ITRM940647A1 - Metodo diagnostico per la determinazione della infertilita' maschile dei mammiferi basato su un procedimento di estrazione della proteasi acrosina-simile e della proteasi benzamidina-resistente e sulla determinazione delle loro attivita' enzimatiche - Google Patents
Metodo diagnostico per la determinazione della infertilita' maschile dei mammiferi basato su un procedimento di estrazione della proteasi acrosina-simile e della proteasi benzamidina-resistente e sulla determinazione delle loro attivita' enzimatiche Download PDFInfo
- Publication number
- ITRM940647A1 ITRM940647A1 IT000647A ITRM940647A ITRM940647A1 IT RM940647 A1 ITRM940647 A1 IT RM940647A1 IT 000647 A IT000647 A IT 000647A IT RM940647 A ITRM940647 A IT RM940647A IT RM940647 A1 ITRM940647 A1 IT RM940647A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- benzamidine
- proteases
- acrosine
- resistant
- protease
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims description 31
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims description 30
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title claims description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 10
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 8
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 16
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000002943 spectrophotometric absorbance Methods 0.000 claims description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N N-α-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=C([N+]([O-])=O)C=CC=1NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1=CC=CC=C1 DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 102100026041 Acrosin Human genes 0.000 description 3
- 108090000107 Acrosin Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RSYYQCDERUOEFI-UHFFFAOYSA-N 2-benzamido-5-(diaminomethylideneazaniumyl)pentanoate Chemical compound NC(N)=NCCCC(C(O)=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1 RSYYQCDERUOEFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 241001649081 Dina Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- -1 ethyl ether benzoyl-DL-arginine Chemical compound 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- RKDYKIHMFYAPMZ-UHFFFAOYSA-N n-[5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]benzamide Chemical compound C=1C=C([N+]([O-])=O)C=CC=1NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1=CC=CC=C1 RKDYKIHMFYAPMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
DESCRIZIONE
dell'invenzione avente per titolo ^ y "Metodo diagnostico per la determinazione della infertilità maschile dei mammiferi basato su un procedimento di estrazione
della proteasi acro sina- simile e della proteasi benzamidina-re sistente e sulla determinazione delle loro attività enzimatiche"
La presente invenzione riguarda un metodo diagnostico semplice, efficace e preciso per la determinazione della infertilità maschile dei mammiferi, basato su un procedimento di estrazione
della proteasi acro sina- simile e della proteasi benzamidina-resistente e sulla determinazione delle loro attività enzimatiche.
È noto che l'acrosina gioca un ruolo importante nella fecondazione (McRorie, R.A. and Williams, W.L., Annual Rev. Biochem.
43:777, 1974; Zaneveld, D.J.D. et al, Human Reprod. 6:1265, 1991)
ed è stato ripetutamente affermato che l'attività dell'acrosina può
essere un importante parametro per diagnosticare la fertilità (Sharma, R. et al, Fertility and Sterility, 60:881, 1993; Goodpasture J.C. et al, J. Androl. 8:267, 1987). Esiste anche l'opinione
contraria per cui l'acrosina da sola non è ben correlata con la fertilità (Kruger T.F. et al, Arch. Androl. 20:237, 1988; Chen, J.S. et al, Zygote 1:309, 1993). Per questa ragione, le analisi cliniche incontrano delle difficoltà nel mettere a fuoco la causa principale della infertilità maschile (Gerhard I. et al, Androl. 21:146, 1989).
Più di recente, la RhoMed Ine., Albuquerque, MN, ha ottenuto un brevetto statunitense (US-A-5.250.417) su di un "metodo per l'analisi della reazione aerosomiale" (metodo AR) sottolineando che l abilità dello spermatozoo a compiere la reazione aerosomiale caraterizza la capacità di fecondare l'uovo. Questo test richiede solo due o tre ore di lavoro manuale ed è assai più veloce della analisi attualmente in vigore.
