ITTO20090797A1 - Metodo e soluzione per la crioconservazione di embrioni umani - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

del brevetto per invenzione industriale dal titolo:

“METODO E SOLUZIONE PER LA CRIOCONSERVAZIONE DI EMBRIONI UMANI”

La presente invenzione è relativa a un metodo e a una soluzione per la crioconservazione di embrioni umani.

Stato dell’Arte

La fertilizzazione in vitro e il trasferimento di embrioni richiedono l’utilizzo di stimolazioni ormonali e di interventi chirurgici che possono modificare la recettività dell’utero della paziente. La crioconservazione degli embrioni consente di posticipare a un momento più ottimale il trasferimento degli stessi nell’utero, ad esempio a un ciclo successivo non stimolato.

Le procedure di stimolazione in alcuni casi non permettono di controllare la crescita follicolare e possono avere come risultato una produzione eccessiva di oociti e conseguentemente di embrioni.

Per questi motivi la crioconservazione degli embrioni rappresenta un’alternativa importante per il successo delle tecniche di FIVER (fecondazione in vitro ed embrioriposizione).

Le tecniche di crioconservazione degli embrioni sono state sviluppate a partire dagli anni ‘80 nel tentativo di limitare i danni cellulari causati dal raffreddamento e dalla conservazione a temperature molto basse. In particolare, la tecnica detta “vitrificazione”, permette di evitare la formazione di cristalli di ghiaccio nei blastomeri (le cellule che compongono gli embrioni) preservandoli così da un danno cellulare e consentendone la conservazione per lunghi periodi. La vitrificazione è resa possibile dall’utilizzo di una soluzione concentrata di agenti crioprotettivi che solidifica durante il raffreddamento rapido in modo da formare “vetro” solidificato mantenendo le normali distribuzioni molecolari e ioniche dello stato liquido in una forma estremamente viscosa e super-raffreddata. La sopravvivenza degli embrioni in uno stato vitrificato è stata ormai dimostrata sia in vitro che in vivo, anche se la percentuale di sopravvivenza degli embrioni è ancora tutt’altro che ottimale.

Gli embrioni possono essere crioconservati secondo questa tecnica a qualsiasi stadio di crescita a condizione che siano di buona qualità. Gli embrioni sono conservati in gruppi di uno o più a seconda del numero di embrioni che si prevede di trasferire in utero.

Gli embrioni sono solitamente trasferiti in soluzioni contenenti concentrazioni crescenti di agenti crioprotettivi per preservarli dal danno causato dalle variazioni osmotiche e di volume. Gli embrioni immersi nella soluzione di crioconservazione appropriata sono poi aspirati in una paillette di plastica e conservati in appositi contenitori contenenti azoto liquido, utilizzando solitamente una macchina automatizzata per il raffreddamento progressivo. Lo scongelamento avviene estraendo la paillette contenente gli embrioni dall’azoto liquido e portando gli stessi a temperatura ambiente, trasferendoli in soluzioni con concentrazioni decrescenti di agenti crioprotettivi e infine in terreno di coltura. Gli embrioni sono successivamente posizionati in un incubatore in attesa del trasferimento.

Le procedure di crioconservazione prevedono generalmente periodi di stabilizzazione dell’embrione nelle diverse soluzioni a concentrazioni variabili di agenti crioprotettivi.

Esistono diversi kit commerciali e protocolli per la crioconservazione degli embrioni ottenuti mediante fertilizzazione in vitro, ad esempio quelli distribuiti dalle ditte Cook IVF®, Medicult e Vitrolife.

Questi kit consistono in un sistema di congelamento mediante il trasferimento degli embrioni in 3 soluzioni successive che contengono concentrazioni crescenti di agenti crioprotettivi e in un sistema di scongelamento mediante il trasferimento degli embrioni in 4 soluzioni successive che contengono concentrazioni decrescenti di agenti crioprotettivi. Per ciascun trasferimento occorre attendere un periodo di stabilizzazione in cui gli embrioni si adattano alla nuova concentrazione della soluzione in cui sono immersi.

Gli embrioni sono comunque soggetti a un certo danno cellulare durante il processo di crioconservazione e le procedure utilizzate dai suddetti kit implicano in ogni caso un notevole stress per gli embrioni, sia a causa del continuo cambiamento dell’ambiente esterno in cui si trovano, sia a causa delle inevitabili manovre per trasferirli da una soluzione all’altra. Il catalogo della Cook® (A complete guide to Cook IVF® Media, June 2001) infatti riporta percentuali di sopravvivenza degli embrioni soltanto pari all’80% e percentuali di gravidanza per trasferimento di due embrioni soltanto pari al 40%.

