ITTO20091020A1 - "cardiomyocytes anti-apoptotic molecules, products and compositions thereof" - Google Patents

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:

“ Molecole, prodotti e loro composizioni anti-apoptotiche per cardiomiociti”

TESTO DELLA DESCRIZIONE

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda l’uso di un anticorpo monoclonale, di suoi frammenti e/o di un anticorpo ingegnerizzato geneticamente, della sequenza nucleotidica che codifica detto anticorpo, suoi frammenti e/o dell’anticorpo ingegnerizzato geneticamente, prodotti e/o composizioni contenenti detto anticorpo, suoi frammenti e/o dell’anticorpo ingegnerizzato geneticamente nella prevenzione dell’apoptosi come di una strategia innovativa nel preservare la funzione cardiaca.

STATO DELL’ARTE

L’apoptosi è un meccanismo conservato per rimuovere le cellule, che ha un ruolo importante nell’omeostasi tessutale ed è perciò coinvolta in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Nel cuore, si osserva apoptosi fisiologica durante l’ontogenesi nel rimodellamento postnatale dei ventricoli. Nell’adulto, si osserva generalmente apoptosi in risposta a diversi tipi di stress cardiaco, tra cui danno per ischemia e riperfusione, insufficienza cardiaca, cardiomiopatia da diabete, aritmie cardiache, insufficienza cardiaca congestizia, miocarditi e cardiomiopatia indotta da antracicline. Lo stress ossidativo ha un ruolo cruciale nella patogenesi del danno causato da ischemia-riperfusione.

Contrastare l’apoptosi dei cardiomiociti può quindi essere vista come una strategia innovativa per preservare la funzione cardiaca.

Il recettore per il fattore di crescita epatocitario (Met/HGF-R) (HGF) è una tirosina chinasi transmembrana, codificata dal proto-oncogene Met, che media svariate risposte biologiche in seguito a stimolazione con il suo ligando. In particolare, la sua attivazione promuove motilità e proliferazione cellulare, morfogenesi e protezione da apoptosi, che possono essere presenti singolarmente o in combinazione a seconda del tipo cellulare e delle condizioni del microambiente. Mentre l’HGF è sintetizzato da cellule di origine mesenchimale, il recettore è espresso su tessuti diversi, quali quello epiteliale, endoteliale, emopoietico, muscolare e nervoso. Questa coppia ligandorecettore ha un ruolo durante l’embriogenesi e l’organogenesi, cosi come pure nell’omeostasi dei tessuti nell’adulto. In condizioni normali, la via di segnalazione dell’HGF è generalmente silente, ma può essere riattivata se un organo subisce un danno, promuovendo la sua protezione da apoptosi ed eventualmente riparazione della ferita e rigenerazione dell’organo. Le diverse risposte biologiche sono la conseguenza del legame dell’HGF al suo recettore, un evento che ne induce la dimerizzazione e l’attivazione (fosforilazione su residui di tirosina), che è poi seguito dall’attivazione di molteplici vie di segnalazione. Vengono generalmente attivate la via PI 3-chinasi-Akt e la via ras-MAPK Erk1/2, che sono coinvolte nell’effetto anti-apoptotico dell’HGF in diversi sistemi cellulari, tra cui i cardiomiociti.

Parecchie evidenze suggeriscono che l’HGF e il suo corrispondente recettore siano coinvolti nell’omeostasi del miocardio: i) mentre entrambi sono espressi transitoriamente e normalmente soltanto durante lo sviluppo del miocardio nell’embrione, essi vengono ri-espressi quando questo tessuto subisce un danno in seguito a infarto indotto sperimentalmente o in seguito a cardiomiopatie degenerative su basi genetiche; ii) i livelli plasmatici di HGF aumentano in pazienti infartuati e in roditori in cui si sia indotto infarto sperimentalmente; iii) HGF endogeno ed esogeno hanno attività cardioprotettiva in casi di infarto indotto sperimentalmente o in cardiomiopatie degenerative su base genetica. In tutti questi casi l’HGF endogeno ed esogeno mostrano attività anti-apoptotica e anti-fibrotica, portando a un miglioramento della funzione cardiaca; iv) anticorpi neutralizzanti anti-HGF diminuiscono l’attività cardioprotettiva dell’HGF endogeno; infine v) l’HGF può agire come fattore di differenziamento inducendo l’espressione di marcatori cardio-specifici in cellule staminali mesenchimali e come fattore di motilità per cellule progenitrici cardiomiocitiche. Da tutto questo risulta evidente che l’HGF e il suo recettore possono rappresentare il bersaglio di una strategia innovativa volta a preservare la funzione cardiaca, contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti.

Sfortunatamente l’uso dell’HGF nella sperimentazione in vitro e in vivo incontra parecchie limitazioni. Questo fattore di crescita è difficile da purificare nella sua forma eterodimerica biologicamente attiva ed è piuttosto instabile.

È ormai riconosciuto come i polifenoli, contenuti in abbondanza in cibi di origine vegetale, sono tra i maggiori principi attivi con proprietà anti-ossidanti, utili per contrastare i ROS (specie ossidanti reattive), che si generano nei tessuti dell’organismo, soprattutto in caso di danno. Parecchi di questi sono stati identificati e ora possono essere sintetizzati in modo relativamente semplice e a basso costo.

RIASSUNTO DELL’INVENZIONE

Si sente perciò la necessità di un anticorpo monoclonale, di suoi frammenti e/o di un anticorpo ingegnerizzato geneticamente, prodotti e/o composizioni contenenti il suddetto anticorpo monoclonale, suoi frammenti e/o un anticorpo ingegnerizzato geneticamente per preservare la funzione cardiaca contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti.

L’oggetto di questa descrizione fornisce tali soluzioni migliorate.

In base all’invenzione, si ottiene l’oggetto di cui sopra grazie alla materia richiamata specificamente nelle rivendicazioni che seguono, che si intendono costituire parte integrale di questa descrizione.

Una forma di realizzazione dell’invenzione fornisce l’uso di un anticorpo monoclonale diretto contro il dominio extracellulare del recettore per il fattore di crescita epatocitario (HGF-R) per contrastare l’apoptosi dei cardiomiociti, allo scopo di preservare la funzione cardiaca. In particolare la presente descrizione riguarda l’uso di i) l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, ii) un frammento dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 contenente i due siti di legame per l’antigene e/o iii) un anticorpo ingegnerizzato geneticamente comprendente le regioni determinanti complementari (CDR) dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 per preservare la funzione cardiaca contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti, dove l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 è prodotto della linea cellulare di ibridoma ICLC PD 09004.

Una ulteriore forma di realizzazione dell’invenzione fornisce l’uso di un anticorpo monoclonale diretto contro il dominio extracellulare del recettore per il fattore di crescita epatocitario (HGF-R) in associazione con composti polifenolici, preferibilmente clovamide e/o suoi derivati, per contrastare l’apoptosi dei cardiomiociti, allo scopo di preservare la funzione cardiaca.

Più specificamente, la presente descrizione riguarda l’uso di i) l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, ii) un frammento dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 contenente i due siti di legame per l’antigene e/o iii) un anticorpo ingegnerizzato geneticamente comprendente le regioni determinanti complementari (CDR) dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 e di almeno un composto polifenolico, preferibilmente clovamide e/o suoi derivati, come preparazione combinata per l’uso simultaneo, separato o sequenziale per preservare la funzione cardiaca contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti, dove l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 è prodotto della linea cellulare di ibridoma ICLC PD 09004.

La presente descrizione riguarda anche l’uso di i) l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, ii) un frammento dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 contenente i due siti di legame per l’antigene e/o iii) un anticorpo ingegnerizzato geneticamente comprendente le regioni determinanti complementari (CDR) dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 e di almeno un composto polifenolico, preferibilmente clovamide e/o suoi derivati, come medicamento per preservare la funzione cardiaca contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti, dove l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 è prodotto della linea cellulare di ibridoma ICLC PD 09004.

