ITTO20080585A1

ITTO20080585A1 - Composizione cosmetica e procedimento cosmetico per la ricrescita di apparati tegumentari

Info

Publication number: ITTO20080585A1
Application number: IT000585A
Authority: IT
Inventors: Chiara Cesano; Vivo Enrico De; Luisa Gennero; Emanuella Morra; Antonio Ponzetto
Original assignee: Chiara Cesano; Vivo Enrico De; Luisa Gennero; Emanuella Morra; Antonio Ponzetto
Priority date: 2008-07-29
Filing date: 2008-07-29
Publication date: 2010-01-30
Also published as: WO2010013191A2; WO2010013191A3

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo:

"Composizione cosmetica e procedimento cosmetico per la ricrescita di apparati tegumentari"

TESTO DELLA DESCRIZIONE

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione concerne una composizione cosmetica ed un procedimento cosmetico atti a promuovere la crescita dei capelli attraverso il recupero del trofismo originale degli apparati tegumentari, a stimolare la loro crescita ed a migliorare la vitalità dei follicoli piliferi .

SFONDO TECNICO DELL'INVENZIONE

E' noto come con campi ELF {Extremely Low Frequency) a bassa intensità si possano indurre variazioni nel trasporto di varie specie ioniche (per es. ioni calcio) attraverso la membrana cellulare, ottenendo variazioni nel tasso di rigenerazione e riparazione di cellule e tessuti e variazioni del potenziale di ossidoriduzione delle molecole SINTESI DELL'INVENZIONE

La presente invenzione si prefigge lo scopo di identificare una composizione cosmetica ed un procedimento cosmetico che possano determinare una ricrescita dei capelli e degli apparati tegumentari in generale, determinando una riparazione dei follicoli piliferi atrofici e/o la rigenerazione dei follicoli piliferi quiescenti accelerandone il recupero funzionale ed il ricambio cellulare competente.

La presente invenzione si prefigge lo scopo di trovare una soluzione valida ed efficace per combattere i problemi di caduta dei capelli ed alterazione degli apparati tegumentari nei mammiferi, ed in particolare nell'uomo, che fino ad ora sono rimasti insoluti.

Secondo la presente invenzione, tale scopo è raggiunto grazie alla soluzione richiamata in modo specifico nelle rivendicazioni che seguono. Le rivendicazioni formano parte integrante dell'insegnamento tecnico qui fornito in relazione all'invenzione.

L'invenzione concerne una composizione cosmetica da utilizzarsi per stimolare la crescita dei capelli e degli apparati tegumentari in generale che comprende:

almeno un metallo, suoi sali e/o suoi composti, eventualmente sotto forma di sospensione colloidale; ed

almeno un agente proteolitico, preferibilmente papaina .

L'invenzione riguarda, inoltre, un procedimento cosmetico per stimolare la crescita degli apparati tegumentari di un mammifero che prevede 1'applicazione combinata i) della composizione cosmetica sopra descritta e ii) di onde elettromagnetiche ELF a bassa frequenza, di campi magnetici e/o elettrici statici ad una porzione di tessuto di interesse del mammifero, in modo tale che si generi una azione specifica e sinergica tra la composizione e l'applicazione ELF tale da promuovere il recupero del trofismo originale degli apparati tegumentari nella porzione di tessuto di interesse attraverso:

1) l'attivazione fisiologica della ricrescita dei peli, ovvero della stimolazione dei bulbi piliferi a riprendere la loro normale attività;

2) un'azione diretta sui follicoli piliferi con recupero dei follicoli atrofici, anche in zone cicatriziali.

I presenti inventori hanno, infatti, dimostrato che campi elettrici e/o magnetici statici associati a onde elettromagnetiche ELF a bassa frequenza di relativamente debole potenza determinano, quando utilizzati in combinazione con la composizione cosmetica oggetto della presente invenzione, il rapido recupero funzionale fisiologico dei follicoli piliferi quiescenti o atrofici.

I presenti inventori hanno, infatti, applicato simultaneamente una radiazione elettromagnetica (nell'intervallo di frequenze 1 a 1000 Hz), e campi magnetici statici (nell'intervallo di intensità 1 a 1000 uT), e/o campi elettrici statici (nell'intervallo di intensità 1 a 1000 V/m) a differenti biopsie di annessi cutanei piliferi animali in terreni di coltura contenenti la composizione cosmetica per l'applicazione tissutale in oggetto, ed in vivo a diversi soggetti affetti da alopecia, effluvio o defluvio. Sorprendentemente, è stata osservata una particolare rigenerazione dei follicoli piliferi atrofici o quiescenti accelerandone il recupero funzionale e la crescita del pelo, nonché il recupero della pigmentazione originaria degli apparati tegumentari.

Tale fenomeno di crescita del pelo si manifestava anche in condizioni sperimentali avverse, ovvero nel comparto tissutale reduce da esiti cicatriziali postchirurgici.

Ulteriore scopo della presente invenzione è fornire un dispositivo atto ad implementare i procedimenti della presente invenzione.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

L'invenzione sarà ora descritta in modo dettagliato, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento alle figure annesse, in cui:

- la figura 1 è una rappresentazione schematica di un dispositivo capace di generare campi elettrici e/o magnetici statici associati ad onde elettromagnetiche ELF a bassa frequenza da utilizzarsi nel procedimento cosmetico oggetto della presente invenzione;

- le figure 2 a 5 illustrano schematicamente diverse forme di realizzazione di bobine da impiegarsi nel dispositivo di figura 1.

In una forma di attuazione al momento preferita, il procedimento cosmetico secondo la presente invenzione prevede l'applicazione di una composizione cosmetica specifico-inducente (preferibilmente sotto forma di lozione) e la esposizione per un periodo di tempo che varia tra 5 minuti e 10 minuti per due volte al giorno (mattino e sera) ad un dispositivo che eroghi un insieme di campi elettrici e/o magnetici statici e campi elettromagnetici alternati a bassa frequenza (ELF) di bassa intensità.

