ITTO20100487A1 - Procedimento per la preparazione di tessuto biologico per protesi biologiche - Google Patents

Procedimento per la preparazione di tessuto biologico per protesi biologiche Download PDF

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Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
“Procedimento per la preparazione di tessuto biologico per protesi biologicheâ€
TESTO DELLA DESCRIZIONE
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente descrizione concerne un procedimento per la preparazione di un tessuto biologico destinato alla realizzazione di protesi biologiche, quali ad esempio protesi valvolari, preferibilmente protesi valvolari cardiache.
SFONDO TECNOLOGICO
Le protesi biologiche sono dispositivi medici la cui realizzazione si basa sull’impiego di tessuti animali di specie diverse, ad esempio, bovina, suina, ovina, o equina. Il tessuto biologico – in funzione dei diversi usi medici – può essere costituito da valvole cardiache, pericardio, tendini, legamenti, dura mater, pelle, vene, ecc.
I tessuti destinati alla realizzazione di protesi biologiche sono costituiti principalmente da collagene, una proteina la cui unità strutturale à ̈ rappresentata da tre catene polipeptidiche che si associano a formare una tripla elica. Le molecole di collagene si assemblano a formare microfibrille che a loro volta si assemblano a formare fibrille che, disposte in fasci ondulati o paralleli, danno origine alle vere e proprie fibre di collagene. Tali tessuti presentano una buona resistenza alla trazione, sono flessibili, ma sostanzialmente inestensibili.
Il tessuto destinato alla realizzazione di protesi biologiche viene preventivamente sottoposto a numerosi lavaggi per eliminare tracce di sangue e ad una accurata rimozione delle parti di grasso e delle parti legamentose. Cellule o residui di cellule dell’animale donatore possono tuttavia rimanere intrappolate nella struttura del tessuto stesso. In una situazione di questo genere à ̈, quindi, possibile che il sistema immunitario del ricevente dia origine ad un fenomeno di rigetto che può addirittura condurre alla distruzione del tessuto costituente la protesi biologica.
Ulteriore problema da affrontare nella realizzazione di protesi biologiche à ̈ la degradazione a cui può andare incontro il tessuto biologico costituito da collagene una volta impiantato nell’organismo ricevente.
I tessuti biologici vengono, pertanto, sottoposti ad un trattamento di fissazione che ha lo scopo di preservare il tessuto da tale fenomeno di degradazione e contribuire a limitare il fenomeno di rigetto sopra descritto.
Tra le sostanze utilizzate per fissare i tessuti biologici la più diffusa à ̈ la glutaraldeide. Questa molecola bifunzionale, recante due gruppi aldeidici, à ̈ in grado di legare stabilmente i gruppi amminici liberi degli amminoacidi che costituiscono le catene polipeptidiche del collagene sia all’interno di una molecola di collagene sia tra molecole di collagene adiacenti. In questo modo la glutaraldeide realizza strutture a ponte sia all’interno delle catene sia fra catene adiacenti dando origine ad un fenomeno di reticolazione del tessuto biologico. Tale reticolazione preserva il tessuto dalla degradazione da parte dell’ospite e conferisce buone proprietà meccaniche quale ad esempio una migliore resistenza alla trazione rispetto al tessuto non trattato.
La glutaraldeide à ̈ una sostanza ad elevato potere battericida e virucida; la fase di fissazione quindi oltre a originare la reticolazione del tessuto ne determina anche almeno una parziale sterilizzazione.
La glutaraldeide à ̈, inoltre, in grado di legarsi ai residui amminici liberi delle proteine di membrana delle componenti cellulari ancora presenti mascherandone il potenziale antigenico ed impedendo fenomeni di attivazione immunitaria e di rigetto da parte dell’ospite.
Nonostante l’uso ampiamente diffuso, la glutaraldeide presenta lo svantaggio di essere uno dei fattori che favoriscono il processo di calcificazione patologica dei tessuti impiantati. Il calcio, presente nei liquidi corporei dell’organismo ospite, si accumula sul tessuto protesico dando origine a un processo che può rappresentare, per esempio nel caso delle valvole cardiache biologiche, una delle principali cause di rottura della valvola. I depositi di calcio possono, infatti, determinare una ridotta flessibilità delle porzioni di tessuto biologico costituenti la valvola (ovvero i cosiddetti lembi o cuspidi valvolari) e portare a una lacerazione del tessuto stesso causando una parziale o totale perdita della funzionalità della valvola.
Il meccanismo responsabile della calcificazione non à ̈ ancora completamente chiarito ed à ̈ imputabile a numerosi fattori, ma à ̈ noto che, a seguito del processo di fissazione con glutaraldeide, gruppi aldeidici non coniugati al tessuto possono dare origine a siti di legame per il calcio.
Inoltre, i fosfolipidi che compongono le membrane cellulari delle cellule o dei residui di cellule dell’animale donatore rimaste intrappolate nella struttura del tessuto costituiscono anch’essi siti di legame ed accumulo di calcio.