La presente descrizione riferisce che i) l’anticorpo monoclonale DO-24 protegge efficacemente linee cellulari di muscolo cardiaco dall’apoptosi, valutata in base a criteri morfologici (contrazione della cellula, frammentazione del DNA) e biochimici (positività all’Annnessina V, traslocazione di bax ai mitocondri, attivazione delle caspasi). ii) Similmente all’HGF, l’effetto protettivo anti-apoptotico del mAb DO-24 dipende dall’attivazione delle vie di trasduzione ras-MAPK Erk1/2 e PI 3 chinasi-Akt, poiché esso è abrogato dal trattamento con specifici inibitori farmacologici. iii) Il mAb DO-24 è perciò un efficace sostituto dell’HGF e presenta il vantaggio aggiuntivo di essere notevolmente più stabile dell’HGF. iv) La combinazione del mAb DO-24 con la clovamide e/o suoi derivati ha un effetto anti-apoptotico additivo/sinergico sui cardiomiociti. La combinazione dell’anticorpo monoclonale DO-24 con la clovamide e/o suoi derivati rappresenta quindi un valido sostituto del ligando naturale HGF.

BREVE DESCRIZIONE DELE FIGURE

Verrà ora descritta l’invenzione, solo mediante degli esempi, con riferimento alle figure dei disegni qui allegati:

- Figura 1: Stabilità in vitro del mAb DO-24 e dell’HGF. L’attività biologica del mAb DO-24 e dell’HGF presente in campioni preincubati su monostrati di cellule H9c2 per tempi diversi è stata misurata in un saggio quantitativo di scatter (dispersione) effettuato su piccole colonie di cellule MDCK. La concentrazione iniziale di attività scatter del mAb DO-24 e dell’HGF era di 10 Unità scatter/ml, corrispondenti rispettivamente a 12 nM HGF o 5 nM mAb DO-24, come determinato in precedenti esperimenti di titolazione. Si definisce 1 Unità scatter/ml l’inverso della massima diluizione in grado di indurre dispersione in più del 70% delle colonie di cellule epiteliali. (A) figure rappresentative di un saggio effettuato con surnatanti preincubati per 1 giorno o 5 giorni, così come pure con soluzioni preparate al momento contenenti la stessa quantità di mAb DO-24 e di HGF (controlli). (B) curva tempo-dipendente di un esperimento di titolazione rappresentativo effettuato con diluizioni seriali dei surnatanti preincubati su cellule H9c2. Si sono ottenuti dati simili quando i surnatanti sono stati incubati su monostrati di cellule MDCK o NIH-3T3. L’attività scatter dei campioni che contenevano HGF era mantenuta soltanto fino al giorno 1, mentre l’attività scatter dei campioni che contenevano il mAb DO-24 rimaneva invariata fino al giorno 5. L’esperimento è stato ripetuto 3 volte. Le coppie delle diverse condizioni sono state paragonate con il test t di Student (T di Student: * p < 0,005).

- Figura 2: Il mAb agonista DO-24 anti-Met/HGF-R attiva il Met/HGF-R e le vie di segnalazione a valle Akt e Erk1/2 in linee cellulari di cardiomioblasti. (A) Cellule H9c2 e HL-5 quiescenti sono state stimolate con 20 nM DO-24 o con 0,50 nM HGF (controllo) per 15 minuti. Il Met/HGF-R è stato immunoprecipitato con il mAb DO-24 da lisati cellulari ottenuti con detergente e fatti reagire con anticorpi anti-PY (P-Met-HGF-R) o anticorpi commerciali bone fide anti-Met/HGF-R (Met/HGF-R). (B) Lisati cellulari totali preparati dalle cellule stimolate come detto sopra sono stati fatti correre in SDS-PAGE e saggiati in Western blot con diversi anticorpi specifici per le proteine fosforilate o per le proteine indipendentemente dal loro stato di fosforilazione. Si riportano esperimenti rappresentativi dei tre effettuati.

- Figura 3: Il mAb DO-24 agonista anti-Met/HGF-R protegge da apoptosi indotta da stress ossidativo. (A, pannello a sinistra) Apoptosi indotta da stress ossidativo transiente in cellule H9c2 con diverse concentrazioni di H2O2. Le cellule sono state incubate per 15 minuti con H2O2e, dopo la sua rimozione, per altre 24 h in medium completo. La morte cellulare è stata monitorata dopo marcatura con Annessina V-fluoresceinata e Ioduro di Propidio (PI). (A, pannello a destra) Modificazioni morfologiche rappresentative delle cellule trattate. (B) Curva dose-risposta dell’attività anti-apoptotica di HGF e del mAb DO-24 sui cardiomioblasti H9c2. Le cellule sono state incubate con concentrazioni diverse di agonista dopo la rimozione di H2O2. (C, pannello a sinistra) Cellule H9c2 e HL-5 sono state incubate con 20 nM mAb DO-24, mAb BD-31 di controllo o 0,5 nM HGF dopo la rimozione di H2O2. Le cellule sono state poi marcate con Annessina V e PI 24 ore dopo, alla fine dell’esperimento. (C, pannello a destra) Citogramma rappresentativo di una delle tre analisi citofluorimetriche effettuate su cellule H9c2. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte in triplicato. Le analisi statistiche sono state fatte paragonando cellule trattate con l’agente protettivo (mAb DO-24 o HGF) rispetto a cellule non trattate (T di Student: * p < 0,05).

- Figura 4: Il mAb agonista DO-24 anti-Met/HGF-R inibisce la traslocazione di bax e l’attivazione della caspasi 9. (A) Cellule H9c2 sono state sottoposte a stress ossidativo transiente, e successiva incubazione in medium completo in presenza di 20 nM mAb DO-24 o 0,5 nM HGF. Dopo 3 h le cellule sono state colorate in rosso con MitoTracker per localizzare i mitocondri (sinistra) e, dopo fissazione con paraformaldeide e permeabilizzazione, sono state colorate in verde con anticorpi anti-bax di coniglio, seguiti da anticorpi di capra anti-Ig di coniglio marcati con FITC (centro). Le microfotografie sono state sovrapposte (destra). Dopo il trattamento con H2O2bax è traslocato ai mitocondri, ma il mAb DO-24 o l’HGF interferiscono con questa traslocazione. Le fotografie sono rappresentative dell’aspetto delle popolazioni cellulari in tre esperimenti indipendenti. (B) L’attivazione della caspasi è stata misurata 6 h dopo la rimozione di H2O2con un saggio fluorometrico. Il trattmento con il mAb DO-24 e l’HGF reverte l’attivazione della caspasi indotta dallo stress ossidativo. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte in triplicato. Coppie di condizioni sono state paragonate con il test del t di Student (T di Student p < 0,05).

- Figura 5 : Il mAb agonista DO-24 anti-Met/HGF-R protegge da apoptosi in modo dipendente dalle vie di ras/Erk1/2 e di PI3-Kinasi/Akt (saggio TUNEL).

(A) Cellule H9c2 sono state sottoposte a stress ossidativo transiente, e successive incubazione in medium completo in presenza of 20 nM mAb DO-24 o 0,5 nM HGF. Dopo 6 h le cellule sono state fissate con paraformaldeide, permeabilizzate e marcate con TUNEL e DAPI. (B) Le cellule H9c2 sono state pre-incubate per 30 min con Wortmannin (WM) o con PD98059 (PD), sia da soli che in combinazione, e successivamente trattate come in (A). Il trattamento con il mAb DO-24 e con HGF ha inibito la frammentazione del DNA indotta da H2O2. Questo effetto veniva revertito dagli inibitori farmacologici WM and PD, confermando il coinvolgimento delle vie ras/Erk1/2 and PI3-Kinase/Akt nell’effetto pro-sopravvivenza di DO-24. Il saggio è stato ripetuto tre volte in triplicato. Le analisi statistiche sono state fatte paragonando cellule trattate con l’agente protettivo (mAb DO-24 o HGF) rispetto a cellule in cui erano stati aggiunti gli inibitori (T di Student: * p < 0,05).

- Figura 6: Sequenza nucleotidica (a) e aminoacidica (b) della catena pesante di DO-24. Le regioni CDR sono sottolineate in entrambe le sequenze nucleotidica e aminoacidica.