Le caratteristiche dei campi ELF applicati (forma d'onda, frequenza, duty cycle, intensità) e dei campi magnetico ed elettrico statici eventualmente sommati all'ELF dipendono dal tipo di risultato desiderato (rigenerazione, riparazione, accrescimento), e dalle varie condizioni al contorno (tipo di atrofia tessutale, tipo di substrato, tempo). Le caratteristiche dei campi applicati nell'ambito del procedimento oggetto della presente invenzione sono date da:

la frequenza di ripetizione dell'onda elettromagnetica a bassa frequenza applicata e la forma d'onda;

- l'intensità del campo alternato (ELF) applicato;

- l'intensità del campo magnetico statico applicato; - l'intensità del campo elettrico statico applicato; e - il tempo di applicazione.

Tessuti in vitro ed in vivo oggetto di studio sono: 1. in vitro biopsie di cute animale alopecica o con grande effluvio-defluvio di pelo, refrattaria ai comuni trattamenti;

2. in vivo cuoio capelluto umano alopecico o con effluvio-defluvio di capelli, refrattario ai comuni trattamenti.

Strumentazione e specifiche fisiche

Il dispositivo 1 da utilizzarsi nell'ambito del procedimento cosmetico oggetto della presente invenzione è schematicamente illustrato in figura 1.

Il dispositivo 1 comprende una camera 2 che può essere eventualmente schermata al campo magnetico statico o alternato a bassa frequenza grazie ad uno schermo in mumetal, e al campo elettrico statico e elettromagnetico alternato ad alta frequenza grazie ad un ulteriore schermo in ottone contenuto in quello in mu-metal.

Il dispositivo 1 è collegato con l'esterno attraverso strette aperture 5 per consentire il passaggio dei collegamenti elettrici 15 (bobine, telecamera).

In una forma di realizzazione preferita il dispositivo 1 comprende al proprio interno:

due bobine 4 generanti il campo magnetico statico poste sullo stesso asse;

due bobine 7 generanti il campo elettromagnetico alternato poste sullo stesso asse;

due piastre in alluminio 3 generanti il campo elettrico statico con asse perpendicolare a quello delle citate bobine .

Il campo magnetico statico è generato mediante un circuito elettrico esterno 10, in configurazione "pompa di corrente", che fornisce la corrente - regolabile desiderata alle apposite bobine.

Il campo elettrico statico è generato applicando una differenza di potenziale continua opportuna alle due placche metalliche mediante una sorgente 9.

Il campo elettromagnetico alternato è generato mediante un generatore di corrente 11 pilotato da un generatore di forme d'onda arbitrarie, applicato sulle apposite bobine.

Le bobine 4 e 7 contenute nel dispositivo 1 possono essere realizzate in una delle seguenti configurazioni: a) una forma di realizzazione particolarmente preferita del dispositivo 1 comprende una bobina bifilare come illustrata in figura 2, in cui un avvolgimento è utilizzato per produrre il campo elettromagnetico alternato e l'altro per produrre il campo magnetico statico.

b) una diversa forma dì realizzazione particolarmente preferita del dispositivo 1 comprende almeno due bobine bifilari come sopra arrangiate in array come in illustrato figura 3 in modo da ottenere una zona ampia quanto si desidera in cui è possibile irradiare il campo.

c) un'altra forma di realizzazione particolarmente preferita del dispositivo 1 comprende una bobina bifilare avvolta attorno ad un nucleo magnetico in ferrite, come illustrato in figura 4.

d) un'ulteriore forma di realizzazione particolarmente preferita del dispositivo 1 comprende almeno due bobine bifilari avvolte ciascuna attorno ad un nucleo magnetico in ferrite, ove tutti detti insiemi (bobine nuclei) sono arrangiati in array come illustrato in figura 5 in modo da ottenere una zona ampia quanto si desidera in cui è possibile irradiare il campo.

Un'ulteriore forma di realizzazione preferita è quella in cui tutte le forme di realizzazione a), b), c), d) sopra descritte sono realizzate con bobine semplici (monofilari) in luogo delle bobine bifilari, nella quali l'eventuale sovrapposizione di campo magnetico statico e campo elettromagnetico alternato sono ottenute per via elettronica, con una operazione di somma algebrica dei segnali desiderati.

In figura 5 è inoltre illustrata la presenza intorno alle bobine bifilari o monofilari, con nucleo o senza nucleo, di uno schermo elettromagnetico in mu-metal o materiale simile tale da rendere nulla l'irradiazione su tutti i lati, tranne il lato destinato ad irradiare la porzione di tessuto di interesse (riferimento numerico 12 in figura 1), permettendo ad un eventuale operatore di tenere in mano il dispositivo 1, comunque costituito, senza venire inutilmente irradiato.

L'irradiazione è stata sospesa ogni ora ed una parte del campione è stato rimosso ed analizzato.

L'esposizione totale al campo elettromagnetico alternato/campo magnetico e/o elettrico statico del campione cellulare è compresa tra 15 minuti e 96 ore.

Si noti che le condizioni di irradiazione qui riportate identificano una finestra specifica di operazione del dispositivo utilizzato per l'irradiazione, tale finestra essendo suscettibile di generare gli effetti descritti nel seguito sulle colture cellulari. E' chiaro, peraltro, che tali condizioni di irradiazione non sono da intendersi come limitative e sarà possibile per l'esperto tecnico del settore individuare sperimentalmente altre condizioni di irradiazione e altre finestre di lavoro.

Composizione ELF-specifica per la rigenerazione dei follicoli piliferi.

