ITTO20080810A1 - Microdispositivo integrato per reazioni di amplificazione di acidi nucleici - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Microdispositivo integrato per reazioni di amplificazione di acidi nucleici"

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un dispositivo integrato per reazioni di amplificazione di acidi nucleici (PCR) e per analisi quantitative di acidi nucleici in tempo reale (qPCR), in generale utilizzabile per analisi genomiche e proteoniche.

La tecnologia dei biochip, finalizzata a miniaturizzare un intero laboratorio di biologia molecolare in un dispositivo integrato e compatto, ? in continua evoluzione ed espansione, grazie alle vantaggiose caratteristiche che offre in termini di costo di produzione, velocit? di reazione, basso consumo di campioni e non ultima estrema versatilit?.

Particolare interesse ? rivolto alla possibilit? di analizzare quantitativamente il processo di amplificazione di DNA, poich? tale tecnologia, nelle sue diverse modalit? combinate ai nuovi metodi di sintesi automatizzata degli acidi nucleici, fornisce un importante mezzo di ricerca nella diagnostica ed ? ampiamente utilizzata nella genotipizzazione di antigeni patogeni e virali.

Il principio di funzionamento della real-time PCR si basa tipicamente sulla misura del segnale derivante da un marcatore fluorescente, che aumenta in misura proporzionale alla quantit? di DNA amplificato in ogni ciclo di reazione. Generalmente, si avvale di sonde opportunamente coniugate a molecole fluorescenti che presentano diversi meccanismi di funzionamento.

I biochip per PCR, in particolare quelli in modalit? real-time, devono possedere sostanzialmente tre componenti: una camera di reazione, mezzi per effettuare rampe termiche associati alla camera di reazione e mezzi di rivelazione per monitorare il DNA prodotto.

Sono gi? stati descritti diversi microdispositivi a tale scopo, che per? presentano svantaggi: hanno costi su scala industriale elevati (ad esempio dispositivi in silicio) e, in alcuni casi, richiedono grandi volumi di miscela per la rivelazione della fluorescenza, devono essere abbinati a termociclatori classici per i cicli termici o a microscopi a fluorescenza per la rivelazione ottica.

Allo scopo di ridurre i costi di produzione, risultano vantaggiosi microreattori da usarsi come camere di reazione costruiti con materiale plastico; tuttavia, in relazione all'utilizzo di materiali plastici, devono essere presi in considerazione i limiti di tali materiali, quali la scarsa capacit? di conduzione termica e la debole idrofilia di tali materiali.

WO2007/142669 descrive un dispositivo per il monitoraggio e la rivelazione di PCR in modalit? real-time. In particolare, ? descritto un dispositivo miniaturizzato costituito da un reattore ibrido di vetro, costituente il fondo, e da pareti laterali di materiale polimerico, quale polidimetilsilossano (PDMS) o polimetilmetacrilato (PMMA), integrato ad un microciclatore termico. Quest'ultimo ? costituito da un sottile elemento riscaldante e da una piccola ventola per raffreddare.

Il dispositivo pu? essere associato ad un classico microscopio per fluorescenza o, in alternativa, integrato ad un dispositivo per la rivelazione della fluorescenza, cos? da realizzare un dispositivo completo e portatile.

Tale biochip presenta tuttavia alcuni limiti, quali la possibile formazione di bolle in seguito a chiusura ermetica del dispositivo e la presenza di perdite di liquido tra le piccole fratture o pori che si hanno tra i due diversi materiali, favoriti anche dalla diversa dilatazione termica degli stessi. Inoltre, poich? il fondo della camera di reazione ? vetro, materiale che inibisce reazioni biologiche, l'amplificazione diretta di DNA genomico risulta impossibile se non a seguito di procedure di ricopertura con polivinilpirrolidone.

US 2008/0064086 si propone l'intento di ridurre notevolmente i costi di fabbricazione dei classici dispositivi termici per processare il DNA (che utilizzano soprattutto silicio e vetro) tramite la fabbricazione di microdispositivi a base di materiali plastici. Il dispositivo descritto prevede l'utilizzo di una microcamera di silicio per l'alloggiamento del campione e pertanto non risolve completamente l'abbattimento dei costi.

EP 1 541 237 descrive un dispositivo per PCR a pi? moduli, nel quale pu? essere effettuata l'amplificazione di campioni a differenti condizioni di temperatura, con monitoraggio in tempo reale. Ciascun modulo ? costituito da un alloggiamento per il campione da amplificare tramite PCR del tipo a microchip (microchip-type PCR tube), comprendente una camera per la soluzione ed un sensore per la temperatura, una micropiastra riscaldante dotata di ventola ed unit? per la rivelazione del segnale di fluorescenza.

