ITTO20011042A1 - Polipeptidi isolati basati sulla sequenza della proteina p17 di hiv utili come vaccino anti-hiv. - Google Patents
Polipeptidi isolati basati sulla sequenza della proteina p17 di hiv utili come vaccino anti-hiv. Download PDFInfo
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Landscapes
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: "Polipeptidi isolati basati sulla sequenza della proteina p17 di HIV utili come vaccino anti-HIV"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce a polipeptidi isolati, basati sulla sequenza della proteina p17 di HIV, utili nella terapia e nella diagnosi della sindrome da immunodeficit umano acquisito (AIDS).
L'AIDS comprende un gruppo di sindromi cliniche causate dà un retrovirus denominato virus dell'immunodeficienza umana (HIV). L'HIV infetta in maniera preferenziale le cellule che esprimono l'antigene CD4 sulla propria superficie, quindi i linfociti T helper e i macrofagi, ma anche le cellule dendritiche dei linfonodi.
L'infezione da HIV può essere bloccata in vitro per mezzo di anticorpi ottenuti dal siero di individui infettati .
Nel corso degli anni sono stati inoltre sviluppati diversi anticorpi neutralizzanti HIV che per la maggi parte reagiscono con i prodotti proteici del gene env.
Tali prodotti proteici sono stati utilizzati come: immunogeni sotto varie forme, ad esempio come estratti glicoproteici, proteine ricombinanti e peptidi sintetici.
I prodotti di env sono stati tradizionalmente considerati le proteine di HIV più immunogeniche e più adatte a stimolare una risposta immunitaria protettivaL contro HIV.
Tuttavia, i ricercatori hanno rivolto la propria attenzione anche alle proteine codificate da altri geni di HIV, ad esempio quelle di gag. Il gene gag, come è noto, codifica per una poliproteina precursore avente: peso molecolare di circa 55.000 (p55), che viene: tagliata dalla proteasi di poi nei polipeptidi p24, pl7 e pl5 che costituiscono le proteine strutturali del core del virione.
Alcuni studi hanno indicato che anche i prodotti delgene gag possono essere il bersaglio di una risposta immune neutralizzante.
In particolare è stato descritto che la proteina p17 di HIV può essere bersaglio di anticorpi neutralizzanti la replicazione di HIV e che alti livelli di anticorpi anti-pl7 sono correlati con una più lenta progressione dell'AIDS.
Il brevetto US 5,185,147 presenta alcune sequenza polipeptidiche isolate basate sulla regione amminoterminale di p17, descritte come in grado di. evocare anticorpi anti-p17 che interagiscono con lei particella virale di HIV modificandone la capacità infettante in vitro. Tuttavia, come è noto da studi di microscopia elettronica
la proteina p17 è localizzati all'interno della particella virale e quindi non e disponibile all'interazione con anticorpi anti-p17. La modificazione della capacità infettante in vitro della particella virale di HIV osservata in questo studio non è pertanto ascrivibile ad una effettiva inibizione dell'attività biologica della proteina p11.
Il problema alla base della presente invenzione è quindi quello di trovare polipeptidi basati sulla sequenza della proteina p17 che siano effettivamente in grado di evocare anticorpi neutralizzanti l'attività biologica della proteina p17 di HIV.
Per risolvere tale problema i presenti inventori hanno utilizzato un approccio del tutto diverso da quello utilizzato nel brevetto US 5,185,147 citato, basato sulla scoperta che l'attività biologica della proteina p17 si esplica attraverso un'interazioni: tra la proteina in forma di entità a sé stante, separata dalla particella virale, e recettori specifici espressi sulla superficie delle cellule bersaglio di HIV L'esistenza di tali recettori per p17 sui linfociti, bersaglio di HIV non era stata finora ipotizzata.
Inoltre, come verrà descritto in maggior dettagliò nella sezione relativa agli esempi, gli inventori hanno anche trovato che l'attività biologica della p17 deriva da un lato dalla sua capacità di incrementare la produzione di citochine pro-infiammatorie ad azione prò--HIV, quali IFN-γ e TNF-α, e dall'altro dalla sua capacità di ripristinare la produzione di tali citochine proinfiammatorie quando questa viene inibita da citochine anti-infiammatorie, quale ad esempio IL-4. L'individuazione di recettori specifici per la p17 sulla superficie delle cellule bersaglio di HIV è alla base della presente invenzione.