Per limitare il processo di calcificazione dei tessuti destinati alla realizzazione di protesi biologiche à ̈ stato fatto ricorso a diversi trattamenti per neutralizzare i residui aldeidici rimasti liberi dopo la fase di fissazione e per rimuovere i fosfolipidi di membrana. Ad esempio, US-A-2006/0193885 descrive l’utilizzo di due soluzioni, la prima contenente alcoli inferiori per rimuovere i fosfolipidi di membrana e la seconda contenente arginina, istidina, lisina, o sali dell’acido aspartico o glutammico per neutralizzare i gruppi aldeidici presenti sul tessuto biologico dopo la fissazione. US-B-6 479 079 descrive un trattamento del tessuto biologico per la rimozione dei fosfolipidi di membrana con soluzioni comprendenti alcoli costituiti da un numero di atomi di carbonio variabile tra 4 e 36. US-A-5 873 812 descrive l’impiego di acidi ammino carbossilici, come ad esempio l’acido omocisteico, per neutralizzare i residui aldeidici rimasti liberi sul tessuto biologico dopo il procedimento di fissazione.
Tali procedimenti non sono, tuttavia, risolutivi poiché permangono sul tessuto biologico siti di legame per il calcio, in particolare, la neutralizzazione dei gruppi aldeidici liberi presenti a seguito del trattamento di fissazione con glutaraldeide à ̈ solamente parziale.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
Tenendo in considerazione queste premesse, à ̈ quindi sentita la necessità di soluzioni più efficaci che consentano di limitare la calcificazione del tessuto biologico dopo l’impianto nell’ospite.
In accordo con l’invenzione, il suddetto scopo à ̈ ottenuto grazie alla soluzione specificatamente richiamata nelle rivendicazioni allegate, che costituiscono parte integrale della presente descrizione.
Una forma di attuazione qui descritta concerne un procedimento per il trattamento di un tessuto biologico destinato alla realizzazione di protesi biologiche, che prevede le seguenti fasi:
i) fissazione del tessuto biologico mediante trattamento con una soluzione fissante, preferibilmente contenente glutaraldeide, e
ii) detossificazione del tessuto biologico fissato mediante trattamento con una soluzione detossificante, il procedimento presentando almeno una delle seguenti caratteristiche:
- Ã ̈ prevista una fase di eliminazione di fosfolipidi dal tessuto biologico mediante trattamento con una soluzione di eliminazione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo,
- detta fase di detossificazione à ̈ condotta mediante trattamento con una soluzione detossificante contenente taurina o acido omocisteico ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente, preferibilmente superiore a 30°C.
I risultati riportati nel seguito dimostrano che il procedimento per il trattamento di un tessuto biologico presenta evidenti vantaggi se comprende una fase di eliminazione di fosfolipidi di membrana mediante trattamento con una soluzione acquosa contenente 1,2-octandiolo ed etanolo.
Lo stesso procedimento per il trattamento di un tessuto biologico presenta ulteriori vantaggi qualora la fase di detossificazione venga condotta ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente.
I risultati migliori, ovvero la più efficace riduzione del numero di gruppi aldeidici liberi presenti sul tessuto fissato, sono ottenuti quando il procedimento prevede la conduzione sia della fase di eliminazione di fosfolipidi di membrana sia della fase di detossificazione ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente.
Attuando il procedimento qui descritto à ̈ possibile ottenere un tessuto biologico destinato alla realizzazione di protesi biologiche esposto in misura fortemente minore al processo di calcificazione quando impiantato in un organismo ospite rispetto al tessuto trattato con i procedimenti della tecnica nota sopra evidenziata.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L’invenzione verrà ora descritta in modo dettagliato, a titolo di esempio non limitativo, con riferimento alle figure allegate, in cui:
- Figura 1: Colorazione con fucsina di tessuti biologici detossificati secondo una forma di attuazione del procedimento qui descritto. Campione di controllo fissato e non detossificato (A); campione fissato e detossificato con una soluzione secondo la tecnica nota contenente acido omocisteico a temperatura ambiente (B); campione fissato e detossificato con una soluzione contenente taurina a temperatura ambiente (C); campione fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C (D); campione fissato e detossificato con una soluzione contenente taurina a 40°C (E).
- Figura 2: Colorazione con fucsina di tessuti biologici detossificati secondo una diversa forma di attuazione del procedimento qui descritto. Campione di controllo fissato e non detossificato (A); campione fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a temperatura ambiente (B); campione sottoposto al trattamento di eliminazione dei fosfolipidi, fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a temperatura ambiente (C); campione fissato e e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C (D); campione sottoposto al trattamento di eliminazione dei fosfolipidi, fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C (E)
- Figura 3: Istogramma relativo al contenuto di fosfolipidi in tessuti biologici trattati secondo una ulteriore forma di attuazione del procedimento qui descritto. Campione di controllo fissato e non detossificato (A); campione fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C (B); campione sottoposto al trattamento di eliminazione dei fosfolipidi, fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C (C).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DI ALCUNE FORME DI REALIZZAZIONE
L’invenzione verrà ora descritta in modo dettagliato, a titolo di esempio non limitativo, con riferimento alla realizzazione di protesi biologiche valvolari cardiache. È evidente che il procedimento qui descritto può essere utilizzato per la preparazione di qualsiasi altro tessuto biologico destinato alla realizzazione di altre protesi biologiche che impieghino ad esempio tendini, legamenti, dura mater, pelle, vene, ecc.
Nella seguente descrizione, sono presentati numerosi dettagli specifici per fornire una comprensione completa delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere attuate in pratica senza uno o più dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di oscurare certi aspetti delle forme di realizzazione.
