ITTO20100539A1 - Composti per il trattamento di tumori che portano oncoproteine myc deregolate - Google Patents

Description

“Composti per il trattamento di tumori che portano oncoproteine MYC deregolateâ€

TESTO DELLA DESCRIZIONE

Campo dell’invenzione

La presente invenzione riguarda composti per il trattamento di tumori caratterizzati da oncoproteine MYC deregolate.

Sfondo dell’invenzione

L’attivazione degli oncogeni à ̈ un evento molecolare frequente sia nei tumori solidi che nelle leucemie e linfomi. Può essere causato da diverse lesioni molecolari, le più comuni delle quali sono l’aumento del dosaggio genico o amplificazione, traslocazioni cromosomali, mutazioni puntiformi, alterazioni epigenetiche di sequenze di promotori od incrementatori, alterazioni nelle regioni non tradotte al 5’ (5’UTR) e 3’ (3’UTR).

Le proteine MYC (MYC, MYCN, e MYCL) sono fattori di trascrizione con dominio basico elica-ansa-elica coinvolti nella regolazione di processi che controllano molti aspetti del destino cellulare. Non à ̈ quindi sorprendente che questi geni siano anche potenti oncogeni e rappresentino punti di lesione chiave nello sviluppo di tumori umani, potendo essere deregolati da tutti i meccanismi di alterazione menzionati sopra.

I geni MYC sono controllati nella loro espressione ai livelli trascrizionale e post-trascrizionale, quest’ultimo rappresentando sostanzialmente i livelli di stabilità del mRNA nel citoplasma e per la disponibilità di mRNA per la traduzione. Questi due tipi di controllo sono esercitati specificamente attraverso un numero di segnali che agiscono in siti cis, che risiedono principalmente nel 5’UTR e nel 3’UTR dei tre geni. In molti casi le alterazioni riportate dai geni MYC nel cancro riguardano queste regioni geniche, dimostrando il ruolo cruciale dei controlli posttrascrizionali dei geni MYC nell’omeostasi tessutale.

All’interno della famiglia MYC, MYCN à ̈ stato identificato inizialmente come un gene amplificato in tandem nel 20% dei casi di neuroblastoma, il più frequente tumore solido extracranico pediatrico. Circa il 35-40% dei pazienti che recano questa alterazione, nonostante la terapia multimodale, hanno una cattiva prognosi: l’amplificazione di MYCN e la conseguente sovraespressione (non la sovraespressione di MYCN senza amplificazione, si veda, PMID 16510605) à ̈ un forte elemento predittivo, indipendente dello stato avanzato del tumore, della progressione del tumore e di scarsa prognosi, indipendentemente da lesioni genomiche concomitanti.

Si à ̈ scoperto che il MYCN à ̈ sovraespresso in caso di altri tumori di origine neurale, come glioblastoma, medulloblastoma, retinoblastoma, microcitoma, tumore neuroectodermico primitivo, e in altri tumori embrionali.

Come capita per pazienti affetti da tumori con attività deregolata degli altri membri della famiglia MYC, i pazienti con alterazioni di MYCN manifestano quindi tumori notevolmente aggressivi che sono per lo più resistenti al trattamento.

In passato sono stati fatti molti tentativi per sfruttare le proteine MYC quali bersagli chiave del cancro, proponendo composti che sopprimono la loro attività. Ma, dato che la categoria di composti a cui appartengono queste proteine à ̈ quella dei fattori di trascrizione, sostanzialmente non formulabili in farmaci, sono auspicabili nuovi modi per sfruttare farmacologicamente l’espressione deregolata dei geni della famiglia MYC.

Tutti i tentativi finora condotti con l’obiettivo di diminuire l’espressione dei geni MYC invece che verso le proteine MYC sono stati indirizzati agli mRNA di questi geni, con l’intento di sopprimere direttamente la loro produzione o di favorire la loro degradazione.

Compendio dell’invenzione

Tenendo in conto queste premesse, si sente quindi il bisogno di soluzioni migliori per che consentono in trattamento di tumori caratterizzati da oncoproteine MYC deregolate.

Lo scopo della presente invenzione à ̈ quello di fornire tali soluzioni migliorate.

In accordo con l’invenzione, il suddetto scopo à ̈ ottenuto grazie all’argomeno in oggetto specificatamente richiamato nelle rivendicazioni allegate, che, come va da sé, costituiscono parte integrante della presente descrizione.

Una forma di realizzazione delle presente invenzione prevede composti di formula (I):

1 (I)

in cui

R<1>, R<2>r R<3>, che sono identici o differenti, sono un atomo di idrogeno od un alchile C1-4, e

R<4>Ã ̈ un radicale idrocarburico lineare, ramificato o ciclico C6-9saturo od un radicale di formula (II)

1 (II)

in cui

X Ã ̈ S o O,

Y à ̈ un atomo d’idrogeno o fino a 2 atomi di un alogeno, Z à ̈ un legame singolo od un radicale bivalente scelto tra O, S, -CR2-, in cui R à ̈ un idrogeno od un gruppo alchilico C1-4, od altri radicali divalenti con 2-10 atomi di carbonio e, facoltativamente, atomi di O e/o S accoppiati sotto forma di catena, in cui – se i radicali contengono 2 o più atomi di O e/o S – questi ultimi sono reciprocamente separati da almeno 2 atomi di carbonio, ed essendo possibile per due atomi di carbonio adiacenti essere accoppiati tra loro mediante un doppio legame, e le valenze libere degli atomi di carbonio essendo saturate da un atomo di idrogeno e/o da gruppi alchilici C1-4,

Ar à ̈ un sistema di anelli aromatici che ha fino a due anelli e che può essere sostituito da fino a tre radicali dal gruppo di fluoro, cloro, bromo, metossi, alchile C1-4, trifluorometile e trifluorometossi, loro sali e/o solvati, per l’uso nel trattamento di un tumore caratterizzato da oncoproteine MYC deregolate, in cui detto composto à ̈ capace di aumentare l’espressione dipendente dall’UTR di almeno un gene MYC.

Breve descrizione delle figure

L’invenzione sarà ora descritta esclusivamente a titolo d’esempio, facendo riferimento alle figure allegate, in cui:

- Figura 1: descrizione del metodo di clonaggio senza siti di restrizione.

- Figura 2: contro-screening con 112 composti sui cloni cellulari di neuroblastoma CHP134-MYCN#3 e CHP134-MYCN#19, per eliminare quei picchi che hanno prodotto un aumento della luciferasi riportato per via dell’azione sul promotore del plasmide reporter. I valori grezzi della luciferasi sono stati normalizzati rispetto ai valori delle cellule corrispondenti non trattate. I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard degli esperimenti in triplicato.

- Figura 3: Effetto del trattamento di CPX 2 Î1⁄4M per 24h su cloni stabili di neuroblastoma CHP134. I dati sono riportati come media ± deviazione standard degli esperimenti in triplicato. I numeri sopra le barre indicano l’aumento di unità di luminescenza dopo trattamento con CPX per ogni clone.

- - Figura 4: saggio WST-1 con 112 composti alla concentrazione 2 Î1⁄4M nel clone cellulare di neuroblastoma CHP134-MYCN#3. Le analisi sono state eseguite 24h e 48h dopo il trattamento. I dati sono riportati come media ± deviazione standard degli esperimenti in triplicato.

- Figura 5: Effetto di concentrazioni crescenti di CPX su sette linee cellulari di neuroblastoma. Le cellule sono state trattate con CPX alle concentrazioni definite per 48h seguite dall’analisi della vitalità tramite il saggio WST-1. I dati sono riportati come percentuale media di crescita ± deviazione standard.