Nell'ambito degli studi che hanno condotto alla presente invenzione è stato altresì preso in considerazione il metodo convenzionale, complicato, laborioso ed impreciso (Goodpasture J.C. et al, J. Androl., 1:16, 1979; Gerhard I. et al, Andrologia, 21, 146, 1989; Sharma, R. et al 60:881, 1993) delle analisi cliniche volto a identificare la causa della infertilità maschile. Poiché la base biochimica della fecondazione è praticamento ignota (Green, D.P.L., Human Reprod., 8:91, 1993), abbiamo effettuato studi finalizzati al chiarimento dei fattori coinvolti direttamento o indirettamente nella fecondazione.
In letteratura numerosi sono i metodi per l’estrazione delle proteasi acrosomiali e vengono principalmente seguiti i metodi di Goodpasture et al (Goodpasture J.C. et al, J. Androl. 1:16, 1979) e quello di Siegei et al (Siegei M.S. et al Biol. Reprod. 35, 485, 1986). In generale si basano tutti sulla tecnica nota come estrazione adda normalmente intorno a pH 3 in presenza di detergenti con e senza inibitore(i). I procedimenti sono generalmente complicati, dispersivi e per lo più non danno una buona resa (Kennedy W.P. et al, J. Androl., 10:221-231; Chen et al, Atti Accademia Fisiocritid, Siena, Serie XV-TOMO XII: 137-141, 1993). Un altro grave diffetto di questa metodologia è la perdita di numerosi enzimi proteolitiri acrosomiali termolabili (vedi Chen J.S. et al, Serono Symposium Series, Voi. 75, pag. 225) che possono essere importanti per la funzione normale degli spermatozoi. Abbiamo pertanto voluto rivedere il procedimento di estrazione tipicamente acrosomiale fattibile per una rapida conclusione compresa la determinazione delle attività enzimatiche delle proteasi contenute nell’estratto. Per questo motivo abbiamo affrontato il tema per individuare quanti tipi di proteasi acro sina- simile sono presenti negli spermatozoi (Menesini Chen, M.G. et al, in Atti Riunione Annuale TUM (Sodetà Italiana Biochimica), Assisi, 22 Aprile 1994, pag. 4). Ma il risultato più significativo è quello relativo alla scoperta di una proteasi tipicamente acrosomiale (Chen, J.S. et al, Serono Symposium Series, Voi. 76:125, 1991; Chen J.S. et al, Italian Biochemical Sodety Transactions, Voi. 3, pag. 439, 1992) chiamata proteasi ben zami dina-resi stente per la proprietà di non essere inibita dalla benzamidina (potente inibitore dell'acrosina) (Zahler W.L., Polakoski, K.L., Biochim. Biophys. Acta, 480:461-468, 1977).
La sudetta proteasi è stata osservata per la prima volta nel 1990 (Chen, J.S. et al, Serono Symposium Series, Voi. 76:125, 1991); ed è stato subito notato che essa contiene il calcio che è essenziale per l'esplicazione della sua attività proteolitica. Studi successivi hanno dimostrato che questo enzima è presente, oltre che nel bue, nel cinghiale, nel coniglio, nel ratto, nel montone e nell'uomo (Chen J.S. et al, Acta Embryol. Morphol. Expr., n.s. 12:99, 1991; Chen J.S. et al, Zygote 1:309, 1993; Sensini C. et al, The Clinical Biochemist-Reviews, 14 (iv):S45).
Secondo la presente invenzione ed in seguito alla identificazione da noi effettuata di una proteasi tipicamente acrosomiale, la proteasi benzemidina resistente, abbiamo trovato che il rapporto tra l'acro sina- simile e la proteasi benzamidina-resistente ha una buona correlazione con la struttura acrosomiale e con la fecondazione.
