ITTO20100865A1 - Purificazione ed amplificazione di acidi nucleici in un dispositivo microfluidico comprendente superfici di polidimetilsilossano - Google Patents
Purificazione ed amplificazione di acidi nucleici in un dispositivo microfluidico comprendente superfici di polidimetilsilossano Download PDFInfo
- Publication number
- ITTO20100865A1 ITTO20100865A1 IT000865A ITTO20100865A ITTO20100865A1 IT TO20100865 A1 ITTO20100865 A1 IT TO20100865A1 IT 000865 A IT000865 A IT 000865A IT TO20100865 A ITTO20100865 A IT TO20100865A IT TO20100865 A1 ITTO20100865 A1 IT TO20100865A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- microfluidic
- nucleic acid
- amplification
- biological sample
- process according
- Prior art date
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 24
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 17
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 34
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 34
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims description 13
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 10
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 7
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 7
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 6
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000002161 passivation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 7
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 6
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 208000018565 Hemochromatosis Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 2
- 208000022806 beta-thalassemia major Diseases 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002032 lab-on-a-chip Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001234 nutrigenomic effect Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002174 soft lithography Methods 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002725 thermoplastic elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012815 thermoplastic material Substances 0.000 description 1
- 229920001187 thermosetting polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004634 thermosetting polymer Substances 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Purificazione ed amplificazione di acidi nucleici in un dispositivo microfluidico comprendente superfici di polidimetilsilossano"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce al settore dei dispositivi microf luidici , del tipo denominato correntemente con il termine LAB-ON-A-CHIP, atti ad effettuare su di un campione un saggio biologico comprendente uno stadio di estrazione/purificazione di acidi nucleici (DNA) dal campione ed uno stadio di amplificazione/rivelazione degli acidi nucleici mediante reazione a catena della polimerasi (PCR e RT-PCR).
Recentemente, sono stati proposti e descritti dispositivi microfluidici che consentono di effettuare, in un'unica struttura integrata, le tre operazioni di estrazione degli acidi nucleici, amplificazione e rivelazione.
Chen et al. in Biomed. Microdevices (2010) 12:705-719, descrive un dispositivo del tipo sopra citato, in cui si effettuano le operazioni di lisi, isolamento dell'acido nucleico, amplificazione enzimatica e rivelazione in una struttura di policarbonato. In tale microdispositivo, la fase di estrazione del DNA viene effettuata con sali caotropici su membrane di silicio e successiva eluizione, e la reazione di PCR avviene con passivazione dinamica con l'impiego di BSA (albumina bovina); nonostante il dispositivo microfluidico consenta di effettuare il saggio biologico nella sua interezza, le reazioni dei singoli stadi devono essere effettuate spostando il campione in zone fisicamente diverse del dispositivo.
W02006/085948 descrive un dispositivo microfluidico integrato includente una regione di estrazione/purificazione di acidi nucleici ed una regione di amplificazione/rivelazione, effettuate mediante RT-PCR. Questo dispositivo presenta, nella regione di estrazione del DNA, colonnine microfabbricate con rivestimento di silice e la purificazione del DNA è effettuata utilizzando un tampone di lisi, contenente sali caotropici, atto ad aprire le cellule ed a legare il DNA alle colonnine microfabbricate. Dopo uno stadio di lavaggio per la rimozione del materiale indesiderato, il DNA viene rilasciato dalle colonnine ed utilizzato per la reazione di RT-PCR in una regione di amplificazione con superfici passivate mediante BSA.
EP 2 160243 Al descrive un dispositivo microfluidico atto ad effettuare la lisi cellulare e l'estrazione del DNA; il PDMS (polidimetilsilossano) è indicato tra i vari materiali utilizzabili per la struttura del microdispositivo; tuttavia, il microdispositivo presenta una struttura di tipo modulare con regioni e parti diverse, specificatamente studiate per utilizzare ed eseguire parte dei protocolli contemplati; l'operazione di amplificazione del DNA viene effettuata trasferendo il DNA in un'unità di amplificazione.
