ITRM930587A1 - Metodo per marcare cellule eucariote. - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
a corredo di una domanda di brevetto per: invenzi?ne industrial e dal titolo: '"Metodo per marcare cel l ule eucariote"
L'invenzione concerne un metodo per marcare cellule eucariote (di mammifero) utilizzando un recettore? di superficie cellulare con un dominio intracellulare modificato come marcatore selezionabile,
L'identificazione di cellule nelle quali una sequenza di DNA ? stata introdotta con successo ? un passaggio ' essenziale nella tecnologia del DNA ricombinante? Poich? la sequenza di DNA da introdurre non produce necessariamente un fenotipo che pu? essere selezionato in maniera semplice, sono normalmente introdotte sequenze di L>NA aggiuntive codificanti per un fenotipo selezionabile. Vi ? ancora solo un numero molto limitato di tali geni marcatori selezionabili da utilizzarsi nella tecnologia del DNA ricombinante di cellule eucariote. La maggior parte di questi geni marcatori disponibili come, per esempio, la timidina chinasi del virus Herpes simplex tipo 1 (Wigier et al.. Celi 1, 1977, 223) o la ipoxart i no ? fosforibosil transferasi (Jolly et al. F?roc. Nati. Acad. Sci. u? 1983, 477) corrispondono a geni che sono espressi in maniera costitutiva nella maggior parte delle cellule normali o sono identici a tali geni.
Pertanto, questi geni marcatori possono essere utilizzati in cellule mutanti speciali che non esprimono il gene corrispondente. Un gene marcatore preferito, d'altra parte, dovrebbe non essere espressa nella maggior parte delle cellule di mammifero o almeno non essere espresso in alcuni tessuti e tipi cellulari, in modo che essi possano essere utilizzati come geni marcatori selezionabili nella tecnologia del DNA ricombinante che coinvolge tali cellule.
Robert Pawlink et al. hanno descritto l'uso de 11?ant igene di superficie cellulare CD24 come un marcatore selezionabile dominante nel trasferimento genico mediato da retrovirus (Journal of Cellular B iochemistry, Supplement 17 E, pag. 203, ab stractS210). Utilizzando questo marcatore^ fibroblasti NIH-3T3, cellule pre-B BAF-3 cosi come cellule di midollo osseo murino possono essere marcate per infezione retrovirale e le cellule cosF marcate sono evidenziate per analisi di selezione delle cellule attivate per fluorescenza (f luorescence activated celi sorting analysis). Tuttavia, 1?antigens di superficie cellulare CE>24 ? espresso normalmente su alcune cellule di mammiterQ, e pertanto 1'uso di questo marcatore sar? limitato dalla difficolt? di discriminare tra le cellule che normalmente esprimono 1'antigene di superficie cellulare CD24 e le cellule marcate con questo marcatare.
Inoltre, ? stato trovato che r antigene cellulare di superficie CD24, a seguito di espressione eterologa, ? presentato sulla superficie cellulare solo in maniera minore.
E? pertanto oggetto dell?invenzione fornire un procedimento per marcare cellule eucariote, con l?uso di recettori di superficie cellulare, in modo che a mezzo di tale processo i recettori di superficie cellulare siano presentati in grande quantit? sulla superficie cellulare, in cui la sensibilit? della selezione e della evidenziazione delle cellule marcate pu? essere aumentata .
Questo scopo ? ottenuto a mezzo di un processo di marcatura di cellule eucariote (di mammifero) esprimendo in queste cellule un acido nucleico, detto acido nucleico codificante un recettore di superficie cellulare, e presentando il recettore alla superficie cellulare, il processo essendo caratterizzato dall?uso di un acido nucleico in cui la regione codificante il doniinio intracellulare del recettore ? completamente o parzialmente deleta, o modificata in modo che il recettore presentata alla superficie non pu? effettuare alcuna trasduzione di segnale dopo il legame al suo ligando.
Preferibilmente, il dominio intracellulare ? deleto completamente, oppure ne sono modificati vV
nuclotidi individuali.
Preferibilmente, viene utilizzato l?acido nucleico codificante per il recettore NGF-, CE>24- o LDL.
La sequenza del recettore NGF, che sar? riferito d?ora in poi come "recettore per il fattore di crescita nervoso a bassa affinit?, LNGFR", ? descritto in D. Johnson, Celi 47, 1986, 545?554. Preferibilmente, viene utilizzato un acido nucleico in cui la regione di DNA codificante gli amminoacidi da 245 al C-terminale sono stati deleti (SEQ ID NO 1).
L?acido nucleico pu? essere introdotto nella cellula bersaglio, per esempio, con un vettore virale (preferibilmente retrovirale) a mezzo di lipofezione o elee tropo razione.
Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? un DNA, che codifica per un LNGFR modificato e che ? illustrato in SEQ ID NO 1, cosi come cellule eucariote contenenti dett? acido nucleico.
Un acido nucleico di questa tipo pu? essere utilizzato per esprimere u.n recettore della superficie cellulare cosi modificato, e per presentare il recettore alla super-ficie cellulare in modo che il recettore possa essere utilizzato come marcatore selezionabile per le cellule eucariote trasfettate .
E' anche possibile isolare le cellule marcate per immuno-sel ezione , introducendo tale acido nucleico in una cellula eucariote. A questo scopo, le cellule trasfettate sono ;identificate, selezionate con un anticorpo marcato che lega in maniera speci-fica il recettore utilizzato secondo l?invenzione, e isolate dissociando il complesso anticerpo-complesso cellulare.
Il DNA codificante il recettore o un derivato di questo sar? introdotta in un vettore di espressione eucariote con metodi noti nel settore. Vettori di espressione adatti sono noti agli esperti nel settore, preferibilmente sono utilizzati vettori retrovirali. Anche altri vettori virali secondo lo stato dell?arte possono essere utilizzati per il trasferimento del DNA recettore (per esempio virus herpes, adenovirus, vaccinia virus), vettori retrovirali, vettori a doppia copia (Yu et al., Froc. Nati. Acad. Sci. 83, 1986, 3194?3198) in cui Una -Frequenza alta di provirus riarrangiato ed un titolo significativamente pi? basso di virus sano stat i osservai i. I vettori XSN virali (Bio-Techniques, 7, 1.939, 980-990) sono i preferiti.
I vettori di espressione eucariotica ricombinanti sono poi introdotti nelle cellule ospite eucariote, sia da soli per un protocollo di marcatura genica, o in combinazione con altro DNA da trasdurre, ma con nessun fenotipo selezionabile. L?introduzione DNA nella cellula ospite ? ottenuto con metodi di infezione virale noti nell?arte. Inoltre, il trasferimento del gene del recettore pu? essere ottenuto anche utilizzando metodi di trasferimento non virali (per esempio electroporaiione, trasferimento 1 iposomale, precipitazione con calcio). Le cellule che controllano il DNA esogeno possono essere poi riconosciuti per la loro capacit? di produrre un recettore ad alti livelli. Le cellule ricombinanti eucariote che controllano un DNA secondo la presente invenzione possono anche essere pili facilmente evidenziate per la loro capacit? di produrre un derivato del recettore.
II recettore marcatore delle cellule eucariote ottenute come sopra descritto permette una facile selezione e separazione di tali cellule utilizzando anticorpi che legano il recettore utilizzato. Tali anticorpi sono noti nel settore e descritti, per esempio, da A. Ross et al. (F'roc. Nati. Acad. Sci. 81, 1984, 6681-6685, EP-A 0202055). Inoltre, gli anticerpi per i recettori possono essere ottenuti con metodi noti nel settore immunizzando un animale con una proteina codificata dal DNA secondo la presente invenzione ed isolando gli anticorpi dal siero degli animali immunizzati, o fondendo cellule di milza degli animali immunizzati con cellule immortali, cosi come, per esempio, una linea cellulare di mieloma murino, per ottenere anticarpi monoclonali. Questi anticorpi possono essere marcati con metodi noti nel1'arte (cosf come quelli descritti, per esempio, in J.H. Peters, Ma noklornale Ant ikfirper, Springer Verlag , 2. Auflage, 1988, 285-315). Marcatori adatti saranno enzimi, coloranti fluorescenti o chemiolu.mimescenti .