Un oggetto della presente invenzione è quello di fornire un procedimento per l'estrazione delle proteasi acrosomiali acrosinasimile e benzamidina resistente da un campione di sperma, che comprende gli stadi consistenti nel:
(a) preparare ima sospensione/soluzione di campione in tampone da 50 mM a 100 mM a pH 1-11, ad una concentrazione di spermatozoi da IO6 a 108/mL e lavare per tre volte mediante centrifugazione da 1000 a 3000 xg per 5 minuti;
(b) sonicare a potenza di 20 W per 1-5 minuti a 0’ C;
(c) regolare il pH della fase così ottenuta a 1-11; e
(d) centrifugare da 5000 a 10000 xg per 5-35 minuti (ad una temperatura di 4-25° C);
(e) recuperare il sopranatante.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è quello di fornire un metodo per la diagnosi della infertilità maschile dei mammiferi, che comprende gli stadi consistenti nel:
(a) estrarre da un campione di sperma ima fase contenente le proteasi acrosomiali acrosina-simile e benzamidina-resistente; (b) determinare le attività proteolitiche di dette proteasi acrosomiali
(i) preparando una miscela di incubazione comprendente 600 pL di ima soluzione tampone, a pH 6-8,5; 0-200 pL di detta fase contenente le proteasi; 0-50 pL di una soluzione acquosa contenente 150-550 mM di un inibitore; 0-500 pL di una soluzione acquosa allo 0, 1-0,5% di un substrato;
(ii) sottoponendo la suddetta miscela di incubazione a misurazione spettrofotometrica a 260-450 nm per ricavare, per ciascuna delle proteasi, la velocità iniziale (V0) mediante la seguente formula:
in cui (Vmax - Vmin) è la differenza di assorbenza spettrofotometrica e T è il tempo, in minuti, durante il quale si è verificata detta differenza di assorbanza; e
(c) calcolare il rapporto
in cui (E) è VQ dell'acrosina- simile in assenza di inibitore ed (E)x è VQ della proteasi benzimidina-resi stente in presenza di almeno 20 μΐι di detta soluzione di inibitore.
11 valore di R utile ai fini della diagnosi secondo la presente invenzione è stato correlato con le osservazioni al microscopio elettronico mediante ima valutazione statistica. Ad esempio, nel caso di campioni provenienti da uomini, se R > 1,3 vi è il 76,9% di probabilità che la posizione deH'acrosoma sia corretta e che il campione sia fertile.
Le attività enzimatiche possono essere determinate usando i substrati sintetici o quelli naturali in presenza o in assenza di inibitore.
Tra gli inibitori che possono venire impiegati nel metodo secondo l'invenzione si possono citare benzamidina, pepstatina, leupeptina ed inibitore della pepsina. Si preferisce soprattutto la benzamidina.
Tra i substrati che possono venire impiegati nel metodo secondo l'invenzione si possono citare substrati sintetici quali BAPNA (p-nitroanilide benzoil-DL-arginina), L1280 (p-nitroanilide glieina) ed il BAEE (etere etilico benzoil-DL-arginina) e substrati naturali quali emoglobina bovina, gelatina, α-caseina, albumina serica bovina e azocaseina. Preferibilmente, il substrato è un substrato sintetico croniogeno.
La scelta del substrato può influenzare la sensibilità ed il tempo di esecuzione delle analisi. Quando la reazione enzimatica avviene su un substrato sintetico quale il BAPNA, lo spettrofotometro utilizzato deve essere munito del "Time Drive File" e la lettura viene eseguita nel campo visibile (405 nm).
Tra i tamponi che possono venire impiegati nel metodo secondo l’invenzione si possono citare PBS (tampone fosfato salino), TBS (tampone Tris salino), tampone Tris-HCl, tampone acetato, tampone fosfato e tampone HC1-KC1.
Preferibilmente, lo stadio (a) di estrazione delle proteasi acrosina- simile e benzamidina-resistente viene effettuato secondo il procedimento dell'invenzione.
Di conseguenza, secondo l'invenzione, viene fornito un metodo diagnostico per la determinazione della infertilità maschile dei mammiferi che presenta i seguenti vantaggi.
1) Il metodo dell'invenzione offre valori aventi una minore probabilità di errore ed è quindi molto preciso.
2) Il metodo dell'invenzione è molto rapido in quanto richiede solo un'ora di lavoro manuale.
3) Il metodo dell’invenzione è semplice ed efficace.
3) Le sostanze usate per le analisi effettuate secondo il metodo dell'invenzione sono stabili e sicure e di facile approviggionamento.
4) Il parametro ottenuto con il metodo dell'invenzione permette di compiere una corretta diagnosi, pari al 76,92% delle probabilità. E questo è un buon risultato.
5) Con i metodi della tecnica nota non viene rivelata l'esatta localizzazione delTacrosoma, contrariamente a quanto avviene con il metodo secondo l'invenzione.