L'invenzione si fonda sulla sorprendente osservazione condotta dai presenti inventori di un particolare stimolo pro-rigenerativo eutrofizzante esercitato dalla combinazione di almeno un metallo, preferibilmente un sale di zinco, argento colloidale o oro colloidale, ed almeno un agente proteolitico, quale ad esempio papaina, su cuoio capelluto umano, tessuto cutaneo con annessi piliferi umani o animali in genere.

I presenti inventori hanno, infatti, sorprendentemente verificato che i metalli, le loro sospensioni colloidali, i loro sali ed i loro composti, sinergicamente alla erogazione di un insieme di campi elettrici e/o magnetici statici e campi elettromagnetici alternati a bassa frequenza (ELF) di bassa intensità, intervengono in diversi processi enzimatici ed hanno un' azione di regolazione del metabolismo e del catabolismo del microambiente follicolare pilifero, inducendo il controllo e la rigenerazione dei bulbi piliferi atrofici o quiescenti.

In parallelo all'azione sopra descritta, i presenti inventori hanno potuto verificare nella conduzione della sperimentazione che l'enzima proteolitico (preferibilmente papaina) promuove due funzioni fondamentali, ovvero: (i) l'attivazione dei fattori di crescita presenti fisiologicamente nel microambiente dei tessuti danneggiati o senescenti, e (ii) l'induzione chemiotattica del comparto staminale residenziale ad un rapido differenziamento riparativo .

Inoltre, è stato scoperto che (i) i metalli, le loro sospensioni colloidali, i loro sali ed i loro composti, (ii) unitamente alla erogazione di un insieme di campi elettrici e/o magnetici statici e campi elettromagnetici alternati a bassa frequenza (ELF) di bassa intensità e in concomitanza con (iii) la somministrazione di papaina svolgono diverse funzioni sinergiche fra loro: si accelera l'assorbimento dei nutrienti presentì nella preparazione, si induce la riparazione dei tessuti, la rigenerazione di un microambiente fisiologicamente corretto, ed, infine, si corregge la disemia periferica che compare negli stati di atrofia follicolare. Inoltre, i presenti inventori hanno scoperto che con la papaina le cellule di Langerhans (strato spinoso) sono stimolate ad inglobare le sostanze estranee (eccesso di collagene) e digerirle. Tale meccanismo si è rivelato particolarmente utile nel trattamento dei follicoli quiescenti.

Queste osservazioni assolutamente sorprendenti ed inaspettate hanno condotto i presenti inventori alla creazione un procedimento corredato dal relativo dispositivo ed una composizione atti a promuovere il recupero del trofismo originale degli apparati tegumentari, a stimolare la loro crescita ed a migliorare la vitalità dei follicoli piliferi attraverso l'uso di metalli, loro sospensioni colloidali, loro sali ed i loro composti, unitamente alla erogazione di un insieme di campi elettrici e/o magnetici statici e campi elettromagnetici alternati a bassa frequenza (ELF) di bassa intensità e in concomitanza con la somministrazione di papaina.

Il trattamento di biopsie di tessuto cutaneo con annessi piliferi animali in vitro con il procedimento, il dispositivo e la composizione dell'invenzione risulta in una sorprendete riparazione dei danni ed in un totale recupero del trofismo originario degli apparati tegumentari. Tutti i tessuti rappresentati nei campioni bioptici trattati sono soggetti ad una rigenerazione completa, funzionale e morfologica, (vedere Esempio 1).

I risultati istologici ottenuti in vivo a partire da 30-60 giorni di trattamento con la composizione oggetto della presente invenzione e le sue formulazioni tessuto-specifiche, confermano all'esame istologico la formazione di una rigenerazione e ritrofizzazione di cuoio capelluto umano ed in genere di tessuto cutaneo con annessi piliferi umani con caratteristiche isto-f unzionali ottimali, morfologicamente comparabili integri in vivo, (vedere la sezione relativa agli Studi Clinici).

In dettaglio, la composizione oggetto della presente invenzione comprende almeno i seguenti componenti:

almeno un metallo, eventualmente sotto forma di sospensione colloidale, suoi sali e/o suoi composti; ed almeno un agente proteolitico, preferibilmente papaina.

In una forma ulteriormente preferita dell'invenzione, la composizione comprende ulteriori ingredienti attivi, selezionati per la loro attività potenziante e sinergica di ELF e dei principi attivi sopra definiti, in modo specifico per ogni tipologia tissutale e relativi apparati tegumentari umani o animali da trattare.

Esempi di composizioni tessuto specifiche in vitro ed m vivo

Tabella 1. Cuoio capelluto umano, tessuto cutaneo con annessi piliferi umani ed animali.

Tabella 2. Cuoio capelluto umano, tessuto cutaneo con annessi pilìferi umani ed animali.

glicole propilenico 5% p/v q.b. per L di soluzione

Soluzione alcolica al 30% p/v q.b. per L di soluzione

Tabella 4 . Cuoio capelluto umano, tessuto cutaneo con annessi piliferi umani ed animali.

Composizione CrPl-MD-INFUS (Liquido infusionale)

Sostanza Concentrazione

Principi Attivi mq/L

Oro colloidale soluzione al 46% p/v 10 mg/L

Papaina FU 20,00 mg/L

Eccipienti mg/L

Miscela di L-aminoacidi (preferibilmente

L-Metionina, L-Cistina, L-Cisteina,

2,820 mg/L

L-Glicina, L-Leucina, L-Lisina, L-Prolina,

L-Glutamina)

Vitamina A 4 mg/L

Vitamine B (Bl, B2, B5, B6, B9, B12) 48mg/L

Vitamina c 4500 mg/L

Vitamina D 0,0055 mg/L

Vitamina E 10 mg/L

Vitamina H 0,069 mg/L

Vitamina PP 46 mg/L

Selenio 0,1 mg/L

glicole propilenico 5% p/v q.b. per L di soluzione

Soluzione alcolica al 30% p/v q.b. per L di soluzione

La composizione oggetto della presente invenzione può inoltre comprendere ulteriori componenti attivi, quali:

- miscele di aminoacidi, preferibilmente L-Metionina, L-Cistina, L-Cisteina, L-Glicina, L-Leucina, L-Lisina, L-Prolina, L-Glutamina L-Glicina, L-Leucina, L-Lisina , L-Pro lina ;

- vitamine A, B, C, D, E, H e PP;

- Selenio.