Utilizzando un anticorpo immobilizzato invece di un anticorpo marcato, si possono selezionare le cellule trasfettate. Pertanto, la fase solida con 1 'anticorpo immobilizzato contro il recettore viene utilizzata come una matrice in cromatografia di affinitei. Dopo separazione delle cellule ???-tr affettate che non esprimono il recettore, le cellule legate sono, per esempio, coltivate e poi espanse su piastre di petri per la notte.
I processi come sopra descritti saranno importanti specialmente come mezzi diagnostici per la identificazione di cellule introdotte in un organismo mammifero a mezzo di protocolli di terapia genica. F'er alcune applicazioni, come, per esempio, il trapianta di midollo osseo, ? di valore diagnostico differenziare tra le cellule che originano dal trapianto di midollo osseo e le cellule che derivano dalle cellule residue dell'ospite. In questo caso, le cellule di midollo osseo che contengano il DNA che codifica per il recettore sono trapiantate per fornire cellule con un marcatore di superficie cellulare. Preferibilmente saranno trapiantate cellule progenitrici o staminali contenenti il gene secondo l'invenzione che erano state arricchite secondo lo stato dell'arte (per esempio con anticorpi immobilizzati anti-CD34). Dopo il trapianto, le cellule, specialmente quelle derivanti da cellule tumorali, possono essere differenziate tra quelle derivate dalle cellule trapiantate o quelle dalle cellule residue dell'organismo ospite.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione ? pertanto l'uso del procedimento per la immunose lezione di cellule trasfettate secondo la presente invenzione per la identificazione diagnostica, di cellule, che sono state marcate per trasfezione con un DNA codificante un recettore, in particolare un DNA secondo la presente invenzione.
La principale applicazione della marcatura di cellule del sangue o di cellule del midollo osseo con i recettori modificati descritti sar? il monitoraggio di cellule da trapianti autolaghi e anche allogenici. Nel trattamento delle leucemie e dei linfomi ? spesso necessario trattare i pazienti con dosi subletali di farmaci citostatici o con dosi comparabili di irradiazione o con una combinazione di questi. Per ristabilire le funzioni del midollo osseo viene effettuato o un reimpianto di midollo osseo che era stato prelevato prima del trattamento o un impianto allogenico di midollo da un donatore compatibile per HLA .
Nel caso di trapianto di midollo osseo autolDgo la contaminazione di cellule tumorali nel materiale reimpiantato potrebbe condurre ad un riavvio del tumore. Metodi di selezione per purificare il midollo dalle cellule tumoral i sono utilizzati, ma tali tecniche non sono affidabili al momento. Nel caso di un riavvio ? ovviamente non possibile distinguere tra queste cellule tumorali potenzialmente contaminanti ed un riavvio causato da cellule residue dopo il trattamento. Nel caso di trapianti di midollo osseo allogenici il rigetto del midollo allogenico ? il problema principale.
be dopo il trapianto autologo le cellule trapiantate sono marcate con un gene e di conseguenza il prodotto genico derivato da questo che non ? espresso in queste cellule, ? possibile tracciare queste cellule direttamente dopo trapianto e in caso di riavvio del tumore differenziare tra cellule tumorali derivate dal materiale trapiantato e cellule tumorali residue. Questa informazione porterebbe ad una definizione molto precoce di un ulteriore trattamento basato sulla fonte di riavvio del1 tumore. Oltre a questo scopo diagnostico, la marcatura genica in trapianti autolaghi porterebbe anche a monitorare ed a paragonare l'efficienza di diversi metodi di eliminazione di cellule tumorali in gruppi di pazienti relativamente piccol i .
Per il trapianto autologo il principale campo di applicazione sar? il monitoraggio del rigetta di cellule trapiantate.
Il protocollo clinico conterr? i seguenti passagq i:
a) Espianto delle cellule del paziente, b) Depurazione delle cellule espiantate secondo tecniche note nel settore.
c) Trasduzione nelle cellule del paziente di un vettore che contiene il gene per il recettore modificata secondo la presente invenzione.
d) Facoltativamente^ 1'espansi one delle cellule del paziente in condizioni selettive, per esempio con G418, utilizzando l'espressione del gene per la resistenza alla neomicina codificato, dal vettore contenente il gene per<' >il recettore modificato.
e) ImmunGselezione delle cellule marcate che esprimano il gene modificato e rappresentano il recettore sulla superficie delle cellule.
f) Reimpianto delle cellule arricchite e marcate nel paziente.
g) Monitoraggio delle cellule del sangue/m idol1o del paziente per il gene marcatore per analisi FACS o tecniche ELISA.
DIAGRAMMA SCHEMATICO PER IL PROTOCOLLO
DI MARCATURA GENICA
Espianto di cellule di midollo osseo Congel am anto di Depurazione delle Trattamento del al iquote ce 11u1e paz i ente Trasduz Iirone di
cellule con il
vettore LNGFR
E_spansi Aone i.n
.condizioni selettive
Immunose l lezi.one per
cellule LNGFR? positive
Reimpianto delle cellule marcate ?-Ioni toragg io di ce l il u le del sangue/osseo Nessuna r ?ec i di va Ree i di va
Cel lu le tumoral i Cellule tumorali marcate non marcate Recidiva causata da Recidiva cactsata cellule tumorali da cellule contaminanti nel tumorali residue materiale celi LIlare
trapiantato
Un gran numera di studi hanno dimostrata che i vettori retrovirali sono un mezzo efficace per il trasferimento di DNA esogeno in cellule somatiche (1). Nel sistema ematopoietico del topo., ? stato ottenuto un efficiente trasferimento ed espressione genico, sia in cellule progenitrici che in cellule staminali pluripatenti , in vitro cosi come in vivo. Livelli minori di trasferimento genico sono stati ottenuti in progenitori ematopoiet ici canini e umani in coltura, nei quali sono stati dimostrati livelli significativi di espressione dei geni trasdotti (vedi riferimento 35>. Il trasferimento genico mediato da retrovirus ? al momento utilizzato in protocolli di terapia genica per il trattamento di malattie ereditarie e acquisite, cos? come la deficienza di adenasina deaminasi (ADA~) la immunodeficienza combinata grave (SCIE?) e i tumori avanzati (come riferita in 3). Sebbene vi sia stato un significativo sforzo per ottimizzare le procedure di purificazione delle cellule staminali ematopoietiche umane e per trovare le condizioni efficienti di trasferimento ed espressione genica, i linfociti da sangue periferico (F'BLs) sono ancora considerati il veicolo cellulare pi? sicuro per la terapia genica umana .
Sono stati ingegner izzati e utilizzati per il trasferimento genico in cellule ematopoietiche umane diversi vettori retroviral i, tutti derivati dal virus della leucemia mu.rina di Moloney (MoMLV). L?USO di diversi promotori che dirigono l?espressione del gene d?interesse, e la posizione di questa sequenza, rispetto alle unit? di trascrizione virale, sono stati alcuni dei parametri presi in considerazione nel generare vettori alternativi ?- ^). Alcuni di questi vettori sono stati utilizzati per trasdurre cellule 1info idi umane in condizioni diverse. Linfociti umani infiltranti nei tumori (TILs) sono stati trasdotti con il vettore retrovirale ??, con il gene per la neomicina f osfotransf erasi (Neo), ed ? stato dimostrato che mantenevano un fenotipo normale e le caratteristiche funzionali in vitro CSF> ?). Le cellule trasdotte sono state recuperate dai siti tumorali fino a 64 giorni dopa la somministrazione delle cellule in viva a pazienti affetti da melanoma C*). Il trasferimento genico era ottenuto in sottopapa 1az ioni si,a di cellule T umane CD4* che CD8??? derivate da TILs e da PBLs<10). Un vettore retrovirale per 1 espressione di un gene CD1B funzionale, diretto da un promotore virale LTR, ha trasdotto con successo linfociti da pazienti affetti da deficienza di adesione dei leucociti (LAD), ed ha condotto alla correzione della LAD in vitro (11 ).