La presente invenzione verrà ora descritta in maggior dettaglio, a titolo illustrativo e non limitativo, negli esempi che seguono.
Esempio 1
Determinazione del valore di R a partire da un campione di spermatozoi eiaculati di origine umana.
1 - a II campione viene sospeso in un tampone (5 voi.), preferibilmente PBS (tampone fosfato salino, pH 7,2). Dopo centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti (a freddo), il precipitato viene sospeso usando lò stesso tipo di tampone. La stessa operazione viene ripetuta per tre volte (totale). Alla fine dell'operazione di lavaggio, gli spermatozoi vengono sospesi in 1,5 mL di PBS e contati in ima camera contaglobuli (camera di Thomas) per la determinazione della concentrazione spermatica.
1 - b II campione viene sottoposto a sonicazione (potenza 20 W) per 3 minuti (a 0*0 in una provetta di plastica, preferibilmente conica. Il pH del sonicato viene regolato a 2 con 3 N HC1 ed il campione viene quindi centrifugato a 13000 rpm (Microfuge) per 15 minuti. Il sopranatante (limpido) viene usato per la successiva determinazione delle attività proteasiche.
1 - c Lo spettrofotometro viene predisposto nel seguente modo: viene selezionato il "Time Drive File" e viene quindi impostata la lunghezza d'onda desiderata (405 nm per il substrato BAPNA ed il tempo di reazione (1 minuto ). La reazione viene compiuta in una cuvetta di plastica usa e getta mantenuta ad una temperatura costante di 37 "C. Anche il tampone d'incubazione, preferibilmente 0,2 M Tris Buffer, pH 8,5, ed il substrato, preferibilmente un substrato sintetico croniogeno BAPNA (benzoil-DL-arginina-p-nitroanilide) (0,1% in acqua distillata) vengono preriscaldati a 37’C. Il campione viene invece conservato a 0‘ C e l’inibitore, preferibilmente benzamidina, (7 mg/100 mL) resta a temperatura ambiente. Dopo essersi accertati che il solo tampone ed il substrato non producano un assorbimento maggiore di 0,0015 unità, lo spettrofotometro è pronto per la misurazione. Si prepara quindi la miscela d’incubazione che è costituita come segue nell'ordine da: 600 mL di tampone Tris-HCl 0,2M, pH 8,5; 100 mL di campione; nessun inibitore in caso di (E) e 20 μL di inibitore nel caso (E)x; 330 mL di substrato. Dopo avere ben mescolato per qualche secondo, si inizia la misurazione avendo avuto cura di avere azzerato lo strumento. La curva delle assorbanze del prodotto di idrolisi viene vissualizzata sullo schermo, e deve essere di secondo grado (secondo la cinetica enzimatica). Alla fine della misurazione, viene calcolato la V0 secondo la formula di cui sopra. Ogni tipo di misurazione viene ripetuta per tre volte.
1 - d La media di tre misurazioni con e senza Tinibitore, indicate rispettivamente come (E)x ed (E), permettono di calcolare il valore di R (si veda la formula sopra riportata).
Secondo i nostri dati, il valore di R è un'indice per la situazione dello stato dell'acrosoma presente negli spermatozoi umani. In sintesi, se il valore supera 1,3 si ha il 76,9% di possibilità di avere un acrosoma normale. Questo implica che lo spermatozoo ha la capacità di compiere la reazione acrosomiale e significa la possibilità di fecondazione [RhoMed Ine. (Albuquerque, MN), US-A-5.250.417].
Esempio 2
Determinazione del valore di R a partire da un campione di spermatozoi eiaculati di toro
2 - a II campione viene sospeso in un tampone come descritto in 1 - a. Alla fine del lavaggio, il precipitato di spermatozoi viene sospeso in 0,2 voi. di TBS (tampone fosfato salino) e si procede per la determinazione della concentrazione spermatica come descritto in precedenza. Il campione ad una desiderata concentrazione di spermatozoi (si veda più avanti) viene portato a pH 2 usando 3N HC1.
2 - b In una provetta di plastica contenente non più di 6 mL di spermatozoi in TBS (ad una concentrazione pari a 80 x 10G/mL), viene sottoposto a sonicazione come descritto in 1 - b, tranne che la centrifugazione viene eseguita a 10000 xg per 35 minuti. Il sopranatante viene usato per la successiva determinazione delle attività enzimatiche.
