ITTO20070201A1

ITTO20070201A1 - Nuovi marcatori di metilazione del dna utili per la diagnosi di malattie neoplastiche

Info

Publication number: ITTO20070201A1
Authority: IT
Inventors: Elena Miotto; Silvia Sabbioni
Original assignee: Elena Miotto; Silvia Sabbioni
Priority date: 2007-03-19
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2007-10-08

Description

"Nuovi marcatori di metilazione del DNA utili per la diagnosi di malattie neoplastiche"

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un procedimento in vitro per la rivelazione di neoplasie dell'uomo tramite analisi dello stato di metilazione del DNA di specifiche regioni del DNA tumorale, nonché acidi nucleici e oligonucleotidi utili in tale procedimento e kit comprendenti tali oligonucleotidi.

La metilazione del DNA, ossia il legame di gruppi metilici (-CH3) a citosine presenti nel DNA nel contesto del dinucleotide CpG (C = citosina; G = guanina; p = monofosfato) è la più comune e nota modificazione epigenetica a cui il DNA può andare incontro nelle cellule di mammifero. Di norma, una volta stabilito lo schema di metilazione del DNA, la cellula madre lo trasmette fedelmente a tutte le cellule figlie.

Nel genoma umano, sono presenti numerose migliaia di regioni particolarmente ricche di CpG - le cosiddette isole CpG (CpG islands). Queste regioni, spesso locallizate nei promotori genici, sono generalmente prive di metilazione.

E' noto dalla letteratura scientifica che svariate isole CpG presentano metilazione aberrante nei tumori umani. Ciò spesso si associa con l'inibizione della trascrizione dei geni ad esse collegate, suggerendo che l'alterato stato di metilazione del DNA riscontrato nei tumori umani possa avere un ruolo nel processo tumorigenico. In ogni caso, la presenza di alterata metilazione si presenta come un utile marcatore di diagnosi di malattie neoplastiche nell'uomo, inoltre, poiché alterazioni nello stato di metilazione si riscontrano già nelle fasi iniziali del processo neoplastico, questi marcatori sono utili anche per una diagnosi precoce.

La letteratura scientifica e brevettuale riporta infatti numerosi studi sullo stato di metilazione di geni implicati nello sviluppo di tumori umani e sui metodi utili per la loro rivelazione.

Vi è peraltro la continua necessità di individuare nuovi marcatori di malattie neoplastiche che da un lato consentano di ampliare le conoscenze attualmente disponibili sui meccanismi molecolari alla base della canceroge nesi, e dall'altro contribuiscano a fornire nuovi strumenti per la diagnosi precoce di tumori umani.

La presente invenzione si basa su studi effettuati dai presenti inventori, con i quali è stato identificato un gruppo di isole CpG associate a geni umani {elencati in tabella 1) che si sono rivelati utili come marcatori di metilazione del DNA. Specificamente, tutte le isole CpG elencate in tabella 1 sono state inizialmente identificate attraverso un unico esperimento di analisi del profilo trascrizionale nella linea cellulare umana RKO trattata con farmaco demetilante.

Più specificamente, gli inventori hanno trovato che lo stato di metilazione delle isole CpG elencate in tabella 1 è alterato in tumori umani e che l'analisi dello stato di metilazione delle isole CpG di tali geni costituisce un marcatore utile per la diagnosi di diversi tipi di neoplasie umane, comprendenti sia tumori solidi sia neoplasie ematologiche.

Più specificamente, gli inventori hanno trovato che le isole CpG riportate in tabella 1 presentano, in cellule derivate da neoplasie umane, una frequenza di metilazione superiore a quella osservata nei controlli normali, che risultano non metilati o metilati con bassa frequenza. Lo stato di metilazione di tali isole CpG, la cui localizzazione genomica ed estensione è specificata in tabella 1, costituiscono quindi un utile marcatore di tumori solidi e neoplasie ematologiche nell'uomo.

Le isole CpG si trovano tutte all'estremità 5' di geni umani elencati in tabella 1 e coprono regioni variabili da circa 1,3 kb a circa 7,5 kb.

Un oggetto della presente invenzione è quindi un procedimento per la diagnosi di tumori solidi e neoplasie ematologiche, caratterizzato dal fatto di comprendere, in un campione di DNA genomico, la fase di analizzare lo stato di metilazione dell'isola CpG di un gene scelto dal gruppo che consiste dei geni umani elencati in tabella 1, la localizzazione genomica dell'isola CpG di ciascuno di detti geni umani essendo come indicata in tabella 1, la metilazione di detta isola CpG essendo indicativa di malattia neoplastica.