In tutta la presente specificazione, il riferimento ad “una forma di realizzazione†o “forma di realizzazione†significa che una particolare configurazione, struttura, o caratteristica descritta in connessione con la forma di realizzazione à ̈ inclusa in almeno una forma di realizzazione. Quindi, la comparsa delle frasi “in una forma di realizzazione†o “in una certa forma di realizzazione†in vari siti nell’intera presente specificazione non fa necessariamente riferimento alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, le particolari configurazioni, strutture, o caratteristiche possono essere combinate in qualsiasi modo adatto in una o più forme di realizzazione.
Le intestazioni qui presentate servono semplicemente per convenienza e non interpretano lo scopo o il significato delle forme di realizzazione.
La presente descrizione concerne un procedimento di trattamento di un tessuto biologico che consta delle seguenti fasi:
i) fissazione del tessuto biologico mediante trattamento con una soluzione fissante contenente glutaraldeide, e
ii) detossificazione del tessuto biologico fissato mediante trattamento con una soluzione detossificante.
Tale procedimento à ̈ caratterizzato dal fatto che a) prevede una fase di eliminazione di fosfolipidi di membrana mediante trattamento con una soluzione di eliminazione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo e - in alternativa o in combinazione – b) che la fase di detossificazione sia condotta mediante trattamento con una soluzione detossificante contenente taurina o acido omocisteico ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente (20°C).
La fase di eliminazione dei fosfolipidi può essere effettuata sul tessuto biologico immediatamente prima la conduzione della fase di fissazione con glutaraldeide o quando la fissazione non sia comunque ancora completata.
In una diversa forma di attuazione, la fase di eliminazione dei fosfolipidi può essere condotta in due stadi distinti: un primo stadio essendo condotto prima della fissazione del tessuto e un secondo stadio essendo condotto simultaneamente alla fase di detossificazione, in cui la soluzione contenente l’agente detossificante (taurina o acido omocisteico) contiene anche 1,2-octandiolo ed etanolo.
La soluzione acquosa contenente 1,2-octandiolo ed etanolo à ̈, infatti, in grado di solubilizzare i fosfolipidi di cui sono composte le membrane delle cellule dell’animale donatore rimaste intrappolate nel tessuto (Pettenazzo et al., 2008, Octanediol treatment of glutaraldehyde fixed bovine pericardium: evidence of anticalcification efficacy in the subcutaneous rat model. Eur J Cardiothorac Surg., 34(2):418-422). Tale trattamento determina, quindi, la rimozione sia dei fosfolipidi, componenti integrali della membrana cellulare, sia dei detriti cellulari che si formano in seguito alla distruzione delle cellule dovuta alla solubilizzazione dei fosfolipidi stessi.
A seguito dell’eliminazione dei fosfolipidi di membrana dal tessuto si riduce il numero di siti disponibili per il legame con il calcio e quindi tale trattamento rappresenta un ulteriore efficace approccio per limitare la calcificazione del tessuto biologico dopo l’impianto nell’organismo ospite.
I presenti inventori hanno inoltre verificato che l’eliminazione dei fosfolipidi determina una migliore predisposizione del tessuto alla fissazione con glutaraldeide. Infatti, grazie all’eliminazione dei fosfolipidi costituenti principali delle membrane cellulari rimaste intrappolate nel tessuto, le fibre di collagene presentano una più omogenea distribuzione spaziale che si riflette in una migliore penetrazione della glutaraldeide e quindi in una più efficace ed omogenea reticolazione del tessuto.
È stato, inoltre, scoperto dai presenti inventori che l’eliminazione dei fosfolipidi permette una migliore penetrazione delle sostanze detossificanti (taurina o acido omocisteico) nel tessuto biologico fissato e conseguentemente una più efficace neutralizzazione dei gruppi aldeidici non coniugati presenti sul tessuto a seguito della fase di fissazione.
Inoltre, Ã ̈ stato verificato che la fase di detossificazione condotta ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente determina una maggiore efficacia nella neutralizzazione dei gruppi aldeidici rimasti liberi dopo la fissazione, riducendo, quindi, in modo altamente efficace il numero dei siti di legame e accumulo di calcio presenti sul tessuto biologico.
Nel seguito verrà descritto a titolo di esempio non limitativo una forma di attuazione del procedimento di trattamento di un tessuto biologico oggetto della presente descrizione.
I tessuti biologici destinati alla realizzazione di protesi biologiche valvolari cardiache, ovvero pericardio bovino, equino o eventualmente pericardio di altre specie animali o valvola porcina, sono raccolti da macelli autorizzati.
I tessuti vengono lavati ed inizialmente prefissati – mediante immersione - in una soluzione di glutaraldeide ad una concentrazione compresa tra 0,05% e 0,30%, preferibilmente pari a 0,20% v/v in tampone fosfato pH=7,4, per un intervallo di tempo variabile tra 3 e 13 ore a temperatura ambiente.
In una forma di attuazione preferita del procedimento qui descritto, dopo la fase di prefissazione i tessuti vengono immersi nella soluzione di trattamento per la eliminazione dei fosfolipidi contenente 1,2-octandiolo ed etanolo.
La soluzione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo presenta una concentrazione di 1,2-octandiolo compresa tra 1% e 25% v/v, preferibilmente tra 2% e 10%, più preferibilmente pari a 5% ed una concentrazione di etanolo compresa tra 25% e 49% v/v, preferibilmente tra 30% e 45%, più preferibilmente pari a 40%. 1,2-octandiolo ed etanolo sono diluiti in soluzione fisiologica oppure in una soluzione acquosa contenente un tampone di tipo fosfato, citrato, acetato, HEPES. Il pH della soluzione à ̈ compreso tra 4 e 9, preferibilmente tra 5 e 8, più preferibilmente pari a 7,2.