- Figura 7: Sequenza nucleotidica (a) e aminoacidica (b) della catena leggera di DO-24. Le regioni CDR sono sottolineate in entrambe le sequenze nucleotidica e aminoacidica.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FORME DI REALIZZAZIONE PREFERITE

Nella descrizione seguente si danno numerosi specifici dettagli per fornire una comprensione approfondita delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere messe in pratica senza uno o più specifici dettagli, o con altri metodi, componenti, materiali, etc. In altri casi, non sono mostrate o descritte in dettaglio strutture, materiali o operazioni per evitare di oscurare certi aspetti delle forme di realizzazione.

Il riferimento mediante questa specificazione a “una forma di realizzazione” o “forma di realizzazione” significa che un particolare aspetto, struttura o caratteristica descritta in connessione con la forma di realizzazione è inclusa in almeno una forma di realizzazione. Così, la presenza delle frasi “in una forma di realizzazione” o “in una certa forma di realizzazione” in vari punti lungo questa specificazione non necessariamente si riferiscono tutte alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono essere combinate in ogni possibile opportuna maniera in una o più forme di realizzazione.

Le intestazioni fornite qui sono solo per comodità e non interpretano lo scopo o il significato delle forme di realizzazione.

L’apoptosi è una delle cause maggiori della perdita di cardiomiociti sia in malattie cardiache ischemiche che in quelle non-ischemiche. Infatti, ha un ruolo importante nell’infarto, specialmente nella fase di riperfusione che segue l’evento ischemico. L’apoptosi concorre anche ai meccanismi patogenetici delle cardiomiopatie ereditarie, miocarditi, rigetto di trapianto e insufficienza cardiaca. L’apoptosi può essere provocata da vari stimoli e fattori che la contrastano sono un campo di attiva ricerca. È stato dimostrato che l’HGF è uno dei fattori che ha attività anti-apoptotica e cardioprotettiva. L’asse HGF/Met/HGF-R è normalmente silente nel cuore dell’adulto, ma viene riattivato quando l’organo va incontro a danno e questo è considerato una risposta adattativa per preservare o mantenere l’omeostasi in vivo e questo è stato riportato anche per altri organi, tra cui fegato, rene, polmone, cute, intestino, sistema nervoso periferico e centrale. Nel caso di malattie cardiache l’HGF mostra attività ipertrofica e anti-apoptotica sui cardiomiociti, oltre ad essere un fattore anti-fibrotico e pro-angiogenico, come dimostrato in modelli animali di cardiomiopatia ischemica indotta sperimentalmente o in cardiomiopatia ereditaria. Un limite all’uso di HGF in vitro e in vivo è la sua breve emivita, che in vivo è misurabile in minuti

La presente descrizione dimostra che il mAb DO-24 prodotto dalla linea cellulare di ibridoma depositata da Advanced Biotechnology Center (ABC), Interlab Cell Line Collection (ICLC), S.S. Banca Cellule e Colture in GMP, Largo Rosanna Benzi 10, Genova, Italia con numero di deposito ICLC PD 09004 diretto contro l’ectodominio di Met/HGF-R protegge due differenti linee cellulari di cardiomioblasti di roditore da apoptosi indotta da perossido di idrogeno. Questo anticorpo agisce attivando il Met/HGF-R e interferendo con la via intrinseca dell’apoptosi, in maniera dipendente da MAPK Erk1/2 e Akt. Il mAb è significativamente più stabile dell’HGF.

. MAb agonisti diretti contro recettori della superficie cellulare possono essere considerati efficaci sostituti del ligando naturale e possono addirittura essere superiori sotto certi aspetti. In particolare qui, il presente inventore riporta che, oltre a mimare tutte le attività evocate dal ligando naturale HGF, il mAb DO-24 ha una stabilità significativamente maggiore, quando paragonato all’HGF. L’anticorpo ha mostrato attività anti-apoptotica su cellule esposte transientemente a stress ossidativo dovuto a perossido di idrogeno. Il mAb era in grado di interferire con la via apoptotica intrinsica, come dimostrato in diversi saggi effettuati per seguire alcuni degli eventi cruciali, cioè. acquisizione di positività all’Annessina V, traslocazione di bax ai mitocondri, attivazione di caspasi 9 e frammentazione del DNA. Il DO-24 mimava il ligando naturale anche dal punto di vista biochimico, poichè stimolava la fosforilazione e l’attivazione del Met/HGF-R, come pure di MAPK Erk1/2 e di Akt. L’effetto antiapoptotico dipendeva dall’attivazione di queste due vie, poichè la loro inibizione farmacologica aboliva l’effetto protettivo osservato. È stato dimostrato che entrambe le vie sono coinvolte nella segnalazione anti-apoptotica da parte dell’HGF in cardiomioblasti come anche in altri tipi cellulari. È notevole che nei cardiomioblasti queste stesse vie siano attivate in risposta al trattamento con altri fattori che mostrano attività anti-apoptotica. É notevole che sia stato recentemente riportato che la via PI3K/Akt eserciti la sua attività anti-apoptotica fosforilando bax, che, in seguito a questa modificazione, viene inibita nella sua traslocazione ai mitocondri.

Tra le attività agoniste esercitate dal mAb DO-24, il suo effetto pro-angiogenico in vivo descritto precedentemente è degno di nota (1). Infatti, l’effetto cardioprotettivo dell’HGF è attribuito alla sua potente azione angiogenica in vivo, oltre che alla sua azione diretta sui cardiomiociti. In linea con il ruolo dell’HGF e del suo recettore nell’omeostasi tissutale dell’ossigeno è stato dimostrato che l’ipossia induce la trascrizione del Met/HGF-R, che poi amplifica la segnalazione da parte dell’HGF. Questo può contribuire alla ripresa dell’espressione dell’HGF e del suo recettore nel cuore dopo danno ischemico.

Le risposte biochimiche e biologiche evocate dal mAb DO-24 sono specificamente mediate dal Met/HGF-R. La specificità di questo mAb è perfettamente in linea con quella osservata per il ligando naturale. Tuttavia, sono necessarie dosi significativamente più alte di mAb per indurre sia le risposte biochimiche che quelle biologiche. Questo può essere spiegato dall’altissima affinità dell’HGF per il suo recettore, che è inferiore a nM e dal fatto che questo anticorpo è stato prodotto contro il recettore umano. Il mAb DO-24 lega un epitopo conformazionale non-lineare localizzato nel dominio extracellulare della catena β di Met/HGF-R (1), che è diverso dal sito di legame dell’HGF. È interessante notare che esperimenti di competizione hanno dimostrato che un’altra molecola, l’Internalina B della Listeria monocytogenes, che attiva entrambe le risposte cellulari biologiche e biochimiche, lega l’epitopo identificato dal mAb DO-24 (2). Mentre sia l’HGF che l’Internalina B necessitano di almeno due siti separate di contatto con il recettore per promuovere gli effetti biologici, il mAb DO-24 può attivare tutte le risposte mediate dal Met/HGF-R interagendo con un solo sito di legame sul recettore. Si può spiegare questo fatto prendendo in considerazione il meccanismo di attivazione di Met/HGF-R, che, come la maggior parte dei recettori tirosina-chinasici, è attivato da dimerizzazione indotta dall’agonista, la quale è facilmente evocata da anticorpi bivalenti. In effetti, solo le forme bivalenti, ma non il Fab monovalente del mAb DO-24, sono in grado di attivare il recettore (1). Tuttavia, la semplice dimerizzazione del recettore tirosina-chinasico non è sempre sufficiente, poichè in generale soltanto pochi tra i numerosi anticorpi che legano il dominio extracellulare dei recettori sono in grado di attivarli completamente; questo suggerisce che ci siano altri requisiti legati al particolare epitopo riconosciuto.