Il dispositivo permette di aumentare la velocit? di trasferimento termico, riducendo notevolmente i tempi di reazione; tuttavia, il dispositivo ? relativamente costoso, in quanto realizzato con silicio e presenta una struttura complessa che non soddisfa caratteristiche di uso al punto di cura e portabilit?.

Lo scopo primario della presente invenzione ? quello di fornire un dispositivo integrato del tipo di biochip precedentemente descritto, in cui il microreattore pu? essere realizzato come dispositivo usa e getta, di basso costo e che, al contempo, consenta di ottenere risultati, in analisi quantitativa di DNA, analoghi a quelli ottenibili con dispositivi pi? complessi o con l'impiego di termociclatori.

In vista di tale scopo, costituisce oggetto dell'invenzione un dispositivo integrato avente le caratteristiche definite nelle rivendicazioni che seguono.

Un altro oggetto dell'invenzione ? un procedimento per la produzione di un microreattore utilizzato nel suddetto dispositivo integrato.

Un altro oggetto dell'invenzione ? un procedimento per l'amplificazione di acidi nucleici e/o per il monitoraggio quantitativo in tempo reale di reazioni di amplificazione di acidi nucleici che utilizza il dispositivo integrato precedentemente citato ed il relativo microreattore.

Ulteriori caratteristiche degli oggetti dell'invenzione risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata che segue, effettuata con riferimento ai disegni annessi, in cui:

- la fig. 1 ? una rappresentazione schematica delle fasi operative per la produzione di un dispositivo integrato (biochip) secondo l'invenzione; - le figg. 2-7 illustrano i risultati di prove sperimentali, effettuate al fine di convalidare l'utilizzo dei microreattori realizzati in conformit? all'invenzione e relativi dispositivi integrati con differenti reazioni di PCR;

- la fig. 8 illustra la tipica configurazione di un esperimento di real-time PCR con l'impiego del dispositivo integrato; e

- la fig. 9 illustra i risultati di prove sperimentali, effettuate al fine di convalidare l'utilizzo dei microreattori realizzati in conformit? all'invenzione e relativi dispositivi integrati con differenti reazioni di PCR effettuate su campioni biologici reali(cellule umane, sangue, peli, biopsia gengivale) e su singole colonie di microrganismi.

Fabbricazione ed ottimizzazione dei microreattori plastici

Per la realizzazione dei microreattori si ? scelto di utilizzare il polimero polidimetilsilossano (PDMS), che offre il vantaggio di poter essere trattato mediante l'uso di tecniche di fabbricazione a basso costo, quali la litografia soffice ed in particolare tecniche di produzione per imprinting con l'uso di opportuni stampi (replica-moulding).

In una prima forma di attuazione, il microreattore che pu? essere a camera singola o presentare una pluralit? di camere, presenta un corpo integrale (in un sol pezzo), ottenuto per formatura con l'impiego di stampi e controstampi (puncher) del suddetto materiale polimerico.

In un'altra forma di attuazione, il microreattore presenta un corpo con pareti laterali ottenute per formatura ed una parete di fondo che presenta uno spessore di parete inferiore allo spessore delle pareti laterali, ottenuta mediante un procedimento di spin coating del suddetto polimero.

In questa forma di attuazione, la parete di fondo che presenta uno spessore variabile da 1 ?m a 500 ?m, tipicamente di circa 100 ?m, viene successivamente collegata alla parete laterale del microreattore, costituita dello stesso materiale mediante un semplice processo di "conformal contact".

La fig. 1, fase I, illustra la prima fase di formatura (replica-moulding) con stampo e controstampo o punzone ("puncher") 2. In particolare, i puncher sono stati realizzati in diversi materiali (ad esempio in metallo, plastica, vetro, ceramica), anche se i migliori risultati (in termini di riproducibilit?, trasparenza, omogeneit? e piattezza delle microcamere e/o delle loro superfici) sono stati ottenuti con i punzoni metallici.

I microreattori plastici sono realizzati in questa fase versando una soluzione di PDMS ed agente polimerizzante (generalmente vengono usati kit commerciali costituiti da una soluzione di monomero e agente curante, quale ad esempio il prodotto Sylgard 184 DowCorning) in stampi le cui forme e dimensioni impartiscono le forme desiderate e spessori costanti ai microreattori.

Il rapporto in peso di concentrazione tra PDMS ed agente polimerizzante pu? variare in un ampio campo, ad esempio tra 30:1 e 5:1, il valore di 10:1 essendo preferito, come suggerito nelle istruzioni (datasheet) dei kit commerciali.

In seguito a polimerizzazione della soluzione (ad esempio in forno a 70?C per 60 minuti), la microcamera di PDMS viene rimossa dalla forma metallica e raffreddata (fig. 1, fase II).

Combinando opportunamente gli stampi ed i puncher, ? quindi possibile ottenere microreattori di diverse forme e dimensioni, con capacit? tipicamente comprese tra 50 ?l e 1 ?l. Con questa tecnica si possono realizzare microreattori a camera singola o multicamera, questi ultimi sono importanti per analisi di tipo multiplexing.