La fase di eliminazione dei fosfolipidi à ̈ condotta ad una temperatura compresa tra 15°C e 65°C, preferibilmente tra 30°C e 40°C, più preferibilmente pari a 37°C. Il periodo di trattamento del tessuto con la soluzione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo può variare tra 2 ore e sette giorni, preferibilmente à ̈ compreso tra 16 e 72 ore.
Al termine della fase di eliminazione dei fosfolipidi, i tessuti vengono lavati ripetutamente per eliminare sia i residui della soluzione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo sia i fosfolipidi solubilizzati ed i detriti cellulari formatisi.
Segue la fase di taglio e foggiatura del tessuto -secondo tecniche note nel settore - per la realizzazione, ad esempio, di valvole cardiache. Tale fase di lavorazione del tessuto à ̈ ininfluente ai fini della attuazione del procedimento oggetto della presente descrizione.
Successivamente, il tessuto biologico à ̈ sottoposto al procedimento di fissazione mediante immersione del tessuto in una soluzione contenente glutaraldeide in concentrazione compresa tra 0,10% e 2,00% v/v, preferibilmente tra 0,30% e 1,00%, più preferibilmente pari allo 0,50%.
La soluzione a base di glutaraldeide contiene vantaggiosamente un tampone di tipo fosfato, citrato, acetato, HEPES, borato, più preferibilmente di tipo fosfato. Il pH della soluzione a base di glutaraldeide à ̈ compreso tra 5 e 8, più preferibilmente pari a 7,4.
Il procedimento di fissazione à ̈ condotto ad una temperatura compresa tra 4°C e 30°C, più preferibilmente a temperatura ambiente, per un periodo di tempo che può variare tra 1 e 20 giorni, preferibilmente tra 3 e 13 giorni.
Dopo la fase di fissazione, il tessuto viene lavato al fine di rimuovere residui di glutaraldeide non coniugati al tessuto stesso.
Il tessuto viene, quindi, detossificato mediante immersione in una soluzione contenente taurina o acido omocisteico.
La soluzione detossificante contiene:
i) taurina in concentrazione tra 0,10% p/v fino a saturazione della soluzione, preferibilmente tra 0,20% e 1,00%, più preferibilmente pari allo 0,70%, o
ii) acido omocisteico in concentrazione tra 0,10% p/v fino a saturazione della soluzione, preferibilmente tra 0,5% e 5%, più preferibilmente pari a 1%.
La soluzione contenente le sostanze detossificanti viene preparata in un tampone di tipo fosfato, citrato, acetato, HEPES, borato, più preferibilmente di tipo fosfato. Il pH di tale soluzione à ̈ compreso tra 4 e 9, preferibilmente tra 5 e 8, più preferibilmente pari a 7.
La fase di detossificazione viene condotta ad una temperatura superiore a 30°C, preferibilmente compresa tra 35°C e 45°C, più preferibilmente pari a 40°C. Il periodo di trattamento del tessuto con la soluzione detossificante può variare tra 2 e 96 ore, preferibilmente tra 12 e 48 ore, più preferibilmente à ̈ pari a 24 ore.
Al termine della fase di detossificazione, il tessuto à ̈ sottoposto a lavaggio.
Il tessuto detossificato viene, infine, trasferito in una soluzione di conservazione priva di aldeidi in tampone fosfato pH=7 contenente conservanti, preferibilmente parabeni.
I risultati della presente descrizione mostrano che la fase di eliminazione dei fosfolipidi di membrana, oltre a ridurre il numero di siti di legame per il calcio, determina un considerevole potenziamento della fase di detossificazione, ovvero una più efficace neutralizzazione dei gruppi aldeidici non coniugati da parte delle sostanze detossificanti.
La rimozione dei fosfolipidi di membrana e conseguentemente delle cellule rimaste intrappolate nel tessuto favorisce, inoltre, una più omogenea reticolazione del collagene da parte della glutaraldeide, sia per una migliore penetrazione della glutaraldeide stessa nel tessuto sia per una migliore sistemazione spaziale delle fibre di collagene.
Questo risulta, al termine del processo, in un maggior successo delle reazioni di detossificazione. L’acido omocisteico o la taurina penetrano, infatti, nel tessuto più liberamente e sono in grado di detossificare il tessuto ad un grado più elevato.
Il pretrattamento con soluzione di etanolo e octandiolo costituisce non solo una rimozione di fosfolipidi dal tessuto, ma una sorta di preparazione del tessuto per una più efficace reticolazione e successiva detossificazione dello stesso, agendo in una sorta di sinergia con il detossificante.
Inoltre, il trattamento detossificante effettuato con taurina o acido omocisteico ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente (pari a circa 20°C) determina una maggiore efficacia del trattamento riducendo sostanzialmente il numero di gruppi aldeidici non coniugati presenti nel tessuto fissato rispetto ad un tessuto sottoposto allo stesso trattamento a temperatura ambiente.
Nel seguito verrà descritta in dettaglio una particolare forma di attuazione del procedimento qui descritto.