- Figura 6: CPX induce morte cellulare e apoptosi nelle cellule di neuroblastoma CHP134. Le cellule sono state trattate per 24 e 48h con concentrazioni definite di CPX e poi colorate con propidio ioduro (PI) e FITC-annessina V. I numeri indicano rispettivamente la percentuale di cellule apoptotiche/morte (P1) e cellule pre-apoptotiche (P2).

- Figura 7: Analisi ad immunofluorescenza dell’espressione di MYCN in cellule di neuroblastoma CHP134 trattate con CPX a diverse concentrazioni per 24h.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Nella seguente descrizione vengono forniti numerosi dettagli specifici per garantire una comprensione completa delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere attuate in pratica senza uno o più dettagli specifici, o con altri metodi, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture ben conosciute, materiali, o operazioni non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di oscurare aspetti delle forme di realizzazione.

Il riferimento lungo tutta la presente specificazione ad “una forma di realizzazione†od “una certa forma di realizzazione†significa che una determinata peculiarità, struttura, o caratteristica descritta in connessione con la forma di realizzazione à ̈ compresa in almeno una forma di realizzazione. Perciò la presenza dell’espressione “in una forma di realizzazione†in diversi punti in tutta la presente descrizione non à ̈ necessariamente sempre riferita alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, le particolari peculiarità, strutture, o caratteristiche possono essere combinate in ogni maniera idonea in una o più forme di realizzazione.

I titoli qui presentati servono soltanto per convenienza e non interpretano lo scopo od il significato delle forme di realizzazione.

Il concetto di “dipendenza da oncogeno†della terapia antitumorale si basa sul fatto che le cellule del tumore diventano dipendenti da oncogeni attivati e quindi la soppressione dell’espressione o dell’attività dell’oncogeno può pregiudicare selettivamente la sopravvivenza delle cellule cancerose.

I presenti inventori forniscono qui la prova del concetto opposto di terapia tumorale con “overdose da oncogeno†, per cui un oncogeno attivato in un tumore à ̈ vice versa ulteriormente sovraregolato per ottenere un certo effetto terapeutico. Questa strategia paradossale si à ̈ rivelata sorprendentemente possibile agli inventori dopo i risultati di uno screening condotto utilizzando un saggio con gene reporter per composti capaci di modulare l’espressione dell’oncogeno MYCN nelle cellule di neuroblastoma con MYCN amplificato agendo attraverso il suo 3’UTR.

Nonostante il fatto che il proposito dello screening fosse quello di identificare composti capaci di sottoregolare l’espressione di MYCN, riducendo il potenziale oncogenico di MYCN e inducendo citotossicità, i presenti inventori hanno notato che 4 composti selezionati nello screening sono capaci invece di sovraregolare MYCN, inducendo anche citotossicità. Di queste 4 molecole, 3 erano agenti chemioterapici ben noti appartenenti alla classe delle antracicline, che à ̈ usata nel trattamento in prima linea del neuroblastoma (dossorubicina, daunorubicina ed epirubicina), dando quindi conferma della validità dell’approccio. La quarta molecola à ̈ un composto antifungino usato per via topica nel trattamento di micosi, la ciclopirossolammina.

Una possibile ragione di questo risultato paradossale potrebbe basarsi sul fatto che in molti casi l’attivazione dell’oncogeno induce di per sé programmi di soppressione tumorale conservati filogeneticamente (morte cellulare, differenziazione o senescenza) che sono possibilmente un meccanismo intrinseco di salvaguardia attivo nelle cellule staminali per prevenire la proliferazione eccessiva e incontrollata.

La selezione clonale durante il lento processo dello sviluppo del tumore (specialmente quando un evento graduale passo a passo di attivazione di un oncogeno come l’amplificazione genica à ̈ una delle maggiori forze scatenanti l’aggressività del clone) alza barriere a questi programmi, sotto forma di una varietà di mutazioni che li inattivano.

Quindi, una ulteriore sovra-attivazione acuta dell’oncogeno già attivato potrebbe determinare un superamento massivo di queste barriere, portando all’estinzione dei cloni cellulari aventi l’oncogeno attivato.

Mentre una specifica sovraregolazione dell’attività della proteina oncogenica o della trascrizione dell’oncogeno sarebbe difficile da ottenere farmacologicamente, un aumento del contenuto della proteina oncogenica, così come una sua diminuzione, sono intrinsecamente ottenuti analizzando le attività che perturbano i controlli di espressione genica posttrascrizionali, specificatamente sulla stabilità degli mRNA e/o l’efficienza di traduzione.

Una forma di realizzazione preferita della presente descrizione riguarda composti di formula (I):

(I)

in cui

R<1>, R<2>r R<3>, che sono identici o differenti, sono un atomo di idrogeno od un alchile C1-4, e

R<4>Ã ̈ un radicale idrocarburico lineare, ramificato o ciclico C6-9saturo od un radicale di formula (II)

(II)

in cui

X Ã ̈ S od O,

Y à ̈ un atomo d’idrogeno o fino a 2 atomi di un alogeno, Z à ̈ un legame singolo od un radicale bivalente scelto tra O, S, -CR2-, in cui R à ̈ un idrogeno od un gruppo alchilico C1-4, od altri radicali divalenti con 2-10 atomi di carbonio e, facoltativamente, atomi di O e/o S accoppiati sotto forma di catena, in cui – se i radicali contengono 2 o più atomi di O e/o S – questi ultimi sono reciprocamente separati da almeno 2 atomi di carbonio, ed essendo possibile per due atomi di carbonio adiacenti essere accoppiati tra loro mediante un doppio legame, e le tre valenze libere degli atomi di carbonio essendo saturate da un atomo di idrogeno e/o da gruppi alchilici C1-4,

Ar à ̈ un sistema di anelli aromatici che ha fino a due anelli e che può essere sostituito da fino a tre radicali dal gruppo di fluoro, cloro, bromo, metossi, alchile C1-4, trifluorometile e trifluorometossi, loro sali e/o solvati, per l’uso nel trattamento di un tumore caratterizzato da oncoproteine MYC deregolate, in cui detto composto à ̈ capace di aumentare l’espressione dipendente dall’UTR di almeno un gene MYC.

Composti preferiti sono 1-idrossi-2-piridinone (rivendicazione 2), ciclopirox (rivendicazione 3), ciclopirossolammina (rivendicazione 4), piroctone (rivendicazione 5), piroctoneolammina (rivendicazione 6), e rilopirox (rivendicazione 7).

Altri composti preferiti sono 1-idrossipiridin-2-tione (omadina) e 3-idrossi-1,2-dimetilpiridin-4-one (deferiprone).

Questi composti sono caratterizzati da una tossicità sistemica molto bassa e da una biodisponibilità molto superiore rispetto agli agenti antitumorali tradizionali.

Ad esempio, la dose letale acuta 50 (LD50) per la ciclopirossolammina e per il deferiprone nel ratto à ̈ rispettivamente di 2350 mg/kg e 2000 mg/kg, mentre lo stesso valore per la dossorubicina e la cisplatina à ̈ rispettivamente di 10,5 mg/kg e 25 mg/kg. La concentrazione plasmatica di deferiprone negli esseri umani per il trattamento da sovraccarico di ferro in pazienti talassemici à ̈ di 250 Î1⁄4M e oltre, mentre quella per la dossorubicina infusionale ad alto dosaggio in pazienti affetti da tumore à ̈ di 0,1 Î1⁄4M. Quindi la tossicità sistemica tra questa classe di composti e la classe di composti antitumorali tradizionali come le antracicline potrebbe essere anche 200 volte inferiore, mentre la loro concentrazione plasmatica e presumibilmente la loro biodisponibilità, alle dosi utilizzate in terapia, potrebbero essere anche 2500 volte più alta.