La fig. 1, fase III, illustra la forma di attuazione in cui alle pareti del microreattore viene applicata una parete di fondo 3, costituita da una ulteriore lamina di PDMS, il cui spessore (preferibilmente non superiore ai 100 ?m) viene finemente controllato mediante la procedura di deposizione di PDMS per spin coating; tale fondo viene quindi messo a contatto con le pareti del reattore mediante semplice processo di conformal contact.

Il sottile spessore della parete di fondo favorisce il passaggio di calore, contrapponendosi alla naturale inerzia termica del materiale.

Per migliorare le caratteristiche di idrofilia della superficie, il PDMS ? preferibilmente sottoposto a trattamenti di modifica superficiale mediante metodologie fisico-chimiche. Sebbene i trattamenti di attacco fisico usati possono essere diversi (Emanuel A. Waddell, et al. Applied Surface Science 254 (2008) 5314?5318)(Surface grafting, corona discharge, laser ablation, microwave irradiation, UV modification), quello impiegato e preferito ? un trattamento con plasma di ossigeno (fig. 1, fase III). Il plasma favorisce la formazione di gruppi idrossilici liberi in superficie, che incrementano l'idrofilia superficiale.

Migliori risultati in termini di permanenza del trattamento sono stati ottenuti quando il materiale impiegato era stato polimerizzato con una concentrazione di polimero ed agente polimerizzante di 10:1. Le condizioni di plasma preferite sono 25 W, 100 mTorr per 2 minuti, che danno il miglior risultato inteso come compromesso tra l'idrofilia della superficie ottenuta immediatamente dopo il trattamento e la stabilit? della stessa nelle 24 ore.

Preferibilmente, in una fase successiva, al fine di ottimizzare e rendere biocompatibili i microreattori per reazioni di amplificazione di acidi nucleici (in modo tale che le superfici di PDMS non interferiscano con le reazioni biochimiche e/o con il materiale biologico contenuto nelle miscele di reazione e per garantire alte efficienze di reazioni PCR), i microreattori sono trattati mediante procedure di passivazione chimica. Tali procedure servono anche a garantire un'ulteriore stabilit? al ritorno idrofobico del materiale polimerico.

I migliori risultati sono ottenuti mediante due procedure, basate rispettivamente su lavaggi con soluzioni di BSA o con soluzioni acide di Si-PEG.

La validazione dei microreattori dopo il trattamento di passivazione ? stata effettuata mediante valutazione di una reazione di PCR condotta su DNA plasmidico (sequenza bersaglio 272 bp, inserita nel plasmide pBS/KS+, Stratagene). Tali esperimenti di validazione sono stati condotti nei microreattori di PDMS inseriti in differenti strumenti commerciali per PCR (termociclatori) e per confronto nelle classiche provette (vial).

Sono stati effettuati cento esperimenti indipendenti, successivamente analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio (1%), valutando sia la resa sia la specificit? della reazione. Questi risultati sono illustrati nella fig. 2.

Come risulta da un'analisi della fig. 2, il trattamento dei microreattori con BSA e con PEG garantisce un'ottima PCR, sia in termini di resa, sia in termini di specificit? della reazione (gel a sinistra ed al centro della fig. 2, rispettivamente). Preferita ? la passivazione con soluzioni di BSA che risulta essere maggiormente efficace e stabile nel tempo.

Per prevenire l'evaporazione della soluzione durante la PCR, i microreattori 10 sopra descritti possono essere chiusi efficacemente, sia con classici film ottici adesivi, disponibili in commercio, sia con olio minerale o cere o con qualsiasi tappo adattabile alle microcamere (ad esempio in materiale polimerico, metallico e vetroso).

La fig. 1, fase IV, illustra l'applicazione di una sigillatura a tenuta mediante un film adesivo del microreattore.

Fabbricazione ed ottimizzazione dei microriscaldatori/sensori e software per l'effettuazione di rampe termiche per analisi PCR

La fig. 1, fase V, illustra un dispositivo integrato secondo l'invenzione che utilizza il microreattore precedentemente descritto. Il dispositivo comprende un substrato 5, un microreattore 10 realizzato in conformit? con quanto precedentemente descritto che poggia su un elemento riscaldante 8.

Gli elementi riscaldanti possono essere di diverso tipo, lamine riscaldanti di diversa natura in grado di effettuare i cicli termici tipici delle reazioni di PCR, ad esempio Peltier commerciali, ecc. In una forma di attuazione preferita, realizzata a titolo di dimostratore, ? stato utilizzato un dispositivo su substrato di Si/SiO2, comunemente utilizzato nell'industria elettronica. Alternativamente, il substrato pu? essere costituito da vetro, quarzo, ITO, materiale plastico o metalli. Diverse configurazioni e geometrie sono possibili per i microriscaldatori ed i sensori. Preferibilmente, entrambi tali elementi sono integrati in un unico materiale in un singolo processo di fotolitografia, in modo da semplificarne sensibilmente la progettazione e la fabbricazione e ridurne il costo.