Gli inventori, infatti, studiando l'interazione p17/recettore hanno individuato una regione della proteina p17 che rappresenta la regione di legame con il recettore cellulare e che è in grado di evocare anticorpi inibenti l'attività biologica della proteina p17, nonché il suo legame al recettore stesso, presente descrizione tali anticorpi saranno indicati come "anticorpi neutralizzanti anti-p17" e, οve appropriato, tale regione di legame sarà indicata come "epitopo di neutralizzazione".
Gli inventori hanno quindi verificato che polipeptidi isolati, aventi una sequenza amminoacidica basata su quella dell'epitopo di neutralizzazione della pl7, ossia la sequenza nella regione N-terminale compresa tra le posizioni amminoacidiche 9 e 22 di p17 risolvono il problema alla base della presente invenzione poiché, grazie alla loro struttura secondaria, tali polipeptidi sono in grado di evocare anticorpi neutralizzanti l'attività biologica della pl7 Tali polipeptidi sono quindi particolarmente adatti ad essere utilizzati in un vaccino per interferire con la replicazione di HIV.
La numerazione dei residui amminoacidici della sequenza di p17 qui utilizzata è in accordo con quella proposta in Ratner et al. (1985), Nature 313:277.
E' stato inoltre dimostrato che tali polipeptidi vengono specificamente riconosciuti da anticorpi monoclonali neutralizzanti anti-p17, mentre non vengono riconosciuti da anticorpi monoclonali anti-p17 non neutralizzanti. Tali polipeptidi sono quindi particolarmente adatti anche per 1'impiego in metodi diagnostici per rivelare la presenza di anticorpi. neutralizzanti anti-pl7 in un soggetto infetto con HIV nonché in metodi per la purificazione di tali anticorpi Un primo oggetto dell'invenzione è quindi uh polipeptide isolato, in grado di reagire specificamente con anticorpi neutralizzanti anti-p17 di HIV, avente una sequenza amminoacidica che corrisponde all'epitopo di neutralizzazione della proteina p17 di HIV ossia la sequenza compresa tra la posizione 9 e la posizione 22 della proteina p17 di HIV.
Come sarà descritto più dettagliatamente negli esempi, gli inventori hanno inizialmente costruito un polipeptide sintetico come sopra definito, basato sulla sequenza dell'epitopo di neutralizzazione della proteina pl7 contenuta nel plasmide BH10 (ceppo di laboratorio) Tale polipeptide sintetico ha la sequenza NH2-Ser-Gly Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH. Gli inventori hanno verificato sperimentalmente che tale polipeptide viene specificamente riconosciuto dà anticorpi monoclonali neutralizzanti ottenuti contro la pl7 di BH10.
Questo polipeptide è pertanto adatto ad essere utilizzato come immunogeno in grado di evocare anticorpi neutralizzanti la p17 di BH10.
E' stato inoltre verificato che varianti della proteina pl7 caratteristiche di altri ceppi di HIV presentano modificazioni nell'ambito della regione dell'epitopo di neutralizzazione che comunque non ne alterano significativamente il riconoscimento da partii di anticorpi neutralizzanti l'attività biologica della P17.
Tra tali varianti citiamo a titolo illustrativo le sequenze della pl7 di ceppi virali prevalenti in Africa (clade C). Polipeptidi secondo l'invenzione, basati sulla sequenza della pl7 di ceppi virali prevalenti in specifiche aree geografiche permettono di ottenere anticorpi a maggiore affinità nei confronti della p17 corrispondente, e pertanto si prestano particolarmente ad essere utilizzati come vaccini da impiegare in tale aree geografiche.
Basandosi sulle informazioni di sequenza contenute nelle banche dati genetiche (ad esempio GenBank) relative alla sequenza della p17 di ceppi provenienti da diverse aree geografiche, i presenti inventori hanno quindi ottenuto una serie di polipeptidi sintetici secondo l'invenzione, corrispondenti alle posizioni 9 a 22 della p17 di differenti ceppi di HIV, che condividono la proprietà immunologica di reagire specificamente con anticorpi neutralizzanti diretti contro la pl7 del corrispondente ceppo di HIV.
Tali polipeptidi sono rappresentati dalla formula generale : NHz-X^Gly-X^X^Leu-Asp-X^-Trp-Glu-X^Ile-X<6>-Leu-Arg-COOH, in cui X<1 >è un residuo amminoacidicp scelto tra Ser e Arg,- X<2 >è un residuo amminoacidico scelto tra Gly, Giu e Ser; X<3 >è un residuo amminoacidicp scelto tra Giu, Lys, Asp e Arg; è un residuo amminoacidico scelto tra Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Giu Asp e Gin; X<5 >è un residuo amminoacidico scelto tra Lys Arg e Ser; ed X<6 >è un residuo amminoacidico scelto tra Arg e Gin.