Rispetto al ligando naturale HGF, il mAb DO-24 qui descritto presenta il grande vantaggio di essere significativamente più stabile. In effetti, quando valutata in un sensibile saggio scatter quantitativo, l’attività biologica del mAb DO-24 persisteva invariata dopo cinque giorni in cultura cellulare a 37°C, mentre quella dell’HGF era rilevabile soltanto fino al giorno uno, e scompariva dopo tre giorni. Inoltre, l’HGF è una molecola dimerica, secreta come precursore monomerico, che deve andare incontro a taglio proteolitico per acquisire attività biologica. Questo complica il procedimento della sua preparazione farmacologica come proteina ricombinante, and fa sì che il successo di una terapia genica dipenda dall’attività di proteasi endogene. Una volta attivata, come già discusso, la molecola è altamente instabile. Oltre a legare il suo recettore ad alta affinità sulla superficie della cellula, l’HGF lega con minore affinità l’eparan solfato della matrice extracellulare, il che può causare la sua ritenzione nel sito dell’inoculo. Al contrario, i mAb sono molecole molto stabili, che possono essere facilmente prodotte nella loro forma attiva in grandi quantità ed essere facilmente purificate. Inoltre, essi legano un unico epitopo, che, nel caso del mAb DO-24, è diverso dal sito di legame dell’HGF e perciò anche dai componenti della matrice extracellulare (1). Infine, i mAb convenzionali possono essere ingegnerizzati geneticamente (ad esempio, per la produzione di anticorpi chimerici o umanizzati) aprendo la possibilità di applicazioni terapeutiche.

É stato recentemente dimostrato che i composti polifenolici, contenuti in abbondanza in cibi di origine vegetale e in particolare nel cacao (Theobroma cacao L.), esercitano effetti benefici sul cuore e sul sistema cardiovascolare in generale, probabilmente grazie alla loro attività anti-ossidante. L’attività biologica di queste molecole dipende largamente dalla loro biodisponibilità, che sembra essere inversamente proporzionale al loro peso molecolare. La clovamide (N-caffeoyl-L-DOPA) appartiene a questo gruppo di sostanze, è una molecola relativamente piccola, dotata di alta attività specifica. La clovamide è il prototipo di una famiglia di molecole con struttura simile, quali N-caffeoil-Dopamine, Dideossyclovamide, N-caffeoiltiramina, acido rosmarinico. Apparentemente la loro attività anti-ossidante (eliminazione di radicali) aumenta con l’aumentare del numero dei gruppi idrossilici o le porzioni catecoliche e con la presenza di gruppi che donano idrogeno (-NH, SH)(3).

. Il meccanismo molecolare della loro azione è sotto attiva ricerca. Il generale effetto benefico a livello del sistema cardiovascolare è stato attribuito anche alla produzione di ossido nitrico.

La combinazione del mAb DO-24 con la clovamide e/o suoi derivati, nella forma di una composizione farmaceutica o di una preparazione combinata per l’uso simultaneo, separato o sequenziale, permette di ridurre la quantità dei reagenti necessari per proteggere i cardiomiociti dall’apoptosi indotta da stress ossidativo.

Il mAb DO-24 e i suoi frammenti sono preferibilmente utilizzati in composizioni farmaceutiche nella forma di proteina solubile, la cui somministrazione può essere effettuata usando metodi convenzionali di somministrazione di farmaci. La somministrazione di composizioni farmaceutiche comprendenti l’anticorpo DO-24 e/o suoi frammenti può essere effettuata con qualsiasi metodo noto a un tecnico esperto. Ad esempio, la composizione può essere somministrata in una soluzione fisiologica che viene inoculata o infusa nel paziente. La determinazione dell’appropriato dosaggio dipende da un numero di variabili specifiche per ogni caso, tra cui età, peso del paziente e richiede sperimentazione di routine all’interno dell’esperienza di un tecnico esperto.

Il mAb DO-24 conforme alla presente invenzione può essere prodotto con metodi convenzionali in animali o, preferibilmente, con tecniche di ingegneria genetica.

L’uso dell’anticorpo monoclonale DO-24 secondo le presente invenzione è inteso per includere anche l’uso di anticorpi ingegnerizzati e umanizzati. Anticorpi ingegnerizzati e umanizzati e metodi per la loro produzione sono noti nell’arte.

I composti polifenolici da usarsi nella preparazione combinata secondo la presente invenzione possono essere prodotti mediante sintesi chimica convenzionale.

MATERIALI E METODI

Materiali. Tutti i reagenti sono della Sigma-Aldrich (St Louis, MO), tranne quando esplicitato in modo diverso. L’HGF è comprato dalla Peprotech (Rocky Hill, NJ). Gli ibridomi che producono il mAb DO-24 diretto contro il dominio extracellulare del Met/HGF-R umano (1) e il mAb BD-31 (4) erano stati prodotti precedentemente da M. Prat nel suo laboratorio. Il mAb DO-24 è stato depositato da Advanced Biotechnology Center (ABC), Interlab Cell Line Collection (ICLC), S.S. Banca Cellule e Colture in GMP, Largo Rosanna Benzi 10, Genova, Italia con numero d’accesso ICLC PD 09004. Il mAb BD-31 è reso pubblicamente disponibile dal laboratorio di M. Prat, Università degli Studi del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”. Gli anticorpi sono purificati dal fluido ascitico mediante precipitazione in solfato d’ammonio e cromatografia d’affinità su Sepharosio 4B-proteina A. La clovamide è sintetizzata attraverso passaggi sequenziali descritti in dettaglio in (5). L’Annessina-V FITC è della ditta Alexis (ALEXIS Corporation, Lausen, CH). MitoTracker-CMXRos è della ditta Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Per la colorazione per il Tunel si usa il kit In Situ Cell Death Detection (Roche Diagnostics Corporation Indianapolis, IN). Si usano gli anticorpi contro i seguenti antigeni: fosfotirosina (clone 4G10; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), Met/HGF-R di topo, Erk 1/2(sc-8057, sc-154, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), P-Erk 1/2, Akt, P-Akt, b(#9106, #9272, #4051, Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA), Sepharosio-proteina A e Sepharosio-proteina G, anticorpi secondari, coniugati con perossidasi di rafano o marcati con fluoresceina, e membrane PVDF sono della ditta Amersham (Amersham Biosciences, Otelfingen, CH), il kit di chemiluminescenza rinforzata (ECL™) è della Pierce (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). L’attività della caspasi 9 è misurata mediante fluorimetria (MBL International, Woburn, MA).

Sequenze nucleotidiche e aminoacidiche di DO-24. La traduzione della sequenza nucleotidica della catena pesante di DO-24 corrispondente alla SEQ ID No.: 1 e alla figura 6a è riportata nella figure 6b e nella SEQ ID No:3.

Le sequenze nucleotidiche e aminoacidiche corrispondenti alle regioni CDR sono scritte in grassetto nelle Figure 6a e 6b; le loro sequenze aminoacidiche sono: CDR-H1: DYTIH (SEQ ID NO.:5); CDR-H2: VIWSGGSTNYNSALMS (SEQ ID NO.:6); CDR-H3: PYYRYDGPFAY (SEQ ID NO.:7).

La traduzione della sequenza nucleotidica della catena leggera di DO-24 corrispondente alla SEQ ID No.: 2 e alla figura 7a è riportata nella figure 7b e nella SEQ ID NO.:4.

Le sequenze nucleotidiche e aminoacidiche corrispondenti alle regioni CDR sono scritte in grassetto nelle Figure 7a e 7b; le loro sequenze aminoacidiche sono: CDR-L1: RASKSISKYLA (SEQ ID NO.:8); CDR-L2: SGSTLQS (SEQ ID NO.:9); CDR-L3: QHNEYPFT (SEQ ID NO.:10).