Nel caso dei dimostratori realizzati su Si/SiO2, il processo di fabbricazione parte con il definire i diversi elementi nel fotoresist. Per la realizzazione del microriscaldatore 8, si ? utilizzato un processo di evaporazione di platino.

In generale, per?, si possono adoperare anche materiali differenti al posto del platino. Anche lo spessore depositato pu? essere variato secondo le esigenze. Una volta evaporato lo strato di platino, un processo di lift-off conclude la fabbricazione di microriscaldatori e sensori di temperatura, indicati con 7 nella fig. 1, fase V. In un secondo step litografico sono quindi realizzati i contatti in oro, indicati con numero di riferimento 6, per i vari elementi che successivamente sono stati interconnessi ad un'interfaccia plug&play pronta per essere collegata alla strumentazione di controllo.

I sensori sono stati caratterizzati e tarati mediante misure di resistenza in funzione della temperatura, al fine di verificare la linearit? e stabilit? di tali curve (uno step di annealing per 2 ore a circa 150?C ? utile per i dispositivi su Si/SiO2 al fine di aumentarne la stabilit?).

I parametri cos? calcolati sono stati quindi inseriti nel software di controllo che permette di guidare i cicli termici. In particolare, ? stato implementato un feedback di tipo PID (proporzionale-integrale-differenziale) per assicurare un controllo accurato della temperatura durante i cicli termici.

Le rampe termiche ottenute sono abbastanza veloci, (grazie anche alla presenza di una ventola) anche in fase di raffreddamento, e sono state calcolate essere intorno ad un valore da 2?C a 6?C/ sec.

Validazione del dispositivo integrato secondo l'invenzione

Il dispositivo integrato, identificato nelle fig. 4-8 con la denominazione Lab-on-Chip ? stato testato e validato con differenti reazioni di PCR effettuate su diversi tipi di DNA, di diversa complessit? (diversa lunghezza degli ampliconi risultanti e diversa lunghezza del DNA di partenza). A-nalogamente a quanto fatto per i test sui microreattori di PDMS (caratterizzati nei termociclatori), le reazioni di PCR sul dispositivo integrato sono state condotte con volumi ridotti di soluzione (tipicamente da 10 ?l a 1-3 ?l). In particolare, il dispositivo integrato ? stato caratterizzato con tre differenti tipi di DNA:

- DNA plasmidico: lunghezza approssimativa dell'intera sequenza: 3500 bp; lunghezza della sequenza target: 272 bp;

- DNA genomico batterico: lunghezza approssimativa dell'intera sequenza: 105-106 bp; lunghezza della sequenza target: 1600 bp;

- DNA genomico umano: lunghezza approssimativa dell'intera sequenza: 109 bp; lunghezza della sequenza target: 206 bp.

Per tutti gli esperimenti di validazione del dispositivo integrato, presentati e discussi nei successivi paragrafi, si sono effettuati in parallelo: i) test su diversi dispositivi commerciali per reazioni PCR (basati su vial convenzionali in termociclatori), che fungono da dispositivo di riferimento, sia in termini di resa finale della reazione che di specificit? della reazione stessa; ii) test sui microreattori plastici nei termociclatori; iii) test sui dispositivi integrati.

Tali esperimenti sono sempre stati condotti utilizzando, nei tre diversi dispositivi, aliquote della medesima miscela di reazione appena preparata.

DNA plasmidico

Nel caso di DNA plasmidico (sequenza bersaglio 272 bp, inserita nel plasmide pBS/KS+, Stratagene, che presenta una lunghezza di 2958 bp), sono stati effettuati 250 esperimenti indipendenti di validazione del dispositivo integrato. I risultati delle reazioni PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio (1%), tipicamente dopo 30 cicli di PCR (fig. 4).

Come mostrato nel gel (fig. 4, a sinistra), il dispositivo integrato ? in grado di garantire una ottima reazione PCR rispetto ai classici vial, sia in termini di resa che di specificit? della reazione (la presenza di bande aspecifiche di amplificazione ? del tutto trascurabile). In particolare, l'efficienza della reazione ottenuta nel dispositivo integrato ? pressoch? identica rispetto a quanto ottenuto nei vial convenzionali (fig. 4, a destra). Inoltre, la durata complessiva della reazione condotta nel dispositivo integrato ? minore (il tempo medio della reazione rispetto alla strumentazione commerciale ? ridotto di circa 30 minuti).