L?espressione della ADA umana da un promotore ADA in un vettore a doppia copia i*'3) in cellule F'BLs attenute da pazienti affetti da ADA- SCID ha portato anche alla correzione della deficienza enzimatica, permettendo la ricostituzione delle funzioni immunitarie (1=? . Infine, sono stati introdotti con successo^ in una linea cellulare linfoide T; costrutti retrovirali per la superespressione di sequenze di RNA strutturali di HIV (elemento responsabile per la attivazione in trans, TAR, elemento responsabile Rev, RRE) , espressi da un promotore per la RNA polimerasi III, inducendo una immunizzazione intracel lulare parziale contro HlVf1^' 1S). Sebbene in tutti questi casi i vettori retrovirali fossero in grado di trasdurre cellule linfoidi umane e di esprimere i geni trasferiti, non ? stato fatto ancora alcun tentativo per paragonare direttamente i diversi vettori per la stabilit?, l?efficienza del trasferimento genico, e l?espressione del gene trasdotto.
Il recettore per il fattore di crescita nervoso a bassa affinit? umano (LNGFR) non ? espresso sulla maggior parte delle cellule ematopoietiche umane, permettendo pertanto una analisi quant itivativa dell?espressione del gene trasdotto per ciascun vettore e ciascuna cellula bersaglio per analisi di immuno-florescenza, anche a livello di cellula singola. Diverse linee cellulari ematopoietiche umane di origine mieloide e lin-Foide, cosi come cellule mononucleate da sangue periferico normale (F'BMC), sono state trasdotte con quattro vettori e analizzate per la stabilit? e il numero di integrazioni .virali e per l'espressione di LNGFR, sia a livello di RNA che di proteina. E? stata e-F-Fettuata una analisi per FACS delle linee cellulari T trasdotte per la coespressione di LNGFR e dei marcatori di superficie cellulare per studiare l?espressione genica in una sottopopolazione specifica di cellule T. In condizioni appropriate di alta efficienza di in-fenzione, tutti i vettori retrovirali potevano trasdurre una popolazione di cellule T rappresentativa del pannello immunitario normale.
Un efficiente trasferimento genico a mezzo di vettori retrovirali in cellule staminali ematopoietiche rimane ancora il primo obiettivo per una terapia genica di diverse malattie congenite o acquisite. Come veicoli, i vettori retrovirali sono al momento gli strumenti pi? sicuri e e-f-Ficaci per il trasferimento e l?espressione di DNA esogena in cellule umane emo- 1infopo iet iche. Al momento, tutti i protocolli clinici approvati per il trasferimento genico in cellule di midollo o del sangue si ri-Feriscono a vettori retrovirali. (1* 3) Sebbene la cellula bersaglio ideale sia rappresentata dalla cellula staminale pluripotente, non vi ? nessuna evidenza definitiva circa la capacit?'di vettori retrovirali di trasdurre tali cellule ad una effeclenza adeguata, e di mantenere una espressione genica stabile nella loro progenie. I risultati di protocolli clinici in progresso basati su trasferimento genico di midollo osseo potrebbero chiarificare questi problemi a breve (1*
30) .
Ovviamente, il trasferimento genico potrebbe essere ottenuto pi? facilmente in linfociti del sangue periferico, una alternativa potenziale alle cellule di midollo osseo, almeno per i disordini congeniti e acquisiti del sistema immunitario. Tuttavia, a questo scopo, ? necessario definire quale proporzione di PBLs necessitano di essere trasdotti per rappresentare l?intero repertorio immunitario, e se questo possa essere mantenuto in vivo stabilmente, entrambi prerequisiti necessari per una procedura di trasferimento genico che sia di rilevanza terapeutica. A questo scopo 1?efficienza del trasferimento genica e la progettazione del vettore, che entrambi influenzano la persistenza e i livelli di espressione genica, sono dei fattori cruciali.
L?efficienza totale del trasferimento genico in PBLs umani ? stata strettamente correlata al protocollo di infezione. Una limitata espansione cellulare a mezzo di attivazione breve di lin-fociti in vitro, seguita dal trasferimento genico in PBLs per esposizione dei sovranatanti cellulari produttori, provocava una limitata proporzione di cellule resistenti a G418 (circa IV. per ciclo di infezione), con una variabilit? aggiuntiva introdotta dal titolo di sovranatanti del vettore. L'efficienza del trasferimento genico pu? essere aumentata da una espansione in vitro piu estesa delle cellule bersaglio.
La nostra analisi dell'uso del repertorio di nella popolazione di PBLs, dopo tre cicli di infezione di PBLs con sovranatanti contenenti vettori, seguita da selezione di cellule trasdotte in G41S, produceva un repertorio intatto paragonato alla popolazione di controllo originale dei linfociti non tr asdott i/non selezionati. Questi dati suggeriscono che una limitata espansione di cellule bersaqlie e l'uso di sovranatanti contenenti vettori producono un adeguato trasferimento genico, in maniera indipendente dalla relativa bassa frequenza di trasferimento genico, almeno quando i sovranatanti dei vettori hanno dei buoni titoli virali <> di 5 1G=> ? Tuttavia, titoli virali bassi in sovranatanti di vettori producono repertori limitati di ?? . C-i? ? stato confermato d-a a-nalisi per Sout hern blot" del riarrang lamento della catena TCR-,$ , che ha mostra uno schema oligoclonale nella popolazione trasdotta/selezionata. Pertanto, abbiamo tentato di superare questa limitazione per co-coltura di PBLs con cellule producenti vettori irradiate. In maniera indipendente dal titolo virale, questa procedura di trasferimento genico ? significativamente pi? efficace, almeno un ordine di grandezza. Prendendo vantaggio dalla alta efficienza di trasferimento genica per co-coltivazione e espressione di LNGFR su linfociti trasdotti, abbiamo messo a punto un protocolla semplice che coinvolge la co-coltivazione e la immunoselezione che permetta la produzione di cellule trasdotte in maniera omogenea.
In considerazione del fatto che i protocolli di co-coltura sono ancora considerati non sicuri per uso clinico, abbiamo progettato condizioni di co-coltura in cui le cellule producenti i vettori e le cellule PBLs sono mantenute separate a mezzo di una membrana porosa, che permette il passaggio del virus mentre evita il contatto cellula-cellula. Nelle nostre mani, questa procedura non ha mostrato una sufficiente consistenza e riproducibilit? di frequenze di infezione in esperimenti seriali. Tuttavia, questo approccio pu? offrire alcuni vantagg i quando paragonato all7! nteiione con i1 sovranatante.
Un7 analisi per doppia immunof 1crescenza di cellule T selezionate in G418 per la coespresaione di LNGFR e di diversi marcatori di superficie delle cellule T ha mostrato una suscettibilit? simile di tutte le subpopolazioni saggiate con una efficienza apparentemente uguale di trasferimento genico. Inoltre, abbiamo ottenuto una sporadica, sebbene significativa evidenza di trasferimento genico in cellule immature, CDA^/CDB"*?. Abbiamo gi? mostrato il trasferimento genico mediato da vettore retrovirale in progenitori delle cellule T prima del riar rangiamento TCR(13). I dati attuali confermano ulteriormente la conclusione che l'infezione retrovirale di PBMCs permetta il trasferimento genico nei progenitori circolanti ad una frequenza bassa ma evidenziabile. Questo potrebbe essere un vantaggio aggiuntivo dei protocolli di trasferimento genico che comportino una coltura a breve termine in vitro ed una espansione limitata dei linfociti ber sag1io .
Infine, l'influenza del costrutto del vettore sull'efficienza dei trasferimento genico e sull'espressione ? stata analizzata nei seguenti studi. Nei costrutti vettoriali utilizzati, il gene di riferimento ? stato alternativamente posto all'interna dell?unit? di trascrizione retrovirale sotto il controllo di promotori interni di SV40 o di HSV-TK (NSV-N e NTK?N rispettivamente), con LTR virali di MoMLV <LNSN), o al di fuori della unit? di trascrizione retrovirale sotto il controllo del promotore umano ADA (il vettore a "doppia copia" DCN) . L?uso di un recettore di superficie - LNGFR - come gene di riferimento ha permesso lo studio dei livelli di espressione genica in diverse subpopo 1azion i di PEL, con una risoluzione a si ngola cella.