I metalli vengono preferibilmente introdotti nelle composizioni dell'invenzione sotto f^o-rma d-<1>i-<'>s-a-l<1>i<'>o sospensioni colloidali. Oltre all'ossido di Zinco, all'Argento colloidale ed all'Oro colloidale menzionati nelle precedenti tabelle, è possibile utilizzare con i medesimi risultati tra gli altri, sali di Ferro o Ferritina, Sodio, composizioni contenenti metalli, le loro combinazioni e derivati .

Come enzimi proteolitici , oltre alla già citata papaina, possono venire utilizzati ad esempio collagenasi (preferibilmente di tipo la, tipo II, tipo IV), serratiopeptidasi, eparanasi, DNAsi, elastasi, bromelaina, bradichinasi , Clostridium peptidasi, enzimi espressi da Lactobacillus acidophilus , enzimi espressi dal genere Aspergillus, proteasi, aliinasi, fibrinolisina.

Le miscele di aminoacidi, contenenti preferenzialmente L-Metionina, L-Cistina, L-Cisteina, L-Glicina, L-Leucina, L-Lisina, L-Prolina, L-Glutamina L-Glicina, L-Leucina, L-Lisina, L-Prolina, costituiscono elementi eutrof izzanti che fungono da importanti fattori di crescita per cuoio capelluto, cute ed annessi, regolando il ricambio cellulare e tissutale.

Tra gli aminoacidi che possono essere presenti nelle composizioni dell'invenzione citiamo a titolo esemplificativo metionina, cistina, N-acetilcisteina, cisteina, glieina, leucina, isoleucina, prolina, glutamina, arginina, acido glutamico, istidina, istidina-HCl, lisina, lisina-HCl, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina, tirosina-sale disodico, vaiina, prolina, ìdrossiprolina. Tali aminoacidi spesso sono utilizzati in miscele comprendenti un numero elevato di differenti aminoacidi.

Oltre agli aminoacidi, le composizioni dell'invenzione possono anche comprendere altri elementi quali Selenio, carbonati, bicarbonati, acido glicirretico, glicerizzina, glucosio, glutatione, acido glicocolico, lecitina di soia, collagene, elastina, estratto di frumento, e simili.

Tra le vitamine che possono essere presenti nelle composizioni dell'invenzione citiamo, a titolo esemplificativo, acido retinoico, retinaldeide, retinolo, alfa-tocoferolo, beta-carotene, colecalciferolo, acido ascorbico, acido pantotenico, dexpantenolo, D-calcio pantotenato, cocarbossilasi tetraidrato, piridossina, piridossina-HCl, acido folico, niacinammide, nicotinammide, riboflavina, riboflavina diidrata fosfato sodico, cianocobalamina, acido para-aminobenzoico, biotina.

È stato scoperto dai presenti inventori che la vitamina A, utilizzata a dosi prive di qualsiasi effetto farmacologico, potenzia il ripristino del corretto pH e potere antiossidante in tessuti quali cute, sottocute e mucose .

Sempre sulla base delle sperimentazioni dei presenti inventori è stato verificato che nell'ambito della composizione oggetto della presente invenzione le vitamine del gruppo B, preferenzialmente Bl, B2, B5, B6, B9 e B12, contribuiscono alla normalizzazione del microambiente locoregionale .

Sempre sulla base delle sperimentazioni dei presenti inventori è stato verificato che nell'ambito della composizione oggetto della presente invenzione la vitamina C promuove il ripristino di un microambiente fisiologico perifollicolare, mentre la vitamina D a valori fisiologici sostiene un ruolo ausiliario nel consolidamento di un ideale scambio ionico sodio-calcio favorendo la correzione della concentrazione elettrolitica alterata intorno ai follicoli piliferi quiescenti o atrofici a valori fisiologici.

I presenti inventori hanno dimostrato che la vitamina E, utilizzata a dosi prive di qualsiasi effetto farmacologico, porta al graduale ripristino fisiologico del microambiente, sopratutto sottocutaneo contrastando attivamente coadiuvando la biosintesi fisiologica del pelo.

In relazione all'attività della vitamina H (Biotina) all'interno della composizione oggetto della presente invenzione è stato scoperto che questa favorisce l'attivazione nell'organismo di due meccanismi riparativi: il richiamo delle cellule staminali dal torrente circolatorio ed una accelerata specializzazione delle cellule staminali residenziali nella pelle verso un rapido differenziamento in cellule mature destinate a ripristinare i follicoli piliferi danneggiati .

Ancora, i presenti inventori hanno scoperto che la vitamina PP (Nicotinnamide), in associazione ai diversi componenti della composizione oggetto della presente invenzione, induce loco-regionalmente diversi meccanismi d'azione :

1) esplica funzioni come costituente di enzimi implicati in reazioni di ossido-riduzione;

2) interviene nel metabolismo energetico dei glicidi e delle proteine;

3) fa parte dei fermenti del ricambio capillare.

Le composizioni cosmetiche e del tipo medicai device oggetto della presente invenzione possono inoltre comprendere ulteriori elementi accessori quali eccipienti e veicoli, la cui scelta e il cui impiego rientrano nelle capacità del tecnico del settore senza che ciò richieda l'esercizio di alcuna attività inventiva.

Biopsie

Sono state analizzate 20 biopsie di cute animale colpite da alopecia, effluvio o defluvio refrattarie ai comuni trattamenti. Tutti i reperti sono stati lavati tre volte con soluzione fisiologica ed antibiotici (100 unità/ml di penicillina 100 ug/ml streptomicina 40 mg/L gentamicina) per 10 min a temperatura ambiente.