Materiali e Metodi
Raccolta e prefissazione del tessuto biologico
Il tessuto biologico, costituito da pezzi di pericardio bovino raccolti da macelli autorizzati, viene posto in una soluzione fisiologica mantenuta in ghiaccio e trasportato in laboratorio.
Le pezze di pericardio vengono selezionate in base al corretto spessore e all’assenza di difetti evidenti, come disomogeneità di spessore, presenza di vascolarizzazioni, tagli, abrasioni, ecc.
I tessuti vengono prefissati in una soluzione di glutaraldeide allo 0,20% v/v in tampone fosfato pH=7,4, per un tempo variabile tra 3 e 13 ore a temperatura ambiente.
Trattamento del tessuto per l’eliminazione dei fosfolipidi Dopo la prefissazione, i tessuti vengono immersi in una soluzione composta da 5% v/v di 1,2-octandiolo, 40% v/v di etanolo in tampone HEPES a pH=7,2. Il trattamento ha una durata di 16-72 ore a 37°C, in blanda agitazione. Si utilizzano circa 200 ml di soluzione di trattamento per ogni pezza di tessuto delle dimensioni di circa 10 x 5 cm.
Al termine del trattamento i tessuti vengono lavati per 96 ore in soluzione salina o tampone HEPES pH=7,2 o tampone fosfato pH=7,4. Il lavaggio viene condotto a temperatura ambiente, in vigorosa agitazione, sostituendo il tampone ogni 6-12 ore, utilizzando 200 ml di soluzione di lavaggio per ogni pezza di tessuto, per ogni sostituzione.
Segue la fase di taglio e foggiatura del tessuto -secondo tecniche note nel settore - per la realizzazione, ad esempio, di valvole cardiache.
Fissazione del tessuto
I tessuti vengono fissati per un periodo di tempo compreso tra 3 e 13 giorni a temperatura ambiente, in una soluzione di glutaraldeide allo 0,50% v/v in tampone fosfato pH=7,4.
Al termine della fissazione, i tessuti vengono sottoposti ad un lavaggio di 48 ore in tampone fosfato a pH=7-7,4 o in soluzione fisiologica sterile. Il lavaggio viene condotto a temperatura ambiente, in leggera agitazione, sostituendo il tampone ogni 12 ore circa, utilizzando 200 ml di soluzione di lavaggio per ogni tessuto, per ogni sostituzione.
Detossificazione del tessuto
Il tessuto biologico à ̈ quindi sottoposto a detossificazione mediante immersione in una soluzione acquosa contenente i) taurina in una concentrazione pari a circa 0,70% p/v in tampone fosfato a pH=7, o ii) acido omocisteico in concentrazione pari a 1,00% p/v in tampone fosfato a pH=7.
La fase di detossificazione viene condotta ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente (20°C), preferibilmente pari a 40°C per un periodo di tempo di 24 ore.
Vengono utilizzati circa 200 ml di soluzione detossificante per ogni campione.
Al termine della fase di detossificazione, il tessuto à ̈ sottoposto a lavaggio a temperatura ambiente in tampone fosfato a pH=7, per circa tre ore, sostituendo tre volte la soluzione di lavaggio ed utilizzando circa 300 ml di soluzione per ogni tessuto ad ogni cambio.
I tessuti vengono infine trasferiti in una soluzione tampone fosfato pH=7 contenente conservanti, preferibilmente parabeni.
Determinazione semiquantitativa dei gruppi aldeidici liberi La valutazione dei gruppi aldeidici liberi e quindi l’efficacia del trattamento qui descritto à ̈ stata effettuata su due gruppi di campioni, secondo quanto descritto nei punti a) e b) che seguono.
a) Al fine di dimostrare la maggiore efficacia del trattamento di detossificazione ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente, i presenti inventori hanno determinato semiquantitativamente il numero di gruppi aldeidici liberi in cinque campioni di tessuto biologico trattati come segue:
- un primo campione di controllo (figura 1A) costituito da tessuto biologico fissato con glutaraldeide ma non detossificato;
- un secondo campione (figura 1B) fissato con glutaraldeide e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a temperatura ambiente (20°C);
- un terzo campione (figura 1C) fissato con glutaraldeide e detossificato con una soluzione contenente taurina a temperatura ambiente (20°C);
- un quarto campione (figura 1D) fissato con glutaraldeide e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C;
- un quinto campione (figura 1E) fissato con glutaraldeide e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C.
b) Per dimostrare che l’effetto della detossificazione ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente viene potenziato dal precedente trattamento di eliminazione dei fosfolipidi di membrana, i presenti inventori hanno determinato semiquantitativamente il numero di gruppi aldeidici liberi in un altro gruppo di campioni di tessuto biologico trattati come segue:
- primo campione di controllo fissato e non detossificato (figura 2A);
- secondo campione fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a temperatura ambiente, 20°C (figura 2B);
- terzo campione sottoposto al trattamento di eliminazione dei fosfolipidi, fissato, e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a temperatura ambiente, 20°C (figura 2C).
- quarto campione fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C (figura 2D);
- quinto campione sottoposto al trattamento di eliminazione dei fosfolipidi, fissato, e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C (figura 2E)
Colorazione del tessuto con Fucsina
La colorazione del tessuto, per rivelare i gruppi aldeidici liberi, utilizza una soluzione acida di pararosa anilina (fucsina). La colorazione sfrutta la formazione di legami tra i gruppi NH2del colorante e i gruppi aldeidici liberi sul tessuto.