I titoli virali ottenuti per diversi vettori nei cloni producenti selezionati sono stati comparabili, con l?eccezione delle.. cellule producenti DCN che in maniera consistente producevano titolo fino a cinque volte pi? bassi di quelli per gli altri tre vettori, suggerendo che la extra sequenza nelle LTR virali possa ridurre l?efficienza. di trasduzione, probabilmente interferendo con il processo di trascrizione inversa/integrazione. Ci? ? anche indicato dalla tendenza relativamente alta di DCN a integrarsi come provirus riarrangiato, che riduce ulteriormente l?efficienza di trasferimento genica totale che pu? essere ottenuta con questo tipo di vettore. Se ci? dipenda dalle caratter istiche intrinseche della sequenza di cDNA LNGFR ? da determinare- Riarrangiamenti dei provirus integrati sono stati osservati con -Frequenze molto basse per gli altri tre'vettori.
I livelli di espressione genica dimostrano che i vettori basati sulle unit? di trascrizione interne erano i meno efficienti in termine sia di accumula di mRNA che di espressione delle proteine. La sola eccezione era il livello molto alto di trascritti generati dal promotore di SV40 all'interno di due diversi vettori (NSV-N e LNSN) nella linea di cellule B RIM infettata con EBV. Ci? pu? essere dovuto alla interazione delle proteine di EBV attivanti in trans con 1? "enhancer" di SV-40. Al contrario, i vettori basati sulle LTR di MoMLV e sul promotore umano ADA per l?espressione del gene di riferimento funzionavano molto efficientemente in tutte le linee ematopoietiche. Un?analisi delle linee e dei cloni di cellule T ha dato essenzialmente gli stessi risultati. Sia i vettori LNSN che DCN erano molto efficaci nella direzione di alti livelli di espressione genica in tutte le subpopol azioni di cellule T, comprese progenitori immaturi, e mantenevano questi livelli non alterati per un alto numero di passaggi.
In conclusione, il vettore retrovirale basato su LTK ? probabilmente il pi? affidabile ed efficace per il trasterimenta genico e 1?espress ione in PBLs umani, mentre il vettore ' DCM( sebbene molto buono per l'espressione genica, provoca generalmente Lin?efficacia di trasferimento genico bassa sia a causa del basso titolo che della tendenza di riarrangiamenti genomici. Questo tipo di costrutto, tuttavia, potrebbe essere il vettore di scelta quando un'espressione genica tessutospecifica, inducibile, o in qualche altro modo indipendente da LTR sia un requisito obbligatorio, o anche in tessuti in cui vi potrebbe essere una inattivazione di LTR. Sebbene non siano stati indagati questi aspetti nel presente studio, le cellule staminali ematopoietiche umane potrebbetsessere tra questi tessuti, per analogia con quello osservato nel sistema ematopoietico murino.
L?usa di un gene codificante per una molecola di superficie cellulare come marcatore di cellule dopo trasferimento mediato da vettore retrovirale rappresenta chiaramente un importante vantaggio rispetto ai vettori utilizzati in esperimenti di marcatura genica precedenti che utilizzano un gene marcatore, normalmente il gene NeoR, non espresso sulla membrana cellulare. Questo tipo di vettore dovrebbe rappresentare un vantaggio potenziale per studi in vivo preclinici e clinici di marcatura cellulare.
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TABELLA 1 . Ana l isi per FALS dell'espressione di LNbFR in linee cellulari ematopoietiche umane trasdotte con quattro vettori retrovirali.
LINEA CELLULARE VETTORE RETROVI RALE
NSV-N NTK-N LNSN DCN'
K562 ++ + KG 1 + + + ++ RA JI +
DAUDI + + ++ RIM ++ -f-+ ++ MQLT-4 + + J. ri. <?>+* ++
? L'espressione quantitiva di LNGFR era misurata come: -, 0 unit? arbitrarie (a.u.) di intensit? media relativa di fluorescenza, , 0-50 a.u., +, 50?100 a.u., ++, 100?200 a.LI.. Il valore medio relativo della linea cellulare di melanoma AS75, esprimente circa 10* recettori per .cellula, era di 170 a.LI..
I pro-fili per FACS delle celiLIle K562, Duadi, RIM e J.M. erano bi-fasici, e la misura si riferisce solo al picco positivo (vedi risultati).
LEGGENDE DELLE FIGURE
Figura 1. Vettori retrovirali per l'espressione di LNGFR (A, C,?E, G)
Sono mostrate le mappe schematiche dei genomi provirali integrati di NSV-N (A), NTK-N (C), LNSN (E) e DCN (G>, indicanti i promotori interni di SV40 (SV) , HSV-TK (TK) e di ADA umana (ADAp). I siti di restrizione Xba I e Hind III (H) sono indicati.
Le specie di RNA originanti da ciascun vettore sono rappresentati con freccie numerate sulle mappe, e numerate sulle colonne per Northern blot.
Figura 2. Analisi per Southern blot dell'integrazione dei quattro vettori retrovirali (A?D) in digeriti con Xba I di DNA di K5?>2 (1), KG 1 (2), Raji (3), Daudi (4), RIM (5), MOLT-4 (6) e J.M. (7), ibridate con una sonda Neo. Sono indicate le bande che corrispondono a provirus integrati intatti, cosi come il loro peso molecolare (in kb) . Le bande di riarrang lamento sono indicate con Freccie.
Figure 3a e 3b. Costrutti vettoriali diversi.
MATERIALI E METODI
Vettori retrovirali
Sono stati generati quattro diversi vettori retrovirali per l'espressione di LNGFR come gene di riFeri mento, utilizzando il Frammento di 1.5 Kb Sst I interamente codificante del cDNA del LNGFR umano <14?). I vettori NSV-N e NTK?N sono stati ottenuti per clonaggio del cDMA di LNGFR"nei siti unici Hind III e Bg1 II dei vettori NSV e NTK rispettivamente. Il vettore NSV ? stato derivato dal vettore originale ?? per inserzione del Frammento di 0.4 kb Kpn I/Hind III contenente il promotore "enhancer" precoce di SV40 e l?origine di replicazione nel sito di clonaggio unico Xho I. Il vettore NTK era anche derivato da N2 per inserzione di S52 bp del promotore per la timidino chinasi (TK) del virus Herpes Simple:; <H5V). Entrambi i vettori erano dati da E. Gilboa.
Il vettore LN3N ? stato costruita per inserzione del cDNA di LNGFR nel sito Hpa I del vettore LXSN (=).
Nel vettore E>CN (LNGFR a.doppia copia) il cDNA per LNGFR era clonato sotto il controlla del Frammento di 0.S kb Ssp I/Nco I del promotore della adenosina deaminasi (ADA) umana <1?) nei siti Bg1 II/Bna BI del polilinker del vettore retrovirale N2A <?) .
I diversi costrutti dei vettori sono mostrati nelle Figure 3a e 3b.
I DNA dei vettori sono stati convertiti nei corrispondenti virus per protocollo di transinFez ione . In breve, il DNA del vettore ? stato trasFettato nella linea cellulare di assemblaggio ecotropica ? 2 (1V) per coprecipitazione standard con calcio fosfato t^0) . 48 ore dopo la tras-fezione, i sovranatanti di ? 2 sono stati raccolti e utilizzati' per infettare la linea cellulare PA317 di assemblaggio anfotropica (=l) per 16 ore ih presenza di 8 jug/ml di polibrene. . Le cellule infettate F'A317 sono state selezionate in terreno DMEM (GIBCO, Grand Island, NY) supp 1ementato con 107. FCS (Hyclone, Logan, UT) e contenenti 0.8 mg/ml G418 (GIBCO), e poi utilizzate per generare sovranatanti contenenti virus, liberi da virus helper con titoli che raggiungevano da IO-4* a 5>;10= c-Fu/ml. Tutti i vettori contengono il gene NeoR codificante per la neomicina fosfotrasferasi, che conferisce una resistenza in vitro all?analogo della neomicina G418.