Tutti gli amminoacidi identificati nella presenti descrizione sono nella configurazione L. Lfe abbreviazioni utilizzate per i residui amminoacidicji. sono in accordo con la nomenclatura standard.
All'interno di questo gruppo, il polipeptide avente la sequenza amminoacidica NH2-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH costituisce una forma di realizzazione preferita del polipeptidp dell'invenzione. Tale polipeptide corrisponde alla sequenza tra le posizioni 9 e 22 della pl7 del ceppo di laboratorio BH10 di HIV-1, che è rappresentativo d ceppi diffusi in Europa ed America (clade B).
Allo scopo di aumentare la solubilità dei polipeptidi dell'invenzione, essi possono inoltre essere legati ad una seconda sequenza airaninoacidica adatta a tale scopo. quale ad esempio la sequenza -Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-COOH, che corrisponde alle posizioni 23 a 30 della proteina pl7 del ceppo HB10 di HIV-1.
Secondo tale forma di realizzazione, la seconda sequenza amminoacidica è legata direttamente al residuo carbossiterminale del polipeptide secondo 1'invenzioni: (ad esempio, NH2-X<1>-Gly-X<2>-X<3>-Leu-Asp-X<4>-Trp-Glu-X<5>-Ile X<6>-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-COOH).
I polipeptidi oggetto dell'invenzione hanno là capacità di evocare una risposta immune neutralizzante quando somministrati ad un paziente infetto con i corrispondente ceppo di HIV, e sono pertanto adatti ad essere utilizzati in un vaccino.
Nell'ambito della presente descrizione, con il termine vaccino si intende una composizione comprendenti un polipeptide secondo l'invenzione come ingrediente attivo ed un veicolo farmaceuticamente accettabile, tale composizione essendo in grado di indurre una immunità attiva in un soggetto - ad esempio un mammifero, incluso un essere umano - al quale essa viene somministrata in una quantità efficace.
Un secondo oggetto dell'invenzione è quindi una composizione di vaccino comprendente un polipeptide dell'invenzione ed un veicolo farmaceuticamente accettabile. Una tale composizione è anche adatta essere utilizzata come inoculo da somministrare ad mammifero non umano per generare anticorpi chi; immunoreagiscono con HIV, in particolare anticorpi, neutralizzanti anti-pl7 di HIV.
Secondo una forma di realizzazione preferita quando i polipeptidi vengono utilizzati in una composizione di. vaccino o inoculo, i polipeptidi possono essere coniugati con un'adatta molecola carrier, ossia una molecola in grado di accoppiarsi con il polipeptide e renderlo immunogeno. Rientra pertanto nell'ambito della presente invenzione un polipeptide come definito in precedenza, che è coniugato con un carrier.
Esempi di carrier adatti a tale scopo sono proteine quali KLH ("keyhole limpet hemocyanin"), edestina tiroglobulina, albumine quali la sieroalbumina bovina (BSA) o la sieroalbumina umana (HSA), eritrociti quali eritrociti di pecora (SRBC), l'anatossina tetanica l'anatossina del colera, poliamminoacidi quali ad esempio poli(D-lisina:acido D-glutammico) e simili.
Per facilitare il legame del polipeptide alla molecola carrier, possono inoltre essere introdotti dei residui amminoacidici aggiuntivi all'N-terminale o al C-terminale del polipeptide. L'utilizzo di un residuo aggiuntivo di cisteina (Cys) al C-terminale del polipeptide è particolarmente adatto a tale scopo, poiché - come è noto - la cisteina è in grado di formare ponti disolfuro.
Di conseguenza, quando il polipeptide dell'invenzione è destinato ad essere coniugato con un carrier, esso contiene preferibilmente un residue aggiuntivo di cisteina (Cys) legato al residue carbossiterminale del polipeptide. in questo contesto, con l'espressione residuo carbossiterminale del polipeptide si intende o il residuo carbossiterminale della sequenza che costituisce l'epitopo di neutralizzazione di pl7 (Arg 22) o il residuo carbossiterminale della seconda sequenza amminoacidica avente la funzione di aumentare la solubilità del polipeptide (Lys 30).
Inoltre, in un'altra forma di realizzazione, il polipeptide può contenere anche un residuo aggiuntivo di Norleucina (Nleu) nella posizione C-terminale precedente: il residuo cisteinico aggiuntivo di cui sopra, per una. maggiore tracciabilità del peptide durante i processi di. coniugazione con molecole carrier.