Ciascuna biopsia è stata sezionata in sei parti (due controlli-1, due controlli-2 e due campioni).

I campioni (3) sono stati sospesi in una soluzione di 20 mi di CrPl-MD-INFUS con concentrazione finale IX dentro piastre (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Denmark) di 10-cm.

Sono state preparate due tipologie di controlli, i controlli negativi-1 (1) sono stati trattati esclusivamente con soluzione fisiologica e antibiotici (come sopra descritto); i controlli negativi-2 (2) sono stati trattati con terreni per coltura cellulare:

1. reperti bioptici di controllo sono stati sospesi in 20 mi di soluzione fisiologica dentro piastre (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Denmark) di 10-cm.

2. Reperti bioptici di controllo sono stati posti dentro piastre (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Denmark) di 10-cm in 20 mi di terreno D-MEM addizionato con:

10% FCS (Celbio, Milano, Italy)

40 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Italia)

2 mM L-glutammina (Life Technologies.

3. Tutti i campioni sono stati posti per 180 giorni in un incubatore Heraeus termostaticamente controllato alla temperatura di 37°C con un'atmosfera contenente il 5% di apporto costante di C02(v/v in aria).

Ogni 21 giorni di coltura si sono raccolti i surnatantì delle colture in studio e tali surnatantì sono stati stoccati in un congelatore a meno 80°C per le seguenti analisi di Laboratorio: concentrazione di NO totale, nitriti e nitrati.

Per ciascun prelievo bioptico sono stati allestiti sei porzioni tissutali di cui: due campioni e quattro controlli (due controlli 1 e due controlli 2).

A) Tre copie sperimentali, ciascuna formata da due controlli (1, e 2) ed un campione, sono state incubate a 37°C con un'atmosfera contenente il 5% di apporto costante di CO2 (v/v in aria}, per un intervallo temporale di 180 giorni .

B) Ulteriori tre copie sperimentali, ciascuna formata da due controlli (1, e 2) ed un campione, sono state sottoposte a campo magnetico ELF a frequenza compresa nell'intervallo tra 1 e 1000 Hz, e campi magnetici statici (nell'intervallo di intensità 1 a 1000 uT), e/o campi elettrici statici (nell'intervallo di intensità 1 a 1000 V/m) , per un intervallo temporale di 10 minuti due volte al giorno per 180 giorni.

In una forma preferita di attuazione del procedimento oggetto della presente invenzione, le condizioni applicate sono le seguenti:

campo magnetico alternato 30 uT;

> campo magnetico statico 15 uT;

> frequenza di ripetizione della forma d'onda: 35 Hz; forma d'onda: sinusoide;

> tempo di applicazione 10 minuti due volte al giorno ogni 12 ore.

Tali condizioni sono state ricavate sperimentalmente ottimizzando il feedback impedenziometrico mediante scansione dell'intensità del campo magnetico alternato da 0 a 30 uT, e correlando la frequenza all'intensità totale del campo così ottenuta.

Le biopsie, sono state incubate, eseguendo prelievi e relativi test ogni 21 giorni, per un massimo di 180 giorni.

Protocollo di ìmmunofluorescenza

Dopo tre lavaggi per 10 min a temperatura ambiente in PBS {pH .7,4), i campioni sono stati risospesi in una soluzione fissante di paraformaldeide al 4% in RPMI 1640 con pH 7,4, per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'inclusione in paraffina, i campioni sono stati sezionati e posizionati su vetrini portaoggetti. Le sezioni sono state colorate con ematossilina/eosina, anticorpi monoclonali anti-citocheratina 10 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anticorpi monoclonali anti-citocheratina 11 (Santa Cruz Biotechnology, America, California) . Per ogni anticorpo monoclonale sono stati allestiti controlli specifici con i relativi isotipi (Santa Cruz Biotechnology, America, California). Tutti i campioni posizionati su vetrini portaoggetti sono stati osservati al microscopio ottico dopo essere stati sigillati con moviol e vetrini coprioggetti.

Misura dei NITRITI (NO^) e NITRATI (NO<~>)

Poiché la maggior parte del monossido di azoto (NO), prodotto dagli enzimi NO sintetasi, viene ossidata a nitriti e nitrati, la concentrazione di questi anioni è stata utilizzata come misura quantitativa della produzione di NO. Questo metodo si basa sulla conversione enzimatica dei nitrati in nitriti mediante l'utilizzo dell'enzima nitrato reduttasi.

Successivamente i nitriti vengono identificati spettrofotometricamente mediante una reazione colorimetrica che, in presenza del reattivo di Griess (naftiletìlendiammina diidrocloruro in HC1 2N e sulfanilammide in HC12N), fornisce come prodotto finale un azo-derivato che assorbe luce a 540 rati. La concentrazione di NO è indirettamente calcolata valutando sia i livelli di nitriti sia quelli di nitrati separatamente. Questa metodica permette di valutare la quantità di nitriti endogeni presente nei campioni e quindi di sottrarla daivalori totali ottenuti.

Misurazione dei nitriti endogeni nei campioni

Campioni di 100 μΐ di surnatante sono stati addizionati a 100 μΐ di reagente di Griess, e dopo 10 minuti di incubazione 1'assorbenza della soluzione è stata letta a 540 nm con un lettore di micropiastre modello EL340 della Packard. Il bianco, da sottrarre da ogni campione, è stato effettuato con medium fresco, e la curva di taratura con concentrazioni note di nitrito dì sodio. La concentrazione di nitrito è stata espressa come μιηοΐϊ di nitrito per mL. Misurazione dei nitriti totali nei campioni in seguita a conversione dei nitrati in nitriti

Campioni di 50 μΐ di surnatante sono stati addizionati a 25 μΐ nitrato reduttasi e 25 μΐ di NADH in piastre da 96 pozzetti e lasciati incubare per 30 min a 37°C. In seguito sono stati aggiunti 100 μΐ di reagente di Griess, e dopo 10 minuti di incubazione 1<1>assorbanza della soluzione è stata letta a 540 nm con un lettore di micropiastre modello EL340 della Packard. Il bianco, da sottrarre da ogni campione, è stato effettuato con medium fresco, e la curva di taratura con concentrazioni note di nitrato di sodio. La concentrazione di nitrito è stata espressa come μπιοΐί di nitrito per mL.