Infezione delle linee cellulari ematopoietiche
Tutte le linee cellulari descritte in questo studio, con l?eccezione di RIM e di J.M., sono state ottenute da ATCC, e cresciute in terreno RF'MI 1640 (GIBCO) supp 1ementato con FCS 1Q?. Le linee K562 E KG1 sono linee cellulari mieloidi, derivate rispettivamente da leucemie mieloqeniche croniche e acute, le linee Raji e Daudi sono derivate da due linfomi di Burkitt; la linea MOLT?4 ? considerata una linea cellulare di leucemia di cellule T stabile (CDS^); la linea F:IM ? una linea cellulare 1infoblastoide trasformata con tBV; la linea J.M. ? una linea cellulare 1infob lestoide T CD4"-/CDS-??;?1a linea cellulare A875 ? una linea cellulare di melanoma umano che esprime circa IO*5* LN6FR per cellula.
5x10? cellule bersaglio sono state infettate per 1?J ore con sovranatanti virali non diluiti contenenti 8 g/ml di polibrene, cresciute per 24 ore aggiuntive in terreno completo e poi selezionate in presenza di una dose predeterminata di G418 (da 0.5 a 1.5 mg/ml). Analisi ulteriori sono state effettuate su colture di cellule selezionate in E418.
Infezione di linfociti umani
Le cellule mononuc 1eate del sangue periferico (F'BMC) sono state ottenute da donatori sani per separazione su gradiente Fico1 1-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Svezia) e cresciute per 72 ore sotto stimolo di f itoemoagg 1utini na (F'HA) e inter leuchina? ? umana ricombinante (hu?rIL2) (2 fAg/ml di F'HA purificata, Wellcome, Labs., Dartfortd, UK; 100 U/ml di hu-rIL2, Roche, Nutiey, NY). L?infezione virale era effettuata per esposizione di F'BLs stimolati ad un campione virale a cellulare per 6 ore in presenza di polibrene (8 ??/ml). 48 ore dopo l?infezione, le cellule F'BLs erano selezionate in terreno RF'MI 1?40 supp1ementat o con mM L-g 1utamrnina , 17. amminoacidi non essenziali, 17. sodio piruvato, 57. siero umano (HS) e 100 U/ml di hu-i"IL2 (terreno completo), contenente 0.4 mq/ml di G41S. La densit? cellulare era mantenuta costante (5x10s cellule/ml) durante 2 settimane di selezione con G418. I lin-Fociti T umani trasdotti dal retrovirus erano anche clonati in piastre di Terasaki a di-F-ferenti concentrazioni cellulari (1?IO3 cellule per pozzetto) in terreno completo contenente 0.4 mg/ml di G418, in presenza di F'BLs umani irradiati come cellule di nutrimento.
Per migliorare 1Je-F-Ficacia di infezione retrovirale, i PBLs umano sono stati co-coltivati con cellule producenti virus per 48-72 ore in terreno completo. La co-coltivazione era effettuata in piastre Transwell (Costar, Cambridge, MA) per prevenire il contatto cellula-cellula. 3x1 0= cellule producenti sono state seminate in pozzetti di piastre a 6 pozzetti e incubate a 37?C per la notte. 5x10? PBLs stimolati sono stati aggiunti ai pozzetti Transwell e cresciuto per 48-72 ore in presenza di 8 Hg/ml polibrene.
Le cellule trasdotte retrovirali sono state analizzate per citometria a -Flusso per l?espressione del recettore e espanse per analisi ulteriori.
Analisi del DNA
Si otteneva DNA ad alto peso molecolare dalle cellule per standard estrazione fenolo/c loro-formio (=?;, e si digeriva estensivamente in aliquote di 5 ? g con enzimi di restrizione appropriati (GIBCD-BRL), si effettuava una elettroforesi in 0.87. gel di agarosio a 1.5 V/cm in tampone tris-acet at?-EDTA , e si trasferiva ad una membrana di nylon (Hybond-N, Amersham, Buck inghamshi re, UK) per trasferimento capillare Southern (^0) e si ibridizzava con una sonda marcata con 32F? a IO7 dpm.
Le sonde di DNA erano dei frammenti di 1.2 Kb Hind ???/Sma I di pSV2?neo (=3) e il frammento Hinc II 3r del clone YTJ-2 di cDNA, contenenti la regione costante del TCR-^ umano <?3). I filtri erano lavati in condizioni di alta stringenza ed esposti a pellicole Kodak X-AR a -705C.
Analisi del RNA
L?RNA totale cellulare era estratto con la tecnica del guanidina isotioc ianato i?**) e selezionato per poli (A)"?" su cromatografia di oligo (dT)-cel lu.losa <??). 5 H g di RNA poli(A) "?" sono stati frazionati per dimensioni su gei 17. di agorosio in formaldeide, trasferiti su una membrana di nylon per trasferimento capillare Northern , e ibridizzati, lavati e esposti come descritto per i trasferimenti Southern. Le sonde di DNA erano i l -Frammento di 1 . 2 Kb H i nd ? ? ? /Sma I d i pSV2-neo e il frammento di 1.5Kb Set I del cDNA di LNbFR (1*>.
Fenot io iz;a;ione della superficie cellulare L'espressione sulla superficie cellulare di LNGFR era monitorata per citometria a flusso utilizzando r anticorpo monoclonale murino anti-LNGFR umana 20.4 (ATCC) con un metodo di marcatura per florescenza indiretta. Il fenotipo della superficie cellulare delle linee linfocitiche T e dei cloni era determinata per citometria a flusso utilizzando anticorpi monoclonali coniugati con RE anti-CD4 <T4), CDS <T8), CB5, B4, CD25R, Leu7, Cd34 umano (Coulter Immunology, Hialsah, FL) . In breve, 5x10= cellule erano colorate con 100 M 1 di anticorpi diluiti a 4?C per 30 minuti, lavate due volte in terreno senza FCS e risospese in 0.5 mi di FBS per analisi FACS o in 100 HI di anticerpo secondaria coniugato con FITC diluito. L?analisi per dopia colorazione era effettuata per incubazione sequenziale di anticorpi coniugati con FITC e con F'E.
Analisi dell'uso della catena V?B TCR
L?RNA totale era estratto da linee cellulari F?BL e T utilizzante GTC, trascritti inversamente in cDNA utilizzando code di oligo dT e di oliga db, <=7r) ed un ventesimo del DNA ottenuto era utilizzato per F'CR con usa di o1igonuc 1eot idi specifici VA -C/3 (=?) e con un ol iganucleotide C/S speci-fica (57-TGCTGACCCCACTGTCGACCTCCTTCCCATT-G? ) , come descritto nel riferimento 27.
I cicli di amplificazione di F'CR erano effettuati a 94eC per 45";, 57?C per 45", e 72eC per 1?. Il prodotto amplificato era purificato su gel e clonato nel vettore plasmidico bluescript. Le colonie positive per Cj? erano replicate su diverse piastre e trasferite su filtri di cellulosa e ibridizzate con oligonuc 1eotidi Vj? specifici ( ? ^ > nelle seguenti condizioni: 6 x in SSC, 17- biotto, 0.17. SDS e 5mM EDTA a 42?C per 3-6 ore, erano lavati per 1 ora alla stessa temperatura in 6 x SSC ed esposti per 6-12 ore ad una pellicola a raggi X a temperatura ambiente.
RISULTATI
Generazione di retroviru.s ricombinanti per l?espressione del LNGFR
Sono stati sviluppati quattro diversi costrutti retrovirali per l?espressione di LNGFR e utilizzati per la generazione di linee cellulari producenti virus. I costrutti N3V-N (figura 1A) e NTK-N (figura IO sono basati su promotori interni, che dirigono la espressione del cDNA di LNGFR, cio? il promotore precoce di 5V40 e il promotore HSV?TK, rispettivamente. Mei vettore LNSN (-Figura 1E) , il gene LNGFR ? espresso dal LTR virale. Nel costrutto DCN (figura 16) il cDNA LNGFR ? sotto il controllo del promotore ADA umano, nella regione U3 del LTR S?. Dopo in-fezione delle cellule bersaglio, il gene trasdotto ? duplicato e trasferito al 5? LTR. (**), generando cosi un provirus contenente due copie del minigene ADA?LNGFR. Tutti i vettori portano il gene NeoR, sotto il controllo o di LTR virale (NSV-N, NTK-N e DCN) o del promotore precoce SV40 (LNSN).