In una forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene AR-HGAP20 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 42.661 e 45.840 della sequenza Genbank AP003460, versione 3 (SEQ ID NO: 1), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene CDH11 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 52.081e 55.500 della sequenza Genbank AC137643, versione 3 (SEQ ID NO: 2), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene FLI1 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 40.001 e 47.460 della sequenza Genbank AP001122, versione 5 {SEQ ID NO: 3), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene F0SL2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 52.801 e 57.000 della sequenza Genbank AC104695, versione 2 (SEQ ID NO: 4), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene HES2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 31.741 e 34.020 della sequenza Genbank AL031848, versione 11 (SEQ ID NO: 5), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene HTR6 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 92.521 e 95.340 della sequenza Genbank ALO31727, versione 43 (SEQ ID NO: 6), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

in un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene LHX3 conpresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 111.001 e 116.040 della sequenza Genbank AL138781, versione 13 {SEQ ID NO: 7), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene LOC51149 conpresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 117.001 e 119.700 della sequenza Genbank AC008393, versione 7 (SEQ ID NO: 8), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene MAP1B compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 39.361 e 41.460 della sequenza Genbank AGO93218, versione 2 (SEQ ID NO: 9), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione conprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene MDM2 conpresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 140.401 e 141.660 della sequenza Genbank AC025423, versione 32 (SEQ ID NO: 10), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene NID1 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 36.661 e 38.520 della sequenza Genbank AL122018, versione 37 (SEQ ID NO: 11), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene NID2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 75.001 e 77.340 della sequenza Genbank AL008557, versione 5 (SEQ ID NO: 12), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene FNUTL2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 108.541 e 111.200 della sequenza Genbank AC005666, versione 1 {SEQ ID NO: 13), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PRPH compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 149.821 e 152.460 della sequenza Genbank AC125611, versione 4 {SEQ ID NO: 14), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PTGER3 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 123.001 e 124.560 della sequenza Genbank AL031429, versione 11 (SEQ ID NO: 15), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione conprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PTPRM compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 64.321 e 66.660 della sequenza Genbank AP001091, versione 5 {SEQ ID NO: 16), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.

La tabella 1 riassume la corrispondenza delle isole CpG di ciascuno dei geni sopra menzionati con le coordinate nucleotidiche delle rispettive sequenze Genbank.

Lo stato di metilazione dell'isola CpG viene analizzato utilizzando tecniche che includono il trattamento chimico del DNA con un reagente capace di trasformare le differenze di metilazione in differenze di sequenza. Preferibilmente, a tale scopo viene utilizzato un reagente chimico capace di trasformare le basi citosina non metilate in uracile od altra base atta ad appaiarsi con una base diversa da guanina.

Un reagente preferito per questo scopo è il bisolfito, preferibilmente sodio bisolfito, in combinazione con idrochinone. In questa reazione chimica, le citosine non metilate presenti nel DNA vengono infatti deaminate ad uracile che, in termini di appaiamento delle basi, corrisponde alla timidina. Le citosine metilate sono invece resistenti al trattamento chimico e pertanto non subiscono alcuna modificazione. Conseguentemente, le metilcitosine presenti nel DNA originario, che inizialmente non potevano essere distinte dalle citosine poiché presentavano le stesse proprietà di appaiamento, rimangono le uniche citosine presenti nel DNA trattato chimicamente e possono quindi essere identificate utilizzando tecniche standard di biologia molecolare.

La sequenza di basi del DNA trattato chimicamente può ad esempio essere analizzata mediante sequenziamento diretto. In alternativa possono essere utilizzate tecniche, quale ad esempio la Methylation Specific PCR {MSP), basate sull'amplificazione metilazione-specifica di segmenti dell'isola CpG del DNA campione trattato chimicamente. Tali tecniche utilizzano oligonucleotidi capaci di ibridarsi selettivamente alle sequenze modificate dell'isola CpG metilata o non metilata ottenute mediante il trattamento chimico sopra descritto.

Trattando chimicamente come descritto sopra un campione di DNA genomico includente l'isola CpG di uno dei geni descritti in tabella 1, si ottengono per ciascun gene due filamenti modificati, ciascuno dei quali è derivato da imo dei due filamenti del DNA genomico trattato, i quali tuttavia non sono più tra loro complementari.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene ARHGAP20 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene ARHGAP20 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene CDH11 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene CDH11 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FLI1 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FLI1 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FOSL2 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FOSL2 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene HES2 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene HES2 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ XD NO: 37 e SEQ ID NO: 38 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene HTR6 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene HTR6 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene LHX3 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene LHX3 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene LOC51149 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene L0C51149 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene MAP1B sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene MAP1B è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene MDM2 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene MDM2 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene NIDI sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene NIDI è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene NID2 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene NID2 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 66 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FNUTL2 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 68 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PNUTL2 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 70 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PRPH sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PRPH è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 74 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PTGER3 sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 56 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PTGER3 è metilato.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 78 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PTPRM sono metilati.

Le sequenze denominate SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PTPRM è metilato.

Le sequenze SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AP003460, versione 3 (nucleotidi 42661-45840) del gene ARHGAP20.

Le sequenze SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC137643, versione 3 (nucleotidi 52081-55500) del gene CDHll.

Le sequenze SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AP001122, versione 5 (nucleotidi 40001-47460) del gene FLI1.

Le sequenze SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC104695, versione 2 (nucleotidi 52801-57000) del gene FOSL2.

Le sequenze SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL031848, versione 11 (nucleotidi 31741-34020) del gene HES2.