I composti sopracitati sono stati identificati mediante un metodo di screening per un composto per il trattamento di un tumore avente almeno un oncogeno attivato,

in cui il composto à ̈ capace di aumentare l’espressione dell’almeno un oncogeno attivato attraverso un’azione diretta o indiretta sulle regioni non tradotte degli mRNA trascritti dal locus dell’oncogeno di interesse, il metodo comprendendo: i) mettere in contatto un composto con una cellula comprendente un costrutto di acido nucleico, in cui il costrutto di acido nucleico comprende una sequenza codificante un gene reporter fiancheggiante la, od accoppiata alla almeno una sequenza della regione non tradotta dell’oncogeno o di suoi frammenti; e

ii) rivelare l’espressione di un polipeptide reporter codificato dalla sequenza codificante il gene reporter; in cui un aumento nel livello di espressione del polipeptide reporter in presenza del composto, rispetto al livello di espressione del polipeptide reporter in assenza del composto indica che il composto aumenta l’espressione dell’almeno un oncogeno attivato attraverso un’azione diretta o indiretta sulle regioni non tradotte degli mRNA trascritti dal locus dell’oncogeno di interesse.

Preferibilmente la regione non tradotta (UTR) à ̈ costituita dalle regioni 3’ e/o nel 5’ non tradotte e/o loro segmenti o combinazioni di segmenti.

Le cellule utilizzate nel metodo di screening sono preferibilmente cellule tumorali, più preferibilmente cellule tumorali umane. Per lo screening di composti attivi contro il neuroblastoma, le cellule possono essere selezionate tra le linee cellulari: CHP134, KELLY, CHP212, MHH-NB-11, STA-NB-1, STA-NB-7, LA-N-1, SK-N-BE(2), SIMA, LA-N-2,SK-N-DZ, IMR32, SIMA, CHP126 (recanti l’amplificazione del MYCN con un diverso numero di copie di MYCN) oppure, a titolo di confronto, SK-N-AS, SK-N-MC, SK-N-SH, SK-N-FI, NB69 (che non recano amplificazione di MYCN).

Il gene reporter à ̈ preferibilmente selezionato tra luciferasi, proteine fluorescenti verdi, proteine fluorescenti rosse, proteine fluorescenti gialle, b-galattosidasi, b-glucuronidasi, b-lattamasi, fosfatasi alcalina secreta dalla placenta.

Il tumore avente almeno un oncogeno attivato può essere selezionato tra neuroblastoma, medulloblastoma, retinoblastoma, microcitoma, glioma, rabdomiosarcoma alveolare, tumore del neuroectoderma primitivo, cancro della mammella, cancro esofageo, cancro cervicale, cancro ovarico, cancro della testa e collo.

Nella descrizione dell'invenzione, i presenti inventori fanno riferimento alla proteina MYCN esclusivamente a titolo di esempio, il concetto essendo esteso a tutta la famiglia di geni MYC.

Il composto capace di aumentare l’espressione degli oncogeni attivati attraverso l’azione diretta o indiretta sulle regioni non tradotte degli mRNA trascritti dai loro loci può essere selezionato tra composti a molecole piccole composti a macromolecole; preferibilmente, i composti a molecole piccole possono essere selezionati tra: composti chimici a molecole piccole, RNA antisenso e senso normali e chimicamente modificati, oligonucleotidi di DNA e RNA antisenso normali e chimicamente modificati, oligonucleotidi esca di DNA o RNA normali e chimicamente modificati, antagomir (antagonisti di microRNA) di DNA e RNA normali e modificati, oligonucleotidi di RNA normali e chimicamente modificati che agiscono come “spugne†di microRNA, in cui detto composto agisce sulle sequenze cisagenti presenti nella regione non tradotta 5’ o nella regione non tradotta 3’ dell’almeno un oncogeno attivato.

Descrivendo l’invenzione, i presenti inventori fanno riferimento alla proteina MYCN semplicemente a titolo di esempio, dato che il concetto à ̈ esteso a tutta la famiglia di geni MYC.

Le proteine della famiglia MYC (MYC, MYCN, e MYCL) sono un paradigma per questo meccanismo di screening, in quanto la loro attivazione avvia un programma di soppressione tumorale “inwired†potente e ben documentato, che agisce attraverso morte cellulare, differenziazione cellulare o senescenza cellulare (PMID: 20382143).

Specificatamente, la MYCN risulta essere essenziale per mantenere una popolazione di cellule progenitrici indifferenziati e proliferanti nel cervello in via di sviluppo (PMID: 12381668), ma al tempo stesso inizia la migrazione e la differenziazione neuronale delle cellule delle creste neurali nei gangli simpatici (PMID: 9169842), ed à ̈ dotato di proprietà pre-apoptotiche almeno in condizioni specifiche, come l’eccitazione indotta da TRAIL del meccanismo di morte cellulare [PMID: 15632181], ed il danno cellulare indotto da farmaci [PMID: 11107122, PMID: 17141950]. Quindi, assieme al programma di proliferazione non ristretto coinvolto nella genesi tumorale, almeno due programmi di soppressione tumorale, contrastanti “di soccorso†, differenziazione ed apoptosi, sono suscitati dalla MYCN.

I presenti inventori hanno eseguito uno studio computazionale dettagliato del 3’UTR della proteina MYCN ed hanno trovato che à ̈ altamente conservato per la quasi totalità nella filogenesi dei vertebrati, à ̈ legato secondo evidenze sperimentali mediante 2 proteine leganti RNA e secondo predizioni bioinformatiche reca potenziali siti di legame per almeno altre 5 proteine leganti RNA; reca inoltre siti di legame per almeno 17 microRNA. Tutto questo predice un 3’UTR altamente regolato. Inoltre, il profilo del mRNA basato su microarray di 14 linee cellulari progenitrici di neuroblastoma amplificate dalla MYCN (linee cellulari derivate direttamente dal tumore originale e non mediante sub-clonaggio cellulare in vitro) mostra profili di correlazione differenti tra proteina (rilevata tramite western blotting), mRNA polisomale, livelli di mRNA cellulare (rivelati mediante RT-PCR quantitativa) e grado di amplificazione del gene della MYCN (rilevato tramite analisi di CGH di array). Questo mostra indirettamente che durante il processo di amplificazione della MYCN nelle linee cellulari di neuroblastoma controlli posttrascrizionali agiscono diversamente in tumori differenti, possibilmente a causa di alterazioni in questi controlli.

Le osservazioni sopra riportate sono a favore di una certa modulabilità dell’espressione del gene MYC per effetto di intefrerenze esercitate a livello del 3’UTR del mRNA del MYCN. L’annotazione bioinformatica delle regioni 3’UTR di MYC e MYCL ha inoltre mostrato una ricchezza di elementi cis potenzialmente funzionali, alcuni dei quali sono dimostrati nella letteratura scientifica, suggerendo che anche questi due geni potrebbero essere controllati post-trascrizionalmente agendo sul 3’UTR.

I presenti inventori hanno progettato inizialmente un modello di screening ad alta prestazione (HTS) al fine di trovare piccoli composti che sottoregolassero il MYCN, e che fossero quindi prevedibilmente in grado di produrre un effetto citotossico specifico sulle cellule di neuroblastoma amplificate dal MYCN, questa lesione essendo il determinante prognostico negativo principale di pazienti affetti da neuroblastoma ad alto rischio. I presenti inventori hanno inoltre trovato inaspettatamente piccoli composti che sovraregolano il MYCN, e che ciononostante producevano un effetto citotossico molto efficiente su cellule di neuroblastoma amplificate dal MYCN.