I quattro vettori sono stati utilizzati per trasdurre il gene LNGFR nelle linee cellulari ematopoietiche umane di diP-ferenti derivazioni e in PBLs umani;, e mostrano: i) capacit? di trasdurre le cellule bersaglio umane, ii) integrazione e stabilit? dei proviru.s intatti e iii) espressione del gene di riferimento. Il titolo virale delle linee cellulari produtt it rici anfotropiche va da 1:<104 a 5x1Q= c-Fu/ml per i vettori NSV-N, NTK-N e LNSN, e da 5xl03 a ?xlO'4 cfu/ml per il vettore DCN.
Analisi molecolare della integrazione virale nelle linee cellulari ematopoietiche umane
Per un esame iniziale dei diversi vettori, sono state utilizzate diverse linee cellulari tumorali di origine emato- 1infopo ietica come cellule bersaglio per il trasferimento genico. Due linee cellulari mielaidi (K562 e K61), due linfoma di Burkitt (Raji e Daudi), ed una linea cellulare 1infab 1astoi de trasformata da EBV (Riti), e due linee cellulari 1infob1asto idi (I?OLT-4 e J.M.) sono state trasdotte con i quattro vettori retrovirali e selezionate in presenza di 6418. Un?analisi molecolare delle integrazioni retrovirali ? stata effettuata per trasferimento Southern. I DNA genomici sono stati digeriti con Xba I, che taglia sia al 5? che al 3? delle LTR di tutti i vettori (figura 1), permettendo 1?evidenz iazione delle dimensioni dei provirus integrati, e con Bg1 II, che taglia solo nei DNA genomici, permettendo una stima del numero di siti di integrazione. I DNA digeriti con Xba I e con Bg1 II sono stati ibrid?zzati sequenzialmente con sonde specifiche per i geni NeoR e LNGFR.
L?integrazione del vettore NSV-N ha generato una singola banda Xba I della dimensione attesa di 5.1 kb, corrispondente ad un provirus intatto, in tutte le linee cellulari selezionate in 6418 (figura 2A) . Nelle cellule Raji una banda aggiuntiva di dimensione minore ? stata osservata, indicando l?integrazione di un provirus riarrangiato (figura 2A, colonna 3). In maniera simile, la digestione con Xba I ha generato una singola banda della dimensione attesa di 5.4 kb nei DNA da tutte e quattro le linee cellulari infettate MTK-N (figura 2B) . Una banda aggiuntiva, probabilmente dovuta alla presenza di provirus riarrangiato, '? stata evidenziata solo nel campione RIM (figura 2B, colonna 5). Una singola banda di 4.3 kb ? osservata in tutti i campioni trasdotti con il vettore LNSN con nessuna evidenza di riarrangiamenti virali (figura 20 . Al contrario, il quadro delle integrazioni virali nel DNA da cellule infettate con DCN ? caratterizzato da frequenti riarrangiamenti (figura 2D; . Tutte le linee cellulari trasdotte con DCN mostrano la presenza di una banda di 5.4 kb, corrispondente al provirus intatto, ma anche di una banda aggiuntiva di 3.2 kb in tutte eccettuata 1 (KG1) le linee cellulari. La proporzione relativa delle due bande era variabile nei campioni analizzati, variando da una predominanza del provirus intatto (MQLT-4, figura 2D, colonna 6) ad una prevalenza di quella riarrangiata (Raji, figura 2D, colonna 3). Infezioni ripetute con lo stesso campione retrovirale hanno indicato che la proporzione tra provirus intatto e riarrangiato ? un evento casuale, non cellula-specifico.
Come osservato per le linee cellulari trasdotti da tutti gli altri vettori, il quadro con Bg1 II ha mostrato che l'infezione con DCN genera un? integrazione policlonale in tutte le linee cellulari.
l-'er chiarire la natura del meccanismo responsabile per ' la generazione di provirus riarrang iato, abbiamo efFettu.a.to digestioni aggiuntive di DNA genomici con Hind III, che taglia due volte nel minicene ADA-LNGFR seguita da ibridazione con la sonda LNGFR. L'analisi comparativa dei quadri di restrizione con Xba I e con Xba I/Hind III con entrambe le sonde hanno indicato che la banda di 3.2 kb corrispondeva ad un provirus riarrangiato mancante del minigene ADA-LNGFR da entrambe le LTR. I provirus difettivi sono stati anche evidenziati ad alta Frequenza durante la selezione delle linee cellulari producenti DCN. Il clone utilizzato in tutti i nostri esperimenti portava solo il provirus intatto, indicando che la generazione di provirus difettivi avviene durante l'integrazione nelle cellule bersaglio, e non ? dovuta a difetti della linea cellulare produttiva.
Riassumendo, l'infezione di tutte le linee cellulari con NSV-N, NTK-N e LN3N ha dato luogo a ???? 1azioni resistenti a G418 che portano poche copie di provirus principalmente non riarrangiato, mentre l'infezione con il vettore DCN ha generato un provirus comunemente riarrangiato ad alta frequenza, molto probabilmente derivato dalla perdita del minigene ADA-LNGFR dal LTR del vettore retrovirale durante il processo di integrazione. Questo problema pu? essere dovuto alla dimensione e alla natura del gene inserito nella LTR virale, limitazioni simili con altri costrutti vettoriali a "doppia copia" non sono stati osservati <1=_1A).
Espressione mediata da vettore di LNGFR in linee cellulari ematopo iet iche umane
L?espressione del LNGFR trasdotto in di-F-Ferenti vettori retrovirali ? stata valutata sia a livello di proteina che di RNA. L?espressione sulla superficie cellulare di LNGFR nelle linee cellulari selezionate con G41S ? stata analizzata in maniera quantitativa per citometria a -Flusso con un anticorpo monoclonale anti-LNGFF:. I risultati sono sommarizzati nella tabella I. La maggior parte delle linee cellulari trasdotte con NSV?N e NTK-N mostravano un livello media basso di espressione sulla superficie di LNGFR, espressa come fluorescenza media relativa << di 100 unit? arbitrarie). Un?espressione alta di LNGFR (202 u.a.) si osservava solo nella linea cellulare RIM in-Fettata con ??0 trasdotta con NSV-N. L?espressione di LNGFR non era evidenziabile nella linea cellulare MOLT?4 trasdotta con NTK?N, sebben nessun riarrana imento del genoma provirale -Fosse evidenziabile in un digerito del DNA genomico con Xba I (figura 2B, colonna 6). Trasferimento genico ripetuta con questo vettore nella stessa linea cellulare produceva risultati negativi in maniera consistente.
Tutte le linee cellulari trasdotte con il vettore retrovirale LNSN esprimeva LNGFR a livelli medio alti (50-200 u.a.) (tabella I).
La maggior parte delle linee cellulari trasdotte con DCN esprimevano livelli medi o lati di LNGFR (50-200 u.a.). I profili per FACS delle linee cellari trasdotte con DCN correlavano con i risultati ottenuti per analisi "Southern", nelle quali le linee cellulari che portavano un provirus riarrangiato oltre ad un provirus intatto mostravano curve bifasiche, con un picco positivo ed un picco negativo proporzionali alla intesita relativa delle bande corrispondenti ai provirus riarrangiati ed intatti rispettivamente.
L?'espressione degli RNA vettori speci-fici nelle cellule trasdotte (K562) era determinata per analisi di trasferimento "Northern" di RNA poli(A)??<" >isolato dalle linee cellulari selezionate con G418, e ibridizzate a sonde LNGFR e Neo. I risultati ottenuti erano consistenti con i profili di trascrizione attesi di ciascun vettore retrovirale. Nelle cellule trasdotte con NSV-N e NTK-N, specie di RNA non maturate e maturate ibridiz zava.no sia alla sonda NLGFR che alla sonda Neo. I trascritti subgenomici derivati da 5V40 e da Ti< contenenti mRNA speci -Fico per LNGFR erano osservati solo dopo ibridazione con la sonda LNGFR. Le cellule trasdotte con LNSN esprimevano solo la Forma di RNA non maturata, ibr idiziando sia alla sonda NeoR che alla sonda LNGFR. Ci? ? consistente con ? inattivazione del sito donatore di maturazione nel vettore LXSN, da cui LNSN era derivato <=) . Un trascritta pi? corto, corrispondente al mRNA NeoR derivato da SV40 ibridizzava solo con la sonda NeoR.