Le sequenze SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL031727, versione 43 (nucleotidi 92521-95340) del gene HTR6.

Le sequenze SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL138781, versione 13 (nucleotidi 111001-116040) del gene LHX3.

Le sequenze SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC008393, versione 7 (nucleotidi 117001-119700) del gene LOC51149.

Le sequenze SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC093218, versione 2 (nucleotidi 39361-41460) del gene MAP1B.

Le sequenze SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC025423 versione 32 (nucleotidi 140401-141660) del gene MDM2.

Le sequenze SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL122018, versione 37 (nucleotidi 36661-38520) del gene NIDI.

Le sequenze SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL118557, versione 5 (nucleotidi 75001-77340) del gene NID2.

Le sequenze SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 68 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC005666, versione 1 (nucleotidi 108541-111200) del gene PNUTL2.

Le sequenze SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC125611, versione 4 (nucleotidi 149821-152460) del gene PRPH.

Le sequenze SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 76 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL031429, versione 11 (nucleotidi 123001124560) del gene PTGER3.

Le sequenze SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AP001091, versione 5 (nucleotidi 64321-66660) del gene PTPRM.

La tabella 1 riassume la corrispondenza tra i diversi geni e le SEQ ID.

Oligonucleotidi di almeno 10 nucleotidi di lunghezza complementari o identici ad un segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80 costituiscono un utile strumento per l'analisi dello stato di metilazione delle isole CpG dei geni elencati in tabella 1 in un campione di DNA genomico, poiché la loro ibridazione dipende dallo stato di metilazione dell'isola CpG originaria del campione. Tali oligonucleotidi rientrano nell'ambito della presente invenzione. Preferibilmente, gli oligonucleotidi dell'invenzione sono complementari o identici a un segmento di una sequenza bersaglio come definita sopra comprendente almeno un dinucleotide CpG.

Nel procedimento diagnostico dell'invenzione, gli oligonucleotidi sopra definiti possono essere utilizzati come primers di amplificazione o come sonde di ibridazione. Nel secondo caso, essi hanno preferibilmente una lunghezza di almeno 18 nucleotidi.

A titolo di esempio, la tabella 2a riporta primers oligonucleotidici specifici basati su alcune delle sequenze bersaglio sopra elencate, utili nel procedimento diagnostico dell'invenzione.

Le caratteristiche del prodotto amplificato con i primers della tabella 2a sono riportate in tabella 2b.

Il procedimento diagnostico dell'invenzione può ad esempio essere un procedimento di rivelazione basato sull’amplificazione del DNA, eventualmente seguito da rivelazione dei frammenti di DNA amplificati tramite ima sonda di ibridazione. In tale procedimento un campione di DNA genomico da esaminare viene pre-trattato chimicamente con un reagente atto a convertire le basi citosina non metilate in uracile od altra base atta ad appaiarsi con una base diversa da guanina. Il campione di DNA genomico da analizzare è preferibilmente ottenuto da una fonte quale sangue, siero, plasma, lavaggio bronchiale, espettorato, saliva, lavaggio intestinale, urina, feci, eiaculato, tamponi di varia origine, ago aspirati, biopsie linfonodali, o loro combinazioni. Il suddetto pretrattamento chimico del DNA genomico viene effettuato preferibilmente con sodio bisolfito e idrochinone. A seguito del pretrattamento chimico, dal DNA genomico originario a doppio filamento si ottengono due filamenti modificati che tuttavia non sono più tra loro campiementari.

Dopo la fase di pretrattamento chimico, uno qualsiasi dei filamenti modificati ottenuti dal pretrattamento del DNA genomico può essere sottoposto a una reazione di amplificazione degli acidi nucleici, utilizzando come primers di amplificazione una coppia di oligonucleotidi di almeno 10 nucleotidi di lunghezza, in cui uno di detti o ligonucleotidi è complementare a un primo segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 78 e l'altro di detti oligonucleotidi è identico a un secondo segmento di detta sequenza bersaglio, il secondo segmento essendo localizzato a valle del primo segmento.

Secondo una forma di attuazione, almeno uno di detti primo e secondo segmento della sequenza bersaglio comprende almeno un dinucleotide CpG. In tal caso, la reazione di amplificazione è metilazione-specifica, nel senso che la coppia di primers oligonucleotidici utilizzata è disegnata per amplificare specificamente un filamento modificato derivante dalla sequenza dell'isola CpG originaria metilata. In questa forma di attuazione, la rivelazione dei frammenti di DNA amplificati, se presenti, può essere effettuata con qualsiasi procedimento di per sé noto, ad esempio mediante elettroforesi su gel di agarosio e colorazione con un agente intercalante del DNA, quale ad esempio bromuro di etidio.

Secondo un'altra forma di attuazione, né il primo né il secondo segmento della sequenza bersaglio comprende un dinucleotide CpG. In tal caso la reazione di amplificazione non è metilazione-specifica. Conseguentemente, la rivelazione dei frammenti amplificati, se presenti, verrà effettuata mediante ibridazione con una sonda oligonucleotidìca di almeno 18 nucleotidi di lunghezza complementare a un terzo segmento della sequenza bersaglio, detto terzo segmento essendo situato tra i suddetti primo e secondo segmento e comprendendo almeno un dinucleotide CpG. Il terzo segmento della sequenza bersaglio può eventualmente essere parzialmente sovrapposto al primo o al secondo segmento.