Sintesi e caratterizzazione della clovamide. Questa è descritta in (5). In atmosfera di azoto, il tionil cloruro (943 1L, 12.7 mmol) è stato aggiunto a MeOH raffreddato in un bagno ghiacciato (18 mL). Dopo 30 min, si è aggiunta L-3,4-diidrossifenilalanina (1 g, 5.1 mmol), e la miscela è stata mescolata a temperatura ambiente per tutta la notte. Dopo rimozione del solvente, il residuo è stato ricuperato in piridina asciutta (15 mL) e trattato sequenzialmente con acido caffeico (1.01 g, 6.1 mmol, 1.2 equiv.) and DCC (1.25 g, 6.1 mmol, 1.2 equiv). Dopo aver mescolato a temperatura ambiente per 72 h, la reazione è stata sottoposta a diluizione con 2N H2SO4ed estrazione con EtOAc. La rimozione del solvente ha dato origine a un residuo semisolido che è stato purificato per cromatografia di gravità su colonna di gel di silica usando un gradiente di etere di petrolio/EtOAc. Le frazioni eluite con etere di petrolio/EtOAc 2:8 (v/v) hanno dato l’estere metilico crudo del clovamide come polvere giallastra (1.32 g; resa: 70%). In atmosfera di azoto, un campione di questo estere crudo (300 mg, 0.8 mmol) è stato dissolto in tetraidrofurano/H2O 2:1 (v/v), e poi trattato con LiOH.H2O (84 mg, 2.0 mmol, 2.5 equiv.). La miscela è stata mescolata a 45 °C per 6 h, e poi acidificata con resina Dowex_ 50W<®>x 8, filtrata, ed evaporate, usando toluene per aumentare la rimozione di acqua. Il residuo è stato purificato su colonna di gel di silica usando un gradiente di etere di petrolio/EtOAc per rimuovere alcune impurità nonpolari, e poi usando EtOAc/MeOH 7:3 (v/v) per ottenere clovamide (resa: 38%). La clovamide purificata è stata poi caratterizzata mediante NMR, IR e analisi di massa.

<1>H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.36 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8’), 6.99 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2), 6.89 (1H, dd, J = 8.2, 1.9 Hz H-6), 6.75 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 6.68 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-2’), 6.66 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5’), 6.55 (1H, dd, J = 8.2 Hz J = 1.9 Hz, H-6’), 6.41 (1H, d, J = 15.7 Hz, H-7’), 4.68 (1H, m, H-8), 3.05 (1H, dd, J = 5.5 Hz, 8.5 H-7a), 2.89 (1H, dd, J = 8.5, 5.8 Hz, H-7b). IR (KBr) cm<-1>: mmax3282 (s), 1718 (s), 1652 (s), 1598 (s), 1522 (s), 1363 (m), 1282 (s), 1198 (s), 1115 (m), 975 (m). MS: m/z 358 [M _ H]-.

Colture cellulari. La linea cellulare di mioblasti ventricolari di embrione di ratto H9c2, le cellule di rene di cane Madine Darby (MDCK) e i fibroblasti NIH-3T3 (una linea controllata per non produrre HGF) sono stati ottenuti dall’American Type Culture Collection (Manassas, VA). Le cellule sono coltivate in medium Eagle modificato da Dulbecco contenente 1,500 mg/l NaHCO2, supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) inattivato al calore, 50 U/ml penicillina, e 50 μg/ml streptomicina. Cellule HL-5, un clone derivato dalle cellule HL-1 (6, 7) sono coltivate su piastre rivestite da fibronectina in medium Claycomb, 10% FBS ed antibiotici. Le cellule sono passate regolarmente e passate quando a circa il 90% di confluenza prima delle procedure sperimentali. Per gli esperimenti di immunofluorescenza, le cellule sono piastrate su vetrini coprioggetto in piastre da 24 pozzetti a una concentrazione di 6 x 10<4>per pozzetto un giorno prima dell’esperimento. Per gli esperimenti di immunoprecipitazione e western blot, le cellule sono piastrate su piastre petri con diametro di 10 cm.

Valutazione dell’attività biologica delle soluzioni contenenti HGF e mAb DO-24. In esperimenti preliminari l’attività scatter di soluzioni contenenti concentrazioni note di HGF e di mAb DO-24 è titolata in esperimenti di diluizioni seriali effettuati sulle cellule di riferimento MDCK, dopo incubazione per tutta la notte (1). Si definisce 1 Unità scatter/ml l’inverso della massima diluizione (minore concentrazione) di HGF o di mAb DO-24/ml che induce dispersione in più del 70% delle piccole colonie di cellule MDCK. Per valutare la stabilità, l’HGF e il mAb DO-24 sono incubati su monostrati di cellule che esprimono (H9c2, MDCK) o non esprimono (NIH-3T3) Met/HGF-R alla concentrazione di 10 Unità scatter/ml, che corrispondono rispettivamente a 1.2 nM HGF e a 5 nM mAb DO-24. Campioni dei surnatanti cellulari sono raccolti a tempi diversi (1h, 4h, 8h, 1g, 3g, 5g), centrifugati e congelati a -80°C. Essi sono poi titolati in un saggio scatter. L’effetto scatter è monitorato al microscopio ottico. Le cellule sono poi fissate in 2% paraformaldeide in PBS, risciacquate estensivamente, colorate con 0.1% cristal violetto e fotografate come descritto sopra. Il livello di significatività è p < 0,005.

Stimolazione delle cellule, immunoprecipitazione e analisi in western blot. Cellule quiescenti subconfluenti sono incubate per 12 min at 37°C in assenza o in presenza di 0,50 nM HGF, 20 nM mAb DO-24, clovamide, da soli o in combinazione come scritto nei singoli esperimenti. Sono fatti una serie di esperimenti di immunoprecipitazione per dimostrare la capacità del DO-24 di attivare, cioè di fosforilare il Met/HGF-R su residui di tirosina, similmente a quanto riportato per la stimolazione da HGF. Per questo tipo di esperimento, dopo stimolazione con HGF o con mAb DO-24, le cellule sono lavate due volte con PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) freddo e lisate con tampone DIM (50 mM PIPES pH 7.4, 300 mM saccarosio, 100 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 100 mM ZnCl2), contenente 1% Triton X-100, un cocktail di inibitori di proteasi e 1 mM orto-vanadato. I lisati cellulari sono centrifugati a 13,000 rpm at 4°C per 15 min e incubati 2 h con mAb anti-Met/HGF-R (DO-24) e Sepharosio-proteina G, come già descritto (9). Le proteine legate sono lavate più volte con tampone DIM freddo, eluite e denaturate scaldando per 5 min a 95°C in tampone Laemmli riducente; le proteine sono risolte in elettroforesi in gel di poliacrilamide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) in due gel identici. Le proteine sono poi trasferite su filtri di PVDF, che sono bloccati con metanolo per 5 min e poi sciacquate con acqua, e incubate con mAb contro fosfotirosina o con mAb commerciali (sc-8057, Santa Cruz) contro Met/HGF-R di topo diluiti in TBS (soluzione salina tamponata con Tris)-5% BSA, per 2 h at 22°C. Dopo lavaggi estensivi, gli immunocomplessi vengono rilevati con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano, seguiti da chemiluminescenza rinforzata. Similmente, dopo stimolazione con le diverse molecole, gli estratti cellulari totali (20 µg di proteine) sono separati in SDS-PAGE, trasferite su PVDF e saggiati con anticorpi contro Erk 1/2, P-Erk 1/2, Akt, P-Akt.

Induzione dell’apoptosi. Per indurre apoptosi, le cellule sono prima incubate in medium di coltura contenente H2O2per 15 min, poi il medium è sostituito e le cellule incubate per ulteriori crescenti periodi (8). HGF, mAb, clovamide da soli o in combinazione sono aggiunti con terreno fresco dopo la rimozione dell’H2O2. PD98059 (PD), l’inibitore di Erk1/2 e wortmannin (WM), l’inibitore di PI3-K sono aggiunti da soli o in combinazione 30 min prima e durante il trattamento transiente con H2O2e poi durante le successive 6 h di incubazione. Tutti gli esperimenti sono effettuati in triplicati e ripetuti almeno tre volte. I dati sono espressi come media ± SD. Le coppie delle diverse condizioni sono state paragonate con il test t di Student. Il livello di significatività è p < 0,05.

Annessina V. Per l’analisi citofluorometrica della morte cellulare, le cellule sono raccolte, lavate in PBS, e incubate per 15 min a temperatura ambiente con 2 μl Annessina V-FITC (100 nM), 5 μl ioduro di propidio (PI, 50 μg/ml), sciolti in 93 μl di tampone (10 mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2). Vengono analizzate almeno 10,000 cellule in un citofluorimetro a flusso FacScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) equipaggiato con laser ad argon a 488 nm. Tutti gli esperimenti sono effettuati in triplicati e ripetuti almeno tre volte. I dati sono espressi come media ± SD. Le coppie delle diverse condizioni sono paragonate con il test t di Student. Il livello di significatività è p < 0,05.