Dallo screening per composti che agiscono sul 3’UTR del mRNA del MYCN i presenti inventori hanno specificatamente identificato la ciclopirossolammina (CPX), un ben noto farmaco antimicotico, come un determinante della sovraregolazione post-trascrizionale e della morte cellulare indotta da MYCN nelle cellule di neuroblastoma. Esempio 1. Generazione del plasmide pcDNA5/FRT-MYCN

La regione 3’UTR della MYCN à ̈ stata inizialmente inserita nel plasmide pcDNA5/FRT (Invitrogen) con il metodo di clonaggio senza siti di restrizione descritto nella Figura 1 (Chenget al., 2000).

In breve, sono stati progettati due primer di integrazione di DNA in modo che le loro sequenze nucleotidiche fossero omologhe alla sequenza 3’UTR della MYCN (NG_007457.1) in corrispondenza della porzione 3’ ed alla sequenza della regione di inserzione del vettore pcDNA5/FRT nella porzione 5’.

Le sequenze dei primer sono:

5'-GCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAACGCTTCTCAAAACTGGACAGTCAC-3' per il primer diretto (SEQ ID No.:1), e

5'-CTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTGGCCCCCCAACCAGGATTGTACAG-3' per il primer inverso (SEQ ID No.:2).

Il 3’UTR di MYCN à ̈ stato dapprima amplificato mediante PCR con la DNA polimerasi PlatinumP fx (Invitrogen) con i primer di integrazione diretto ed inverso (SEQ ID No.: 1 and 2) ed il DNA genomico da cellule CHP134 (ECACC) come templato. È stato utilizzato un programma per PCR di 30 cicli, con denaturazione a 94°C per 15 s, ricomposizione a 64°C per 30 s ed estensione a 68°C per 2 min con un’operazione di estensione finale a 68°C per 10 min. Il prodotto di questa PCR à ̈ stato separato su un gel di agarosio all’1% in tampone TBE, purificato usando il kit di estrazione da QIAquick (Qiagen) e quantificato mediante un Nanodrop.

In seguito, il prodotto della PCR Ã ̈ stato amplificato mediante DNA polimerasi usando il vettore pcDNA5/FRT come templato.

Una reazione di allungamento mediante ciclizzazione termica di 50 Î1⁄4l era costituita da 50 ng di pcDNA5/FRT, 200 ng di prodotto della PCR purificato, 200 Î1⁄4M di dNTP sciascuno e 2,5 U di polimerasi PfuUltra High-Fidelity (Stratagene) nel suo tampone 1×PCR. Il programma di cicli termici era denaturazione a 95°C per 30 sec, ricomposizione a 55°C per 1 min ed estensione a 68°C per 15 min con 35 cicli.

Dopo la reazione, 10 U di enzima di restrizione DpnI sono state aggiunte a 9 Î1⁄4l di prodotto della PCR da digerire per 2 h a 37°C. Il plasmide designato à ̈ selezionato dopo la digestione con DpnI, dato che DpnI taglia i plasmidi originario ed ibrido.

3 Î1⁄4l di miscela della PCR tagliata con DpnI sono stati utilizzati per trasformare cellule di E.coli Top10 chimicamente competenti (Invitrogen) in accordo col protocollo del fornitore. Le colonie di E.coli sono state controllate per la presenza del 3’UTR di MYCN con uno screening mediante PCR. Una tipica miscela di PCR di 12 Î1⁄4l era costituita da 0,2 mM di primer diretto 5'-CGCAAGATCCGCGAGATTC-3'(SEQ ID No.:3), 0,2 mM di primer inverso 5'-GCAAGTGTAGCGGTCACG-3' (SEQ ID No.:4), 0,2 mM di dNTPs, 1,5 mM di MgCl2e 0,5 U DNA polimerasi Platinum Taq nel suo tampone 1×PCR. L’operazione di denaturazione iniziale a 94°C per 5 minuti à ̈ stata seguita da 35 cicli di amplificazione mediante PCR come segue: 94°C per 30 secondi, 58°C per 30 secondi, 72°C per 2 minuti con un’operazione di estensione finale a 72°C per 5 minuti. I prodotti della PCR sono stati visualizzati mediante elettroforesi su gel d’agarosio.

Il plasmide pcDNA5/FRT-MYCN Ã ̈ stato preparato da 250 ml di una coltura per una notte di E.coli trasformata utilizzando il kit Qiagen EndoFree plasmid maxi seguendo le istruzioni del fornitore.

Esempio 2. Generazione dei plasmidi pGL4.26-MYCN3UTR e – CTRL

Per la transinfezione stabile sono stati generati due vettori – pGL4.26-MYCN3UTR e pGL4.26-CTRL recanti il gene di resistenza all’igromicina B.

Per ottenere il plasmide pGL4.26-MYCN sono stati progettati due oligonucleotidi 5'-CTAGAAAGTATAATCGATAAG-3' (SEQ ID No.:5) e 5'-GATCCTTATCGATTATACTTT-3' (SEQ ID No.:6) in modo da ottenere mediante ricomposizione un oligonucleotide a filamento doppio estremità 5’ e 3’ sporgenti, che rappresentano emi- siti di restrizione XbaI e BamHI.

Il vettore pGL4.26 (Promega) à ̈ stato digerito con gli enzimi NheI e BamHI per rimuovere il gene luc2 insieme al segnale del polyA tardivo ottenendo lo scheletro del vettore pGL4.26 con le estremità sporgenti 5’ e 3’ che rappresentano gli emi-siti di restrizione NheI e BamHI (designati come pGL4.26 ́(NheI/BamHI)). Il promotore CMV con il gene luc2 seguiti dal 3’UTR di MYCN sono stati tagliati con le restrittasi SpeI and XbaI dal costrutto MYCN-pcDNA5/FRT descritto in precedenza. Una legatura successiva dello scheletro pGL4.26 ́(NheI/BamHI), del CMV promotoreluc2 gene MYCN 3'UTR ́(SpeI/XbaI) e dell’oligonucleotide adattatore descritti in precedenza ha prodotto il vettore di espressione desiderato pGL4.26-MYCN3UTR.

Il vettore pGL4.26-CTRL utilizzato rappresenta un plasmide pGL4.26 con un promotore CMV inserito. Il plasmide pGL4.26-CTRL à ̈ risultato dalla reazione di legame tra lo scheletro del vettore pGL4.26 ́(KpnI/BsrGI) ed un frammento contenente il promotore CMV. Quest’ultimo à ̈ stato isolato dal pGL4.26-MYCN mediante digestione con le restrittasi KpnI e BsrGI. In questo modo, i plasmidi pGL4.26-MYCN e pGL4.26-CTRL differivano reciprocamente esclusivamente nella regione successiva al gene luc2.

Esempio 3.Transinfezione stabile di cellule CHP134

Cellule CHP134 sono state fatte crescere come monostrati aderenti a 37°C e 5% di CO2/aria in RPMI 1640 (Lonza) integrato con siero fetale bovino al 10% (Lonza) e 10 mML di glutammina (Lonza). Le cellule CHP134 sono state transinfettate in accordo col seguente protocollo: 100 Î1⁄4l di OPTI-MEM (Gibco), 2 Î1⁄4g di plasmide pGL4.26-MYCN o di plasmide -CTRL e 6 Î1⁄4l di TurboFectin 8.0 (OriGene) sono stati miscelati in un tubo. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, la miscela à ̈ stata aggiunta a gocce alle cellule CHP134 crescenti su piastre da 12 pozzetti in RPMI 1640 completo. Dopo 5h il mezzo à ̈ stato sostituito da RPMI con FBS al 20%.