La soluzione di trattamento di partenza à ̈ incolore e in presenza di gruppi aldeidici liberi sul tessuto sviluppa un colore violetto. Si tratta di una valutazione semiquantitativa della disponibilità di gruppi aldeidici liberi, dopo i diversi trattamenti.
I campioni da colorare vengono tagliati per ottenere tessere di dimensioni pari a circa 1,5 x 1,5 cm e successivamente immersi nella soluzione colorante, circa 10 ml, ciascuna tessera in una provetta separata.
La soluzione colorante à ̈ pararosaanilina idrocloruro al 1,00%, sodio metabisolfito al 4,00% in acido cloridrico 0,25 M. I tessuti rimangono immersi nel colorante per 5 minuti a temperatura ambiente, in blanda agitazione.
Ciascuna tessera viene poi trasferita in una soluzione ottenuta miscelando 8 gr di Na2SO3e 30 ml di acido cloridrico al 37%, da portare ad un litro con acqua demineralizzata. Le tessere rimangono immerse per 10 minuti in questa soluzione di lavaggio, in leggera agitazione.
Poi si procede a 2 successivi lavaggi da 10 minuti, in leggera agitazione in soluzione di lavaggio di etanolo acido, composta da 700 ml di etanolo e 30 ml di acido cloridrico al 37%, da portare a un litro con acqua demineralizzata.
I lavaggi rimuovono il colorante legato, in maniera aspecifica, al tessuto. Si utilizzano circa 20 ml di soluzione di lavaggio ad ogni cambio.
Al termine le tessere sono trasferite in tampone fosfato pH=7 e fotografate, per documentarne la differente colorazione.
Spettroscopia in riflettanza
I campioni colorati vengono sottoposti a spettroscopia in riflettanza per valutare quantitativamente le differenti caratteristiche cromatiche della colorazione con fucsina.
La spettroscopia in riflettanza à ̈ una tecnica di indagine ottica basata sulla misura del fattore di riflettanza spettrale della superficie di un campione in funzione della lunghezza d’onda della radiazione incidente. Il parametro riflettanza à ̈ espresso come rapporto di intensità fra radiazione riflessa e radiazione incidente, in funzione dalla lunghezza d'onda.
Sono state effettuate misure di riflettanza alla lunghezza d’onda di 570 nm mediante uno spettrofotometro Perkin Elmer Lambda 35 con sfera integratrice.
In una scala di valori, un valore di riflettanza più basso indica una colorazione del campione più intensa e al contrario un valore di riflettanza maggiore indica una debole intensità di colorazione.
Determinazione del contenuto di fosfolipidi del tessuto Mediante l’utilizzo di una metodologia spettrofotometrica, i presenti inventori hanno quantificato la concentrazione di fosfolipidi nel tessuto biologico per dimostrare:
- l’efficacia del trattamento del tessuto con una soluzione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo e
- che le fasi di fissazione e detossificazione condotte successivamente alla fase di trattamento del tessuto con la soluzione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo non interferiscono sul contenuto di fosfolipidi del tessuto.
A tale scopo, l’analisi quantitativa à ̈ stata condotta su campioni trattati come segue:
- primo campione di controllo fissato e non detossificato (figura 3A);
- secondo campione fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C (figura 3B); - terzo campione sottoposto al trattamento di eliminazione dei fosfolipidi, fissato e detossificato con una soluzione contenente acido omocisteico a 40°C (figura 3C).
Per la determinazione spettrofotometrica del contenuto di fosfolipidi, da ciascun tessuto trattato si ricava una tessera del peso di 300 mg. Ciascuna tessera viene sottoposta a numerosi lavaggi in soluzione salina priva di ioni fosfato, per rimuovere tutto il tampone fosfato residuo. Le tessere vengono quindi prelevate dalla soluzione salina di lavaggio e tamponate per eliminare l’eccesso di soluzione salina. Le tessere vengono quindi pesate e poi triturate. Ciascuna tessera, così sminuzzata, viene estratta in una soluzione etanolo/etere etilico 3/1, a caldo. L’estratto viene successivamente portato a secco.
Gli estratti vengono sottoposti ad un trattamento di digestione acida effettuato aggiungendo a ciascun campione 650 ul di acido perclorico al 60% per 30 minuti a 160°C. Questo passaggio trasforma il fosforo presente in fosfato inorganico che verrà determinato spettrofotometricamente. Al termine dei 30 minuti i campioni vengono lasciati raffreddare e miscelati ad una soluzione costituita da 3,3 ml di acqua distillata, 500 ul di una soluzione contenente acido ascorbico al 10% in acqua distillata, 500 ul di una soluzione di molibdato d’ammonio all’1% in acqua distillata. I campioni vengono portati a 100°C per 5 minuti e centrifugati. Si esegue, poi, la lettura dell’assorbanza a 820 nm dei surnatanti. La concentrazione di fosforo viene ricavata da una retta di taratura costruita utilizzando come standard una soluzione a titolo noto di fosfato inorganico. Il fosforo determinato sugli estratti à ̈ proporzionale alla concentrazione di fosfolipidi del campione.
Determinazione della temperatura di contrazione
La temperatura di contrazione à ̈ un indice del livello di reticolazione del tessuto fissato e viene determinata su rondelline di pericardio di circa 5 mm di diametro, utilizzando un calorimetro a scansione differenziale (DSC) Q100 TA Instruments con i seguenti parametri:
- flusso di azoto di 50 ml/min,
- rampa di riscaldamento di 5°C/min,
- range di temperature tra 65°C e 95°C.