Determinazione della concentrazione di nitrati nei campioni Per ottenere la concentrazione dei nitrati si rende necessario sottrarre il valore ottenuto nella metodica per la misurazione dei nitriti endogeni a quello risultato nella metodica per la misurazione dei nitriti totali (dopo conversione completa dei nitrati a nitriti).

La misurazione dei nitriti e dei nitrati è stata eseguita con un kit: Nitric Oxide (NC>2<~>/N03-) Assay, cat. n<D>DE1500, (R&D Systems Ine., Minneapolis MN 55413, USA). Misura del monossido di azoto (NO) totale

Questo metodo si basa sulla conversione enzimatica dei nitrati in nitriti mediante l'utilizzo dell'enzima nitrato reduttasi. I nitriti ottenuti reagiscono con il reattivo di Griess (naftiletilendiammina diidrocloruro in HC1 2N e sulfanilammide in HC12N dando come prodotto finale un azoderivato otticamente visibile a 540nm. La quantità di NO è indirettamente calcolata sulla base della concentrazione di nitriti ottenuta dalla totale conversione dei nitrati in nitriti. Per la misurazione sono stati prelevati campioni di 50 μΐ di surnatante e sono stati addizionati a 25 μΐ nitrato reduttasi e 25 μΐ di NADH in piastre da 96 pozzetti e lasciati incubare per 30 min a 37°C. In seguito sono stati aggiunti 100 μΐ di reagente di Griess, e dopo 10 minuti di incubazione 1<1>assorbanza della soluzione è stata letta a 540 nm con un lettore di micropiastre modello EL340 della Packard. Il bianco, da sottrarre da ogni campione, è stato effettuato con medium fresco, e la curva di taratura con concentrazioni note di nitrato di sodio. La concentrazione di nitrito è stata espressa come μιηοΐϊ di nitrito per mL. La misurazione del NO totale è stata eseguita con il kit: Total Nitric Oxide Assay, cat. n° DE1600, (R&D Systems Ine., Minneapolis MN 55413, USA).

Western Blot per citocheratine

Le biopsie, sono state sospese in tampone lisante (1% SDS, 30 mM Tris pH 6,8, 5% glicerolo) al quale sono stati aggiunti gli inibitori delle proteasi (Protease Inhibitor Cocktail, Calbiochem, San Diego, CA) , hanno subito una omogeneizzazione, cui segue una incubazione dei campioni per 30 minuti a 4°C. I lisati ottenuti sono stati centrifugati a 12.000 rpm per 20 min a 4°C ed è stato raccolto il surnatante; la concentrazione proteica dei campioni è stata valutata con metodo Bio-Rad (Benchmark Plus assay, Bio-Rad) . Prima della corsa elettroforetica, i campioni sono stati fatti bollire per 5 minuti in presenza di beta-mercaptoetanolo e blu di bromofenolo. I campioni sono stati sottoposti a corsa elettroforetica in un gel al 12% (SDS-PAGE) e trasferiti su membrana PVDF (Perkin Elmer Ine.) . Le membrane sono state saturate con metanolo a temperatura ambiente e successivamente incubate con i seguenti anticorpi primari diluiti in PBS con 5% di latte in polvere scremato: anti-citocheratina 14 con titolo di diluizione 1:500 (Santa Cruz Biotechnologies Ine., Santa Cruz, California, USA), anti-citocheratina 18 con titolo di diluizione 1:500 (Santa Cruz Biotechnologies Ine., Santa Cruz, California, USA) e anti-citocheratina 19 con titolo di diluizione 1:500 (Santa Cruz Biotechnologies Ine., Santa Cruz, California, USA) per tutta la notte a 4°C. Dopo cinque lavaggi, le membrane sono state incubate con i relativi anticorpi secondari (1:1000) coniugati con perossidasi di rafano (HRP, Santa Cruz Biotechnologies Ine., Santa Cruz, California, USA) per Ih a temperatura ambiente. Le bande corrispondenti sono state evidenziate con liquidi di chemioluminescenza (Super Signal Western Pico solution, Pierce Biotechnology Ine., Rockford, Illinois, USA) e fissate su lastre fotografiche.

ESEMPI

Incubazione a sei mesi

Tutti i controlli appartenenti alla tipologia 1, sia per i gruppi di trattamento A che per i gruppi di trattamento B, sospesi unicamente in soluzione fisiologica, come da descrizione in materiali e metodi, incorsero in un processo necrotico rapidamente progressivo. Vennero quindi eliminati al giorno 15 dello studio (Tabella 5).

Tutti i controlli appartenenti alla tipologia 2, sia per i gruppi di trattamento A che per i gruppi di trattamento B, sospesi unicamente in terreno colturale, come da descrizione in materiali e metodi, incorsero in un processo di sfaldamento progressivo, senza presentare alcuna riparazione delle aree colpite da alopecia, effluvio o defluvio, sino ad un esito globale auto-litico in circa 30-60 giorni. Vennero quindi eliminati all'incorrere dei processi necrotici irreversibili in media al giorno 45 (Tabella 5).

ESEMPIO 1. Microscopia ottica

Questi risultati indicano nei campioni bioptici, sia per i gruppi di trattamento A che per i gruppi di trattamento B, un fenomeno di riattivazione o rigenerazione dei follicoli piliferi.