Sono altresì noti dispositivi microfluidici di PDMS predisposti per amplificazione genica e/o rivelazione; in questi microdispositivi vengono sempre utilizzati agenti passivanti per modificare le superfici di PDMS ed ottenere l'amplificazione del materiale genico.
Frey et al. in Biomed. Microdevices (2007) 9:711-718 descrive un sistema di amplificazione miniaturizzata in PDMS, in cui nel mix di PCR viene inserito un colorante specifico per il DNA a doppia elica; le pareti del dispositivo in PDMS sono ricoperte con poli "L-lisina" coniugata con poli etilenglicole (PLL-g-PEG), per rendere la superficie idrofilica ed aumentare la resa PCR.
La presente invenzione si fonda sulla scoperta del fatto che superfici di polidimetilsilossano, in virtù delle loro caratteristiche chimiche e morfologiche, presentano la capacità spontanea di adsorbire gli acidi nucleici. In vista di tale scoperta, l'invenzione fornisce così un procedimento semplificato per l'effettuazione di saggi biologici comprendenti l'estrazione/purificazione di acidi nucleici da un campione biologico, ed altresì l'amplificazione dell'acido nucleico, con l'impiego di un singolo dispositivo microfluidico.
Costituisce così un oggetto dell'invenzione un procedimento per l'effettuazione di un saggio diagnostico/biologico avente le caratteristiche quali definite nelle rivendicazioni che seguono.
A seguito dell'invenzione, si è rilevato che l'adsorbimento di acidi nucleici su superfici di PDMS è spontaneo e non necessita di alcun tipo di trattamento o modifica superficiale per essere promosso. Conseguentemente, l'operazione di estrazione/purificazione del DNA può essere eseguita ponendo il campione biologico, precedentemente U sato o opzionalmente in una soluzione di lisi, a diretto contatto con superfici di PDMS, ove tali superfici non sono funzionalizzate o modificate preventivamente al contatto con il campione biologico.
Nell'ambito dell'invenzione si contempla così l'impiego di superfici di PDMS che siano:
strati bidimensionali (ove con tale termine si intendono strati molto sottili) usati come ricoprimento di altri materiali, nella forma di superfici piane o con piccole curvature (ad esempio rivestimenti interni di dispositivi microfluidici) o a forma circolare o sferica, con alte curvature (ad esempio rivestimento di materiali in forma di beads o capillari);
superfici di parti massive in PDMS piane o a piccola curvatura (ad esempio dispositivi microfluidici o parti di essi) o a forma circolare o sferica con alte curvature (ad esempio beads o capillari).
Pertanto, in una prima forma di attuazione, tali superfici di PDMS possono far parte di dispositivi microfluidici fabbricati con diversi materiali, quali silicio, silicio-vetro, vetro, metalli compositi, ossidi, polimeri, polimeri termoplastici, polimeri termoindurenti, elastomeri, elastomeri termoplastici .
In questi casi, il PDMS può:
ricoprire le superfici interne del dispositivo ottenuto secondo la tecnoloqia prevista per la classe di materiali utilizzati per la fabbricazione;
può altresì costituire strutture ausiliarie inserite nella struttura fluidica primaria al solo scopo di aumentare la superficie specifica interna di PDMS in qrado di adsorbire spontaneamente DNA.
Il massimo beneficio che il sistema, oqqetto della presente invenzione, è in qrado di apportare in termini di riduzione di costi e tempi di analisi, si ottiene costruendo sistemi microfluidici utilizzando unicamente PDMS. Il dispositivo interamente realizzato in polidimetilsilossano, mediante processo di casting in stampo aperto, permette una significativa riduzione del costo, rispetto sia a materiali tradizionali quali vetro e silicio, sia ad altri materiali polimerici quali le resine e i materiali termoplastici.