Questi kit a 3 fasi per il congelamento e 4 fasi per lo scongelamento implicano inoltre una procedura piuttosto lunga e complicata per l’operatore e un probabile rischio di errore a causa dell’elevato numero di passaggi.

Si avverte quindi la necessità di sviluppare dei metodi e delle composizioni che migliorando la procedura di crioconservazione di embrioni risolvano i problemi sopra descritti.

Un primo scopo della presente invenzione è pertanto quello di limitare il danno cellulare procurato agli embrioni dalla complessità dei procedimenti noti.

Un secondo scopo della presente invenzione è quello di minimizzare la manipolazione da parte dell’operatore.

Un terzo scopo della presente invenzione è quello di aumentare la percentuale di sopravvivenza degli embrioni.

Un quarto scopo della presente invenzione è quello di ottenere una procedura più veloce e semplice.

Secondo la presente invenzione tali scopi vengono raggiunti mediante il metodo secondo la rivendicazione 1.

Secondo la presente invenzione viene inoltre fornita una soluzione secondo la rivendicazione 23.

Tale metodo consente di crioconservare embrioni umani mediante una procedura rapida, semplice ed efficace e di recuperarli con una percentuale di sopravvivenza molto elevata.

Definizioni

A meno che non sia specificato esplicitamente il contrario, i seguenti termini presentano il significato qui sotto indicato.

Per “raffreddare gradualmente” si intende raffreddare la soluzione di crioconservazione per fasi successive fino a raggiungere la temperatura dell’azoto liquido. Preferibilmente, il protocollo di raffreddamento seguito comprende una prima fase di raffreddamento a una prima velocità di raffreddamento da temperatura ambiente ad una temperatura compresa tra -2°C e -20°C, seguita da una prima fase di standby; successivamente la soluzione viene sottoposta a una fase di cristallizzazione seguita da almeno una seconda fase di raffreddamento, preferibilmente a una seconda velocità di raffreddamento inferiore alla prima velocità di raffreddamento, dalla temperatura raggiunta nella fase precedente alla temperatura di crioconservazione.

Breve descrizione delle figure

Per una migliore comprensione della presente invenzione, viene nel seguito descritta una forma di realizzazione preferita anche con riferimento alla figura allegata che è una rappresentazione schematica di una paillette contenente gli embrioni, pronta al congelamento.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Il metodo per crioconservare embrioni umani secondo la presente invenzione comprende una prima fase di stabilizzazione degli embrioni in una soluzione di crioconservazione.

Quindi gli embrioni vengono caricati mediante aspirazione di un’aliquota di soluzione di crioconservazione in una paillette.

Successivamente gli embrioni vengono raffreddati in una prima fase di raffreddamento ad una prima velocità di raffreddamento da temperatura ambiente ad una temperatura a) compresa tra -2°C e -20°C. Preferibilmente la temperatura a) è compresa tra -4°C e -8°C, ancor più preferibilmente è pari a -6°C.

Segue una prima fase di standby e successivamente una fase di cristallizzazione, che preferibilmente viene indotta toccando la parete della paillette con una pinza di metallo previo raffreddamento della stessa in azoto liquido.

Quindi la soluzione viene ulteriormente raffreddata in una seconda fase di raffreddamento ad una seconda velocità di raffreddamento inferiore alla prima velocità di raffreddamento dalla temperatura a) alla temperatura di b). La temperatura b) è preferibilmente compresa tra -40°C e -50°C, ancor più preferibilmente è pari a -45°C.

Successivamente la soluzione viene nuovamente raffreddata in una terza fase di raffreddamento ad una terza velocità di raffreddamento maggiore della seconda velocità di raffreddamento dalla temperatura b) alla temperatura c). La temperatura c) è preferibilmente compresa tra -140°C e la temperatura dell’azoto liquido, più preferibilmente è compresa tra -140°C e -160°C, ancor più preferibilmente è pari a -150°C.

Opzionalmente il metodo comprende una quarta fase di raffreddamento successivamente alla terza fase di raffreddamento per portare la soluzione alla temperatura dell’azoto liquido, temperatura alla quale possono essere conservati per anni.

La prima e la seconda velocità di raffreddamento sono preferibilmente comprese rispettivamente tra -1°C/min e -3°C/min e tra -0,25°C/min e –0,50°C/min. Preferibilmente la terza velocità di raffreddamento è compresa tra -5°C/min e -15°C/min.