Si procede infine come in 1 - c e in 1 - d.
Per il toro, il valore di R è in genere intorno a 1 (pH 2). Se il valore di R è inferiore ad 1,1 la qualità del seme è considerata mediocre.
Esempio 3
Determinazione del valore di R a partire da un campione di spermatozoi epididimali di ratto .
3 - a La raccolta ed il successivo lavaggio e conteggio delle cellule spermatiche possono essere eseguiti come descritto in 1 - a, tranne che la concentrazione di spermatozoi è preferibilmente intorno a 60 x 106/mL.
3 - b Viene seguita la procedura descritta in 1 - b sino a portare il pH a 2. La centrifugazione può essere eseguita a 9000 xg per 35 minuti (4°C). Il sopranatante risultante viene usato per la determinazione dell'attività enzimatica.
Si procede infine come in 1 - c e in 1 - d.
Per i ratti, se il valore di R (da epididymis caudae) è superiore a 1,2, il seme è giudicato fertile, se inferiore a questo valore, è considerato scadente e quindi non fertile.
Esempio 4
Determinazione del valore di R a partire da spermatozoi eiaculati congelati di origine umana.
4 - a Viene seguita la procedura descritta in 1 - a, dopo di che i campioni vengono congelati a -25°C (il risultato finale resta invariato anche dopo diversi mesi di congelamento).
4 ■ b II campione viene scongelato rapidamente e quindi subito mantenuto in ghiaccio. Il resto della procedura è uguale a quantoo descritto in 1 - b.
Si procede infine come in 1 - c e in 1 - d.
La presente invenzione è stata descritta a titolo illustrativo e non limitativo, ma è si intende che varianti e modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per l'estrazione delle proteasi acrosomiali acrosina-simile e benzamidina resistente da un campione di sperma, che comprende gli stadi consistenti nel: (a) preparare una sospensione/soluzione di campione in tampone da 50 mM a 100 mM a pH 1-11, ad una concentrazione di spermatozoi da IO6 a 108/mL e lavare per tre volte mediante centrifugazione da 1000 a 3000 xg per 5 minuti; (b) sonicare a potenza di 20 W per 1-5 minuti a 0* C; (c) regolare il pH della fase così ottenuta a 1-11; e (d) centrifugare da 5000 a 10000 xg per 5-35 minuti (ad una temperatura di 4-25* C); (e) recuperare il sopranatante.
- 2. Metodo per la diagnosi della infertilità maschile dei mammiferi, che comprende gli stadi consistenti nel: (a) estrarre da un campione di sperma una fase contenente le proteasi acrosomiali acrosina-simile e benzamidina- resistente; (b) determinare le attività proteolitiche di dette proteasi acrosomiali (i) preparando una miscela di incubazione comprendente 600 pL di una soluzione tampone, a pH 6-8,5; 0-200 pL di detta fase contenente le proteasi; 0-50 pL di una soluzione acquosa contenente 150-550 mM di un inibitore; 0-500 pL di una soluzione acquosa allo 0, 1-0,5% di un substrato; (ii) sottoponendo la suddetta miscela di incubazione a misurazione spettrofotometrica a 260-450 nm per ricavare, per ciascuna delle proteasi, la velocità iniziale (V0) mediante la seguente formula: in cui (Vmax - Vmin) è la differenza di assorbenza spettrofotometrica e T è il tempo, in minuti, durante il quale si è verificata detta differenza di assorbanza; e (c) calcolare il rapporto in cui (E) è VQ deH’acrosina-simile in assenza di inibitore ed (E)x è V0 della proteasi benzimidina-resistente in presenza di almeno 20 pL di detta soluzione di inibitore.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che l'inibitore è benzamidina.
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 2 o 3, caratterizzato dal fatto che il substrato è un substrato sintetico croniogeno.