In una forma di attuazione preferita, il dispositivo è formato da una parte principale in cui sono definite le diverse funzionalità (chip), e da una base piana formata da una sottile membrana che consente la chiusura degli elementi fluidici definiti nel corpo principale attraverso un processo di incollaggio (bonding) mediante uno strato sottile dello stesso materiale (PDMS) reticolato in sede. Inoltre, i processi di lisi cellulare del campione di sangue, di purificazione/estrazione del DNA, di PCR ed infine di rivelazione, vengono eseguiti nella stessa struttura senza bisogno di zone distinte per le diverse operazioni. Potendo utilizzare sangue intero (ma non solo) come campione biologico, il sistema proposto risulta adatto alla diagnosi di malattie geniche, oltre che alla rivelazione di patogeni.
Questo, unitamente alla semplificazione costruttiva e all'abbattimento dei costi, caratteristiche della proposta, lo rende adatto allo sviluppo di sistemi "point-of-care". La purificazione del DNA avviene sfruttando la semplice interazione chimico-morfologica con il materiale del dispositivo, e la reazione di PCR viene effettuata direttamente sul DNA adsorbito sulle pareti del dispositivo, senza la necessità di particolari trattamenti con agenti passivanti per poter essere svolta efficacemente.
L'invenzione consiste nell'utilizzo innovativo di un sistema miniaturizzato per la rivelazione di patologie a partire da quantità ridotte di fluidi biologici (circa 7 μΐ di sangue).
Il principale componente del dispositivo è un chip realizzato in PDMS accoppiato ad una base (membrana) nello stesso materiale, eventualmente ottenuta stendendo un velo sottile (ad esempio per spinning) su una superficie rigida, liscia e più conduttiva termicamente rispetto al polimero (ad esempio silicio). La fabbricazione sfrutta la semplice e poco costosa tecnologia di casting (colata in stampo aperto).
In seguito alla reticolazione ed estrazione, le due parti (base e chip) vengono incollate mediante un velo sottile dello stesso polimero, interposto tra la base e il chip, e quindi fatto reticolare.
Tale chip deve assolvere la funzione di contenere il volume di reazione, senza interferire nelle reazioni biologiche e garantendo ermeticità in tutte le fasi delle reazioni.
Il processo di estrazione del DNA può essere attuato utilizzando circa 5-10 μΐ di materiale biologico, in meno di trenta minuti. Il sistema di estrazione non necessita di trattamenti superficiali del dispositivo, ma sfrutta il naturale adsorbimento del materiale biologico sulle pareti del dispositivo stesso.
I sistemi convenzionali di PCR richiedono l'intervento di personale specializzato per il loro utilizzo e sono condotti impiegando tubi di reazione in polipropilene con volumi di 25 μΐ o maggiori che sono caratterizzati da una bassa conducibilità e da un'alta inerzia termica. L'utilizzo della base in silicio, permette di abbreviare i tempi per la reazione di PCR grazie alla miglior conducibilità termica del materiale.
La rivelazione in fluorescenza avviene tramite l'impiego di sonde marcate, e può essere integrata direttamente nel sistema, effettuando un monitoraggio on-line del segnale fluorescente e/o una misurazione al termine del processo di amplificazione direttamente sul dispositivo.
Il sistema è concepito per permettere diagnosi in maniera veloce ed economica; ciò trova applicazione negli screening di massa, nelle analisi in loco, ad esempio in favore dei degenti ospedalieri per individuare infezioni nosocomiali direttamente al letto del paziente.
Nei disegni annessi, forniti a titolo di esempio non limitativo:
la fig. 1 è un'immagine di un dispositivo dimostrativo, realizzato interamente in PDMS;
la fig. 2A è una vista in sezione verticale del dispositivo della fig. 1; e
la fig. 2B è una vista schematica dall'alto. Il dispositivo (o chip) microfluidico è formato da due parti:
1. un corpo principale 2, nel quale sono definite le funzionalità del chip; e
2. una base 4 che serve per chiudere il dispositivo, garantendo il confinamento dei fluidi nel volume di lavoro.