Quando si desidera scongelare gli embrioni si può procedere ad una fase di stabilizzazione a una temperatura d).

Alternativamente si può procedere ad una prima fase di stabilizzazione a una temperatura d) seguita da una seconda fase di stabilizzazione a una temperatura e).

La temperatura d) è preferibilmente compresa nell’intervallo tra 0 e 6 °C e la temperatura e) tra 35°C e 39°C.

Il metodo può inoltre comprendere una fase di stabilizzare gli embrioni in terreno di coltura successiva alla fase di scongelamento.

L’embrione da crioconservare si trova preferibilmente a uno stadio di 4-8 cellule.

L’aliquota di soluzione di crioconservazione utilizzata per crioconservare gli embrioni è preferibilmente da 100 μl a 500 μl.

Le fasi di raffreddamento si svolgono preferibilmente in un dispositivo di raffreddamento automatizzato.

La soluzione di crioconservazione comprende preferibilmente saccarosio e/o PBS e/o albumina sierica umana e/o 1,2-propandiolo, ancor più preferibilmente comprende saccarosio 0.2 M, 1,2-propandiolo 1.5 M, albumina sierica umana al 20%, PBS.

Secondo la presente invenzione viene inoltre fornita una soluzione di crioconservazione comprendente saccarosio, 1,2-propandiolo, albumina sierica umana, PBS.

La presente invenzione sarà descritta nel seguito con riferimento a un esempio di realizzazione senza per questo uscire dall’ambito protettivo della presente invenzione.

Esempio di realizzazione

In due pozzetti di una piastra multi pozzetto Nunc da 4 pozzetti da 500 μl l’uno, si depositano 400 μL/pozzetto di soluzione di crioconservazione a temperatura ambiente. La soluzione di crioconservazione è composta da saccarosio 0,2 M, 1,2-propandiolo 1,5 M, albumina sierica umana (HSA) 20% in PBS.

Si posiziona la piastra Nunc sotto il microscopio e si affianca a una piastra Petri contenente gli embrioni da congelare. Gli embrioni possono essere a uno stadio di circa 4-8 cellule.

Gli embrioni vengono prelevati con una pipetta munita di puntale sterile dal terreno di coltura della Petri e adagiati sul fondo del primo pozzetto della piastra Nunc contenente la soluzione di crioconservazione.

Dopo cinque minuti di stabilizzazione gli embrioni vengono posizionati al centro di una paillette sterile, mediante aspirazione di una piccola aliquota (150 μl circa) di terreno prelevata dal secondo pozzetto della piastra Nunc.

Nel frattempo si porta la macchina per congelare (Cryologic Freeze control system CL 5500) a temperatura ambiente e si satura con azoto liquido.

La paillette viene poi chiusa all’estremità opposta all’aspirazione con un tappo o jonc colorato etichettato con i dati della paziente.

A questo punto la paillette può essere posizionata nella macchina per congelare e si può dare lo start per il congelamento lento o slow cooling.

Il protocollo della macchina per lo slow cooling prevede una prima fase di discesa da RT a -6°C a -2°C/min; uno standby a -6°C della durata di circa 10 min, durante il quale si procede con il seeding, ovvero l’induzione della cristallizzazione della paillette (che avviene manualmente toccando la paillette con una pinza di metallo tenuta immersa in azoto liquido); quindi una discesa da -6°C a -45°C di 0.3°C/min; infine una discesa “free fall” (discesa della temperatura di -10°C/min) da -45°C a circa -150°C.

Procedura di scongelamento

Si preleva la paillette dal contenitore di azoto liquido. Si stabilizza per due minuti nella parte bassa del frigorifero (4°C). Si stabilizza per un minuto a bagnomaria a 37°C. Si toglie il jonc e si connette la paillette alla pipetta aspirante. Si taglia con una forbice sterile l’estremità opposta. Si scarica il contenuto della paillette in una piastra Petri con terreno di coltura stabilizzato precedentemente in incubatore a 37°C e 5% di CO2. È stato utilizzato il terreno distribuito commercialmente da Cook® (Sidney IVF cleavage medium) ma può essere utilizzato qualsiasi terreno di coltura noto nella tecnica. Successivamente viene valutata la presenza degli embrioni. Si riposiziona la piastra Petri contenente gli embrioni nell’incubatore. Dopo 30 minuti si spostano gli embrioni in una seconda piastra Petri con terreno di coltura e si lasciano in incubatore fino al momento del trasferimento.

