ITRM940740A1 - Uso di anticorpi che riconoscono la proteina 90k nella diagnostica clinica e nel monitoraggio dei pazienti affetti da epatite virale - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: "Uso di anticorpi che riconoscono la proteina 90K nella diagnostica clinica e nel monitoraggio dei pazienti affetti da epatite virale"

La presente invenzione riguarda l'uso di anticorpi che riconoscono la proteina 90K nella diagnostica clinica e nel monitoraggio dei pazienti affetti da epatite virale.

Più in particolare l'invenzione concerne l'uso di anticorpi che riconoscono la proteina 90K per la preparazione di saggi diagnostici per la diagnostica clinica e il monitoraggio dei soggetti con infezione asintomatica (cosiddetti "portatori sani"), infezione sintomatica e per predire la risposta alla terapia con interferone nei pazienti con malattia conclamata da virus dell'epatite.

E' noto che l'anticorpo monoclonale SP-2 (sottoclasse IgGl, C.N.C.M. Institut Pasteur N. 1-1083) identifica un antigene glicoproteico di peso molecolare di circa 90.000 daltons, denominato 90K, presente nel tessuto tumorale e nel siero di pazienti affetti da carcinoma della mammella ed altre neoplasie, cosi come nel siero di soggetti con infezione da virus del'immunodeficienza acquisita, in cui risulta predittiva di progressione a AIDS. La sequenza amminoacidica e le proprietà biochimiche e fisiologiche della proteina 90K sono descritte nelle seguenti pubblicazioni, qui incorporate per intero: S. Iacobelli et al., Cancer Res. 46, 3005-10, 1986; Breast Cancer Res.

Treat. 11, 19-30, 1988; Anticancer Res. 8, 761-764. 1988: Gynecol. Oncol. 35, 286-9, 1989, Domande di brevetto italiane N. RM92/A000099 e Rm92/A000100; S. Iacobelli et al., J. Infect. Dis. 164,616-617, 1991; J AIDS 6,370-375, 1993; AIDS RES. Human Retrov. 9, 811-816, 1993; Br. J. Haematol. 85, 207-209, 1993.

Gli autori della presente invenzione hanno ora trovato che l'antigene 90K è presente a livelli elevati nel siero di pazienti portatori di epatite virale; inoltre la percentuale di pazienti positivi e le concentrazioni medie del'antigene sono significativamente più elevate nei pazienti che non rispondono o rispondono per un periodo limitato di tempo alle terapie standard con interferone, valutate come ritorno dei valori delle transaminasi a valori rientranti nella norma. Il dosaggio della 90K può quindi rappresentare un presidio utilissimo per individuare i pazienti che hanno scarsa possibilità di risposta alla terapia con interferone o che, dopo una risposta, vanno incontro in breve tempo a recidiva di malattia. Tali pazienti, a prognosi clinica negativa, possono essere così selezionati per terapie alternative. Inoltre livelli elevati di antigene 90K in soggetti con epatite virale asintomatica (portatori sani) possono essere predittivi di una evoluzione in malattia conclamata. Tali soggetti sono da sottoporre a controlli periodici più ravvicinati.

Costituisce pertanto oggetto della presente invenzione, l'uso di anticorpi che riconoscono la proteina 90K per la preparazione di saggi diagnostici per il monitoraggio dell'infezione da virus dell'epatite in soggetti sia ad uno stadio asintomatico (portatori sani) che sintomatico e per predire la risposta alla terapia con interferone in detti soggetti. Preferibilmente detti anticorpi che riconoscono la proteina 90 K sono inibiti fitoemoagglutinina. Più preferìbilmente detto anticorpo è l'anticorpo SP-2 (C.N.C.M. Institut Pasteur N.

1-1083).

Un secondo oggetto della presente invenzione è costituito da un metodo diagnostico per il monitoraggio dell'infezione da virus dell'epatite in soggetti sia ad uno stadio asintomatico (portatori sani) che sintomatico e per predire la risposta alla terapia con interferone in detti soggetti che comprenda l'uso degli anticorpi dell'invenzione come reagenti specifici.