Entrambe le parti vengono fabbricate in PDMS attraverso un processo di colata in stampo aperto (casting) del polimero precedentemente mescolato con l'agente reticolante. Il PDMS è un polimero elastomerico, disponibile come prodotto bi-componente, che viene preparato miscelando il polimero ad un agente reticolante.
Dopo degasamento si versa la miscela in uno stampo con geometria duale rispetto a quella dell'oggetto che si vuole ottenere, si lascia degassare e si riscalda il materiale nello stampo ad una temperatura compatibile con quella del materiale che forma lo stampo stesso (usualmente 75°C per 45 minuti) oppure si conduce la reazione a temperatura ambiente per almeno 24 ore.
La composizione del PDMS finale, definita come il rapporto in peso di polimero rispetto all'agente reticolante può essere scelta in base a caratteristiche finali d'impiego, quali ad esempio la rigidezza. Per i dispositivi fabbricati a titolo di esempio per la presente invenzione, si è scelto di utilizzare, a puro fine dimostrativo, una composizione pari a 10 parti in peso di polimero e 1 di agente reticolante (10:1).
Il mescolamento è eseguito per via manuale. Il polimero così ottenuto viene colato negli stampi e sottoposto a riscaldamento al fine di promuovere la reazione di reticolazione. Il materiale viene quindi estratto dallo stampo e può essere utilizzato.
I dispositivi preparati per questa dimostrazione sono caratterizzati dalla presenza di una sola camera 6 di reazione con forma all'incirca ellittica, connessa a due fori 8, 10 (inlet e outlet), disposti lungo l'asse maggiore della struttura (si veda l'immagine proposta nella fig. 1). Il volume totale disponibile in questo dispositivo dimostrativo è pari a 15 μΐ.
Lo stampo utilizzato per questa dimostrazione è stato fabbricato con lavorazione meccanica ad alta precisione mediante fresa a controllo numerico. Il volume di lavoro, utilizzando questa tecnologia, e conservando invariata la forma della camera, può scendere sino a 10 μΐ. Un'ulteriore riduzione si può ottenere utilizzando oli buffer compatibili con le soluzioni, in modo da occupare con quegli oli i canali (minimo volume 5 μΐ).
Un'ulteriore riduzione di volume si può ottenere fabbricando lo stampo attraverso l'impiego di microtecnologie e modificando la forma della zona di lavoro da camera a canale microfluidico. In letteratura c'è evidenza di volumi minimi fabbricabili in dispositivi interamente costituiti di PDMS via soft-lithography, dell'ordine di 1.75 μΐ [A. Ranjit Prakash et al. Sensors and Actuators B 113 (2006) 398-409].
La base del dispositivo può essere fabbricata come:
membrana self-standing, attraverso processo di casting in stampo avente struttura duale di quella di interesse;
film depositato e assottigliato (con utensili come, ad esempio, spatole) o via spinning su una superficie di supporto rigido, che conduca il calore in modo più efficiente del PDMS (metalli, compositi, silicio, silicio-vetro, vetro).
Le due parti (corpo e base) vengono unite mediante layer di PDMS non-reticolato posizionato tra il corpo e la base e poi lasciato reticolare (ma altre modalità di bonding possono essere scelte).
Per il processo di estrazione e di amplificazione del DNA non sono necessari trattamenti del dispositivo. Il dispositivo può essere alimentato con un materiale biologico costituto da acidi nucleici precedentemente purificati, o un materiale biologico includente acidi nucleici in un solvente o in una soluzione di lisi; preferibilmente, tale materiale non comprende solventi o Sali caotropici. Il materiale biologico viene incubato sul dispositivo e, grazie alla struttura chimica e morfologica della superficie del PDMS, viene assorbito su di esso. I lavaggi, effettuati per eliminare componenti che potrebbero interferire con la successiva reazione di amplificazione, lasciano disponibile il materiale biologico sulle pareti del dispositivo.