In entrambe le forme di attuazione sopra descritte, la reazione di amplificazione è preferibilmente una reazione a catena della polimerasi (PCR). Ancora più preferibilmente, è ima reazione di amplificazione in due fasi che comprende una PCR primaria seguita da una PCR secondaria semi nested o nested.

Poiché il DNA modificato che costituisce il bersaglio della reazione di amplificazione è inizialmente a singolo filamento, nel primo ciclo di PCR al filamento bersaglio si ibriderà inizialmente uno solo dei due primers. Il primo primer ibridato verrà esteso da una polimerasi utilizzando come stampo il filamento bersaglio. Successivamente, il secondo primer si ibriderà alla catena neosintetizzata e verrà esteso dalla polimerasi utilizzando come stampo la catena neosintetizzata. In tal modo, il DNA.bersaglio iniziale a singolo filamento verrà trasformato in DNA a doppio filamento. Invece, nei successivi cicli della reazione PCR i due primers di amplificazione si ibrideranno simultaneamente ciascuno ad un filamento del DNA bersaglio a doppio filamento.

In tabella 2a sono riportati alcuni esempi specifici di oligonucleotidi adatti come primers o sonde nel procedimento diagnostico dell'invenzione.

Gli oligonucleotidi ARHGAP20_MF (SEQ ID NO: 81) e AR-HGAP20_MR (SEQ ID NO: 82) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 18. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi ARHGAP20_MF e ARHGAP20_MR anplifica una sequenza di 153 bp compresa tra il nucleotide 1777 ed il nucleotide 1930 di SEQ ID NO: 18.

Gli oligonucleotidi CDH11_MF (SEQ ID NO: 83) e CDH11_MR (SEQ ID NO: 84) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 21. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi CDH11_MF e CDH11_MR anplifica una sequenza di 246 bp compresa tra il nucleotide 2098 e il nucleotide 2343 di SEQ 1D NO: 21.

Gli oligonucleotidi FLI1_MF {SEQ ID NO: 85) e FLI1_MR {SEQ ID NO: 86) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 25. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi FLI1_MF e FLI1_MR amplifica una sequenza di 199 bp compresa tra il nucleotide 5744 ed il nucleotide 5909 di SEQ ID NO: 25.

Gli oligonucleotidi FOSL2_MF (SEQ ID NO: 87) e FOSL2_MR {SEQ ID NO: 88) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 29. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi FOSL2_MF e FOSL2_MR amplifica una sequenza di 264 bp compresa tra il nucleotide 2496 e il nucleotide 2760 di SEQ ID NO: 29.

Gli oligonucleotidi HES2_MF (SEQ ID NO: 89) e HES2_MR (SEQ ID NO: 90) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 33. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi HES2_MF e HES2_MR amplifica una sequenza di 205 bp compresa tra il nucleotide 972 e il nucleotide 1177 di SEQ ID NO: 33.

Gli oligonucleotidi HTR6_MF (SEQ ID NO: 91) e HTR6_MR (SEQ ID NO: 92) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 37. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi HTR6_MF e HTR6_MR amplifica una sequenza di 134 bp conpresa tra il nucleotide 719 e il nucleotide 853 di SEQ ID NO: 37.

Gli oligonucleotidi LHX3_MF (SEQ ID NO: 93) e LHX3_MR (SEQ ID NO: 94) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 42. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi LHX3_MF e LHX3_MR amplifica una sequenza di 164 bp conpresa tra il nucleotide 2814 e il nucleotide 2978 di SEQ ID NO: 42.

Gli oligonucleotidi LOC51149_MF (SEQ ID NO: 95) e LOC51149_MR (SEQ ID NO: 96) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 46. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi L0C51149_MF e LOC51l49_MR amplifica una sequenza di 176 bp compresa tra il nucleotide 1284 e il nucleotide 1460 di SEQ ID NO: 46.

Gli oligonucleotidi MAP1B_MF (SEQ ID NO: 97) e MAP1B_MR (SEQ ID NO: 98) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 49. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi MAP1B_MF e MAP1B_MR amplifica una sequenza di 216 bp compresa tra il nucleotide 315 e il nucleotide 531 di SEQ ID NO: 49.

Gli oligonucleotidi MDM2_MF {SEQ ID NO: 99) e MDM2_MR (SEQ ID NO: 100) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 54. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi MDM2_MF e MDM2_MR amplifica una sequenza di 328 bp compresa tra il nucleotide 578 e il nucleotide 906 di SEQ ID NO: 54.

Gli oligonucleotidi NID1_MF (SEQ ID NO: 101) e NID1_MR (SEQ ID NO: 102) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 57. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi NID1_MF e NID1_MR amplifica una sequenza di 144 bp compresa tra il nucleotide 1228 e il nucleotide 1371 di SEQ ID NO: 57.