DNA genomico batterico

Il DNA genomico batterico (Cyanobacterium Leptolyngbya) utilizzato presentava una lunghezza della sequenza target di circa 1600 bp e una complessit? molecolare maggiore (lunghezza approssimativa dell'intera sequenza: 105-106 bp). In questo caso, sono stati effettuati 50 esperimenti indipendenti di validazione del dispositivo integrato.

I risultati delle reazioni PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio (1%) tipicamente dopo 30 cicli di PCR (fig. 5). Anche nel caso di DNA genomico batterico, il dispositivo integrato si ? dimostrato in grado di garantire un'ottima efficienza di reazione rispetto alla strumentazione commerciale, sia in termini di resa che di specificit? della reazione, insieme ad una riduzione della durata complessiva della reazione (circa 30 minuti in meno rispetto ai termociclatori).

DNA genomico umano

Il DNA genomico umano utilizzato presentava una lunghezza della sequenza target di 206 bp (rappresentante una porzione del gene umano APOE) ed una complessit? molecolare di gran lunga maggiore rispetto ai precedenti test (lunghezza approssimativa dell'intera sequenza: 109 bp). In questo caso, sono stati effettuati 50 esperimenti indipendenti di validazione del dispositivo integrato, analizzati successivamente mediante elettroforesi su gel di agarosio (1%), tipicamente dopo 30-35 cicli di PCR (fig. 6).

Significativamente, il dispositivo integrato, anche nel caso di DNA genomico umano (cio? il DNA su cui vengono solitamente effettuate le analisi cliniche reali) ha dimostrato un'ottima efficienza di reazione rispetto alla strumentazione commerciale, sia in termini di resa che di specificit? della reazione (fig. 6), insieme ad una riduzione della durata complessiva della reazione (circa 1 ora in meno rispetto ai termociclatori).

In generale, quindi, i test effettuati hanno dimostrato un'ottima efficienza del dispositivo integrato Lab-on-Chip (paragonabile o addirittura superiore alla tecnologia corrente basata sui vial in termociclatore) sia nel caso di reazioni PCR condotte su dispositivi modello (DNA plasmidico) che in caso di applicazioni cliniche reali, basate su sequenze di DNA particolarmente complesse (DNA genomico umano).

In particolare, i risultati sperimentali hanno mostrato un'ottima affidabilit? del chip, un'eccellente riproducibilit? degli esperimenti e una buona efficienza della reazione PCR, sia in termini di resa finale della reazione, che di specificit? della sequenza amplificata. Inoltre, il dispositivo integrato permette di utilizzare quantit? ridotte di reagenti (fino a pochi ?l di miscela di reazione) e porta una significativa riduzione dei tempi complessivi della reazione.

Dispositivo integrato multicamera

Il dispositivo integrato Lab-on-Chip, oltre che singole reazioni PCR su specifiche sequenze di DNA, pu? effettuare anche reazioni multiple in parallelo (simultaneamente) utilizzando dei dispositivi di PDMS a pi? microreattori (dispositivi multicamera). Tali dispositivi possono comprendere da pochi microreattori (ad esempio quattro microreattori, come mostrato nella fig. 7 in alto a destra), a decine di microreattori (ad esempio trentasei, come mostrato nella fig. 7 in alto a sinistra), ma ovviamente ? possibile aumentare notevolmente il grado di integrazione del dispositivo, arrivando a dispositivi plastici costituiti da centinaia o migliaia di microcamere indipendenti.

In tali dispositivi integrati multicamera, ? possibile effettuare simultaneamente diverse reazioni di PCR, sia sul medesimo campione di DNA (ad esempio, allo scopo di ottimizzare una specifica miscela di reazione o per caratterizzare ed ottimizzare importanti parametri, in tempi molto brevi, grazie all'alto parallelismo del dispositivo, che su campioni di DNA differenti (ad esempio, per effettuare simultaneamente un grande numero di reazioni PCR su materiale genetico differente). In quest'ultimo caso, va evidenziato che i singoli microreattori del dispositivo multicamera possono essere gestiti in maniera indipendente per quanto riguarda i cicli termici da effettuarsi durante la reazione (analogamente, nel caso di analisi in real-time delle reazioni PCR, ad esempio mediante reporter fluorescenti, anche la gestione dei dispositivi di rivelazione dei segnali ottici avviene in maniera indipendente per ogni singolo microreattore).

La validazione del dispositivo integrato multicamera ? stata effettuata mediante analisi di reazioni PCR su DNA genomico batterico (analogamente a quanto riportato finora, il test del dispositivo ? stato effettuato per confronto con i dispositivi commerciali per reazioni PCR, basati su vial convenzionali in termociclatori). Tali esperimenti di validazione (quaranta esperimenti indipendenti) sono stati poi analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio (1%), tipicamente dopo 30 cicli di PCR.