- 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 4, caratterizzato dal fatto che lo stadio (a) di estrazione delle proteasi acrosina-simile e benzamidina-resistente viene effettuato mediante to della rivendicazione 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM940647A IT1273989B (it) | 1994-10-10 | 1994-10-10 | Metodo diagnostico per la determinazione della infertilita' maschile dei mammiferi basato su un procedimento di estrazione della proteasi acrosina-simile e della proteasi benzamidina-resistente e sulla determinazione delle loro attivita' enzimatiche |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM940647A IT1273989B (it) | 1994-10-10 | 1994-10-10 | Metodo diagnostico per la determinazione della infertilita' maschile dei mammiferi basato su un procedimento di estrazione della proteasi acrosina-simile e della proteasi benzamidina-resistente e sulla determinazione delle loro attivita' enzimatiche |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITRM940647A0 ITRM940647A0 (it) | 1994-10-10 |
| ITRM940647A1 true ITRM940647A1 (it) | 1996-04-10 |
| IT1273989B IT1273989B (it) | 1997-07-14 |
Family
ID=11402761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ITRM940647A IT1273989B (it) | 1994-10-10 | 1994-10-10 | Metodo diagnostico per la determinazione della infertilita' maschile dei mammiferi basato su un procedimento di estrazione della proteasi acrosina-simile e della proteasi benzamidina-resistente e sulla determinazione delle loro attivita' enzimatiche |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1273989B (it) |
-
1994
- 1994-10-10 IT ITRM940647A patent/IT1273989B/it active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1273989B (it) | 1997-07-14 |
| ITRM940647A0 (it) | 1994-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Balercia et al. | Coenzyme Q10 supplementation in infertile men with idiopathic asthenozoospermia: an open, uncontrolled pilot study | |
| Légaré et al. | Investigation of male infertility using quantitative comparative proteomics | |
| Merendino et al. | Malondialdehyde in benign prostate hypertrophy: a useful marker? | |
| Henkel et al. | Sperm function and assisted reproduction technology | |
| US5698411A (en) | Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells | |
| Langlois et al. | Discrepancy between sperm acrosin activity and sperm morphology: significance for fertilization in vitro | |
| JP5059600B2 (ja) | 扁平上皮細胞癌関連抗原を指標とする皮膚性状の評価方法 | |
| Scarselli et al. | Analysis of MYO-Inositol effect on spermatozoa motility, in hyper viscous ejaculates and in patients with grades II and III varicocele | |
| Longato et al. | Reactive gamma-ketoaldehydes as novel activators of hepatic stellate cells in vitro | |
| Czarnecka-Operacz et al. | Acute-phase response and its biomarkers in acute and chronic urticaria | |
| Kruger et al. | Correlation between sperm morphology, acrosin, and fertilization in an IVF program | |
| Almashhedy et al. | Low levels of peroxiredoxins are associated with high iron content and lipid peroxidation in seminal plasma from asthenozoospermic infertile men | |
| Schill | Determination of active, non-zymogen acrosin, proacrosin and total acrosin in different andrological patients | |
| US7541182B2 (en) | In vitro test to detect risk of preeclampsia | |
| Wetterauer | Recommended biochemical parameters for routine semen analysis | |
| Francavilla et al. | Sperm acrosin activity and fluorescence microscopic assessment of proacrosin/acrosin in ejaculates of infertile and fertile men | |
| US5733719A (en) | Method of making an assay compound | |
| Lu et al. | Preliminary investigations on the standardization and quality control for the determination of acid phosphatase activity in seminal plasma | |
| Mushtaq et al. | Stress-responsive factor regulation in patients suffering from type 2 diabetes and myocardial infarction | |
| Agarwal et al. | Acrosin activity in patients with idiopathic infertility | |
| Figueroa et al. | An ontogenie study of renal tissue kallikrein in Okamoto spontaneously hypertensive rats: comparisons with human hypertensive nephropathy | |
| Cracowski | Isoprostanes as a tool to investigate oxidative stress in scleroderma spectrum disorders—advantages and limitations | |
| KR100270160B1 (ko) | 피검물질의 활성 측정법 | |
| Gomez-Lopez et al. | The apoptotic pathway in fertile and subfertile men: a case-control and prospective study to examine the impact of merocyanine 540 bodies on ejaculated spermatozoa | |
| Oludare et al. | Effects of lipopolysaccharide and high saline intake on blood pressure, angiogenic factors and liver enzymes of pregnant rats |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 0001 | Granted |