Il dosaggio dell'antigene 90K mediante l'anticorpo monoclonale SP-2 può essere effettuato mediante tecniche convenzionali quali, per esempio, dosaggio immunoradiometrico (IRMA) o dosaggio ELISA

Un esempio di corredo (kit) di facile impiego per la diagnostica clinica ed il monitoraggio dell'epatite virale è il seguente:

- sferette in polistirene sensibilizzate con IgG monoclonali di topo SP-2: n.

100

- tracciante costituito da IgG monoclonali di topo SP-2 marcate con 125^ tampone, proteine, stabilizzanti e conservanti; radioattività massima = 496 kBq (13,4 pCi) alla data di taratura: mi 21

- standard 0 costituito da tampone, proteine e conservanti: mi 30

- standard 1-4 contenenti antigene 90K alle concentrazioni, rispettivamente, di 5-10-20-40 U/ml, siero umano negativo per HBsAg e HTV-1, tampone, proteine e conservanti: mi 1

fi suddetto materiale è usato per analizzare campioni di sangue provenienti dai seguenti soggetti:

- 100 soggetti sani di controllo;

- 109 pazienti affetti da epatite virale;

- 30 pazienti con infezione asintomatica da virus dell'epatite (portatori sani). I campioni di sangue sono sottoposti a centrifugazione ed il siero è stato separato e conservato a -30° C.

Al momento dell'analisi, i campioni sono scongelati e diluiti 1:100 con lo standard 0 (10 μl campione 990 μl standard 0) e tutti i reattivi sono condizionati a temperatura ambiente (20-25°C). Utilizzando piastre da microtitolazione in plastica da 20 pozzetti, sono identificati i pozzetti per eseguire il dosaggio dello standard e dei campioni almeno in duplicato. Lo standard 0 (100 μl) è distribuito in tutti i pozzetti. Gli standard 0-4 (100 μl) ed i campioni diluiti (100 μl) sono distribuiti nei rispettivi pozzetti. In ciascun pozzetto è messa una sferetta. 1 pozzetti sono ricoperti con cartoncino autoadesivo per evitare l'evaporazione. Le piastre di reazione sono agitate dolcemente per eliminare eventuali bolle d'aria, controllando che le sferette siano completamente ricoperte.

Le piastre di reazione sono incubate per un'ora a 37°C. Terminata l'incubazione, il cartoncino autoadesivo è rimosso ed il liquido è asportato. Ogni pozzetto e la sferetta in esso contenuta sono lavati ripetutamente con un volume totale di 15 mi d'acqua deionizzata con dispositivi di aspirazione e lavaggio automatico di tipo noto.

In ogni pozzetto sono distribuiti 100 μl di SP-2 marcato con 125 I Le piastre sono nuovamente incubate a 37°C per un'ora. Al termine dell'incubazione, ogni sferetta è trasferita da un pozzetto ad una provetta per capovolgimento. La radioattività di ogni sferetta è misurata con un contatore di raggi gamma.

Ε' calcolata la media dei conteggi per ogni gruppo di 3 provette, dopo aver sottratto il valore di fondo. Sono tracciate delle curve standard su grafico lineare-lineare, riportando in ordinata i cpm medi ottenuti per ciascun standard ed in ascissa le corrispondenti concentrazioni di antigene 90K. Le concentrazioni di antigene 90K in U/ml sono quindi lette direttamente sulla curva standard. Il valore soglia per distinguere i soggetti normali dai patologici è fissato a ll U/ml.