Come si evince dal gel e dall'analisi dei dati (fig. 7, in basso), anche nel caso di dispositivi multicamera, il dispositivo Lab-on-Chip ? in grado di garantire un'ottima reazione PCR rispetto ai classici vial, sia in termini di resa che di specificit? della reazione (sostanzialmente, si osserva un comportamento identico al dispositivo integrato a microcamera singola). Inoltre, anche in questo caso, si ottiene una riduzione di circa 30 minuti della durata complessiva della reazione, rispetto ai termociclatori commerciali.

Analisi PCR quantitative in real-time

Il dispositivo integrato Lab-on-Chip, sia in modalit? singola camera che in modalit? multicamera, pu? effettuare reazioni PCR, come descritto finora, solitamente analizzate all'end-point della reazione (ad esempio mediante elettroforesi su gel di agarosio, elettroforesi su gel di acrilammide, elettroforesi capillare, elettroforesi capillare su chip, ecc.).

Tipicamente, tali analisi all'end-point non permettono di quantificare il materiale genetico di partenza. Il dispositivo Lab-on-Chip pu?, per?, effettuare anche analisi quantitative in real-time, utilizzando nella miscela di reazione un opportuno sistema reporter (tipicamente, un sistema fluorescente), ed un opportuno dispositivo di eccitazione/rivelazione del sistema fluorescente (tipicamente coordinato ai cicli termici della reazione).

Il sistema reporter pu? essere costituito da un'ampia gamma di sistemi fotoluminescenti, con l'unica restrizione per cui il segnale emesso dal reporter deve essere correlabile alla quantit? di DNA presente nella miscela di reazione. Di solito, i marcatori utilizzati si basano su un segnale di fluorescenza che aumenta nel tempo, in funzione del numero crescente di cicli di PCR, e cio? in funzione della crescente quantit? di DNA, che si sta amplificando, presente in soluzione. Tale monitoraggio in real-time della reazione di amplificazione (PCR) permette di ottenere informazioni quantitative sulla sequenza genica di interesse (cio?, sulla presenza e sulla quantit? di una specifica sequenza di DNA in un certo campione).

Tra i reporter di reazioni real-time, quelli pi? comunemente usati sono i fluorofori intercalanti (come, ad esempio, il SYBR Green), i Molecular Beacons, i FRET probes, i dispositivi TaqMan, Scorpions, ecc.. Il dispositivo integrato Lab-on-Chip pu? essere utilizzato indistintamente con uno qualsiasi dei marcatori fluorescenti precedentemente descritti (non vi ? nessuna limitazione del dispositivo integrato rispetto ai marcatori esistenti, ? sufficiente ottimizzare la miscela di reazione in funzione della specifica applicazione, ed usare una opportuna radiazione di eccitazione e banda spettrale di detection). A solo titolo di esempio, e come dimostratore di una reazione real-time PCR nel dispositivo integrato, di seguito ? riportato il caso in cui il reporter ? rappresentato dal fluoroforo intercalante SYBR Green I.

Riguardo al dispositivo ottico di eccitazione e rivelazione del segnale di fluorescenza emesso dal reporter, ? possibile utilizzare qualsiasi strumentazione disponibile in commercio come sorgente di eccitazione (ad esempio, laser, led, lampade, ecc., eventualmente accoppiati con lenti, specchi, filtri, monocromatori, collimatori, pinhole e qualsiasi componente ottico necessario ad una migliore e pi? efficiente eccitazione del reporter fluorescente) e come dispositivo di rivelazione del segnale (fotodiodi, fotomoltiplicatori, APD, DAD, CCD, CMOS, ecc., eventualmente accoppiati con lenti, collimatori, specchi, filtri, monocromatori, pinhole o qualsiasi componente ottico necessario ad una migliore e pi? efficiente raccolta del segnale) ed una qualsiasi configurazione e geometria del dispositivo di eccitazione e rivelazione, scelta arbitrariamente in funzione della specifica applicazione (ad esempio, detection in backscattering o a qualsiasi angolo opportuno rispetto alla direzione di eccitazione, eccitazione e/o emissione dall'alto, ecc.).

Nel dispositivo integrato per analisi real-time PCR (e a solo titolo di esempio), si ? utilizzata una classica geometria ad angolo retto ed una microcamera a base quadrata, in cui sia l'eccitazione che la raccolta del segnale vengono effettuate attraverso le pareti della microcamera di PDMS (come mostrato nella fig. 8, in alto). Ovviamente, ? possibile utilizzare microcamere di qualsiasi forma e dimensione, sia singole che dispositivi multicamera.

Tipicamente, il segnale emesso dal reporter viene raccolto durante la fase di "annealing" dei cicli di PCR (ma possono essere arbitrariamente selezionati altri intervalli opportuni durante i cicli di PCR, in funzione della specifica reazione e/o della temperatura alla quale si preferisce acquisire il segnale del reporter). Il reporter viene solitamente eccitato solo durante l'intervallo di acquisizione (ad esempio, per pochi secondi durante la fase di annealing), per evitare processi di fotodegradazione del fluoroforo e/o del materiale biologico presente nella miscela di reazione.