Colorazione dei mitocondri e immagini al microscopio confocale. I mitocondri sono identificati con colorazione con la sonda MitoTracker rossa (Invitrogen Corp.). Cellule H9c2 coltivate su vetrini coprioggetto sono fissate con 4% paraformaldeide, 2% saccarosio in PBS e poi permeabilizzate con 0,5% Triton X-100 in PBS (8). Dopo aver bloccato in 5% BSA, le cellule sono colorate con l’anticorpo anti-bax diluito (1:100) in PBS, 0,1% Triton-X100, 4% BSA per 1 h, seguito da anticorpo secondario marcato con FITC. I vetrini sono poi montati in mowiol (1% in PBS). Le immagini sono catturate con il microscopio confocale Leica DMIRE2 (Leica Microsystems AG, Wetzlad, Germania) equipaggiato con il Software v. 2.61 per il confocale della Leica. Per ogni condizione sperimentale sono preparati tre vetrini. Sono esaminati almeno quattro campi per ogni vetrino da due ricercatori indipendenti. Sono mostrate immagini rappresentative di campi selezionati. I dati sono riprodotti in almeno tre esperimenti indipendenti.

Colorazioni DAPI e TUNEL. Le cellule apoptotiche sono rivelate con il saggio Terminal deoxinucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) effettuato con il kit fluorescente “In situ Cell Death Detection”, seguendo le istruzione del produttore (9). I nuclei delle cellule sono marcati con il colorante fluorescente DAPI (4-6-diamidino 2-fenilindol-diidrocloruro, 50 μg/ml), che marca il DNA, in PBS, 0,1% Triton X-100, 4% FBS. Le cellule sono visualizzate con il microscopio a fluorescenza DMI 600B della Leica equipaggiato con una lampada a UV per il rilevamento del DAPI. Per ogni campione sono esaminati 20 campi consecutivi e in ogni caso non meno di 150 cellule in doppio-cieco, e al rapporto delle cellule positive per il TUNEL verso il loro numero totale (figure positive in DAPI) nei campioni non trattati viene dato il valore di 1, al quale vengono riferiti valori ottenuti nello stesso modo per i campioni trattati. Il saggio è ripetuto tre volte in triplicato. I dati sono espressi come media ± SD. Le coppie delle condizioni sono paragonate con il test t di Student. Il livello di significatività è p < 0,05.

Saggio dell’attività della caspasi. Dopo il trattamento transiente di 15 min con H2O2e il trattamento per altre 6 h con medium contenente o non contenente il mAb o l’HGF, the cellule H9c2 sono staccate via dalla piastra in PBS ghiacciato. Le cellule presenti in ognuna delle piastre da 6 cm sono poi lisate in 50 μl di tampone di lisi del kit ghiacciato per 10 min and poi rotte con 20 passaggi attraverso un ago da 26 “gauge”. Il lisato è centrifugato a 12,000 g per 10 min a 4°C. Per il saggio, 50 μl della preparazione citosolica (surnatante) sono fatti reagire in 50 μl del tampone del kit contenente 10 mM DTT aggiunto al momento con 5 μl del substrato fluorescente acetil-Leu-Glu-His-Asp)-7-amino-4-trifluorometilcumarina (LEHD-AFC 1 mM) in ogni pozzetto di una piastra scura a 96-pozzetti. La reazione è valutata dopo eccitazione a 400 nm ed emissione di fluorescenza a 525 nm in un lettore Fluoro-Count (Packard, Bioscience, ora PerkinElmer, Waltham, MA) a 0 min e ogni 30 min per 90 min. Dopo sottrazione dei bianchi i valori sono usati per calcolare il rapporto tra i campioni trattati con H2O2rispetto al controllo e i campioni trattati con agonisti di Met/HGF-R e H2O2rispetto al controllo e i valori sono normalizzati per la concentrazione proteica.

Statistica. Tutti gli esperimenti sono effettuati in triplicati, eccetto dove altrimenti detto, e riprodotti almeno tre volte. I dati sono espressi come media ± SD. Le coppie delle diverse condizioni sono paragonate con il test t di Student. Il livello di significatività è p < 0,05 o p < 0,005, come scritto nelle legende delle singole figure.

RISULTATI

Stabilità in vitro del mAb DO-24 e di HGF. Uno dei limiti maggiori all’uso dell’HGF in esperimenti in vitro e in vivo è la sua instabilità, una volta che è processato nella sua forma eterodimerica biologicamente attiva con taglio proteolitico (10). Gli autori della presente invenzione paragonano quindi l’attività biologica dell’HGF e del mAb DO-24 mantenuti in coltura tessutale su monostrati di cellule per diversi periodi di tempo, fino a 5 giorni. L’attività biologica è valutata come attività scatter, ossia dissociazione delle colonie epiteliali, sulle cellule MDCK, la linea cellulare standard usata per questo tipo di saggio (1, 11). Dopo aver quantificato l’attività scatter dell’HGF e del mAb DO-24, medium per colture tessutali contenente 10 Unità scatter/ml, corrispondenti rispettivamente a 1,2 nM HGF o 5 nM mAb DO-24, sono incubati su cellule che esprimono (MDCK e H9c2) o non esprimono (NIH-3T3) Met/HGF-R, poi raccolti a tempi diversi e saggiati per la loro attività scatter. Attività scatter è rilevabile in campioni contenenti HGF solo fino al giorno 1, ma non ai giorni 3 e 5, mentre attività scatter rimane presente agli stessi livelli iniziali nei campioni di DO-24 fino al giorno 5, l’ultimo giorno in cui sono raccolti i surnatanti, quando le cellule dei monostrati sono ancora vive (Fig. 1A, B). Non si osservano differenze tra i surnatanti raccolti dalle cellule che esprimono o meno Met/HGF-R. Tutte le diverse linee cellulari su cui vengono incubati il mAb DO-24 o l’HGF non rilasciano alcuna attività scatter (controllo in Fig.1A).

L’anticorpo monoclonale agonista DO-24 anti-Met/HGF-R attiva il Met/HGF-R e le sue vie di segnalazione a valle in cardiomiociti di ratto e di topo. Dopo aver dimostrato la superiorità del mAb DO-24 sull’HGF in termini di stabilità, si è fatta una prima serie di esperimenti per dimostrare che il mAb può agire da agonista anche sui cardiomiociti. Infatti era stato precedentemente dimostrato che il mAb DO-24 reagisce con il Met/HGF-R espresso su cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo di topo (12) ed è in grado di promuovere i vari effetti biologici evocati dal ligando naturale HGF su cellule umane e canine (13, 1). Qui gli inventori usano come cellule bersaglio i cardiomioblasti di ratto H9c2 o i cardiomiociti di topo HL-5, che rappresentano buoni modelli di cardiomioblasti per fare esperimenti in vitro. Cellule quiescenti sono incubate con il mAb o l’HGF, usato come controllo, per 12 minuti, poi sono lavate, lisate e dagli estratti cellulari vengono preparati immunoprecipitati con anticorpi anti-Met/HGF-R. Le proteine precipitate processate per western blot contengono una specie molecolare che viene decorata sia con anticorpi anti-fosfotirosina sia con anticorpi commerciali anti-Met/HGF-R (Fig. 2A). Anche i principali trasduttori Erk1/2 e Akt sono fosforilati in seguito alla stimolazione da parte di DO-24 o HGF (Fig.2B).

SI può concludere da questi dati che il mAb DO-24 reagisce con il Met/HGF-R eepresso dalle due linee cellulari di roditore derivate dal miocardio ed è in grado di fosforilare specificamente, cioè attivare, sia Met/HGF-R che le due principali via di segnalazione.