Il giorno seguente le cellule sono state tripsinizzate e trasferite in una piastra da 100 mm. Dopo 2 giorni à ̈ stata iniziata la selezione di cellule stabilmente transinfettate aggiungendo igromicina B (Invitrogen) al mezzo per ottenere una concentrazione finale di 110 Î1⁄4g/ml. Il mezzo con igromicina B à ̈ stato cambiato ogni 3-4 giorni.

Approssimativamente 18 giorni dopo la transinfezione, i cloni sono stati trasferiti in una piastra da 12 pozzetti raccogliendoli con una punta di plastica. Quando erano disponibili abbastanza cellule per un clone specifico, la maggior parte delle cellule sono state raccolte, crioconservate e stoccate in azoto liquido; le cellule residue sono state raccolte in tubi da microcentrifuga alla concentrazione di (2-5)×10<6>cellule per tubo e stoccate a -80°C sotto forma di pellet.

I cloni sono stati selezionati basandosi su una moderata attività della luciferasi ed il promotore CMV intatto ed il MYC 3’UTR o le regioni polyA tardive SV40. L’attività luciferasica à ̈ stata stimata utilizzando il saggio Luciferase (Promega) in accordo col protocollo del fornitore con piccole modifiche. In breve, i pellet dei cloni sono stati scongelati su ghiaccio e lisati in 100 Î1⁄4l di tampone di lisi 1×passivo, operazione seguita da tre cicli di congelamento-scongelamento per assicurare una lisi completa. I lisati sono stati centrifugati per 20 min a velocità massima a 4°C. I surnatanti sono stati trasferiti in nuovi tubi. Alla piastra da 96 pozzetti a fondo piatto bianco contenente 20 Î1⁄4l di lisato cellulari per pozzetto, sono stati aggiunti 100 Î1⁄4l di reagente Luciferase Assay per pozzetto. La luce prodotta à ̈ stata misurata immediatamente con un lettore multi-piastra Tecan F200 (Tecan). 5 Î1⁄4l degli stessi lisati sono stati utilizzati per misurare la quantità di proteine mediante il saggio Bradford. Infine, sono state comparate tra loro le unità di luminescenza normalizzate alla quantità di proteina. L’integrità del promotore CMV e del 3’UTR del MYCN sono state verificate mediante PCR. Le cellule pellettizzate dai cloni stoccati a -80°C sono state scongelate su ghiaccio, il gDNA à ̈ stato purificato con il kit Dneasy Blood & Tissue (Qiagen) e quantificato.

Il promotore CMV à ̈ stato amplificato mediante una PCR annidata. Una tipica prima miscela della PCR di 25 Î1⁄4l era costituita da 100 ng di gDNA, 0,2 mM di primer diretto 5'-CTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTG-3' (SEQ ID No.:7), 0,2 mM di primer inverso 5'-CACACCACGATCCGATGGTTTG-3' (SEQ ID No.:8), 0,2 mM di dNTP, 1,5 mM di MgCl2e 2,5 U di Platinum Taq DNA polimerasi nel suo tampone 1×. L’operazione di denaturazione iniziale a 94°C per 2 minuti à ̈ stata seguita da 35 cicli di amplificazione mediante PCR come segue: 94°C per 30 secondi, 63°C per 30 secondi, 72°C per 2 minuti con un’operazione finale di estensione a 72°C per 5 minuti.

Nella seconda PCR 1 Î1⁄4l della rispettiva miscela PCR (diluizione 1:10) à ̈ servito come templato. La seconda miscela PCR era equivalente alla prima a parte i primer che erano i seguenti: primer diretto 5'-CGTTACATAACTTACGGTAAATGG-3' (SEQ ID No.:9) e primer inverso 5'-GAAGTACTCGGCGTAGGTAATG-3' (SEQ ID No.:10). La seconda PCR à ̈ stata eseguita utilizzando il seguente profilo termico: denaturazione iniziale a 94°C per 2 min seguita da 35 cicli di denaturazione a 94°C per 30 sec, ricomposizione a 57°C per 30 sec, allungamento a 72°C per 2 minuti un’operazione di estensione finale a 72°C per 5 minuti. I prodotti della PCR sono stati visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Il 3’UTR della MYCN à ̈ stato amplificato mediante PCR annidata. Una tipica prima miscela PCR di 25 Î1⁄4l era costituita da 100 ng gDNA, 0,2 mM di primer diretto (SEQ ID No.:3), 0,2 mM di primer inverso (SEQ ID No.:4), 0,2 mM di dNTP ciascuno, 1,5 mM di MgCl2e 2,5 U di Platinum Taq DNA polimerasi nel suo tampone 1×PCR. L’operazione di denaturazione iniziale a 94°C per 2 minuti à ̈ stata seguita da 35 cicli di amplificazione mediante PCR come segue: denaturazione a 94°C per 30 secondi, ricomposizione a 58°C per 30 secondi, allungamento a 72°C per 2 minuti con un’operazione di estensione finale a 72°C per 5 minuti.

Nella seconda PCR 1 Î1⁄4l della rispettiva prima miscela PCR (diluizione 1:10) à ̈ servito come templato. La seconda miscela PCR era equivalente alla prima a parte i primer che erano i seguenti: primer diretto (SEQ ID No.:1) e primer inverso (SEQ ID No.:2). È stato utilizzato un programma per PCR in due operazioni, con denaturazione a 94°C per 30 secondi e ricomposizione/estensione a 72°C per 2 minuti con un’operazione finale di estensione a 72°C per 5 minuti. I prodotti della PCR sono stati controllati mediante elettroforesi su gel d’agarosio.

Esempio 4. Screening ad alta prestazione per composti che aumentano la traduzione del MYCN 3’UTR

I costrutti reporter che contengono il gene reporter della luciferasi di lucciola sotto il controllo del promotore virale CMV e seguiti dalla regione 3’UTR del MYCN intera (pGL4.26-MYCN3UTR) o soltanto dalla regione poly(A) del SV40 (pGL4.26-CTRL) come controllo, sono stati prodotti com’à ̈ descritto in precedenza.

La linea cellulare di neuroblastoma CHP134 à ̈ stata utilizzata per generare cloni di transinfezione stabili come descritto nell’esempio 3.

Lo screening à ̈ stato eseguito nel clone stabile CHP134-MYCN#3 con la libreria di piccole molecole Spectrum Collection (MicroSource Discovery) costituita da 2000 composti stoccati alla concentrazione di 10 mM in DMSO: 800 farmaci che sono stati introdotti negli Stati Uniti, 200 farmaci che sono limitati all’uso in Europa e Giappone, 580 prodotti naturali, 420 composti con attività biologica riportata.

Il saggio à ̈ stato esefuito in triplicato in piastre da 96 pozzetti. Le cellule del clone stabile CHP134-MYCN sono state tripsinizzate, raccolte e risospese nel mezzo di coltura. Il braccio multicanale Tecan Multichannel (MCA96) di un robot Tecan EVO 200 (Tecan) à ̈ stato utilizzato per aggiungere 150 ul contenenti 15000 cellule ad una piastr di coltura bianca da 96 pozzetti CulturePlate-96 (Perkin Elmer).

Dopo l’adesione, i composti 10 mM sono stati diluiti a 75uM in PBS ed immediatamente pipettati nei 96 pozzetti al fine di avere una concentrazione finale di 2 uM nelle cellule. Controlli di riferimento sono stati ottenuti trattando i pozzetti della prima colonna con PBS+DMSO alla stessa concentrazione finale dei campioni.