Nel dimostratore di dispositivo integrato per analisi real-time di PCR, si ? acquisito il segnale durante la fase di annealing, utilizzando un tempo di eccitazione/rivelazione di circa un secondo.

Come mostrato nella fig. 8 (in basso a sinistra), il dispositivo integrato Lab-on-Chip consente di effettuare analisi in real-time di reazioni PCR, mantenendo un'ottima specificit? e resa della reazione, come si evince dal gel effettuato all'end-point della reazione (fig. 8, in basso a destra), tipicamente preso dopo 30-35 cicli di PCR nel dispositivo integrato, e paragonato all'analoga reazione PCR di controllo (non in real-time) condotta in vial in termociclatore.

Nel grafico (fig. 8, in basso a sinistra) sono riportate due curve relative a due reazioni di PCR analizzate in real-time, in cui il segnale di fluorescenza (dato dal fluoroforo intercalante SYBR Green I) aumenta con l'aumentare dei cicli di PCR (e quindi della quantit? di DNA in soluzione). Come ? possibile notare, le due sigmoidi sono "shiftate", ossia raggiungono la fase di plateau a differenti cicli di PCR, poich?, pur trattandosi della medesima reazione, le concentrazioni di DNA di partenza sono differenti (approssimativamente, la curva blu ? caratterizzata da una quantit? di DNA di partenza inferiore di 100 volte rispetto alla curva nera).

Effettuando diverse curve di calibrazione (per concentrazioni di DNA di partenza note), tali misure in real-time consentono, dunque, di ottenere informazioni quantitative (su un ampio range dinamico) della sequenza genica di interesse (cio? sulla presenza e sulla quantit? di una specifica sequenza di DNA in un certo campione).

Inoltre, il dispositivo Lab-on-Chip, in configurazione per analisi in real-time, consente di effettuare anche analisi di genotipizzazione della sequenza amplificata mediante curve di "melting".

Tale possibilit? offerta dal dispositivo integrato ? di particolare rilevanza, poich? consente di effettuare una caratterizzazione della sequenza target amplificata.

Tale capacit? di analisi ? di fondamentale importanza in applicazioni cliniche reali, in cui la discriminazione di singole mutazioni in sequenze di DNA genomico umano (o, pi? in generale, la caratterizzazione di specifiche sequenze) pu? essere l'elemento basilare e caratterizzante delle diagnosi mediche. Eventualmente, tale analisi di genotipizzazione pu? essere successivamente accoppiata alla tecnologia micro-array, per una ulteriore e pi? accurata analisi delle sequenze geniche di interesse (in funzione della specifica applicazione e della complessit? biomolecolare dell'analisi da effettuarsi).

Il dispositivo integrato Lab-on-Chip pu? essere utilizzato anche per altri tipi di reazioni di amplificazione del DNA e/o dell'RNA, sia in formato "end-point" (per analisi qualitative) sia per analisi quantitative in real-time (ad esempio, PCR, qPCR, Nested PCR, Multiplex PCR, Colony PCR, reverse transcription PCR, ecc.) per applicazioni cliniche, per colture cellulari (eventualmente accoppiate a dispositivi di flusso e/o a dispositivi microfluidici), per proteomica e comunque per qualsiasi analisi di reazioni (bio)molecolari in cui la miscela di reazione, contenuta in una microcamera, necessita di temperature controllate e/o di opportuni cicli termici.

Analisi PCR diretta (direct PCR) su campioni biologici senza pre-trattamento

Le caratteristiche di ottima biocompatibilit? del microreattore in PDMS sono state dimostrate su campioni biologici reali (cellule umane, sangue, peli, biopisia gengivale) senza alcun pre-trattamento dei campioni di partenza. Sono state inoltre effettuate reazioni di PCR su singole colonie di E. Coli (colony PCR) prelevate direttamente dalla piastra di coltura e inserite nella soluzione di PCR contenuta nel microreattore. Per tutti questi campioni biologici, uno step di denaturazione di 10 min a 95?C, seguito dai classici 30-35 cicli di PCR, permette di evitare completamente lo step di estrazione e purificazione del DNA.

Sono stati effettuati a titolo di dimostratore, reazioni di amplificazione di frammenti di 303 bp di DNA partendo direttamente da cellule o tessuti. In particolare si ? amplificata una regione del gene Apo-E di 303 bp partendo da cellule umane in coltura, da bulbi piliferi, striscio gengivale e sangue (fig. 9a). N? il PDMS, n? il microreattore influenzano il buon esito di reazioni di PCR di siffatta complessit? biologica che generalmente, gi? in condizioni standard nei tubi da PCR, subiscono fenomeni di inibizione da parte di sostanze contenute nei campioni biologici non purificati. I risultati (fig. 9a) sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio (1%) [M = Marker; 1 = Controllo positivo (gDNA umano estratto); 2 = cellule umane in coltura (linfociti); 3 = sangue (1 mL); 4 = biopsia gengivale; 5 = bulbo pilifero] che indica che il microreattore in PDMS rende possibile l'amplificazione del DNA target desiderato senza fenomeni di inibizione della reazione. La reazione ? selettiva ed efficiente e uguale al controllo che consiste nella stessa procedura di PCR ma su DNA genomico estratto e purificato.

