, viene aggiunto 1 mL di chitosano allo 0.5% in acido acetico all’ 1.0% in acqua, anch’esso a 56°C. Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 194 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,162.

Esempio 17: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano reticolato V

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 15. La soluzione organica è preparata sciogliendo 2,1 milligrammi di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo), 9,6 milligrammi di trilaurina, 1,9 milligrammi di resorcinolo-diglicidil-etere in 1 millilitro di tetraidrofurano. Le due soluzioni vengono riscaldate a 56°C e mescolate assieme. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, viene aggiunto 1 mL di chitosano allo 0.5% in acido acetico all’ 1.0% in acqua, anch’esso a 56°C. Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 334 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,162.

Esempio 18: Preparazione di nanocostrutti comprendenti nanoparticelle lipidiche solide incapsulate con un guscio di chitosano e cistammina reticolati

La fase acquosa è la stessa dell’esempio 16. La soluzione organica è preparata sciogliendo 3,2 milligrammi di L-α-fosfatidilcolina (da tuorlo d’uovo), 4,7 milligrammi di trilaurina, 4,5 milligrammi di trimiristina, 5,4 milligrammi di resorcinolo-diglicidil-etere in 1 millilitro di miscela tetraidrofurano:dimetilsolfossido 50:50 v/v. Le due soluzioni vengono riscaldate a 65°C e mescolate assieme. Dopo il mescolamento delle due soluzioni, viene aggiunto 1 mL di soluzione contenente 5 mg di chitosano, 10 mg di acido acetico, 18 mg di cistammina solfato idrato (CAS # 16214-16-7) in acqua, anch’esso a 56°C. Le SLN incapsulate hanno un diametro medio di 430 nm con un indice di polidispersità (PDI) di 0,237.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Nanocostrutti formati da un guscio di polimero reticolato che racchiude almeno una nanoparticella lipidica solida contenente almeno una sostanza farmacologicamente attiva e/o almeno una sostanza nutriente ottenibili dal procedimento comprendente le operazioni seguenti: a. preparazione di una soluzione organica comprendente almeno una sostanza farmacologicamente attiva e/o almeno una sostanza nutriente, almeno un solvente organico miscibile con acqua, almeno un lipide solido a temperatura ambiente, almeno un composto liposolubile con almeno due gruppi funzionali in grado di avere reazioni di reticolazione, almeno un tensioattivo lipofilo; b. preparazione di una soluzione acquosa comprendente almeno un tensioattivo idrofilico; c. mescolamento di dette soluzioni ad una temperatura maggiore della temperatura di fusione di detto almeno un lipide, e inferiore alla temperatura di ebollizione di detto almeno un solvente organico miscibile con acqua; d. aggiunta di almeno un composto idrosolubile con almeno due gruppi funzionali in grado di avere reazioni di reticolazione con almeno due gruppi funzionali di detto almeno un composto liposolubile e. mescolamento e reazione di reticolazione , f. raffreddamento a temperatura ambiente 2. Nanocostrutti formati da un guscio di polimero reticolato che racchiude almeno una nanoparticella lipidica solida contenente almeno una sostanza farmacologicamente attiva e/o almeno una sostanza nutriente ottenibili dal procedimento comprendente le operazioni seguenti: a. preparazione di una soluzione organica comprendente almeno una sostanza farmacologicamente attiva e/o almeno una sostanza nutriente, almeno un solvente organico miscibile con acqua, almeno un lipide solido a temperatura ambiente, almeno un composto liposolubile con almeno due gruppi funzionali in grado di avere reazioni di reticolazione, almeno un tensioattivo lipofilo; b. preparazione di una soluzione acquosa comprendente almeno un tensioattivo idrofilico e almeno un composto idrosolubile con almeno due gruppi funzionali in grado di avere reazioni di reticolazione con detti almeno due gruppi funzionali di detto almeno un composto liposolubile; c. mescolamento di dette soluzioni ad una temperatura maggiore della temperatura di fusione di detto almeno un lipide e inferiore alla temperatura di ebollizione di detto almeno un solvente organico miscibile con acqua, d. e reazione di reticolazione e. raffreddamento a temperatura ambiente 3. Nanocostrutto secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il rapporto tra i volumi di detta soluzione organica e di detta soluzione acquosa è compreso tra 2:1 e 1:10. 4. Nanocostrutto secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un lipide solido a temperatura ambiente è scelto dalla classe formata da trigliceridi, digliceridi, monogliceridi, acidi grassi, alcoli a catena lunga, cere, steroli, stanoli. 5. Nanocostrutto secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti , in cui detto almeno un composto liposolubile in grado di subire reazioni di reticolazione è scelto dalla classe formata da composti contenenti due o più gruppi isocianato, isotiocianato, alogenuro acilico, estere attivato, aldeide o acetale, alogenuro alchilico, epossido, anidride, carbonato e detto almeno un composto idrosolubile in grado di avere reazioni di reticolazione con detto almeno un composto liposolubile è scelto dalla classe di composti contenenti due o più gruppi ammino, idrazide, alcol e tiolo. 6. Nanocostrutto secondo la rivendicazione 5, in cui detto almeno un composto liposolubile in grado di subire reazioni di reticolazione è scelto dalla classe formata da composti contenenti un gruppo ammino o idrazide: 1,6-diammino-esano, diidrazide adipica, zeina e detto almeno un composto idrosolubile in grado di avere reazioni di reticolazione con detto almeno un composto liposolubile è scelto dalla classe : polisaccaridi ossidati con periodato, polisaccaridi modificati con epicloroidrina, pectina attivata con 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide. 7. Nanocostrutto secondo la rivendicazione 5, in cui detto almeno un composto liposolubile in grado di subire reazioni di reticolazione è scelto dalla classe formata da 1,1,3,3-tetraetossipropano, aldeide isoftalica, aldeide adipica, aldeide muconica, genipina, isoforone diisocianato, lisina disocianato, poli(propilenglicole) terminato con toluen 2,4-diisocianato (CAS # 9057-91-4), poli(etilene adipato) terminato con toluen 2,4-diisocianato (CAS # 9019-92-5), bis(4-isotiocianatobutil) disolfuro, tetraglicidil 4,4'diamino difenilmetano, resorcinolo-diglicidil-etere, bisepossimentene, limonene diossido, poli[(fenil isocianato)-co-formaldeide], poli(etilene adipato) terminato con toluen 2,4-diisocianato, bromoacetilbromuro, tetraglicidil 4,4'diamino difenilmetano, resorcinolodiglicidil-etere e detto almeno un composto idrosolubile in grado di avere reazioni di reticolazione con detto almeno un composto liposolubile è scelto dalla classe formata da diammine, oligoammine, peptidi, proteine e amminozuccheri oligomerici o polimerici, tetraetilenepentaammina, cistammina solfato idrato, spermina, lisina, arginina, polilisina, poliarginina, albumina, sieroalbumina bovina caseina, gelatina, lattoalbumina e chitosano. 8. Nanocostrutto secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti in cui detta sostanza farmacologicamente attiva e/o detta sostanza nutriente è scelta dalla classe formata da resveratrolo e suoi derivati.