Risultati
Detossificazione
L’efficacia del procedimento qui descritto, e quindi l’avvenuta reazione tra i gruppi amminici della molecola detossificante e i gruppi aldeidici presenti sul tessuto fissato, viene dimostrata colorando con fucsina i gruppi aldeidici rimasti liberi; una colorazione più intensa indica numerosi gruppi aldeidici liberi e, al contrario, una colorazione più debole o assente indica pochi o assenti gruppi aldeidici liberi presenti sul tessuto detossificato.
Come mostrato dalla diversa intensità di colorazione dei tessuti mostrati in figura 1, aumentando le condizioni di temperatura aumenta l’efficacia del trattamento detossificante. Un campione detossificato a 40°C con taurina, campione E, presenta una colorazione molto debole rispetto ad un campione di controllo, campione A, e rispetto ad un campione detossificato con taurina a temperatura ambiente, campione C.
Allo stesso modo, il trattamento detossificante effettuato con acido omocisteico a 40°C determina una intensità di colorazione debole, campione D, rispetto al controllo, campione A, e rispetto al campione trattato con acido omocisteico a temperatura ambiente, campione B.
Questi risultati dimostrano quindi una maggiore efficacia del trattamento detossificante condotto ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente, preferibilmente superiore a 30°C sia utilizzando taurina, sia utilizzando acido omocisteico.
Queste osservazioni sono confermate dall’analisi di spettroscopia in riflettanza dei campioni. La riflettanza di ciascun campione dipende dall’intensità della colorazione e mediante un’analisi effettuata con uno spettrofotometro à ̈ possibile associare un valore percentuale di riflettenza a ciascun campione.
Un valore di riflettanza maggiore à ̈ associato a una debole intensità di colorazione e viceversa un valore di riflettanza minore à ̈ relativo ad una maggiore intensità di colorazione.
Come si può osservare dai risultati riportati in tabella 1, la riflettanza, analizzata alla lunghezze d’onda di 570 nm ed espressa in percentuale, presenta un valore pari a 5,8 per il campione non detossificato mostrato in figura 1A e valori maggiori, pari a 9 e 13 per i campioni detossificati rispettivamente con acido omocisteico e taurina a temperatura ambiente e mostrati in figura 1B e C. Valori decisamente più alti si osservano per i campioni detossificati con la soluzione contenente acido omocisteico o taurina a 40°C, campioni mostrato in figura 1D ed E.
Tabella 1.
Riflettanza % Campione<Colorazione>
osservataa 570 nm
A – fissato, non detossificato<Viola molto>
inteso5,8
B – fissato, acido omocisteico
temperatura ambiente<Violetto 9>C – fissato, taurina Violetto
temperatura ambiente pallido<13>D – fissato, acido omocisteico
40°CRosa scuro 15
E – fissato, taurina 40°C Rosa 19
Questi risultati confermano che il trattamento con taurina o acido omocisteico a 40°C ha una efficacia maggiore rispetto al rispettivo trattamento condotto a temperatura ambiente nella neutralizzazione dei gruppi aldeidici liberi presenti sul tessuto fissato.
E’ stato inoltre dimostrato che la fase di eliminazione dei fosfolipidi che precede la fase di fissazione e detossificazione del tessuto potenzia l’efficacia della taurina o dell’acido omocisteico nella neutralizzazione dei gruppi aldeidici rimasti liberi nel tessuto fissato quando la detossificazione viene condotta a temperatura ambiente. La figura 2 mostra che l’intensità di colorazione del campione detossificato con acido omocisteico a temperatura ambiente, campione C, dopo il trattamento con 1,2-octandiolo ed etanolo à ̈ decisamente inferiore all’intensità di colorazione del campione detossificato con acido omocisteico a temperatura ambiente, campione B, senza il preventivo trattamento con la soluzione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo per eliminare i fosfolipidi.
Risultati ancora migliori sono ottenuti quando la fase di eliminazione dei fosfolipidi precede la fase detossificazione condotta a 40°C. Il campione E, sottoposto al trattamento di estrazione dei fosfolipidi e detossificato con acido omocisteico a 40°C mostra un risultato migliore rispetto al campione D detossificato con acido omocisteico a 40°C ma non sottoposto al trattamento con 1,2-octandiolo ed etanolo.
L’intensità di colorazione di tali campioni à ̈ decisamente meno intensa dell’intensità di colorazione del campione di controllo non detossificato, campione A.
I risultati dell’analisi della spettroscopia in riflettanza per i campioni mostrati in figura 2 sono mostrati nella tabella 2.
Tabella 2
Riflettanza Campione<Colorazione>
osservata% a 570 nm A – fissato, non
detossificatoViola molto inteso 5,8
B – fissato, acido
omocisteico Violetto 9 temperatura ambiente
C – eliminazione
fosfolipidi, fissato, acido Violetto chiaro 14 omocisteico
temperatura ambiente
D – fissato, acido
omocisteico a 40°C<Rosa scuro 16>
E - eliminazione
fosfolipidi, fissato, acido Rosa
omocisteico a 40°C pallido/decolorato<22>
Risultati ancora migliori si ottengono quando la fase di detossificazione viene condotta con taurina, essendo quest’ultima più efficace dell’acido omocisteico nella neutralizzazione dei gruppi aldeidici liberi già a temperatura ambiente, anche senza fase di eliminazione dei fosfolipidi, come mostrato in figura 1.