L’anticorpo monoclonale agonista DO-24 anti-Met/HGF-R protegge dalla via apoptotica intrinseca. L’apoptosi viene indotta seguendo il protocollo di Han e colleghi (8) con piccole modificazioni, in quanto rispecchia meglio la situazione che si incontra frequentemente di ischemia miocardia acuta/riperfusione dell’esposizione transiente all’agente/situazione dannosa. Esperimenti preliminari effettuati per determinare la concentrazioni di H2O2necessarie ad indurre apoptosi dimostrano che il trattamento per 15 min con 200 µM H2O2e l’incubazione per altre 24 h in medium completo inducono significativa apoptosi e minima necrosi, come visto in citofluorimetria di flusso marcando rispettivamente con Annessina V-fluoresceinata e Ioduro di Propidium (Figura 3A, panello a sinistra). L’esame della morfologia cellulare corrobora queste osservazioni, poichè in queste condizioni si osservano retrazione della cellula, formazione di “blebs” di membrana e alcuni corpi apoptotici, marcatori tipici di apoptosi, mentre a maggiori concentrazioni di H2O2(400µM) si osservano un marcato aumento delle figure necrotiche e, inoltre, rottura dell’integrità della cellula (Fig. 3A, panello a destra). Esperimenti paralleli compiuti sulle cellule HL-5 hanno dato risultati simili (dati non mostrati). Viene riportata una curva dose-risposta dell’attività dei due agonisti di Met/HGF-R sulle cellule H9c2. La massima attività anti-apoptotica del mAb DO-24 è a 20 nM, mentre la massima attività anti-apoptotica dell’HGF è a 0,5 nM (Fig 3B).

Sulla base di questi risultati, viene usata 200 µM H2O2per indurre apoptosi nelle due linee cellulari negli esperimenti successivi, in cui vengono aggiunti alle colture cellulari 20 nM mAb DO-24 o 0,5 nM HGF, dopo aver indotto stress ossidativo transiente. Entrambi i ligandi di Met/HGF-R prevengono efficacemente la morte cellulare. In particolare, il mAb DO-24 e l’HGF riducono l’apoptosi rispettivamente del 36.5% e del 33,5% nelle cellule HL-5 e del 44.2% e del 35% nelle cellule H9c2, quando paragonati ai controlli (Fig. 3C, panello a sinistra). Un mAb diretto contro una molecola non relata (BD-31, 4) non è in grado di proteggere le cellule dall’apoptosi indotta da H2O2. Inoltre, analisi al citofluorometro di flusso effettuate sulle cellule H9c2 indicano che circa il 40% delle cellule trattate con H2O2muore per apoptosi e che la maggior parte di questa popolazione va incontro a necrosi secondaria (doppia marcatura con Annessina V e Ioduro di Propidio). Il trattamento con o HGF o DO-24 riduce la percentuale di cellule apoptotiche e queste sono soprattutto nella fase precoce del processo apoptotico, essendo positive solo all’Annessina V (Fig.3C, right panel).

L’apoptosi procede attraverso tappe sequenziali successive e l’aumentata espressione di bax e/o la sua traslocazione ai mitocondri è uno dei marcatori precoci di questo fenomeno (14). Bax appartiene alla famiglia delle proteine bcl-2 e, quando in eccesso rispetto alle proteine bcl-2 anti-apoptotiche, trasloca dal citosol alla membrana mitocondriale, dove promuove la formazione di pori. Come conseguenza viene attivata la via apoptotica intrinsica, con il rilascio di fattori proapoptotici e l’attivazione delle caspasi effettrici finali (14). Viene quindi somministrato alle cellule il trattamento apoptotico standard e 3 h dopo si analizza la localizzazione cellulare di bax in immunofluorescenza. Mentre le cellule non trattate presentano una leggera marcatura citosolica per bax, parecchie delle cellule trattate presentano un profilo di marcatura per bax più forte e punteggiato, che colocalizza con i mitocondri, visualizzati con il tracciante Mitotracker (Fig 4A). L’incubazione con il mAb DO-24 o con HGF reverte significativamente questo effetto (Fig 4A). Inoltre, si misura l’attivazione di caspasi 9 6 h dopo la rimozione dell’H2O2. L’H2O2aumenta significativamente la forma attiva di questo enzima, mentre il mAb DO-24 e l’HGF revertono questo effetto (Fig. 4B). Nell’insieme, questi dati indicano che il mAb DO-24, come pure l’HGF, proteggono le cellule H9c2 dall’apoptosi indotta da H2O2inibendo la via apoptotica intrinseca, interferendo con la traslocazione di bax ai mitocondri e con l’attivazione della caspasi 9.

L’anticorpo monoclonale agonista DO-24 anti-Met/HGF-R protegge da apoptosi indotta da stress ossidativo attraverso l’attivazione delle vie di ras/Erk1/2 e di PI3-Kinase/Akt.

Le chinasi Erk1/2 e Akt sono trasduttori del segnale multifunzionali per la proliferazione e sopravvivenza cellulare in risposta alla stimolazione da parte di fattori di crescita (15, 16). Per dimostrare il ruolo di questi trasduttori nell’attività antiapoptotica di HGF e del mAb DO-24, le cellule vengono preincubate per 30 min con inibitori specifici dei trasduttori prima del breve trattamento con H2O2e la successiva incubazione di 6 h con o senza gli agenti protettivi dopo la rimozione dell’H2O2. L’apoptosi viene quindi rilevata con il saggio TUNEL (doppia colorazione TUNEL-DAPI), che rileva la frammentazione del DNA indotta dall’apoptosi. Il trattmento con H2O2induce la frammentazione del DNA, e l’incubazione con il mAb DO-24 o con HGF reverte significativamente questo effetto (Fig. 5A). Quando le cellule sono incubate con gli specifici inibitori di Erk1/2 PD98059 (PD) e di PI3-K/Akt wortmannin, (WM), da soli o in combinazione, 30 min prima del trattamento transiente con H2O2e poi durante le successive 6 h di incubazione, si rileva frammentazione del DNA, il che suggerisce che questi inibitori interferiscono fortemente con l’effetto protettivo esercitato dal mAb DO-24 o dall’HGF. In particolare, il trattamento con H2O2aumenta di circa 4 volte il numero delle cellule positive al TUNEL, se paragonate alle cellule di control non trattate. Il trattamento con HGF e con DO-24 riduce a 2,5 e 2,2 volte le cellule positive al TUNEL (Fig. 4B). La pre-incubazione con WM or PD interferisce significativamente con l’effetto protettivo dei ligandi di HGF-R, riducendolo a circa la metà. Questi dati indicano che l’effetto protettivo del mAb dipende dall’attivazione di MAPK Erk1/2 e di Akt.

Attività anti-apoptotica additiva/sinergica della clovamide

Una volta dimostrato che il mAb anti-Met/HGF-R è un valido sostituto del ligando naturale del recettore, con il vantaggio aggiuntivo di essere più stabile in colture tessutali, si mostrano ulteriori esperimenti di protezione, dove la clovamide scelta come un’altra molecola dotata di attività anti-apoptotica viene usata in combinazione con il mAb.

All’inizio, cellule H9c2, dopo trattamento transiente con perossido di idrogeno (15 min with 200 µM H2O2), sono incubate per 24 h in medium completo in presenza di concentrazioni diverse di clovamide, tra 100 e 0,1 µM, sciolta in DMSO, mentre nei campioni di controllo si aggiunge solo DMSO. L’apoptosi viene poi valutata in citofluorimetria dopo marcatura delle cellule con Annessina V e Ioduro di Propidio. Dosi intorno a 100-10 µM sono efficaci nel fornire protezione contro l’apoptosi in modo dose-dipendente.

Dopo questo, quantità subottimali dei due reagenti, cioè rispettivamente 5-10 nM mAb DO-24 e 5-10 µM clovamide vengono aggiunte alle cellule, trattate con lo stimolo pro-apoptotico, come descritto sopra. La combinazione delle due molecole protettive aggiunte in quantità subottimali aumenta significativamente la sopravvivenza cellulare, se paragonata ai controlli non trattati o quando aggiunte separatamente.

Il trattamento dei cardiomioblasti con clovamide riduce la produzione di ROS indotti dal perossido di idrogeno.