Il dispositivo permette di ottenere DNA sufficientemente purificato da detriti cellulari, emoglobina, proteine, lipidi ed altro materiale proveniente dalla lisi delle cellule del sangue senza la necessità di trattamenti superficiali, ed utilizzabile senza ulteriori processi di purificazione nelle successive analisi.
Questo avviene con l'utilizzo di una minima quantità di materiale biologico di partenza, ridotte quantità di reagenti e soprattutto una ridotta durata del processo di estrazione (30 minuti) rispetto alle circa 2-3 ore necessarie per un'estrazione in condizioni standard che utilizza volumi dell'ordine di almeno decine di μΐ.
La reazione di amplificazione viene effettuata direttamente sul materiale biologico adsorbito sulla superficie del dispositivo, che è sufficientemente esposto e disponibile per la reazione, senza la necessità di staccarlo dalle pareti. Inoltre, la reazione di amplificazione avviene senza la necessita di utilizzare agenti passivanti quali BSA (bovine serum albumin) o PVP (polivinilpirrolidone), comunemente utilizzati su questo tipo di materiale.
Mediante un opportuno protocollo di rivelazione fluorescente è inoltre possibile utilizzare il microchip per la determinazione specifica dell'aumento del DNA amplificato. Nella miscela della reazione di PCR possono essere presenti due sonde specifiche, ciascuna legata ad un diverso fluoroforo oppure può essere presente una sola sonda specifica o un indicatore fluorescente dell'amplificazione. Tale sistema permette, attraverso l'analisi della fluorescenza rilevata alla fine della reazione di PCR, di definire l'identità del nucleotide indagato.
Ciò pertanto si presta ad essere impiegato in qualsiasi tipo di screening mutazionale (trova quindi impiego nella diagnostica genetica relativa alle malattie genetiche ereditarie quali fibrosi cistica, emocromatosi, sordità, anemia mediterranea, condroplasia, ecc.), nonché nelle analisi di genotipizzazione (studio dei polimorfismi nucleotidici singoli o SNP) relative a studi di suscettibilità a malattie dai tratti complessi (obesità, malattie cardiovascolari, osteoporosi, ecc.) e, potenzialmente, si apre alla possibilità di effettuare studi di espressione genica su un buon numero di campioni, monitorando la crescita di fluorescenza durante la reazione di PCR, in tempo reale.
Dettagli di esempi di implementazione
Esempio 1: Purificazione di acidi nucleici
Il sistema di purificazione ed il relativo protocollo descritti in questo esempio sono stati messi a punto su microchip con volume di circa 15 μΐ, utilizzando inizialmente DNA genomico umano purificato. L'efficienza di estrazione dei dispositivi è stata verificata con quantità di DNA genomico purificato fino a 100 ng.
Dato l'esito positivo del processo di estrazione e considerato che nella quantità di sangue da utilizzare sono presenti circa 200 ng di DNA, si è proceduto con le prove usando sangue intero, mettendo a punto un protocollo di lisi in chip.
7 μΐ di materiale biologico (sangue intero in EDTA e decongelato) sono stati uniti a 7 μΐ di soluzione di lisi non contenente sali o solventi caotropici e 0,7 μΐ di proteinasi K ed inseriti nel chip. Il chip è stato successivamente alloggiato nel termociclatore apposito e si è proceduto ad applicare il seguente protocollo termico: innalzamento a 56°C, permanenza a questa temperatura per 10 minuti.
Alla fine del ciclo termico il micro-chip viene tolto dal termociclatore ed il materiale biologico lisato viene lasciato adsorbire per 20 minuti a temperatura ambiente sulle pareti del dispositivo.
Al termine dell'incubazione viene lavato il dispositivo inserendovi 15 μΐ di acqua ultrapura per almeno 5 volte consecutivamente, rimuovendo infine l'acqua rimasta in contatto. Al termine del processo di lavaggio, il DNA che rimane adsorbito sulle pareti del dispositivo è disponibile per il successivo processo di amplificazione PCR senza la necessità di doverlo staccare dalle pareti.