L’attività della luciferasi à ̈ stata valutata usando il saggio OneGlow Luciferase (Promega) in accordo col procedimento del fabbricante, dopo 24 h di incubazione a 37°C con CO2al 5% ed umidità relativa del 100%. Il segnale di luminescenza à ̈ stato letto sul letto multipiastra Tecan F200 (Tecan) integrato col robot.

I picchi sono stati selezionati dallo screening primario utilizzando un metodo di assegnazione di punteggio Z stabile. I metodo di normalizzazione del punteggio Z Ã ̈ calcolato come:

Z = (xi- media)/MAD eq. (1)

dove xià ̈ la misurazione grezza sull’i-esimo composto, media e MAD sono, rispettivamente, la media e la deviazione media.

Il metodo RankProduct à ̈ stato applicato tra i tre replicati di tutte le piastre per rilevare picchi mediante pfp (soglia impostata a 0,1). Questo ha prodotto 59 picchi che inducevano sovraespressione del reporter, e 80 picchi sottoregolati.

La maggioranza dei picchi (tabella 2) à ̈ stata poi controllata per la riproducibilità e l’attività citotossica, i composti più interessanti sono stati inoltre testati per il rapporto dose-capacità di risposta. Gli stessi picchi sono stati poi sottoposti a contro-screening con il clone stabile CHP134-CTRL#19 esprimente il plasmide di controllo pGL4.26-CTRL, per segregare gli effetti sul controllo trascrizionale dipendenti dal promotore plasmidico.

Tabella 2

ID NOME DEL COMPOSTO PIASTRA 1

1 01_B08 00330001 DACTINOMICINA

2 01_B09 00330002 MITOMICINA C

PIASTRA 2

3 02_D03 01500189 CICLOPIROSSOLAMMINA

4 02_E03 01500205 COLCHICINA

5 02_F07 01500223 DAUNORUBICINA

6 02_H05 01500246 DIGITOSSINA

7 02_H06 01500247 DIGOSSINA

PIASTRA 4

8 04_A08 01500375 MECLORETAMMINA

9 04_B05 01500387 MERCAPTOPURINA

10 04_B06 01500388 MESTRANOLP

11 04_C03 01500398 METOTREXATO(+/-)

12 04_H07 01500473 FENAZOPIRIDINA IDROCLORURO

PIASTRA 5

13 05_D07 01500521 PRVINIO PAMOATO

14 05_H06 01500573 TIOGUANINA

PIASTRA 6

15 06_C09 01500611 VINBLASTINA SOLFATO

16 06_D04 01500618 ACRIFLAVINIO IDROCLORURO

17 06_D09 01500644 ACETATO FENILMERCURICO

18 06_E11 01500674 ACIDO MICOFENOLICO

19 06_F03 01500676 OUABAINA

PIASTRA 7

20 07_A02 01500873 PIPERINA

21 07_A03 01500903 ETOPOSIDE

22 07_B07 01501016 FENBENDAZOLO

23 07_C03 01501110 MEBENDAZOLO

PIASTRA 8

24 08_B11 01502198 ANISINDIONE

25 08_D05 01503059 FLOXURIDINA

26 08_H11 01503256 AMSACRINA

PIASTRA 9

27 09_A10 01503278 MITOXANTRONE IDROCLORURO

28 09_C10 01503650 NABUMETONE

ID NOME DEL COMPOSTO

29 09_E03 01503908 PACLITAXEL

30 09_G06 01504094 TENIPOSIDE

31 09_H08 01504179 FEXOFENADINA IDROCLORURO

PIASTRA 11

32 11_C08 01505414 BROMINDIONE

33 11_F02 01505483 DOSSORUBICINA

34 11_H06 01505672 VINCRISTINA SOLFATO

PIASTRA 12

35 12_B05 01505708 EPIRUBICINA IDROCLORURO

PIASTRA 13

36 13_A07 02300332 PODOFILOX

37 13_F02 01506084 PROSCILLARIDINA

38 13_H11 01501205 LANATOSIDE C

PIASTRA 14

39 14_A03 00100005 ANTOTECOLO

40 14_A06 00100009 CEDRELONE

41 14_E04 00100291 STROFANTIDINA

42 14_H10 00100584 GITOSSIGENINA DIACETATO

PIASTRA 15

43 15_B03 00100688 DIGOSSIGENINA

44 15_B04 00100698 CYMARINA

45 15_B06 00100749 ACIDO STROFANTHIDINIC LATTONE ACETATO 46 15_B07 00102007 FORMONONETIN

47 15_C03 00200007 ACIDO GAMBOGICO

48 15_C07 00200013 ROTENONE

49 15_C09 00200022 AKLAVINA IDROCLORURO

50 15_F02 00200484 DEOSSISAPPANONE B 7,4'-DIMETIL ETERE

51 15_G03 00200789 DAIDZEINA

52 15_G06 00200846 APIGENINA

53 15_G07 00200848 DEOSSSAPPANONE B 7,3'-DIMETIL ETERE

54 15_H08 00201342 DEOSSISAPPANONE B 7,3'-DIMETIL ETERE ACETATO PIASTRA 16

55 16_A05 00201522 AMMIDE DELL’ACIDO GAMBOGICO

56 16_A06 00201524 ACID DI-IDROGAMBOGICO

57 16_B03 00201604 PIRROMICINA

58 16_B08 00201664 CELASTROLO

59 16_E06 00210658 DEHYDROVARIABILIN

60 16_F07 00211126 DIFENILUREA

61 16_F08 00211249 7,4'-DIMETOSSI-ISOFLAVONE

62 16_G03 00240645 RETUSIN 7-METIL ETERE

ID NOME DEL COMPOSTO

63 16_G10 00240958 4'-METOSSIFLAVONE

PIASTRA 17

64 17_A03 00300007 EUPARINA

65 17_F04 00310010 HELENINA

66 17_G09 00211950 COSMOSIINA

67 17_G11 00212097 ONONETINA

68 17_H07 00501332 FENACILAMMINA IDROCLORURO

PIASTRA 18

69 18_B02 01500709 CHRYSIN

70 18_B03 01500717 6,4'-DI-IDROSSIFLAVONE

71 18_B11 01500736 3,6-DIMETOSSIFLAVONE

72 18_G06 01500986 GITOSSINA

73 18_H07 01501197 PRIMULETINA

74 18_H10 01501207 KINETIN RIBOSIDE

PIASTRA 19

75 19_A04 01502223 RESVERATROLO

76 19_A08 01502232 CAMPTOTHECIN

77 19_B07 01502247 FISETINA

78 19_D06 01503904 PATULINA

79 19_D07 01503906 ANISOMICINA

80 19_E08 01503994 CONVALLATOSSINA

81 19_E10 01504002 BAICALEINA

82 19_G06 01504041 TRIACETILRESVERATROLO

83 19_G07 01504044 RESVERATROL 4'-METIL ETERE

84 19_G10 01504068 DIOSMETINA

85 19_H07 01504082 DI-IDROCELASTROLO

PIASTRA 20

86 20_B05 01504411 PICROPODOFILLOTOXIN ACETATO

87 20_B06 01504412 PODOFILLOTOXIN ACETATO

88 20_C08 01505129 PLUMBAGINA

89 20_C11 01505135 PIPLARTINA

90 20_D05 01505142 2',5'-DI-IDROSSI-4-METOSSICALCONE

91 20_D09 01505152 2',4'-DI-IDROSSI-4- METOSSICALCONE

92 20_D10 01505153 2',3- DI-IDROSSI -4,4',6'-TRIMETOSSICALCONE 93 20_E06 01505177 RUBESCENSINA A

94 20_E07 01505182 ISOFORMONONETINA

95 20_G05 01505278 3-IDROSSI-3',4'-DIMETOSSIFLAVONE PIASTRA 21

96 21_A04 01505490 APIGENIN DIMETIL ETERE

97 21_C07 01600561 LIQUIRITIGENIN DIMETIL ETERE

ID NOME DEL COMPOSTO

98 21_D05 10100003 BIOCHANINA A

99 21_E04 00201138 DEGUELINA(-)