Contenuto di fosfolipidi
L’istogramma di figura 3 mostra che il contenuto di fosfolipidi à ̈ significativamente minore nel campione di tessuto che à ̈ stato immerso in una soluzione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo, campione C, rispetto ad un campione di controllo non trattato con la stessa soluzione, campione A.
Inoltre, à ̈ possibile notare che il contenuto di fosfolipidi non à ̈ influenzato dalla sola fase di detossificazione con acido omocisteico a 40°C, campione B.
Temperature di contrazione
Per verificare che il trattamento di eliminazione dei fosfolipidi e il trattamento detossificante non alterino la reticolazione del tessuto biologico ottenuta mediante trattamento dello stesso con una soluzione contenente glutaraldeide, viene confrontata la temperatura di contrazione dei tessuti trattati con la temperatura di contrazione di un tessuto di controllo fissato e non trattato.
Le temperature di contrazione dei tessuti fissati e trattati con taurina o con acido omocisteico sia a temperatura ambiente sia a temperatura superiore non si discostano dalla temperatura di contrazione del tessuto fissato e non detossificato essendo tali temperature pari a 85-86°C.
I trattamenti detossificanti quindi non presentano effetti significativi sul livello di reticolazione del tessuto.
Quando il tessuto viene sottoposto alla fase di eliminazione dei fosfolipidi, fissato e poi trattato con la soluzione contenente taurina o acido omocisteico si osserva addirittura un leggero innalzamento della temperatura di contrazione. Questo risultato dimostra quindi che il tessuto sottoposto alla fase di eliminazione dei fosfolipidi, fissato e poi detossificato presenta una reticolazione migliore.
Fermo restando il principio dell'invenzione, i particolari e le forme di attuazione possono variare, anche in modo significativo, rispetto a quanto qui descritto ed illustrato a titolo di esempio non limitativo, senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione, così come definito dalle rivendicazioni annesse.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento di trattamento di un tessuto biologico per protesi biologiche, detto procedimento comprendendo le seguenti fasi: i) fissazione del tessuto biologico mediante trattamento con una soluzione fissante contenente glutaraldeide, e ii) detossificazione del tessuto biologico fissato mediante trattamento con una soluzione detossificante, il procedimento presentando almeno una delle seguenti caratteristiche: - à ̈ condotta una fase di eliminazione di fosfolipidi dal tessuto biologico mediante trattamento con una soluzione di eliminazione contenente 1,2-octandiolo ed etanolo, - detta fase di detossificazione à ̈ condotta mediante trattamento con una soluzione detossificante contenente taurina o acido omocisteico ad una temperatura superiore alla temperatura ambiente, preferibilmente superiore a 30°C.
  2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detta soluzione di eliminazione contiene 1,2-octandiolo in una concentrazione espressa in v/v compresa tra 1% e 25%, preferibilmente tra 2% e 10%, più preferibilmente pari a 5%.
  3. 3. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta soluzione di eliminazione contiene etanolo in una concentrazione espressa in v/v compresa tra 25% e 49%, preferibilmente tra 30% e 45%, più preferibilmente pari a 40%.
  4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta soluzione di eliminazione ha un pH compreso tra 4 e 9, preferibilmente tra 5 e 8, più preferibilmente pari a 7,2.
  5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta fase di eliminazione di fosfolipidi à ̈ condotta ad una temperatura compresa tra 15°C e 65°C, preferibilmente tra 30°C e 40°C, più preferibilmente pari a 37°C.
  6. 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta fase di eliminazione di fosfolipidi à ̈ condotta per un tempo compreso tra 2 ore e 7 giorni, preferibilmente tra 16 e 72 ore.
  7. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta fase di eliminazione dei fosfolipidi à ̈ condotta precedentemente a detta fase di fissazione.
  8. 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui detta fase di eliminazione dei fosfolipidi à ̈ condotta in due stadi: un primo stadio essendo realizzato precedentemente a detta fase di fissazione ed un secondo stadio essendo condotto simultaneamente a detta fase di detossificazione, dove detta soluzione detossificante contiene inoltre 1,2-octandiolo ed etanolo.
  9. 9. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta soluzione detossificante contiene taurina in una concentrazione espressa in p/v compresa tra 0,10% fino a saturazione, preferibilmente tra 0,20% e 1,00%, più preferibilmente pari a 0,70%.
  10. 10. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8, in cui detta soluzione detossificante contiene acido omocisteico in una concentrazione espressa in p/v compresa tra 0,10% fino a saturazione, preferibilmente tra 0,50% e 5%, più preferibilmente pari a 1%.
  11. 11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta fase di detossificazione à ̈ condotta ad una temperatura superiore a 30°C, preferibilmente compresa tra 35°C e 45°C, più preferibilmente pari a 40°C.
  12. 12. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta soluzione detossificante ha un pH compreso tra 4 e 9, preferibilmente tra 5 e 8, più preferibilmente pari a 7.
  13. 13. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta fase di detossificazione à ̈ condotta per un tempo compreso tra 2 e 96 ore, preferibilmente tra 12 e 48 ore, più preferibilmente pari a 24 ore.
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