Pertanto, secondo una forma di realizzazione dell'invenzione, il polipeptide è coniugato con un carrier, preferibilmente attraverso un residuo aggiuntivo di cisteina (Cys) o un dipeptide aggiuntivo -Nleu-Cys- in posizione carbossiterminale.
In alternativa all'utilizzo di un carrier, polipeptidi dell'invenzione possono essere adoperati in forma di peptidi ramificati.
Rientra quindi nell'ambito della presente invenzioni anche un polipeptide come definito in precedenza, ϊn forma di peptide ramificato.
Con l'espressione "peptide ramificato" si intendi indicare un complesso ad alto peso molecolare costituito da una pluralità di copie identiche di un polipeptide: dell'invenzione legate ad un core centrale atto a legare: simultaneamente una pluralità di copie identiche di detto polipeptide.
Un peptide ramificato ("branched peptide") può essere ottenuto legando il polipeptide in più copie ad un core centrale di polilisina ( "MAP technology"), in modo da raggiungere un elevato peso molecolare e risultare immunogeno anche senza la presenza di molecole carrier (Nordelly B., et al.,1992, J. Immunol. 148: 914--920). Il core di polilisina può inoltre essere modificato come descritto ad esempio in Okuda K., et al., 1993, Journal of Molecular Recognition 6: 101-109 oppure sostituito da altre sostanze, quali ad esempio glucosio, che hanno la stessa capacità della polilisina di legare più molecole dello stesso polipeptide e quindi generare complessi ad alto peso molecolare.
La scelta del carrier o del tipo di core, che si basa su criteri noti sostanzialmente indipendenti da], determinante antigenico utilizzato, non forma un oggetto specifico della presente invenzione e quindi non sarà discussa in ulteriore dettaglio.
La composizione di vaccino od inoculi) dell'invenzione può inoltre contenere ulteriori ingredienti tra i quali ad esempio un adiuvante antigenico, ossia una sostanza in grado di aumentare l'efficacia o 1'immunogenicità di un antigene.
Poiché alcuni degli adiuvanti utilizzabili negli animali non sono utilizzabili nell'uomo, gli adiuvanti del vaccino e dell'inoculo possono essere identici o differenti.
Come adiuvanti utilizzabili in un vaccino citiamo a titolo illustrativo l'Alum (idrossido di alluminio) 1'adiuvante incompleto di Freund, e il composto MF59 recentemente descritto da Graham B.S., et al. (Ann. Int Med. 1996, 125: 270-279).
Il vaccino od inoculo della presente invenzione contiene una quantità efficace di un polipeptide dell'invenzione. La quantità efficace di polipeptide per dose unitaria dipende da criteri, peraltro ben noti, che riguardano, tra gli altri, la specie a cui appartiene il soggetto da inoculare, il peso corporeo del soggetto da inoculare e il regime di somministrazione prescelto. I vaccini e gli inoculi contengono tipicamente quantità di. polipeptide variabili da 1 a 100 microgrammi/kg per l'uso in mammiferi di media taglia (capre, cani, scimmie) e nell'uomo, e da circa 10 microgrammi a circci 500 microgrammi per dose inoculata in animali di piccoléL taglia (topi, ratti, conigli, criceti).
Queste quantità sono basate sul peso del polipeptide tal quale, senza tener conto del peso del carrier quando questo viene utilizzato.
Come indicato in precedenza, i polipeptidi dell'invenzione possono inoltre essere utilizzati come reagenti diagnostici in un saggio per rivelare la presenza di anticorpi neutralizzanti anti-pl7 in un paziente infetto con HIV.
A questo scopo può essere utilizzato un dosaggio immunologico quale ad esempio un dosaggio immunoenzimatico in fase eterogenea (ELISA, enzymelinked immunosorbent assayì o in fase omogenea (EMIT enzyme multiplied immunoassay t echnique) , un dosaggio radioimmunologico, un dosaggio immunologico basato sulla fluorescenza o qualsiasi altra tecnica in cui l'anticorpo oppure 1'antigene è marcato con una molecola rivelabile o con qualsiasi altro mezzo indicatore.
Inoltre, i polipeptidi dell ' invenzione possono anche: essere utilizzati come reagenti specifici per purificare: anticorpi neutralizzanti anti-pl7 di HIV da un campione: biologico prelevato da un soggetto, quale ad esempio un campione di sangue .