Gli oligonucleotidi NID2_MF (SEQ ID NO: 103) e NID2_MR (SEQ ID NO: 104) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 61 Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi NID2_MF e NID2_MR amplifica una sequenza di 140 bp compresa tra il nucleotide 1237 e il nucleotide 1377 di SEQ ID NO: 61.

Gli oligonucleotidi PNUTL2_MF (SEQ ID NO: 105) e PNUTL2_MR (SEQ ID NO: 106) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 66. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi PNUTL2_MF e PNUTL2_MR amplifica una sequenza di 216 bp compresa tra il nucleotide 826 e il nucleotide 1042 di SEQ ID NO: 66.

Gli oligonucleotidi PRPH_MF (SEQ ID NO: 107) e PRPHMR (SEQ ID NO: 108) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 70. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi PRPH_MF e PRPH_MR amplifica una sequenza di 198 bp compresa tra il nucleotide 100 e il nucleotide 297 di SEQ ID NO: 70.

Gli oligonucleotidi PTGER3_MF (SEQ ID NO: 109) e PTGER3_MR (SEQ ID NO: 110) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 74. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi PTGER3_MF e PTGER3_MR amplifica una sequenza di 191 bp compresa tra il nucleotide 388 e il nucleotide 579 di SEQ ID NO: 74.

Gli oligonucleotidi PTPRM_MF (SEQ ID NO: 111) e PTPRM_MR (SEQ ID NO: 112) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 77. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi PTPRMMF e PTPRMMR amplifica una sequenza di 245 bp compresa tra il nucleotide 741 e il nucleotide 986 di SEQ ID NO: 77.

Nell'ambito della presente invenzione rientra inoltre un kit per 1'esecuzione del procedimento diagnostico del1'invenzione, che può essere composto, ad esempio, da una coppia di primers di amplificazione come definiti in precedenza eventualmente in combinazione con un reagente atto a convertire le basi citosina non metilate in uracile od altra base atta ad appaiarsi con una base diversa da guanina, ad esempio sodio bisolfito in combinazione con idrochinone. Il kit può inoltre comprendere mezzi di rivelazione del DNA, come ad esempio una sonda di ibridazione metilazione-specifica come definita in precedenza, e/o mezzi di amplificazione del DNA, ad esempio un enzima polimerasi. in alternativa alla sonda di ibridazione, il kit può comprendere un reagente di rivelazione del DNA quale un agente intercalante del DNA, per esempio bromuro di etidio.

Il kit dell'invenzione può anche comprendere una seconda coppia di primers di amplificazione di almeno 10 nucleotidi di lunghezza, uno di detti oligonucleotidi essendo complementare a un primo segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80 e l'altro oligonucleotide essendo identico a un secondo segmento di detta sequenza bersaglio, il secondo segmento essendo localizzato a valle del primo segmento. Preferibilmente, almeno uno di tali primo e secondo segmento della sequenza bersaglio comprende almeno un dinucleotide TpG. La seconda coppia di primers è utilizzata come controllo dell'avvenuta modifica del DNA a seguito del trattamento con bisolfito, permettendo la convalida di un risultato negativo dell'amplificazione con primers disegnati sulla base delle sequenze nucleotidiche modificate derivate dall'isola CpG metilata.

Sezione sperimentale (esempi)

E' stato analizzato lo stato di metilazione delle isole CpG dei geni indicati in tabella 1 in campioni tumorali e normali umani, utilizzando i primers e le condizioni di reazione indicate in tabella 2. I risultati ottenuti sono riassunti sotto in tabella 3.

Dall'analisi effettuata su campioni tumorali e normali si evincono le percentuali di metilazione per ciascun gene nei diversi tessuti analizzati. I tessuti analizzati derivano da colon, stomaco, fegato e mammella. Questo risultato indica che le isole CpG elencate in tabella 1 sono frequentemente metilate in almeno uno dei tessuti tumorali analizzati. Questi tumori sono da considerarsi un esempio indicativo della alta frequenza con cui questi geni sono metilati in malattie neoplastiche non limitatamente agli esempi descritti in tabella 3.

Le sequenze nucleotidiche a cui si fa riferimento nella presente descrizione sono illustrate nell'annessa lista delle sequenze, in cui:

SEQ ID NO. 1 è la CpG island di ARHGAP20, corrispondente al segmento di 3.180 nt compreso tra i nt 45840-42661 della versione 3 della sequenza Genbank AP003460; SEQ ID NO. 2 è la CpG Island del gene CDH11, corrispondente al segmento di 3.420 nt compreso tra i nt 52021-55500 della versione 3 della sequenza Genbank AC137643; SEQ ID NO: 3 è la CpG Island di FLI1 corrispondente al segmento di 7.460 nt compreso tra i nt 40001-47460 della versione 5 della sequenza Genbank AP001122; SEQ ID NO: 4 è la CpG Island di FOSL2 corrispondente al segmento di 4.200 nt compreso tra i nt 52801-57000 della versione 2 della sequenza Genbank AC104695; SEQ ID NO: 5 è la CpG Island di HES2 corrispondente al segmento di 2.280 nt compreso tra i nt 31741-34020 della versione 11 della sequenza Genbank AL031848; SEQ ID NO: 6 è la CpG Island di HTR6 corrispondente al segmento di 2.820 nt compreso tra i nt 92521-95340 della versione 43 della sequenza Genbank AL031727; SEQ ID NO: 7 è la CpG Island di LHX3 corrispondente al segmento di 5.040 nt compreso tra i nt 111001-116040 della versione 13 della sequenza Genbank AL138781; SEQ ID NO: 8 è la CpG Island di LOC51149 corrispondente al segmento di 2.700 nt conpreso tra i nt 117001-119700 della versione 7 della sequenza Genbank AC008393; SEQ ID NO: 9 è la CpG I-sland di MAP1B corrispondente al segmento di 2.100 nt compreso tra i nt 39361-41460 della versione 2 della sequenza Genbank AC093218; SEQ ID NO: 10 è la CpG Island di MDM2 corrispondente al segmento di 1.260 nt compreso tra i nt 140401-141660 della versione 32 della sequenza Genbank AC025423; SEQ ID NO. 11 è la CpG island del gene NIDI, corrispondente al segmento di 1.860 nt compreso tra i nt 36661-38520 della sequenza Genbank AL122018, versione 37; SEQ ID NO. 12 è la CpG island del gene NID2, corrispondente al segmento di 2.340 nt compreso tra i nt 75001-77340 di Genbank AL118557, versione 5; SEQ ID NO. 13 è la CpG island del gene FNUTL2, corrispondente al segmento di 2.660 nt compreso tra i nt 108541-111200 di Genbank AC005666, versione 1; SEQ ID NO. 14 è la CpG island del gene PRPH, corrispondente al segmento di 2.640 nt compreso tra i nt 149821-152460 di Genbank AC125611, versione 4; SEQ ID NO. 15 è la CpG island del gene PTGER3, corrispondente al segmento di 1.560 nt compreso tra i nt 123001-124560 di Genbank AL031429, versione 11; SEQ ID NO. 16 è la CpG island del gene PTPRM, corrispondente al segmento di 2.340 nt compreso tra i nt 64321-66660 di Genbank AP001091, versione 5; SEQ ID NO. 17 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene ARHGAP20 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 18 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene ARHGAP20 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 19 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene AR-HGAP20 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO.

20 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene ARHGAP20 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 21 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene CDH11 (top strand), derivata da SEQ ID NO.

2; SEQ ID NO. 22 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene CDH11 (bottom strand) , derivata da SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 23 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene CDH11 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 24 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene CDH11 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 25 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene FLI1 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 3; SEQ 1D NO. 26 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene FLI1 (bottorristrand), derivata da SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 27 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene FLI1 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 28 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene FLI1 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO: 29 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene F0SL2 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 30 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene FOSL2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 31 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene FOSL2 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 32 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene FOSL2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 33 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene HES2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 34 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene HES2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 35 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene HES2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 36 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene HES2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 37 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene HTR6 (top strand), derivata da SEQ ID NO.6; SEQ ID NO: 38 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene HTR6 (bottonistrand), derivata da SEQ ID NO.6; SEQ ID NO: 39 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene HTR6 (top strand), derivata da SEQ ID NO.6; SEQ ID NO: 40 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene HTR6 (bottom strand), SEQ ID NO: 41 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene LHX3 (top strand), derivata da SEQ ID NO.7; SEQ ID NO: 42 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene LHX3 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.7; SEQ ID NO: 43 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene LHX3 (top strand), derivata da SEQ ID NO.7; SEQ ID NO: 44 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene LHX3 (bottom strand), SEQ ID NO: 45 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene LOC51149 (top strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 46 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene LOC51149 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 47 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene LOC51149 (top strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 48 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene LOC51149 (bottom strand), SEQ ID NO: 49 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene MAP1B (top strand), derivata da SEQ ID NO.9; SEQ ID NO: 50 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene MAP1B {bottoni strand), derivata da SEQ ID NO.9; SEQ ID NO: 51 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene MAP1B (top strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 52 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene MAP1B {bottom strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 53 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene MDM2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 54 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene MDM2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 55 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene MDM2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 56 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene MDM2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 57 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene NIDI (top strand), derivata da SEQ ID NO.11; SEQ ID NO: 58 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene NIDI (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.11; SEQ ID NO: 59 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene NIDI (top strand), derivata da SEQ ID NO.il; SEQ ID NO: 60 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene NIDI (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.11; SEQ ID NO: 61 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene NID2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 62 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene NID2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 63 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene NXD2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 64 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene NID2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 65 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PNUTL2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 66 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene FNUTL2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 67 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PNUTL2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 68 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PNUTL2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 69 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PRPH (top strand), derivata da SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 70 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PRPH (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 71 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PRPH (top strand), derivata da SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 72 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PRPH (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 73 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PTGER3 (top strand), derivata da SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 74 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PTGER3 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 75 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PTGER3 (top strand), derivata da SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 76 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PTGER3 (bottonistrand), derivata da SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 77 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PTPRM (top strand), derivata da SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 78 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PTPRM (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 79 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PTPRM (top strand), derivata da SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 80 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PTPRM (bottoni strand), derivata da SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 81 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 82 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:18; SEQ ID NO: 83 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 84 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:21; SEQ ID NO: 85 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:25; SEQ ID NO: 86 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:25; SEQ ID NO: 87 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:29; SEQ ID NO: 88 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:29; SEQ ID NO: 89 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:33; SEQ ID NO: 90 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:33; SEQ ID NO: 91 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:37; SEQ ID NO: 92 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:37; SEQ ID NO: 93 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:42; SEQ ID NO: 94 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:42; SEQ ID NO: 95 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:46; SEQ ID NO: 96 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:46; SEQ ID NO: 97 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:49; SEQ ID NO: 98 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:49; SEQ ID NO: 99 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:54; SEQ ID NO: 100 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:54; SEQ ID NO: 101 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:57; SEQ ID NO: 102 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:57; SEQ ID NO: 103 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:61; SEQ ID NO: 104 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:61; SEQ ID NO: 105 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:66; SEQ ID NO: 106 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:66; SEQ ID NO: 107 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:70; SEQ ID NO: 108 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:70; SEQ ID NO: 109 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:74; SEQ ID NO: 110 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:74; SEQ ID NO: 111 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:77; SEQ ID NO: 112 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:77.