Il vettore DCN generava due trascritti genomici derivati da LTR, rispettivamente non maturo e maturo. Una terza specie di RNA era trascritta dal promotore ADA, e probabilmente utilizzata come principale stampo di mRNA per la sintesi di LNGFR. Il contributo relativo del promotore ADA al 5r o al 37 di LTR per il trascritto LNGFR non pu? essere attribuito con questa tecnica. Una Forma di RNA a migrazione pi? lenta potrebbe rappresentare un trascritto "read-t hrough " che ha inizio dal promotore ADA al ?11 di LTR e termina al sito di addizione del poli(A) al 3' di LTR. Erano anche evidenziati due specie di RNA aggiuntive non considerate che ibrid izcavano solo con la sonda NeoR. Questi trascritti, presenti in tutte le linee cellulari trasdotte con DCN, erano le uniche specie di RNA evidenziabili in cellule R aji che non esprimevano LNGFR e avevano solo il provirus riarrangiato, come dimostrato da analisi per trasferimento ?Southern"- E? pertanto probabile che questi trascritti sono specifici per il provirus riarrangiato, mancanti del minigene ADAp-LNGFR.
L'espressione dell'RNA osservata nelle altre linee cellulari era comparabile con quella ottenuta dalla linea K562, con la sola eccezione della linea cellulare RIM infettata con EBV, che mostrava in maniera consistente alti livelli di trascritti derivati da SV40, sia da N30-N che da LN3N.
Efficienza del trasfsr imento genico mediato da vettore nei F'BLs umani
Linfociti da sangue periferico umani sono stati infettati con vettori retrovirali sotto stimolazione di F'HA e di IL-2. Per evidenziare le frequenze di infezioni, 48 ore dopo l'infezione le cellule T umane sono state coltivate in condizioni di diluizioni seriali <da 1 a IO3 cellule per pozzetto). Cellule infettate e di controllo non infettate sono state coltivate in presenza o in assenza di 0-4 mg/ml di G41B- La crescita cellulare era valutata 14 giorni dopo il piastr amento, quando nessuna cellula poteva essere evidenziata nei pozzetti che contenevano cellule non infettate coltivate in presenza di G418. La frequenza di infezione andava da meno dell '17. al 5.17., in -funzione del titolo virale- dei sovranatanti del vettore. Tuttavia, una variabilit? significativa era osservata tra differenti donatori. L?efficienza del trasferimento genico pu? essere aumentata da cicli d; infezione multipli o da co-coltivazione. Una co-colti vazione di TELs con linee cellulari producenti virus irradiate per 43 ore fornisce in maniera consistente una buona efficienza di trasferimento genico <10?157.), Un?analisi per doppia fluorescenza di LNGFR e di marcatori delle cellule T escludeva la possibilit? di una contaminazione delle cellule producenti vettori nella popolazione positiva per LNGFR. Nell?esperimento la frequenza di espressione di LNGFR era interamente dovuta al 1?espr essione del gene trasdotto nei PBLs infetti, poich? tutte le cellule positive per analisi FAC3 co?espr imevano il CD3 umano. In maniera indipendente dalla efficienza iniziale di trasferimento genico, i FBLs trasdotti possono essere selezionati alla omogeneit? sia per selezione negativa con Cj41a che immun ose1ez ione positiva con palline magnetiche accoppiate con anticorpi monoclonali contro LNGFR. Nell?esperimento rappresentativo, un singolo ciclo di immunose 1ez ione era sufficiente per separare la popolazione di cellule trasdotte da PBLs non infetti.
Una volta che le palline magnetiche sono state rimosse, una popolazione omogenea di linfociti trasdotti ? ottenuta senza una significativa perdita di cellule t rasdotte.
Per valutare l'efficienza dei vettori virali nella infezione di PBLs umani, si trasducevano in maniera indipendente diverse colture di PBL per esposizione a sovranatanti contenenti diversi vettori retrovirali e si selezionava con G418 per la presenza e l'espressione dei vettori. Dieci delle colture trasdotte con i vettori (3 da NSV-N, 3 da NTK?N, 2 da LNSN e 3 da DCN) erano analizzate per le integrazioni provirali per analisi ?Southern". La ibridazione alla sonda NeoR digerita con Xba I, che taglia sia al 5' che al 3' di tutti i vettori LTRs (figura i>, permette 1 'evidenz iazione dei provirus integrati, e con Bgl II, che taglia solo nel DNA genomico, permette una stima del numero dei siti d'integrazione. In tutte le colture di linfociti trasdotti da NSV-N, NTK?N e LNSN, solo le bande corrispondenti ai provirus integrati intatti erano evidenziabili, mentre una banda aggiuntiva corrispondente al provirus riarrangiato era osservata in tutte le colture trasdotte con DCN.
Infine, un'analisi delle integrazioni provirali rivelava che le colture di cellule T trasdotte con N3V-N, MTK-N e LNSN erano largamente policlonali, mentre le colture trasdotte con DCN erano essenzialmente oligoclonali, come indicato dalla presenza di una banda predominante e solo di poche bande minori. Come gi? suggerito, ci? ? probabilmente dovuto ad un titolo virale pi? basso e potrebbe essere evitato con diversi protocolli di trasferimento genico compresa la co?col tivazione delle cellule bersaglio con le linee cellulari producenti vettore.
Espressione mediata da vettore di LNGFR in lin-Fociti T umani
L'espressione sulla superficie cellulare di LN6FR era evidenziata per analisi FACS in un totale di 23 colture di lin-fociti T trasdotti con vettori retrovirali (5 N3V-N, 8 NTK-N, 5 LNSN e 5 E>CN). L?espressione di LNGFR era bassa in tutte le cellule trasdotte con N3V-N, ed in sei delle otto colture cellulari trasdotte con NTK?N. Le due linee cellulari T trasdotte con NTK-N restanti mostravano livelli intermedi di espressione LNGFR. Livelli di espressione eterogenea erano osservati nelle colture cellulari LNSN, con due linee esprimenti livelli bassi, due livelli intermedi, ed una livelli alti di LNGFR. Nelle cellule trasdotte con DCN, quattro delle cinque linee esprimevano livelli bassi ed una livelli intermedi di LNGh R.
Per caratterizzare le cellule inFette, abbiamo saggiato 13 linee cellulari' trasdotte per l'espressione di antigeni di dif Perenz iazione della superficie cellulare dei linPociti, utilizzando anticorpi monoclonali anti-CD4, CD8, CD5, E4, LeLi7, CD25R e CD34. Tutte le linee cellulari saggiate risultavano positive per l'espressione di CD5 e di CD25R e negative per 1 'espressione di Leu.7 , B4 e CD34 (non mostrato) . Dtto delle tredici colture analizzate erano LNGFR^/CDS* , una era LNGFRH_/CD4'*? e quattro erano positive per LNGFR e contenevano diverse percentuali di cellule che coespr imevano CD8 e CD4. La predominanza del Fenotipo CDS*? nelle colture stimolate con PHA e con IL-2 era anche osservata nelle linee cellulari di controllo non inFette, e probabilmente rappresenta un Fenomeno costante della procedura di coltura delle cellule T. In generale, non abbiamo osservato una trasduzione preferenziale di una sottospecie cellulare particolare da parte di nessuno dei quattro vettori retrovirali.
I cloni di cellule T erano ottenuti dalle colture di cellule T trasdotte con vettore per piastr amento delle cellule in diluizioni limitanti (1000, 100 e 10 cellule per pozzetto), considerando una Frequenza di inPezione media di approssimat ivame nte 1%.
Il 72X di tutti i cloni esaminati erano LNGFR-/CD4- e il 2S'/ erano LNGFR*VCD8?*?. La predominanza del Fenotipo CD4?*? era anche osservata nel controllo di cloni di cellule T non infette dagli stessi donatori, ed ? considerata un fenomeno standard nelle nostre condizioni di clonaggio. Inoltre, la trasduzione retrovirale e l?espressione di LNGFR era ottenuta in cloni doppi positivi, CD4^/CD8'*'. Questi risultati dimostrano che l?infezione retrovirale potrebbe avvenire non solo nelle cellule mature CD4?"* e CD8"*?, ma anche nei linfociti da sangue periferico doppiamente positivi CD4^/CD8^.