Il soggetto può essere ad esempio un paziente umanò infettato con il virus HIV oppure un mammifero non umano precedentemente inoculato con una proteina in grado digenerare anticorpi neutralizzanti anti-p17. Tale: proteina può ad esempio essere la stessa proteina p17 de. HIV in una forma sostanzialmente purificata ricombinante, oppure un frammento da essa derivatò contenente almeno l ' epitopo di neutralizzazione della pl7 identificato nella presente invenzione, detto frammento essendo eventualmente coniugato con un carrier, o in forma di peptide ramificato, o in qualsiasi altra forma tale per cui esso è immunogeno.
In questo contesto, con l ' espressione proteina p17 in una forma sostanzialmente purificata si intende indicare la proteina p17 sostanzialmente isolata dal resto della particella virale .
Le tecniche di purificazione degli anticorpi attualmente in uso prevedono la precipitazione degl anticorpi dal fluido biologico prelevato dal paziente ad esempio mediante l ' aggiunta di solfato d' ammonio, poi la loro separazione cromatografica, ad esempio mediante cromatografia per gel-filtrazione, cromatografia a scambio ionico o cromatografia di affinità.
I polipeptidi utilizzati come reagenti diagnostici o di purificazione possono essere in forma libera oppure possono anche essere legati ad un carrier o ad altre: molecole, quali ad esempio biotina, capaci di essere: riconosciuti da anticorpi o da altri ligandi (ad esempio, streptavidina oppure avidina, molecole che: legano specificamente la biotina).
Gli esempi che seguono vengono fom iti a scopo di illustrazione e non sono intesi a limitare in alcun modo la portata della presente invenzione.
ESEMPI
Esempio 1: produzione di p17 ricombinante
La sequenza codificante della proteina pi† dell'isolato BH-10 di HIV-1 (amminoacidi 1-132, Ratner
è stata amplificata mediante PCR e clonata nel sitò BamHI del plasmide pGEX-2T (P
che ne ha consentito la fusione con l'estremità NH2-terminale dell'enzima glutatione S-trasferasi (GST). I primer e le sequenze oligonucleotidiche utilizzati, erano basati sull'entry HIVBH10 della banca dati. GenBank, che corrisponde al genoma completo dell'isolato BH-10 di HIV-1. La sequenza corretta del gene della p17 clonato è stata confermata usando i primer di. sequenziamento pGEX (Pharmacia), un sequenziatore automatico di DNA (ABI PRISM 310; Perkin Elmer, Foster City, CA) ed il corredo ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit con AmpliTaq DNA polimerasi FS (Perkin Elmer).
Le proteine di fusione GST sono state espresse ih Escherichia coli e purificate utilizzando perle glutatione Sepharose 4B (Pharmacia). La proteina virale è stata tagliata da GST mentre era ancora legata a perle glutatione-agarosio, come descritto in
La proteina p17 è stata ulteriormente purificati mediante FPLC in fase inversa, raggiungendo una purezza superiore al 98%.
L'assenza di lina contaminazione da endotossine ne preparazione di pl7 ricombinante di HIV-1 (<0,1 unità endotossine/ml) è stata verificata con il saggio basato sugli amebociti di Limulus (Whittaker Bioproducts, Inc. Walkersville, Maryland, Stati Uniti d'America). La p17 7i HIV-1 purificata è stata anche biotinilata utilizzando AH-NHS-Biotina (SPA, Milano, Italia) secondo le istruzioni del produttore.
Esempio 2: colture di cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC)
I PBMC sono stati isolati mediante gradiente didensità Ficoll-Hypaque (Pharmacia) da sangue eparinizzato appena raccolto da soggetti sani. Lè cellule sono state seminate in piastre per coltura a 96 pozzetti con fondo a U (Nunc, Roskild, Danimarca) ad una densità di IO6 cellule/ml e sono state coltivate per il numero indicato di giorni a 37°C in terreno RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO) supplementato con il 10% di siero AB umano inattivato mediante riscaldamento (Sigma) penicillina 100 U/ml e terreno completo con streptomicina ( "streptomycin complete medium") 100 μg/ml.
Esempio 3: effetto di p!7 sulla secrezione di TNF-ά INF-γ da parte di PBMC stimolati con IL-2
Per valutare se pl7 possa influenzare la produzion di alcune citochine pro-infiammatorie, ossia TNF-ά INF-γ, che notoriamente creano un ambiente più adatt alla replicazione di HIV-1, è stata effettuata una serie di esperimenti per misurare la secrezione di queste: citochine da parte di PBMC in coltura stimolati con IL-2 in assenza e in presenza di pl7. Sono state testati diverse dosi di IL-2, da 2,5 a 100 U/ml.