Cellule H9c2, dopo il trattamento transiente con perossido di idrogeno (15 min con 200 µM H2O2), sono incubate per 30 min in medium completo in presenza di concentrazioni diverse di clovamide, comprese tra 100 e 0.1 µM, sciolta in DMSO, mentre nei campioni di controllo si aggiunge solo DMSO. Il rilascio di ROS nei surnatanti di coltura è valutato dalla riduzione del citocromo C inibibile dalla superossido dismutasi (SOD) e viene espresso come nmol di citocromo C ridotto/5 x 10<5>cellule, usando il coefficiente di estinzione 21.1 mM (17).

Naturalmente, mentre il principio dell’invenzione rimane lo stesso, i dettagli della costruzione e le forme di realizzazione possono variare ampiamente rispetto a quanto è stato descritto ed illustrato solo mediante esempi, senza allontanarsi dallo scopo della presente invenzione come definito nelle rivendicazioni allegate.

REFERENZE

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ELENCO DELLE SEQUENZE

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<120> Molecole, prodotti e loro composizioni anti-apoptotiche per cardiomiociti

<130> BIT12741-CF

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 336

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> seq. nucleotidica della catena variabile pesante di DO-24 <400> 1

caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc tcacagagcc tgtccatcac ttgcgctgtc 60 tctgggtttt cattaaccga ctatactata cactggattc gccagcctcc aggaaagggt 120 ctggagtggc tgggagtaat atggtctggt ggaagcacaa attataattc ggctctcatg 180 tccagactga acatccacaa agacaactcc aagagccaag ttttcttaga aatgaacagt 240 ctgcaaactg atgacacagc catatactac tgtgccagcc cctactatag gtacgacggg 300 ccgtttgctt actggggcca agggaccacg ggatcc 336

<210> 2

<211> 324

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> seq. nucleotidica della catena variabile leggera di DO-24 <400> 2

agatctgtgc tgacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60 attaattgca gggcaagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtatca agagaaaccg 120 gggaaaacta acaagcttct tatctactct ggatccactt tgcaatctgg aattccatca 180 aggttcagtg gcagtgtatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct 240 gaagattttg ccatgtatta ctgtcaacag cataatgaat acccgttcac gttcggctcg 300 gggaccaagc tggaaatcaa aact 324

<210> 3

<211> 109

<212> PRT

<213> artificiale

<223> sequenza aminoacidica della catena VH di DO-24

<400> 3

Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr 1 5 10 15

Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Thr Ile His Trp Ile 20 25 30

Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser 35 40 45

Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Asn Ile 50 55 60

His Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Glu Met Asn Ser Leu 65 70 75 80 Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ser Pro Tyr Tyr Arg

85 90 95

Tyr Asp Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> sequenza aminoacidica della catena VL di DO-24

<400> 4

Arg Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Val Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> seq. aa del CDR-H1

<400> 5

Asp Tyr Thr Ile His

1 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> seq. aa del CDR-H2

<400> 6

Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 1 5 10 15

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> seq. aa del CDR-H3

<400> 7

Pro Tyr Tyr Arg Tyr Asp Gly Pro Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> seq. aa del CDR-L1

Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala 1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> seq. aa del CDR-L2 di DO-24

<400> 9

Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> seq. aa del CDR-L3 di DO-24

<400> 10

Gln His Asn Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso i) dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, ii) un frammento contenente i due siti di legame per l’antigene dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 e/o iii) un anticorpo ingegnerizzato geneticamente contenente le regioni determinanti complementari (CDR) dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, come specificato nelle SEQ ID No.: 5 a 10 per preservare la funzione cardiaca contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti, dove il suddetto anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 è prodotto dalla linea cellulare di ibridoma ICLC PD 09004.
2. 2. Uso secondo la rivendicazione 1, dove detto anticorpo, frammento e/o anticorpo ingegnerizzato geneticamente è in forma di proteina solubile.
3. 3. Uso secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, dove detto anticorpo, frammento e/o anticorpo ingegnerizzato geneticamente è per la somministrazione mediante inoculo o infusione.
4. 4. Uso di una sequenza nucleotidica codificante i) l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, ii) un frammento contenente i due siti di legame per l’antigene dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 e/o iii) un anticorpo ingegnerizzato geneticamente contenente le regioni determinanti complementari (CDR) dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, come specificato nelle SEQ ID No.: 5 a 10 per la preparazione di un medicamento per preservare la funzione cardiaca contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti, dove il suddetto anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 è prodotto dalla linea cellulare di ibridoma ICLC PD 09004.
5. 5. Uso secondo la rivendicazione 4, dove la sequenza nucleotidica comprende almeno: a) SEQ ID NO.:1 e SEQ ID NO.:2, o b) una sequenza nucleotidica corrispondente a SEQ ID NO.:1 e SEQ ID NO.:2, dove una o più sostituzioni silenti sono presenti.
6. 6. Uso di un vettore comprendente almeno una sequenza nucleotidica codificante i) l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, ii) un frammento contenente i due siti di legame per l’antigene dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 e/o iii) un anticorpo ingegnerizzato geneticamente contenente le regioni determinanti complementari (CDR) dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, come specificato nelle SEQ ID No.: 5 a 10 per la preparazione di un medicamento per preservare la funzione cardiaca contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti, dove il suddetto anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 è prodotto dalla linea cellulare di ibridoma ICLC PD 09004.
7. 7. Uso secondo la rivendicazione 6, dove detto vettore comprende una sequenza nucleotidica selezionata da: a) SEQ ID NO.:1 e SEQ ID NO.:2, o b) una sequenza nucleotidica corrispondente a SEQ ID NO.:1 e SEQ ID NO.:2, dove una o più sostituzioni silenti sono presenti.
8. 8. Uso secondo le rivendicazioni 6 o7, caratterizzate dal fatto che il suddetto vettore è in forma di particella.
9. 9. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, dove detta apoptosi dei cardiomiociti avviene per danno da ischemia-riperfusione, insufficienza cardiaca, cardiomiopatia da diabete, aritmia cardiaca, insufficienza cardiaca congestizia, miocardite, cardiomiopatia indotta da antracicline.
10. 10. Prodotto contenente i) l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, ii) un frammento contenente i due siti di legame per l’antigene dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 e/o iii) un anticorpo ingegnerizzato geneticamente contenente le regioni determinanti complementari (CDR) dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, come specificate nelle SEQ ID No.: 5 a 10 e almeno un composto polifenolico come una preparazione combinata per uso simultaneo, separato o sequenziale per preservare la funzione cardiaca contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti, dove il suddetto anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 è prodotto dalla linea cellulare di ibridoma ICLC PD 09004.
11. 11. Composizione comprendente i) l’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24, ii) un frammento contenente i due siti di legame per l’antigene dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 e/o iii) un anticorpo ingegnerizzato geneticamente contenente le regioni determinanti complementari (CDR) dell’anticorpo monoclonale anti-HGF-R DO-24 e almeno un composto polifenolico come medicamento per preservare la funzione cardiaca contrastando l’apoptosi dei cardiomiociti.
12. 12. Prodotto secondo la rivendicazione 10, composizione secondo la rivendicazione 11, dove detto anticorpo, detto frammento e/o detto anticorpo ingegnerizzato geneticamente è in forma di proteina solubile.
13. 13. Prodotto secondo la rivendicazione 10 o 12, composizione secondo la rivendicazione 11 o 12, dove detto composto polifenolico è selezionato tra: Clovamide (N-caffeoil-L-DOPA), N-caffeoil-Dopamine, Dideossiclovamide, N-caffeoil-tiramine, acido rosmarinico.
14. 14. Prodotto secondo una delle rivendicazioni 10, 12 o 13, composizione secondo una delle rivendicazioni 11, 12 o 13, dove detto prodotto è per la somministrazione mediante inoculo o infusione.
15. 15. Prodotto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 o da 12 a 14, composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11, o da 12 a 14, dove detta apoptosi dei cardiomiociti avviene per danno da ischemia-riperfusione, insufficienza cardiaca, cardiomiopatia da diabete, aritmia cardiaca, insufficienza cardiaca congestizia, miocardite, cardiomiopatia indotta da antracicline.