Lista delle sequenze nucleotidiche

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80.
2. Oligonucleotide di almeno 10 nucleotidi di lunghezza complementare o identico a un segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80.
3. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 2, di almeno 18 nucleotidi di lunghezza.
4. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 2 o 3, in cui detta sequenza bersaglio è scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 ed in cui detto segmento della sequenza bersaglio comprende almeno un dinucleotide CpG.
5. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 2 o 3, in cui detta sequenza bersaglio è scelta nel gruppo che consiste di SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 ed in cui detto segmento della sequenza bersaglio comprende almeno un dinucleotide TpG.
6. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 1, scelto dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112.
7. Procedimento per la diagnosi di malattia neoplastica, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA. genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica dell'isola CpG di un gene umano scelto dal gruppo che consiste dei geni elencati in tabella 1, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene ARHGAP20 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 42661 e 45840 della sequenza Genbank AP003460 versione 3, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
9. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene CDH11 conpresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 52081 e 55500 della sequenza Genbank AC137643 versione 3, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
10. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA.genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene FLI1 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 40001 e 47460 della sequenza Genbank AP001122 versione 5, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
11. Procedimento secondo la rivendicazione 7, conprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene FOSL2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 52801 e 57000 della sequenza Genbank AC104695 versione 2, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
12. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene HES2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 31741 e 34020 della sequenza Genbank AL031848 versione 11, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
13. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene HTR6 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 92521 e 95340 della sequenza Genbank AL031727 versione 43, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
14. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene LHX3 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 111001 e 116040 della sequenza Genbank AL138781 versione 13, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
15. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene LOC51149 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 117001 e 119700 della sequenza Genbank AC008393 versione 7, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
16. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene MAP1B conpresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 39361 e 41460 della sequenza Genbank AC093218 versione 2, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
17. Procedimento secondo la rivendicazione 7, conprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilezione della sequenza nucleotidica del gene MDM2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 140401 e 144660 della sequenza Genbank AC025423 versione 32, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
18. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un cauzione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene NID1 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 36661 e 38520 della sequenza Genbank AL122018 versione 37, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
19. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene NID2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 75001 e 77340 della sequenza Genbank AL118557 versione 5, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
20. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PNUTL2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 108541 e 111200 della sequenza Genbank AC005666 versione 1, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
21. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PRPH compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 149821 e 152460 della sequenza Genbank AC125611 versione 4, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
22. Procedimento secondo la rivendicazione 7, conprendente la fase di analizzare, in un campione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PTGER3 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 123001 e 124560 della sequenza Genbank AL031429 versione 11, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
23. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente la fase di analizzare, in un carpione di DNA genomico, lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PTPRM compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 64321 e 66660 della sequenza Genbank AP001091 versione 5, la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica.
24. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente le fasi di: (i) pretrattare chimicamente un carpione di DNA genomico con un reagente atto a convertire le basi citosina non metilate in uracile od altra base atta ad appaiarsi con una base diversa da guanina; (ii) sottoporre un filamento del DNA genomico pretrattato ad amplificazione utilizzando come primers di amplificazione almeno una coppia di oligonucleotidi, ciascuno della lunghezza di almeno 10 nucleotidi, uno di detti oligonucleotidi essendo complementare ad un primo segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 e l'altro di detti oligonucleotidi essendo identico ad un secondo segmento di detta sequenza bersaglio, il secondo segmento essendo localizzato a valle del primo segmento, almeno uno di detti primo e secondo segmento della sequenza bersaglio comprendendo almeno un dinucleotide CpG; e (iii) rivelare la presenza di frammenti amplificati del DNA genomico pretrattato, la presenza di frammenti amplificati essendo indicativa di malattia neoplastica.
25. Procedimento secondo la rivendicazione 7, comprendente le fasi di: (i) pretrattare chimicamente un campione di DNA genomico con un reagente atto a convertire le basi citosina non metilate in uracile od altra base atta ad appaiarsi con una base diversa da guanina; (ii) sottoporre un filamento del DNA genomico pretrattato ad amplificazione utilizzando carne primer di amplificazione almeno una coppia di oligonucleotidi, ciascuno di almeno 10 nucleotidi di lunghezza, uno di detti oligonucleotidi essendo complementare ad un primo segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 e l'altro di detti oligonucleotidi essendo identico ad un secondo segmento di detta sequenza bersaglio, il secondo segmento essendo localizzato a valle del primo segmento; {iii) rivelare la presenza di frammenti amplificati del DNA genomico pretrattato mediante ibridazione con una sonda oligonucleotidica di almeno 18 nucleotidi di lunghezza complementare ad un terzo segmento di detta sequenza bersaglio, detto terzo segmento essendo situato fra detto primo e detto secondo segmento e comprendendo almeno un dinucleotide CpG, la presenza di frammenti amplificati essendo indicativa di malattia neoplastica.
26. Procedimento secondo la rivendicazione 21, in cui detta sonda è marcata con un marcatore rivelabile.
27. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 20 a 22, in cui detta amplificazione è una reazione a catena della polimerasi (PCR).
28. Procedimento secondo la rivendicazione 23, in cui detta amplificazione è una PCR primaria seguita da una PCR secondaria semi-nested o nested.
29. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 20 a 24, in cui detto reagente è bisolfito, preferibilmente sodio bisolfito, in combinazione con idrochinone.
30. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a 25, in cui detta malattia neoplastica è un tumore solido o un neoplasia ematologica.
31. Procedimento secondo la rivendicazione 26, in cui detta malattia neoplastica è scelta nel gruppo che consiste di tumori primari del sistema nervoso centrale, metastasi cerebrali, tumori dell'occhio, tumori dell'ipofisi, tumori della tiroide, tumori della corteccia surrenalica, tumori del sistema endocrino diffuso, tumori della testa-collo, tumore del polmone, mesotelioma maligno, tintomi e tumori timici, tumori del cuore e dei grandi vasi, tumori primari delle cellule germinative del torace, tumori metastatici nel torace, tumori dell'esofago, tumori del fegato, tumori gastrici, tumore della colecisti e dei dotti biliari, tumori del pancreas esocrino, tumori dell'ampolla di Vater, tumori del piccolo intestino, tumori dell'appendice e del peritoneo, tumori del colon e del retto, tumori dell'ano, tumori renali, tumori delle pelvi e dell'uretere, tumore della vescica, tumori della prostata, tumori del pene e dell'uretra, tumore del testicolo, tumori della vulva e della vagina, tumori della cervice, cancro dell'endometrio, tumori delle tube di Fallopio, tumore ovarico, sarcomi ginecologici, tumori della mammella, melanoma maligno, tumori della pelle, tumori dell'osso, sarcomi dei tessuti molli, tumore di Wilms, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma di Kaposi, sindrome mielodisplastica, leucemia mieloide acuta dell'adulto e del bambino, leucemia mieloide cronica, leucemia linfocitica acuta dell'adulto, leucemia linfoblastica acuta del bambino, leucemia linfocitica cronica, hairy celi leukemia, leucemia delle mast celi, malattia di Hodgkin's, linfomi nonHodgkin's, micosi fungoide e Sézary Sindrome, tumori delle plasma cellule, disordini mieloproliferativi cronici.
32. Procedimento secondo la rivendicazione 26, in cui detta malattia neoplastica è scelta nel gruppo che consiste di carcinoma gastrico, carcinoma colon-rettale e carcinoma mammario.
33. Kit per la diagnosi di malattia neoplastica, comprendente una coppia di primer di amplificazione come definiti nella rivendicazione 20 o 21.
34. Kit secondo la rivendicazione 29, comprendente inoltre una sonda di ibridazione come definita nella rivendicazione 21.
35. Kit secondo la rivendicazione 29 o 30, comprendente inoltre un reagente atto a convertire le basi citosina non metilate in uracile od altra base atta ad appaiarsi con una base diversa da guanina.
36. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 29 a 31, comprendente inoltre vina seconda coppia di primers oligonucleotidici di amplificazione di almeno 10 nucleotidi di lunghezza, uno di detti oligonucleotidi essendo complementare ad un primo segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: SI, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 e l'altro di detti oligonucleotidi essendo identico ad un secondo segmento di detta sequenza bersaglio, il secondo segmento essendo localizzato a valle del primo segmento.
37. Kit secondo la rivendicazione 32, in cui almeno uno di detti primo e secondo segmento della sequenza bersaglio comprende almeno un dinucleotide TpG.
38. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 29 a 33, comprendente inoltre mezzi di amplificazione del DNA e/o reagenti di rivelazione del DNA.