In tutti i soggetti analizzati, una dose di 20 U/ml determinava una consistente induzione della secrezione: sia di TNF-ά che di INF-γ nel surnatante delle colture: di PBMC. L'aggiunta di p17 a dosi differenti aumentava la produzione di queste citochine da parte dei PBMC trattati con IL-2. Il massimo incremento è stato riscontrato ad una concentrazione di pl7 di 50 ng/ml anche se la pl7 era biologicamente attiva a basse concentrazioni fino a 5 ng/ml. Ad una concentrazione di. pl7 di 50 ng/ml, l'incremento era più pronunciato per TNF-a (dal 36 a più del 100%) che per lNF-γ (dal 29 al 50%).
Su colture di PBMC non stimolati non è statò osservato alcun incremento della produzione di citochine da parte di p17.
Esempio 4: inversione dell'inibizione indotta da IL-4 sulla produzione di TNF-g e !NF-γ mediante p17 L'aggiunta di IL-4 a colture di PBMC stimolate IL-2 diminuiva sia la produzione di lNF-γ che quella TNF-α. La diminuzione della secrezione di IFN-γ era il 62 e l'83%, mentre la diminuzione della secrezione TNF-ocera tra il 68 e l'84%.
Per verificare se pl7 sia in grado di contrastare gli effetti inibitori di IL-4, la proteina virale è stata aggiunta a PBMC all'inizio della coltura simultaneamente a IL-2 e IL-4.
Dopo 72 ore in coltura, i surnatanti sono statiraccolti ed analizzati per la secrezione di TNF-α e di INF-γ.
In tutti gli esperimenti effettuati, i risultat ottenuti mostrano che pl7 è in grado di ripristinare là capacità dei PBMC di produrre TNF-oc e INF-γ, con un recupero rispettivamente dall '88 al 100% e dal 77 all'89%.
Esempio 5: saggio di legame di p17 ad un recettore cellulare specifico
Per stabilire se l'attività di pl7 sia dovuta alla interazione con un recettore espresso sulle cellule bersaglio, la proteina virale è stata coniugata con biotina e fatta reagire con PBMC appena isolati da soggetti sani oppure stimolati per 48 ore con fitoemoagglutinina (PHA).
La pl7 è stata quindi evidenziata sulla superficie cellulare mediante l'uso di streptavidina marcata con ficoeritrina in citometria di flusso.
L'esperimento è stato condotto nel modo che segue. I PBMC sono stati stimolati o non per 2 giorni con PHA ad una concentrazione di 5 μg/ml e poi incubati per 30 minuti su ghiaccio con diverse quantità di plV biotinilata, comprese tra 50 ng/ml e 1,6 μg/ml. I PBMC sono stati lavati 2 volte con PBS ed incubati per 30 minuti in ghiaccio con una adatta quantità di streptavidina coniugata con ficoeritrina (Becton Dickinson, San Jose, CA) diluita in PBS contenente il 2% di siero fetale di vitello (FCS). In alcuni esperimenti le cellule sono anche state colorate con anticorpi monoclonali anti-CD4, anti-CD8, anti-CD16 o anti-CD19 coniugati con fluoresceina isotiocianato (FITC) (Becton Dickinson) . Per valutare la fluorescenza di fondo sono stati inclusi coniugati di anticorpo per il controllo dell'isotipo IgG (Becton Dickinson). Le cellule sono poi state lavate 2 volte con PBS contenente il 2% di FCS e lo 0,2% di NaN3 ed analizzate su di un citometro a flusso FACSCalibur (Becton Dickinson). L'analisi è stata effettuata utilizzando il software CellQuest (Becton Dickinson) .
I risultati ottenuti sui PBMC appena isolati dal paziente dimostrano che la p17 non lega i linfociti T CD4<+ >e CD8<+>, né le cellule NK (CD16<+>), ma è invece presente sulla superficie della maggior parte linfociti B (CD19<+>). Al contrario, quando stimolati, i linfociti T CD4<+ >e CD8<+ >ed NK acquisiscono la capacità di legare la pl7.
Il dato dimostra che esiste un recettore per la p17 di HIV sui linfociti circolanti e che esso costitutivamente espresso sui linfociti B mentre è inducibile sulla superficie dei linfociti T.
Esempio 6: produzione di anticorpi monoclonali anti-p17 Topi Balb/c femmina sono stati sensibilizzati con 100 μg di pl7 dell'esempio 1 emulsificata in adiuvante completo di Freund e sottoposti a richiami ad intervallidi 15 giorni con 100 μg di proteina in adiuvante incompleto. Dopo 3 giorni dal richiamo n.4, le milze sono state rimosse per la fusione cellulare. liprotocollo di fusione, che prevede l'utilizzo di cellule di mieloma di topo NS-0 in presenza di polietilenglicole al 50%, è stato descritto in Horan Hand, P., A. Thor, D Wunderlich, R. Muraro, A. Caruso, and J. Schlom, 1984 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:5227-5231.