Esempio 2: PCR
Il DNA usato come stampo proviene dal processo di purificazione descritto nell'esempio 1 e viene utilizzato direttamente nella miscela di PCR, senza la necessità di staccarlo dalle pareti del dispositivo, dando luogo a prodotti ben visibili al termine dell'amplificazione. La reazione di PCR viene quindi condotta nel termociclatore, con il seguente protocollo, qui di seguito descritto a titolo di esempio.
Una miscela standard di reagenti PCR contiene 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μΜ di ogni primer C282Y forward e reverse, 1,5U di HotStartTaQ polymerase Roche in 15 μΐ. Il protocollo usato è composto dai seguenti cicli: 1 ciclo a 95°C per 5 minuti, 35 cicli a 95°C per 30 secondi, 62°C per 30 secondi e 72°C per 30 secondi, 1 ciclo a 72°C per 7 minuti. La regione genica amplificata in questo esempio è correlata ad una mutazione puntiforme che causa 1'emocromatosi.
Al termine della reazione la soluzione ottenuta viene utilizzata in questo esempio in una cella elettroforetica per un controllo della purezza del DNA così ottenuto (gel di agarosio al 2% contenente etidio bromuro). In alternativa, utilizzando un protocollo apposito descritto nel prossimo punto, viene rivelato monitorando un segnale di fluorescenza.
Esempio 3: Rivelazione in fluorescenza Attualmente, la funzionalità del sistema di rivelazione in fluorescenza è stata dimostrata impiegando i medesimi chip PCR utilizzati per la rivelazione elettroforetica, che utilizzano un volume di reazione di circa 15 μΐ.
Come sistema di eccitazione e rivelazione del segnale fluorescente è stato impiegato un microscopio a fluorescenza con le seguenti caratteristiche:
2 obiettivo lOx (area acquisita 1000x800 pm ), lampa-da a mercurio 120W, filtro eccitazione passabanda 480/40 nm, filtro emissione passabanda 527/30 nm, tempo di integrazione circa 0,6 sec.
I valori di fluorescenza sono stati misurati su
2
di un'area di circa 400.000 pm , che corrisponde ad una porzione ridotta del microchip utilizzato e quindi ad un volume di reazione inferiore ai 500 ni. Sono state utilizzate sonde fluorescenti del tipo TaqMan®, complementari ad una regione interna della sequenza genica da amplificare la cui presen-za induce un segnale fluorescente in seguito alla repressione di un quenching di fluorescenza.
Ne risulta quindi una rivelazione specifica dell 'amplificato che si desidera monitorare, anche in Real-Time. Il protocollo utilizzato e di seguito descritto, è un esempio di quelli sperimentati con successo negli esperimenti che integrano PCR e detection .
Una miscela standard di reagenti PCR contiene 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, soluzione madre conte-nente primer for e rev e le sonde TaqMan concentra-ta IX (TaqMan® SNP Genotyping Assay) , 1 Unità di HotStartTaQ polymerase Roche. Il protocollo usato è composto dai seguenti cicli: 1 ciclo a 95°C per 10 minuti, 40 cicli a 92°C per 15 secondi, 60°C per 1 minuto.
Nel nostro caso le misure sono state eseguite sia comparando il segnale di fluorescenza di uno stesso chip prima e dopo la PCR sia confrontando il segnale di chip contenenti la miscela sopra descritta ("positivi") con quello di chip di controllo ("negativi": ad esempio privi di templato, o in alternativa completi di tutti i reagenti, ma non sottoposti ai cicli termici di PCR). I valori tipici rilevati passano da circa 1.000 (nei controlli negativi) a circa 10.000 unità arbitrarie per i campioni positivi, con incremento del segnale di circa 10 volte e quindi facilmente rivelabile.