I risultati relativi all'espressione delle citocheratina 10 e 11 e le colorazioni istologiche dei preparati bioptici con ematossilina/eosina (utilizzati per la visualizzazione della vitalità follicolare) sono riportati in tabella 5 (CONTROLLI) ed in tabella 6 (CAMPIONI) e sono stati espressi con una scala qualitativa e semi-quantitativa, rapportando i risultati manifestati dal gruppo di trattamento A (CrPl-MD-INFUS) versus i risultati manifestati dal gruppi di trattamento B (CrPl-MD-INFUS ELF).

Dall'analisi dei risultati in Tabella 6 si evidenzia alla microscopia ottica (colorazione con eosina ed ematossilina) un netto incremento del numero di follicoli nei campioni trattati per sei mesi appartenenti al gruppo B (CrPl-MD-INFUS ELF) rispetto campioni trattati per sei appartenenti al gruppo A (CrPl-MD-INFUS).

Inoltre tutti i follicoli apparivano trofici, vitali ed attivi nei campioni appartenenti al gruppo B (CrPl-MD-INFUS ELF) rispetto ai campioni appartenenti al gruppo A (CrPl-MD-INFUS) dove si nota un ipotrofismo del follicolo stesso.

Infine, si segnala (Tabella 6) una netta predominanza delle citocheratine 10 ed 11, tipiche dei tessuti tegumentari normali con follicoli vitali ed attivi nei campioni appartenenti al gruppo B (CrPl-MD-INFUS ELF) trattati per sei mesi rispetto ai campioni appartenenti al gruppo A (CrPl-MD-INFUS).

Tabella 5. Controlli appartenenti alla tipologia 1 e controlli appartenenti alla tipologia 2, sia per i gruppi di trattamento A che per i gruppi di trattamento B. Giorno mediano di necrosi irreversibile è pari al giorno 15 per i controlli appartenenti alla tipologia 1. Giorno mediano di necrosi irreversibile è pari al giorno 45 per i controlli appartenenti alla tipologia 2.

Controllo 1 Controllo 1 Controllo 2 Controllo 2 Marcatori

GRUPPO A GRUPPO B GRUPPO A GRUPPO B

giorno 15 giorno 15 giorno 45 giorno 45

Nuclei/citoplasma necrosi

necrosi necrosi necrosi conservati colliquativa

massiva diffusa vacuolare

Eosina/ diffusa

iZmatossilina

Legenda

- - assenza di fluorescenza

+ = lieve fluorescenza per campo ottico

++ = sottile fluorescenza per campo ottico

+++ = media fluorescenza per campo ottico fluorescenza per campo ottico

++++ = alta fluorescenza per campo ottico

+++++ = diffusa fluorescenza per campo ottico

Tabella 6. Campioni appartenenti alla tipologia dei gruppi di trattamento A che dei gruppi di trattamento B. Valori semi-quantitativi mediani ai giorni di incubazione 90 e 180.

ESEMPIO 2. Western blot

I campioni sono stati sottoposti ad analisi fenotipiche con Western Blot per i marcatori citocheratina 1, citocheratina 2, citocheratina 10, citocheratina 11 e citocheratina 14, come di seguito discusso.

I risultati evidenziano una forte positività per la produzione di citocheratina 1, citocheratina 2, citocheratina 10, citocheratina 11 e citocheratina 14, nei campioni trattati, ed in particolare nei campioni trattati appartenenti al gruppo B, per 180 giorni in vitro con la composizione oggetto della presente invenzione, ChPl-MD-INFUS, rispetto ad una solo lieve positività nei campioni trattati appartenenti al gruppo B, per 180 giorni in vitro, come riportato in tabella 7.

Le citocheratine 1, 2, 10, 11 e 14 sono espresse nei tessuti tegumentari normali con follicoli vitali ed attivi durate gli stati di differenziamento cellulare, di crescita del follicolo pilifero e di controllo della formazione del capello [3-8] .

Tabella 7. Campioni trattati per 180 giorni in vitro appartenenti al gruppo A ed al gruppo B, espressione elle citocheratine 1,2,10,11,14.

ESEMPIO 3. Misurazione nitriti, nitrati e NO totale

L'ossido di azoto (NO), impropriamente chiamato ossido nitrico, è una specie chimica reattiva di natura radicalica centrata sull'azoto. L’NO viene trasformato in una serie di derivati, quali i nitriti ed i nitrati, che si accumulano, in funzione della quantità del mediatore primario prodotto, nel sangue ed in altri fluidi extracellulari per poi essere definitivamente allontanati dall'organismo attraverso le urine; i livelli plasmatici ed urinari di nitriti/nitrati correlano abbastanza bene in vivo con la produzione "endogena" di NO, anche dopo particolari terapie [4].

Nel complesso, quindi, i dati sperimentali qui analizzati, dimostrano che la composizione, il procedimento ed il dispositivo, oggetto d'invenzione, utilizzati in vitro possono migliorare alcune condizioni fisiopatologiche attraverso un aumento della sintesi endogena dell'NO, dimostrata dal relativo aumento dei suoi cataboliti nitriti e nitrati. L'NO, i nitriti ed i nitrati derivati appaiono assumere il ruolo di mediatori biologici che partecipano indirettamente alla regolazione della proliferazione e del differenziamento delle strutture tegumentarie e nello specifico alle modificazioni cicliche del follicolo pilifero [3-8].

Dall'analisi dei risultati in Tabella 8 si evidenzia un aumento significativo nei campioni del gruppo B trattati in vitro per 90 giorni (tre mesi) e 180 giorni (sei mesi) con il procedimento, il dispositivo e la composizione oggetto di invenzione ChPl-MD-INFUS, rispetto ai controlli 1-2 ed ai campioni del gruppo A, delle concentrazioni di nitriti e nitrati e, quindi, della produzione di NO. Tali risultati sono tipici di tipici dei tessuti tegumentari normali con follicoli vitali ed attivi.