La specificità degli anticorpi è stata determinati mediante ELISA e Western Blot. In breve, piastre da microtitolazione a 96 pozzetti in polistirene sono state rivestite con pl7 (0,25 μg/pozzetto) in tampone carbonato. Dopo lavaggio con PBS contenente lo 0,05% di Tween-20 (v/v), i sum atanti della coltura tissutale ibridoma sono stati aggiunti ai pozzetti rivestiti co: pl7. Dopo 1 ora di incubazione a 37°C e lavaggio, i legame degli anticorpi monoclonali a pl7 è statò rivelato utilizzando anticorpi di capra anti-lgG di topo coniugati con perossidasi di rafano (Dako, Glostrup Danimarca) seguiti dall'aggiunta di o-fenilendiammina come substrato per la reazione colorimetrica.
La reattività degli anticorpi monoclonali con la p17 4ativa è stata valutata mediante analisi Western blot utilizzando kit commerciali per l'analisi Western blot: di HIV-1 (Sanofi Diagnostic Pasteur, Marnes La Coquette Francia).
Esempio 7: saggi di neutralizzazione della p17 di HIV-1 E' stato verificato se gli anticorpi monoclonali anti-pl7 ottenuti nell'esempio 6 possano influirei sull'attività biologica di pl7 e sull'interazione della proteina con il proprio recettore cellulare espresso sui linfociti T e B.
I PBMC sono stati coltivati in triplicato in piastre a 96 pozzetti con fondo a U in terreno completo con IL-2 (ad una concentrazione di 20 U/ml) in presenza o in assenza di diverse concentrazioni di pl7 ricombinante purificata (comprese tra 2,5 e 100 ng/ml). L'inibizione della secrezione di TNF-QC e lNF-γ è stata ottenuta aggiungendo IL-4 (20 ng/ml) alle cellule stimolate con IL-2. All'inizio della coltura, alle cellule sono stati aggiunti gli anticorpi anti-pl7, a concentrazioni, comprese tra 0,5 e 10 μg/ml. Dopo 3 giorni, dall'attivazione cellulare sono stati raccolti surnatanti di coltura e verificati per la presenza di. TNF-a e INF-γ.
Per bloccare il legame di pl7 con il recettore cellulare espresso dai linfociti T e B sono anche stati, utilizzati anticorpi anti-pl7 alle concentrazioni sopréL indicate. La capacità degli anticorpi di bloccare il legame pl7/recettore è stata valutata mediante citometria di flusso.
Tra i diversi anticorpi ottenuti nell'esempio 6 solo uno di essi, denominato MBS-3, era in grado di bloccare gli effetti di pl7 sulla secrezione di citochine proinfiammatorie. Infatti, le cellule PBMC stimolate con IL-2 e pl7 riducevano la produzione di lNF-γ e TNF-α a livelli confrontabili con quelli ottenuti in colture stimolate con IL-2 da sola quando 1'anticorpo monoclonale MBS-3 veniva aggiunto alle colture all'inizio della stimolazione con il mitogeno (dati non mostrati).
L'aggiunta di MBS-3 a colture stimolate con IL-2 più IL-4 e p!7 bloccava completamente la capacità della proteina virale di invertire l'attività inibitoria IL-4 .
Altri anticorpi monoclonali anti-p17, e tra di essi uno in particolare denominato MK-1, non presentavano alcuna capacità di neutralizzazione, inoltre, l'aggiunta di MBS-3 all'inizio della stimolazione con il mitogeno non interferiva, in assenza di p17, con la sintesi delle citochine proinfiammatorie e con l'attività inibitoria di IL-4. Infine, MBS-3 (ma non MK-1) bloccava completamente il legame di p17 con il proprio recettore in maniera dose-dipendente.
Esempio 8: epitope mapping
L'anticorpo monoclonale neutralizzante anti-p17 MBS 3 è stato caratterizzato per il legame ad epitopi specifici della p17 mediante la tecnica dell'epitope mapping.
Sulla base della sequenza nota della p17 del ceppo HB10 di HIV-1, sono stati sintetizzati 62 peptidi di 10 amminoacidi di lunghezza. Tali peptidi erano rappresentativi dell'intera lunghezza della pl7 e S:L sovrapponevano tra di loro con uno spostamento lungo la molecola di p17 di 2 amminoacidi.