I livelli ematici di antigene 90K nei soggetti con epatite virale sono risultati significativamente più elevati, sia come valori medi (29.6 /- 4.2 U/ml; p=0.000), che come percentuale di soggetti con valori superiori al valore soglia (40%; p=0.000), rispetto alla popolazione normale di controllo. Nell'ambito dei soggetti con epatite virale, livelli di antigene 90K superiori al valore soglia di 11 U/ml sono risultati fortemente predittivi di assenza di risposta alla terapia con interferone, o di ricaduta di malattia dopo un risposta transitoria. I pazienti non responsivi alla terapia con interferone mostravano livelli significativamente più elevati di antigene 90K (42.9 /- 7.3 U/ml) rispetto ai pazienti responsivi (13.7 /- 1.4 U/ml; p=0.000). Di 72 pazienti con livelli ematici dell'antigene 90K superiori al valore soglia, SI (70.8%) non rispondevano alla terapia con interferone, mentre di 37 pazienti con livelli serici di 90K nell'ambito della normalità, solo 9 (24.3%) non rispondevano alla terapia. Alla regressione logistica multivariata, i livelli elevati di 90K erano il più importante fattore in grado di predire la risposta alla terapia con interferone (p=0.000), seguita dalla presenza di concomitante cirrosi epatica (p= 0.008). D'altra parte, i livelli nella norma di 90K erano l'unico fattore in grado di identificare pazienti con risposta prolungata nel tempo alla terapia con interferone, ovvero ad oltre un anno dalla sospensione della stessa.

Dati su un limitato numero di pazienti con infezione virale asintomatica (portatori sani) mostrano che 5 (16.6%) soggetti con livelli di 90K superiori al valore soglia, ad un successivo controllo bioptico epatico, mostravano segni di un iniziale danno epatico, indice di possibile evoluzione a malattia sintomatica.

Questi dati complessivamente indicano che l'antigene 90K riconosciuto dall'anticorpo SP-2 è un importante fattore prognostico per individuare l'evoluzione clinica della epatite virale nel singolo paziente. Rispetto ad altri marcatori noti ha il vantaggio di essere un antigene presente nel siero, dosabile con metodica rapida ed economica, applicabile su larga scala su un vasto numero di pazienti.

E' stato inoltre determinato che l'anticorpo SP-2 riconosce sulla proteina 90K un determinante antigenico di natura carboidratica, che è anche riconosciuto dalla lectina vegetale fitoemoagglutinina. Nel dosaggio immunoradiometrico sopra descritto, raggiunta della fitoemoagglutinina in concentrazione micromolare maschera i siti riconosciuti dall'anticorpo SP-2 sulla proteina 90K, impedendo il legame antigene-anticorpo. Ciò è confermato da dati complementari che dimostrano che la 90K (purificata da liquido ascitico di pazienti affetti da neoplasie) in concentrazione micromolare, è in grado di bloccare, in modo dose dipendente, lo stimolo proliferativo indotto dalla fitoemoagglutinina in cellule linfomononucleate isolate da sangue periferico di soggetti sani. Ciò a dimostrare che la 90K, interagendo con la fitoemoagglutinina, le impedisce di interagire con siti di riconoscimento presenti sulla superficie delle cellule linfomononucleate da sangue periferico e quindi di indurre la risposta proliferativa.

Saggio ELISA per la determinazione di 90K nel siero

Materiali

Mab SP-2 purificato da ascite mediante precipitazioni con acido caprili co e cromatografia d'affinità su Proteina A-Sefarosio. Conservato aliquotato a -20°C alla concentrazione di 2 mg/ml in PBS.

Adesione di SP-2 a piastre da microtitolazione

Si diluisce l'anticorpo SP-2 a 2-4 gg/ml tampone NaHC03 0.1 M (pH 8.0). Immediatamente, si distribuiscono 100 μl nei pozzetti di piastre Microtiter usando un dispensatore multicanale. Si lascia per la notte a 30°C (fino a completo essiccamento); quindi si conserva a 4°C. Si allestisce il numero di piastre necessario, che risultano stabili per 6 mesi.

Mab SP-2 coniugato con biotina

La coniugazione avviene come descritto in "Antibodies. A Laboratory Manual", p.341. La biotina estere è aggiunta nel rapporto di 220 gg di estere/mg di SP-2. Si conserva a 4°C fino a 6 mesi.