Analisi del repertorio di cellule T nei linfociti T trasdotti con i vettori
Come gi? mostrato, un?analisi per trasferimento "Southern" delle integrazioni virali dimostrava la natura policlonale delle colture di cellule T infettate da vettori. Questo era ulter iormente confermato da analisi molecolare dei riarrangiamenti della catenaJJ del recettore delle cellule T (TCR) su campioni di DNA digeriti con Xba I e ibridizzati ad una sonda specifica per la regione costante della catena^ del TCR. Uno schema policlonale, con nessuna banda predominante aggiuntiva allo schema della linea germinale, era evidenziate nelle colture di cellule T trasdotte con NSV, NTK-N e LNSN. La presenza di numeri limitati di bande riarrangiate predominanti era osservata in colture infettate con E'CN, cosi come per le popolazioni cellulari o1igodi ona1i .
Un'ulteriore conferma a queste osservazioni era ottenuta per un'analisi sistematica dell'uso della catena del TCR nei linfociti trasdotti. Dopo un singolo ciclo di infezione di PBLs con i sovranatanti contenenti vettori, seguito da una selezione delle cellule trasdotte con G418, l.'RNA totale della popolazione di 'linfociti selezionata era soggetta a trascrizione inversa e il DNA ottenuto era soggetto a F'CR con uso di o1igonne1eotid i-specifici KJA -C$ , ed a PCR "anchor" utilizzando u.n ?1igonne 1eot ide specifico ?? come descritto nella sezione dei metodi. Un'analisi dei prodotti amplificati dagli o1igonuc 1eot idi specifici ?? mostrava un identico repertorio paragonato alla popolazione di controllo originaria dei linfociti non trasdotti/non selezionati. La figura 9 mostra il repertorio sostanzialmente normale dell'uso in u.na popolazione policlonale di linfociti trasdotti con LNSN. In maniera simile ai risultati dell'analisi per trasferimento "Southern" dei riarrangiamenti delle catene TCR ~? , bassi titoli virali nei sovranatanti di vettori producevano un limitata repertorio \??' (non mostrato). Questa limitazione dei vettori a basso titolo potrebbe essere risolta per cicli di infezione multipla a per co- coltivazione di PBLs con la linea cellulare producente.
SEQ ID NO 1 :
GCCGCGGCCAGCTCCGGCGGGCAGGGGGGGCGCTGGAGCGCAGCGCAGCGCAGCCCCATC
- - - 4- 4- - 4 60 CGGCGCCGGTCGAGGCCGCCCGTCCCCCCCGCGACCTCGCGTCGCGTCGCGTCGGGGTAG AGTCCGCAAAGCGGACCGAGCTGGAAGTCGAGCGCTGCCGCGGGAGGCGGGCGATGGGGG
- - - - - - 120 TCAGGCGTTTCGCCTGGCTCGACCTTCAGCTCGCGACGGCGCCCTCCGCCCGCTACCCCC CAGGTGCCACCGGCCGCGCCATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGG
- 4 - - - - - 4 180 GTCCACGGTGGCCGGCGCGGTACCTGCCCGGCGCGGACGACGACAACGACGAAGACCCCC TGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGT
- 4 - - - - :- - 4 240 ACAGGGAACCTCCACGGTTCCTCCGTACGGGGTGTCCGGACATGTGTGTGTCGCCACTCA GCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCG
- - - - - - 300 CGACGTTTCGGACGTTGGACCCGCTCCCACACCGGGTCGGAACACCTCGGTTGGTCTGGC TGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGT
- - - - - - 360 ACACACTCGGGACGGACCTGTCGCACTGCAAGAGGCTGCACCACTCGCGCTGGCTCGGCA GCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCG
- - - - - - 420 CGTTCGGCACGTGGCTCACGCACCCCGAGGTCTCGTACAGCCGCGGCACGCACCTCCGGC ACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCG
- - - - - - 480 TGCTGCGGCACACGGCGACGCGGATGCCGATGATGGTCCTACTCTGCTGACCCGCGACGC AGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGA
- ?- - - - - - 540 TCCGCACGGCGCACACGCTCCGCCCGAGCCCGGAGCACAAGAGGACGGTCCTGTTCGTCT ACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACC
- - - - 4- 4- 4 600 TGTGGCACACGCTCCTCACGGGGCTGCCGTGCATAAGGCTGCTCCGGTTGGTGCACCTGG CGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCT
?- i- i- ? ?- 1- 1- h- 4 660 GCACGGACGGGACGTGGCACACGCTCCTGTGGCTCGCGGTCGAGGCGCTCACGTGTGCGA GGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAG
- 4- 4- 4-- - ? 4- 4- 4 720 CCCGGCTGCGGCTCACGCTCCTCTAGGGACCGGCAACCTAATGTGCCAGGTGTGGGGGTC AGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACC
- 4- - 4- 4- 4- 4 780 TCCCGAGCCTGTCGTGTCGGGGGTCGTGGGTCCTCGGACTCCGTGGAGGTCTTGTTCTGG
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per marcare una cellula eucariota (di mammifero) esprimendo 'in questa cellula un acido nucleico, detto acido nucleico codificante per un recettore di superficie cellulare, e successivamente presentando detto recettore alla superficie cellulare, caratterizzato dall'uso di un acido nucleico in cui la regione codificante per il dominio intracellulare del recettore ? stata completamente o parzialmente deleta o modificata in modo tale che il recettore presentato alla superficie non pu?, dopo legame al suo ligando, effettuare alcuna trasduzione di segnale.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la regione codificante perii dominio intracellulare ? modificata per sostituzione di nucleot idi.
- 3. Il metodo secondo la rivendicaz ione i o 2, caratterizzato dal fatto che ? utilizzato un acido nucleico codificante per il recettore NGF, CD24 o LDL.
- 4. Metodo secando le rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto che come acido nucleico, viene utilizzato l'acido nucleico del recettore NGF in cui la regione codificante dagli amminoacidi 245 al C?terminale ? deleta.
- 5. Metodo secondo le rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzato dal fatto che l'acido nucleico ? introdotto nella cellula a mezzo di un vettore virale, o per lipotezione.
- 6. DNA che codifica per un recettore modificato del NGF e che ? illustrato in SEQ ID NG 1, cosi come la sequenza comp lementare di questo.
- 7. Una cellula eucariota contenente un acido nucleico secondo la rivendicazione 6.
- 8. Uso di un acido nucleico, che codifica un recettore di superficie cellulare e in cui la regione codificante il dominio intracellulare ? stata completamente o parzialmente deleta o modificata in modo tale che il dominio non possa essenzialmente pi? effettuare alcuna trasduzione di segnale, a mezzo di espressione di detto recettore di superficie cellulare modificato e di p resentaz ione del recettore alla superficie cellulare in maniera tale che il recettore possa essere utilizzato come marcatore selezionabile per cellule eucariote trasfettate.
- 9. Metodo per la immunose 1ez ione di cellule trasfettate, a mezzo di introduzione di un acido nucleico che codifica per u.n recettore di superficie cellulare in cui la regione codificante il dominio intracellulare del recettore ? stata completamente o parzialmente deleta o modificata in maniera tale che il recettore presentato alla superficie non pu?, dopo legame al suo ligando, effettuare alcuna trasduzione di segnale, di identificazione delle cellule trasfettate per incubazione delle cellule con un anticorpo marcato che si lega in maniera specifica a detto recettore, e per recupero delle cellule per dissociazione del complesso anticorpo/cellula.
- 10. Metodo per la immunoseparaz ione di cellule trasfettate, a mezzo di introduzione di un DNA che codifica per un recettore di superficie cellulare in cui la regione codificante per il dominio intracellulare del recettore ? stata completamente o parzialmente deista o modificata in maniera tale che il recettore presentato alla superficie non pu?, dopo legame al suo ligando, effettuare alcuna trasduzione di segnale, di incubazione delle cellule con un anticerpo contro il recettore immobilizzato prima o dopo l'incubazione, di separazione delle cellule immobilizzate dal l'anticorpo dalle cellule non legate, e di isolamento delle cellule per dissociazione del legame anticorpo-recettore.
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