PIASTRA 22

100 22_B11 00200833 ACACETINA DIACETATO

101 22_C07 01504123 10-IDROSSICAMPTOTECINA

102 22_C10 01501113 PERUVOSIDE

103 22_G05 01503074 ALEXIDINA IDROCLORURO

PIASTRA 23

104 23_A08 01504079 TOMATINA

105 23_E08 01505180 6,2'-DIMETOSSIFLAVONE

106 23_F02 01505158 2,3-DICLORO-5,8-DI-IDROSSINAFTOCHINONE

107 23_F07 01505328 4'-DEMETILPIPODOFILLOTOSSINA

PIASTRA 24

108 24_C08 00300563 TRICLORMETINA

109 24_D02 01504410 PICROPODOFILLOTOSSINA

110 24_E05 01502083 N- (9-FLUORENILMETOSSICARBONIL)-L-LEUCINA

111 24_G03 01505311 DIBENZOILMETANO

112 24_G11 01504101 TETRACLOROISOFTALONITRILE

Il contro-screening ha selezionato soltanto 4 farmaci come veramente dipendenti dal 3’UTR di MYCN tre dei quali appartenevano alla classe della antracicline (dossorubicina, epirubicina, e daunorubicina), mentre il quarto era ciclopirossolammina (CPX), un composto antifungino sintetico appartenente alla classe degli idrossipiridoni (figura 2).

Esempio 5. Specificità della ciclopirossolammina (CPX) come farmaco che sovraregola la MYCN nelle cellule di neuroblastoma.

Per verificare la specificità dell’effetto di CPX per il 3’UTR di MYCN e la sua indipendenza dal clone, il trattamento à ̈ stato ripetuto con il clone CHP134-MYCN#3 ed i cloni CHP134-CTRL#19 e con altri due cloni indipendenti, di nuovo stabilmente transfettati con i plasmidi pGL4.26-MYCN3UTR e pGL4.26-CTRL (rispettivamente, i cloni CHP134-MYCN#1 e CHP134-CTRL#17).

Il trattamento con CPX 2uM e la misurazione dell’attività della luciferasi con il saggio della luciferasi OneGlow 24h hanno confermato i risultati dello screening (figura 3). Pertanto, à ̈ possibile concludere che la CPX ha suscitato un effetto specifico sul MYCN 3’UTR, indipendente dal clone, di aumentata espressione luciferasi nelle cellule di neuroblastoma CHP 134.

Esempio 6. Citotossicità cellulare dei farmaci che sovrapregolano la MYCN in cellule di neuroblastoma.

a) La citotossicità cellulare à ̈ stata eseguita mediante un saggio WST1 (Roche) seguendo le istruzioni del fabbricante: 15000 cellule sono state piastrate in ogni pozzetto di una piastra trasparente da 96 pozzetti SpectraPlate (PerkinElmer) in 150 ul di mezzo completo.

Dopo l’adesione, le cellule sono state trattate con i farmaci selezionati (tabella 1) alla concentrazione di 2 uM ed incubate a 37° con CO2al 5% ed umidità relativa al 100% per 24 o 48 ore. Al momento finale definito, 15 ul di reagente WST1 sono stati aggiunti e dopo 4 ore di incubazione a 37° con CO2al 5% ed umidità relativa al 100%, le piastre sono state lette per l’assorbanza a 450 nm in un lettore multipiastra Tecan F200 (Tecan).

Sono state necessarie diverse misurazioni per calcolare la crescita percentuale: tempo zero (Tz: che rappresenta una misurazione della popolazione cellulare al momento dell’aggiunta del farmaco), crescita di controllo (C: misure della crescita delle cellule trattate soltanto col veicolo dopo 24 o 48 ore) e crescita di test (Ti: che rappresenta una misurazione della popolazione cellulare dopo 24 o 48 ore). La crescita percentuale à ̈ calcolata come:

[(Ti-Tz)/(C-Tz)]x100 eq.(2) per concentrazioni per cui Ti>=Tz;

[(Ti-Tz)/Tz]x100 eq.(3) per concentrazioni per cui Ti<Tz.

I risultati di questo esperimento sono mostrati nella figura 4.

b) La citotossicità cellulare della CPX a diverse concentrazioni à ̈ stata valutata mediante il saggio WST1 (Roche) seguendo le istruzioni del fabbricante. Gli effetti dipendenti dalla dose della CPX sulla vitalità cellulare sono stati testati in 7 linee cellulari di neuroblastoma: CHP134 (ECACC), SK-N-BE(2) (ECACC), SIMA (DSMZ), LA-N-2 (ECACC), SK-N-MC (ECACC), SK-N-AS (ECACC), SK-N-SH (ECACC). 150 ul di cellule sono state piastrate in ogni pozzetto di una piastra trasparente da 96 pozzetti Spectra (PerkinElmer), a densità di piastratura varianti da 5000 a 40000 cellule per pozzetto, a seconda del tempo di duplicazione delle singole linee cellulari.

Dopo l’adesione, le cellule sono state trattate con concentrazioni differenti di CPX, varianti da una concentrazione di 66 nM a 66 uM, ed incubati a 37° con CO2al 5% ed umidità relativa al 100% per 48 ore. Al punto terminale definito, sono stati aggiunti 15 ul di reagente WST1 e dopo 4 ore di incubazione a 37° con CO2al 5% ed umidità relativa al 100%, le piastre sono state lette per l’assorbanza a 450 nm in un lettore multipiastra Tecan F200 (Tecan).

Sono state richieste diverse misurazioni al fine di calcolare la crescita percentuale: tempo zero (Tz: che rappresenta una misurazione della popolazione cellulare al momento dell’aggiunta del farmaco), crescita di controllo (C: misurazioni della crescita delle cellule trattate soltanto col veicolo dopo 48 ore) e crescita di test (Ti: che rappresenta una misurazione della popolazione cellulare dopo 48 ore dal trattamento con CPX).

La crescita percentuale à ̈ calcolata come in precedenza mediante le equazioni (2) e (3).

L’inibizione della crescita del 50% (GI50) à ̈ calcolata da:

[(Ti-Tz)/(C-Tz)]x100=50, eq.(4) che à ̈ la concentrazione del farmaco risultante in una riduzione del 50% delle cellule rispetto al controllo non trattato.

I risultati di questo esperimento sono mostrati nella Figura 5.

c) Il saggio di apoptosi à ̈ stato eseguito mediante citometria a flusso. Cellule CHP134 sono state inoculate in piastre da 10 cm alla concentrazione di 1x10<6>cellule in condizioni di coltura standard. In tre giorni, le cellule sono state trattate con CPX a diverse concentrazioni per 24 e 48 ore. Le cellule sono state poi raccolte, lavate con PBS freddo e trattate per il saggio di apoptosi utilizzando l’Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences)e seguendo le istruzioni del fabbricante. In breve, le cellule sono state colorate con FITC-Annexin V e PI (Propidio Ioduro) al fine di consentire l’identificazione di cellule morte (positive per FITC e PI), di cellule vitali (negative per FITC e PI) e cellule pre-apoptotiche (positive per FITC e negative per PI). L’acquisizione e l’analisi mediante citometria a flusso sono state eseguite con BD FACS Canto (BD Biosciences).