Come sistema rivelatore si usa la Extravidin-Alkaline Phosphatase (Sigma cat. E2636) e il 1,6 p-nitrofenil fosfato (NPP) (Sigma cat. N-2770). Si diluisce 1 tavoletta (200 mg) in 20 mi Tris-HCI e si utilizza entro 60 min.

Come standard, si diluiscono serialmente un pool di sieri umani a partire da una soluzione madre contenente circa 1000U IRMA e diluita 1 :27 in PBS-FCS 1% NaN3. Si effettuano 5 diluizioni corrispondenti a 40-20-10-5-2.5 U/ml, che sono stabili a 4°C per 12 mesi. Lo standard 0 è formato dalla soluzione di PBS-BSA 1% NaN3

Il dosaggio può essere effettuato su siero o su plasma. Si diluiscono i campioni 1 : 10 con lo standard 0 prima del dosaggio, SO μl di campione 450 μ 1 di standard 0. Si condizionano i reattivi a temp. ambiente. Si eseguono le fasi del dosaggio senza interruzione, utilizzando un puntale monouso per dispensare campioni e standard. Si identificano i pozzetti della piastra di reazione per il dosaggio di standard e campioni e si esegue il dosaggio almeno in duplicato.

Si aggiunge ai pozzetti 200 μl di standard 0 e si incuba per 2 ore a temperatura ambiente. Si aspira il contenuto e si lava con PBS. Si distribuiscono 100 μl di ciascuno standard (0-5) e dei campioni diluiti nei rispettivi pozzetti. Si centrifuga brevemente a 1200 rpm, si ricoprono i pozzetti con un cartoncino autoadesivo per evitare l'evaporazione e si incubano le piastre di reazione per 3 ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, si elimina il cartoncino autoadesivo, si aspira il liquido e si lava ripetutamente ciascun pozzetto con acqua deionizzata, evitando accuratamente la fuoriuscita di liquido dai pozzetti. Dopo essersi assicurati delleliminazione completa di qualsiasi goccia d'acqua dai pozzetti e dalla superficie della piastra di reazione, si distribuiscono 100 μl di SP-2 biotinilato in ciascun pozzetto. Si centrifuga brevemente a 1200 rpm e si incubano le piastre di reazione per 1 ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, si aspira il liquido e a lava come sopra. Si distribuiscono 125 μ 1 di substrato NPP (appena preparato) in ciascun pozzetto e si incuba 30 min a temp. ambiente in agitazione. Si blocca la reazione mediante aggiunta di 25 μl di 3 M NaOH. Si misura l'asso rbanza a 405nm con un lettore per piastre.

La stessa procedura può essere utilizzata per altri liquidi biologici e per estratti cellulari o tessutali. Questi ultimi debbono essere preventivamente omogeneizzati e solubilizzati in PBS-Nonidet P-40 per 60 min a 4°C.

La presente invenzione è stata descritta, a titolo illustrativo ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma è da intendersi che variazioni do modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

Claims (4)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso di anticorpi che riconoscono la proteina 90K per la preparazione di saggi diagnostici per il monitoraggio dell'infezione da virus dell'epatite in soggetti sia ad uno stadio asintomatico (portatori sani) che sintomatico e per predire la risposta alla terapia con interferone in detti soggetti.
2. 2. Uso di anticorpi che riconoscono la proteina 90K secondo la rivendicazione 1 in cui detti anticorpi sono inibiti dalla fitoemoagglutinina.
3. 3. Uso di anticorpi che riconoscono la proteina 90K secondo la rivendicazione 2 in cui detto anticorpo è l'anticorpo SP-2 (C.N.C.M. Insthut Pasteur N. 1-1083).
4. 4. Metodo diagnostico per il monitoraggio dell'infezione da virus dell'epatite in soggetti sia ad uno stadio asintomatico (portatori sani) che sintomatico e per predire la risposta alla terapia con interferone in detti soggetti caratterizzato dal fatto di comprendere come reagenti specifici anticorpi che riconoscono la proteina 90K.