Sono state inoltre effettuate reazioni di PCR su singole colonie di E. Coli prelevate direttamente dalla piastra di coltura e inserite nella soluzione di PCR contenuta nel microreattore (fig. 9b). Si ? proceduto all'amplificazione del cDNA del gene ?2-m precedentemente inserita in plasmide e clonata in E. Coli, la dimensione del frammento amplificato ? di 300 bp. [M = Marker; 1 = colony PCR in vials; 2 = Colony PCR in microreattore di PDMS].

Il Lab-on-Chip si presenta a tutti gli effetti come uno strumento ideale per effettuare delle analisi al punto di cura. Si ricorda che questo sistema ha applicabilit? molto ampia e pu? essere usato anche per applicazioni in proteomica o in cellomica; ad esempio, il microreattore di PDMS pu? infatti essere usato per effettuare saggi ELISA, test per microcolture cellulari e per sintesi proteica in vitro (PTT: Protein Truncation Test).

Le applicazioni possono essere in numerosi campi: dalla diagnostica molecolare su virus, batteri patogeni, malattie genetiche, medicina forense, bioterrorismo, monitoraggio ambientale, ricerca di contaminanti nel settore agroalimentare. La PCR diretta su microrganismi presenta applicazioni di tipo industriale permettendo di effettuare screening diretto di microrganismi al fine di selezionare quelli a maggiore attivit? per la produzione di antibiotici.

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo integrato per reazioni di amplificazione di acidi nucleici e per analisi quantitative di acidi nucleici in tempo reale, comprendente un microreattore definente una o pi? camere di reazione per uno o, rispettivamente, pi? campioni, associato ad un substrato provvisto di mezzi riscaldanti atti alla realizzazione di rampe termiche, caratterizzato dal fatto che detto microreattore presenta pareti laterali ed una parete di fondo, a contatto con detti mezzi riscaldanti, integralmente formate da materiale plastico di polidimetilsilossano.
2. 2. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto microreattore presenta pareti laterali definenti detta una o pi? camere di reazione ottenute per formatura mediante stampo e controstampo ed una parete di fondo, formata da una lamina avente uno spessore variabile da 1 ?m a 500 ?m, tipicamente 100 ?m, ed inferiore allo spessore di dette pareti laterali, ottenuta mediante spin coating e saldata alle pareti laterali mediante conformal contact.
3. 3. Dispositivo secondo le rivendicazioni 1 o 2, caratterizzato dal fatto che comprende in associazione almeno una sorgente di luce, associata al microreattore per generare luce a lunghezza d'onda di eccitazione, almeno un sensore per ricevere lunghezze d'onda di rivelazione dal microreattore ed un dispositivo commutatore ottico accoppiato al sensore ed al microreattore per dirigere emissioni di fluorescenza al sensore.
4. 4. Dispositivo integrato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, caratterizzato dal fatto che detto substrato ? formato da Silicio, Ossido di silicio, vetro, quarzo, ITO, materiale plastico o metalli.
5. 5. Procedimento per la produzione di un microreattore per reazioni di amplificazioni di acidi nucleici, comprendente una o pi? camere di reazione, caratterizzato dal fatto che detto microreattore presenta pareti laterali ed una parete di fondo costituite integralmente da polidimetilsilossano ed ? ottenuto mediante formatura per replica-moulding con l'impiego di uno stampo ed un punzone definenti detta una o pi? camere di reazione.
6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, comprendente la formatura mediante replica-moulding delle pareti laterali di detto microreattore e la produzione della parete di fondo di detto microreattore mediante spin coating ed adesione per contatto di detta parete di fondo alla parete laterale.
7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 5 o 6, caratterizzato dal fatto che comprende inoltre l'operazione di trattamento superficiale del microreattore mediante plasma di ossigeno per incrementare l'idrofilia del materiale.
8. 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 7, caratterizzato dal fatto che comprende inoltre un trattamento di passivazione chimica superficiale mediante lavaggio con soluzione di BSA o con soluzione acida di Si-PEG.
9. 9. Microreattore avente un corpo integrale di polidimetilsilossano, ottenuto mediante un procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 8.
10. 10. Impiego di un microreattore ottenuto mediante un procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 8, per reazioni di amplificazione di acidi nucleici, particolarmente per campioni biologici reali non pre-trattati.