Risultati

Mediante questa procedura sono stati ottenuti i risultati schematizzati nella tabella 1 che segue:

Anno N. di embrioni N. di embrioni Percentuale di scongelati scongelati sopravvivenza integri degli embrioni 1 27 23 85,18%

2 86 79 91,86%

3 46 42 97.90%

4 95 88 92.70%

5 106 103 97.16%

Come si può notare dalla tabella, il metodo secondo l'invenzione sorprendentemente permette di ottenere percentuali di sopravvivenza degli embrioni nettamente maggiori rispetto a quelle ottenibili con i metodi noti, ad esempio le percentuali di sopravvivenza riportate nel catalogo Cook raggiungono soltanto l'80%. È da notare che tali sorprendenti risultati vengono raggiunti con un metodo molto più veloce e semplice.

Claims (2)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per crioconservare embrioni umani comprendente le fasi di: stabilizzare gli embrioni in una singola soluzione di crioconservazione; raffreddare gradualmente alla temperatura dell’azoto liquido. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta fase di raffreddare gradualmente comprende: una prima fase di raffreddare ad una prima velocità di raffreddamento da temperatura ambiente ad una temperatura a) compresa tra -2°C e -20°C; una prima fase di standby; una fase di cristallizzare; almeno una seconda fase di raffreddare ad una seconda velocità di raffreddamento inferiore alla prima velocità di raffreddamento, dalla temperatura a) alla temperatura di crioconservazione. 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto di comprendere una terza fase di raffreddare da una temperatura a) a una temperatura b) successivamente alla seconda fase di raffreddare, la terza fase di raffreddare avendo una terza velocità di raffreddamento maggiore della seconda velocità di raffreddamento. 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto di comprendere una quarta fase di raffreddare da una temperatura b) a una temperatura c) successivamente alla terza fase di raffreddare, la quarta fase di raffreddare avendo una quarta velocità di raffreddamento. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che: detta temperatura a) è compresa tra -2°C e -20°C; detta temperatura b) è compresa tra -40°C e -50°C; detta temperatura c) è compresa tra -140°C e la temperatura dell’azoto liquido. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, caratterizzato dal fatto che: detta prima velocità di raffreddamento è compresa tra -1°C/min e -3°C/min e detta seconda velocità di raffreddamento è compresa tra -0,25°C/min e –0,50°C/min. 7. Metodo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che: detta terza velocità di raffreddamento è compresa tra -5°C/min e -15°C/min. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, caratterizzato dal fatto di comprendere dopo detta fase di stabilizzare una fase di: caricare gli embrioni mediante aspirazione di un’aliquota di soluzione di crioconservazione. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8, caratterizzato dal fatto di comprendere una fase di crioconservare alla temperatura dell’azoto liquido successiva alla fase di raffreddare gradualmente alla temperatura dell’azoto liquido. 10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9, caratterizzato dal fatto di comprendere una fase di scongelare successiva alla fase di crioconservare alla temperatura dell’azoto liquido. 11. Metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che la fase di scongelare comprende almeno una fase di stabilizzare a una temperatura d). 12. Metodo secondo una delle rivendicazioni 10 o 11, caratterizzato dal fatto che la fase di scongelare comprende una prima fase di stabilizzare a una temperatura d) e almeno una seconda fase di stabilizzare a una temperatura e). 13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 12, caratterizzato dal fatto che la temperatura d) è compresa nell’intervallo tra 0 e 6 °C e la temperatura e) è compresa nell’intervallo tra 35°C e 39°C. 14. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 13, comprendente inoltre una fase di trasferire gli embrioni in terreno di coltura, successiva alla fase di scongelare. 15. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 14, caratterizzato dal fatto che l’embrione da crioconservare è a uno stadio di 4-8 cellule. 16. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 15, caratterizzato dal fatto che l’aliquota di soluzione di crioconservazione utilizzata per crioconservare gli embrioni è da 100 μl a 500 μl. 17. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 16, caratterizzato dal fatto che le fasi di raffreddamento si svolgono in un dispositivo di raffreddamento automatizzato. 18. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 17, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di crioconservazione comprende saccarosio. 19. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di crioconservazione comprende PBS. 20. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 19, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di crioconservazione comprende albumina sierica umana. 21. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 20, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di crioconservazione comprende 1,2-propandiolo. 22. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 21, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di crioconservazione comprende saccarosio 0.
2. 2 M, 1,2-propandiolo 1.5 M, albumina sierica umana al 20%, PBS. 23. Soluzione di crioconservazione per un metodo per crioconservare embrioni umani, caratterizzata dal fatto di comprendere saccarosio, 1,2-propandiolo, albumina sierica umana, PBS.