I risultati sono mostrati nella figura 6. I numeri indicano, rispettivamente, la percentuale di cellule apoptotiche/morte (P1) e cellule pre-apoptotiche (P2). Un effetto della CPX dipendente dalla dose e dal tempo sulla vitalità cellulare si riflette nell’aumento percentuale di cellule apoptotiche/morte (P1) e di pre-apoptotiche apoptotiche/morte (P1+P2).

Esempio 7. La CPX determina un aumento nei livelli della proteina MYCN

Per verificare se gli effetti di aumento della CPX sull’attività della luciferasi erano accompagnati da un aumento nei livelli della proteina MYCN, à ̈ cellule CHP134 piastrate in piastre di visualizzazione (BD) da 96 pozzetti e trattate per 24 h dopo l’adesione a concentrazioni differenti di CPX. Le cellule sono state fissate mediante paraforlmaldeide (PFA) al 3,7%, permeabilizzate con Triton X100 allo 0,1%, incubate con un anticorpo monoclonale di topo anti-MYCN (ab16898, ABCAM) e colorate con un anticorpo secondario anti-topo di coniglio Alexafluor 488.

Le immagini sono state acquisite con il sistema ad alto contenuto Operetta (PerkinElmer) ed analizzate mediante il software Harmony.

I risultati rappresentano l’intensità di fluorescenza nell’area nucleare precedentemente identificata mediante colorazione DAPI. È chiaro un aumento dipendente dalla dose nell’immunocolorazione nucleare della MYCN (figura 7).

Naturalmente, mentre il principio dell’invenzione rimane il medesimo, i dettagli strutturali e delle forme di realizzazione possono variare ampiamente rispetto a quello che à ̈ stato descritto e illustrato semplicemente a titolo d’esempio, senza allontanarsi dallo scopo della presente invenzione.

RIFERIMENTI

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- PMID:15632181 - Cui H, Li T, Ding HF. Linking of N-Myc to death receptor machinery in neuroblastoma cells. J Biol Chem. 2005 Mar 11;280(10):9474-81.

- PMID:11107122 - Fulda S, Lutz W, Schwab M, Debatin KM. MycN sensitizes neuroblastoma cells for drug-triggered apoptosis. Med Pediatr Oncol. 2000 Dec;35(6):582-4.

- PMID:17141950 - Paffhausen T, Schwab M, Westermann F Targeted MYCN expression affects cytotoxic potential of chemotherapeutic drugs in neuroblastoma cells. Cancer Lett.

2007 May 18;250(1):17-24.

LISTATO DELLE SEQUENZE

<110> Quattrone, Alessandro

<120> Metodo di screening di composti per il trattamento di tumori caratterizzati da oncoproteine MYC deregolate

<130> BIT13498-CF

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> Primer di integrazione DNA MYCN 3UTR diretto

<400> 1

gccaagaagg gcggcaagat cgccgtgtaa acgcttctca aaactggaca gtcac 55

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> Primer di integrazione DNA MYCN 3UTR inverso

<400> 2

cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtggccc cccaaccagg attgtacag 49

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> Primer diretto per MYCN 3UTR in E.coli

<400> 3

cgcaagatcc gcgagattc 19 <210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Primer inverso per MYCN 3UTR in E.coli

<400> 4

gcaagtgtag cggtcacg 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> Primo oligonucleotide per ottenere il plasmide pGL4.26-MYCN

<400> 5

ctagaaagta taatcgataa g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> Secondo oligonucleotide per ottenere il plasmide pGL4.26-MYCN

<400> 6

gatccttatc gattatactt t 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> Primo primer diretto per la PCR annidata per l’amplificazione del promotore CMV

ctagcaaaat aggctgtccc cagtg 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> Primo primer inverso per la PCR annidata per l’amplificazione del promotore CMV

<400> 8

cacaccacga tccgatggtt tg 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> Secondo primer diretto per la PCR annidata per l’amplificazione del promotore CMV

<400> 9

cgttacataa cttacggtaa atgg 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> Secondo primer inverso per la PCR annidata per l’amplificazione del promotore CMV

<400> 10

gaagtactcg gcgtaggtaa tg 22

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composto di formula (I): (I) in cui R<1>, R<2>r R<3>, che sono identici o differenti, sono un atomo di idrogeno od un alchile C1-4, e R<4>à ̈ un radicale idrocarburico lineare, ramificato o ciclico C6-9saturo od un radicale di formula (II) (II) in cui X à ̈ S o O, Y à ̈ un atomo d’idrogeno o fino a 2 atomi di un alogeno, Z à ̈ un legame singolo od un radicale bivalente scelto tra O, S, -CR2-, in cui R à ̈ un idrogeno od un gruppo alchilico C1-4, od altri radicali divalenti con 2-10 atomi di carbonio e, facoltativamente, atomi di O e/o S accoppiati sotto forma di catena, in cui – se i radicali contengono 2 o più atomi di O e/o S – questi ultimi sono reciprocamente separati da almeno 2 atomi di carbonio, ed essendo inoltre possibile per due atomi di carbonio adiacenti essere accoppiati tra loro mediante un doppio legame, e le valenze libere degli atomi di carbonio essendo saturate da un atomo di idrogeno e/o da gruppi alchilici C1-4, Ar à ̈ un sistema di anelli aromatici che ha fino a due anelli e che può essere sostituito da fino a tre radicali dal gruppo di fluoro, cloro, bromo, metossi, alchile C1-4, trifluorometile e trifluorometossi, loro sali e/o solvati, per l’uso nel trattamento di un tumore caratterizzato da oncoproteine MYC deregolate, in cui detto composto à ̈ capace di aumentare l’espressione dipendente dall’UTR di almeno un gene MYC.
2. 2. Composto secondo la rivendicazione 1, in cui R<1>, R<2>, R<3>e R<4>sono atomi di idrogeno.
3. 3. Composto secondo la rivendicazione 1, in cui R<1>Ã ̈ un gruppo metile, R<2>e R<3>sono atomi di idrogeno, e R<4>Ã ̈ un cicloesile.
4. 4. Composto secondo la rivendicazione 3, in cui il composto à ̈ un solvato con 2-amminoetanolo.
5. 5. Composto secondo la rivendicazione 1, in cui R<1>Ã ̈ un gruppo metile, R<2>e R<3>sono atomi di idrogeno, e R<4>Ã ̈ 2,4,4-trimetilpentile.
6. 6. Composto secondo la rivendicazione 5, in cui il composto à ̈ un solvato con 2-amminoetanolo.
7. 7. Composto secondo la rivendicazione 1, in cui R<1>Ã ̈ un gruppo metile, R<2>e R<3>sono atomi di idrogeno, e R<4>Ã ̈ 4-(4-clorofenossi)-fenossi-metile].
8. 8. Composto a base di 1-idrossipiridin-2-tione per l’uso nel trattamento di un tumore caratterizzato da oncoproteine MYC deregolate, in cui detto composto à ̈ capace di aumentare l’espressione dipendente dall’UTR dell’almeno un gene MYC.
9. 9. Composto a base di 3-idrossi-1,2-dimetilpiridin-4-one per l’uso nel trattamento di un tumore caratterizzato da oncoproteine MYC deregolate, in cui detto composto à ̈ capace di aumentare l’espressione dipendente dall’UTR dell’almeno un gene MYC.
10. 10. Composto secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui il tumore à ̈ selezionato tra: neuroblastoma, medulloblastoma, retinoblastoma, microcitoma, glioma, rabdomiosarcoma alveolare, tumore neuroectodermico primitivo, cancro della mammella, cancro esofageo, cancro cervicale, cancro ovarico, cancro della testa e del collo.
11. 11. Composto secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui almeno un gene MYC Ã ̈ selezionato tra i geni MYC, MYCN e MYCL.