Naturalmente, i particolari di realizzazione e le forme di attuazione potranno essere ampiamente variati rispetto a quanto descritto ed illustrato senza per questo uscire dall'ambito di protezione della presente invenzione, così come definito dalle rivendicazioni annesse.

BIBLIOGRAFIA

1. Blackman CF et al. A role for thè magnetic field in thè radiation induced efflux of calcium ions from brain tissue in vitro. Bioelectromagnetics. 1985; 6: 327-337.

2. Nikolova T, Czyz J, Rolletschek A, Blyszczuk P, Fuchs J, Jovtchev G, Schuderer J, Kuster N, Wobus AM. Electromagnetic fields affect transcript levels of apoptosis-related genes in embryonic stem cell-derived neural progenitor cells. FASEB J. 2005 Oct;19(12):1686-8.

3. Nordberg J and Arnér ESJ. Reactive oxigen species, antiossidants , and thè mammalian thioredoxin system. Free Radicai Biol Med. 200; 31:1287-312.

4. Fujiwara N, Osanai T, Kamada T, Katoh T, Takahashi KrOkumura K. Study on thè relationship between plasma nitrite and nitrate level and salt sensitivity in human hypertension modulation of nitric oxide synthesis by salt intake. Circulation. 2000; 101:856-861.

5. Comaish S. "Metabolic disorders and hair growth" Br J Dermatol 1971; 84:83.

6. Kossard S. "Postmenopausal frontal fibrosing alopecia:

Scarring alopecia in a pattern distribution" Arch Dermatol 1994;130:770-774.

7. Schmidt J.B. "Hormonal basis of male and female androgenetic alopecia: Clinical relevance". Skin Pharmacol 1994;7:61-66.

8. Robinson M, Reynolds AJ, Gharzi A, Jahoda CA. In vivo induction of hair growth by dermal cells isolated from hair follicles after extended organ culture. J Invest Dermatol. 2001 Sep; 117(3):596-604.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composizione cosmetica comprendente: almeno un metallo, suoi sali e/o suoi composti; ed almeno un enzima proteolitico.
2. Composizione secondo la rivendicazione 1, in cui detto almeno un metallo è scelto fra zinco, argento, oro, ferro, sodio.
3. Composizione secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui detto almeno un enzima proteolitico è selezionato<'>fra papaina, collagenasi, serratiopeptidasi, eparanasi, DNAsi, elastasi, bromelaina, bradichinasi, Clostridium peptidasi, enzimi espressi da Lactobacillus acidophìlus , enzimi espressi dal genere Aspergillus , proteasi, aliinasi, fibrinolisina, preferibilmente papaina.
4. Composizione secondo la rivendicazione 2, in cui lo zinco è presente come ossido di zinco.
5. Composizione secondo la rivendicazione 2, in cui il ferro è presente come ferritina.
6. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un enzima proteolitico è presente in una concentrazione compresa nell'intervallo da 0,1 μg/L a 100 mg/L, più preferibilmente da 10 mg/L a 80 mg/L.
7. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un metallo è presente in una concentrazione compresa nell'intervallo da 0,01mg/L a 100mg/L, più preferibilmente da 0,lmg/L a 20mg/L.
8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta composizione comprende inoltre almeno uno fra un veicolo fisiologicamente accettabile, un aminoacido, uno zucchero, una vitamina, selenio.
9. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta composizione è sotto forma di lozione, gel, crema, liquido infusionale, spray, sospensione, emulsione.
10. Procedimento cosmetico per stimolare la rigenerazione e/o il recupero del trofismo originale dell'apparato tegumentario e/o migliorare la vitalità dei follicoli piliferi in una porzione di tessuto di un mammifero comprendente le seguenti fasi: i) applicare su detta porzione di tessuto una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9; ii) applicare su detta porzione di tessuto un campo elettromagnetico alternato a bassa frequenza (ELF) e ad almeno uno tra un campo magnetico statico ed un campo elettrico statico; così da stimolare la rigenerazione e/o il recupero del trofismo originale dell'apparato tegumentario e/o migliorare la vitalità dei follicoli piliferi in detta porzione di tessuto.
11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui detto campo elettromagnetico alternato è applicato con una frequenza compresa tra 1 e 1000 Hz, preferibilmente tra 1 e 100 Hz.
12. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 o 11, in cui detto campo elettromagnetico alternato è applicato con una intensità compresa tra 1 e 200 uT.
13. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 12, in cui detto campo elettromagnetico alternato è applicato con una forma d'onda tale da generare un contenuto armonico fino a 50 KHz.
14. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 13, in cui detto campo magnetico statico è applicato con una intensità compresa tra 10 e 2000 uT, preferibilmente compresa tra 10 e 500 uT.
15. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 14, in cui detto campo elettrico statico è applicato con una intensità compresa tra 1 e 1000 V/m, preferibilmente compresa tra 10 e 100 V/m.
16. Procedimento secondo una qualsiasi del-le rivendicazioni 10 a 15, in cui detta fase ii) ha luogo per un perìodo dì tempo compreso tra 2minuti/Bis in die e 2ore/Bis in die, preferibilmente tra 5minuti/Bis in die e 20minuti/Bis in die.
17. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 16, in cui detto detta composizione è applicata per via topica su tegumenti e tessuti di rivestimento o dì sostegno di mammiferi in campo umano o veterinario.
18. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 17, in cui detto mammifero è un essere umano.
19. Uso della composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9, in forma di cosmetico, di dispositivo medico o di farmaco, per stimolare la rigenerazione e/o il recupero del trofismo originale dell'apparato tegumentario e/o migliorare la vitalità dei follicoli piliferi in un mammifero, preferibilmente nell'uomo.