Come controllo positivo per la sintesi dei peptidi per la reattività degli anticorpi è stato anche sintetizzato il polipeptide EAENLKKYFN di lNF-γ riconosciuto dall'anticorpo monoclonale IGMB-15
A., L. Tiberio, C. De Rango, C. Bonfanti, G. Flamminio G. Gribaudo, E. Monti, E. Viani, N. Manca, G. Garotta S. Landolfo, A. Balsari, and A. Turano, 1993, J Inumino1. 150:1029-1035).
I peptidi sono stati sintetizzati utilizzando un kit SPOT Synthesis (Genosys Biotechnologies, Pampisfors Gran Bretagna) su una membrana di cellulosa 8 x 12 cm ih aree derivatizzate con un dimero di β-alanina con gruppi amminici (N3⁄4 ) esposti. La reattività degli anticorpi monoclonali contro i peptidi è stata valutata secondo le istruzioni del produttore.
La regione di legame è stata quindi individuati, nella sequenza inclusa tra le posizioni 9 e 22 di pl7 (S-G-G-E-L-D-R-W-E-K-I-R-L-R) . Lo stesso peptide veniva riconosciuto anche da altri due anticorpi neutralizzanti anti-pl7 in un saggio ELISA in fase solida, mentre altri anticorpi non neutralizzanti anti-p17 non lo riconoscevano .
Inoltre, in un saggio ELISA competitivo, il peptide sopra indicato è risultato efficace nello spiazzare il legame dell'anticorpo MBS-3 con la p17 adsorbita su fase solida.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1. Polipeptide isolato, in grado di reagire specificamente con anticorpi neutralizzanti anti-p17 di HIV, avente una sequenza amminoacidica che corrisponde all'epitopo di neutralizzazione della proteina p17 di HIV ossia la sequenza compresa tra la posizione 9 e la posizione 22 della proteina p17 di HIV. 1. Polipeptide secondo la rivendicazione 1, in cui detta sequenza amminoacidica è NH2-X<1>-Gly-X<2>-X<3>-Leu-Asp-X<4>-Trp-Glu-X<5>-Ile-X<6>-Leu-Arg-COOH, dove X<1 >è un residuo amminoacidico scelto tra Ser e Arg; X<2 >è un residuo amminoacidico scelto tra Gly, Giu e Ser; X<3 >è un residuo amminoacidico scelto tra Giu, Lys, Asp e Arg; X<4 >è un residuo amminoacidico scelto tra Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Giu, Asp e Gin,- X<5 >è un residuo amminoacidico scelto tra Lys, Arg e Ser; ed X<6 >è un residuo amminoacidico scelto tra Arg e Gin. 3. Polipeptide secondo la rivendicazione 2, in cui detta sequenza amminoacidica è NH2-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu--Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH. 4. Polipeptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, avente inoltre una seconda sequenza amminoacidica -Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-COOH direttamente legata al residuo amminoacidico nella posizione carbossiterminale di detta sequenza amminoacidica dell'epitopo di neutralizzazione proteina pi7 di HIV. 5. Polipeptide secondo una qualsiasi dellfe rivendicazioni 1 a 4, che è coniugato con un carrier. 6. Polipeptide secondo la rivendicazione 5, che è coniugato con un carrier attraverso un residup aggiuntivo di cisteina (Cys) o un dipeptide aggiuntivo -Nleu-Cys- in posizione carbossiterminale. 7. Polipeptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, che è in forma di peptide ramificato. 8. Polipeptide secondo una qualsiasi dellfe rivendicazioni 1 a 7, per l'impiego come vaccino otì inoculo atto a generare una risposta immunitaria neutralizzante l'attività biologica della proteina p17 di HIV. 9. Composizione farmaceutica di vaccino od inoculò comprendente un polipeptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7 ed un veicolo farmaceuticamente accettabile. 10.Uso di un polipeptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7 per la preparazione di un medicamento atto a generare una risposta immunitaria neutralizzante l'attività biologica della proteina p17 di HIV in un soggetto al quale esso viene somministrato 11. Uso di un polipeptide secondo una qualsiasi dell rivendicazioni 1 a 7 in un saggio diagnostico in vitr per rivelare la presenza di anticorpi neutralizzanti paziente infetto con HIV. 12. Uso di un polipeptide secondo una qualsiasi dell rivendicazioni purificare anticorpi di HIV dal sangue di un soggetto infetto con HIV oppur dal sangue di un soggetto precedentemente inoculato con proteina grado generare anticorpi neutralizzanti anti-p17 di HIV.
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