AREE DI APPLICAZIONE PRINCIPALI
Il sistema proposto, integrando le funzioni di: 1) lisi cellulare e purificazione del DNA;
2) amplificazione mediante PCR; e
3) sistema di rilevazione on-line della fluorescenza,
potrà essere impiegato nella diagnosi di patologie causate da mutazioni. Specifiche coppie di primer localizzate a cavallo della zona del gene indagato per la presenza/assenza della mutazione, un sistema di coppie di sonde fluorescenti atte a definire l'identità del nucleotide nella posizione in esame, potranno essere impiegate nella reazione di PCR miniaturizzata; l'analisi del segnale di fluorescenza presente dopo la fase di amplificazione genica, fornirà l'identità del nucleotide in questione e quindi la presenza o meno della mutazione.
Il sistema si presta bene alla parallelizzazione del processo; in tal senso, mediante reazioni di amplificazione multiple potranno essere caratterizzati, per la medesima mutazione, molteplici individui o, viceversa, potranno essere saggiate contemporaneamente più mutazioni per soggetto.
Le applicazioni del sistema in oggetto sono numerose e riguardano tutte le patologie ereditarie causate da mutazioni del codice genetico (fibrosi cistica, emocromatosi, sordità, anemia mediterranea, condroplasia, Còrèa di Huntington, ecc.); l'economicità dell'analisi, la semplicità con cui può essere recuperato il campione ematico dal paziente, la rapidità d'esecuzione rendono il sistema impiegabile in ambito ospedaliero.
Inoltre, la possibilità di individuare l'identità nucleotidica in uno specifico punto del codice genetico rende il sistema utile alla genotipizzazione di un certo numero di individui e quindi rende possibile estrapolare informazioni relative alle cosiddette patologie dai tratti complessi, cioè quelle patologie per cui non vale l'assioma "una mutazione = una patologia", ma che piuttosto traggono origine da una somma di cause tra cui lo stile di vita, fattori ambientali e non ultime le cause genetiche; specifici pattern di polimorfismi potrebbero essere predisponenti per alcune di tali patologie (obesità, malattie cardiovascolari, osteoporosi, tumori e altre).
Più in generale quindi, il dispositivo oggetto di questo brevetto, troverebbe impiego nell'ambito dei Test Predittivi (riguardo a malattie complesse e comuni) che identificano situazioni di suscettibilità o di resistenza nei confronti delle patologie in esame; questo tipo di determinazione non conferisce nessuna certezza a riguardo del manifestarsi della malattia, piuttosto dà indicazioni circa un aumento del rischio di svilupparla, in concomitanza con fattori ambientali scatenanti.
Inoltre resta inteso che qualsiasi applicazione e ambito che preveda l'impiego di una reazione di PCR potrà trarre vantaggio dal sistema in oggetto, in una modalità economica e veloce. Tutti gli ambiti che traggono informazioni dalla genotipizzazione (medicina molecolare, farmacogenomica, nutrigenomica, medicina personalizzata) potranno avvalersi del dispositivo oggetto di questo brevetto, con il singolo paziente come fruitore d'elezione; il dispositivo infatti non è pensato per determinazioni su un numero illimitato di pazienti, ma, viceversa, per dare vantaggio alla diagnosi personalizzata.
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per l'effettuazione di un saggio diagnostico, comprendente almeno uno stadio di estrazione e/o purificazione di acido nucleico da un campione biologico ed uno stadio di amplificazione ed opzionalmente rivelazione dell'acido nucleico, detti stadi essendo effettuati in un singolo dispo-sitivo microfluidico, comprendente almeno una came-ra o canale microfluidico avente almeno una super-ficie a diretto contatto con il campione biologico, suscettibile di adsorbire l'acido nucleico, carat-terizzato dal fatto che detta almeno una superficie è una superficie di polidimetilsilossano posta a diretto contatto con il campione biologico, detta superficie essendo priva di rivestimenti e non es-sendo funzionalizzata o modificata preventivamente al contatto con il campione biologico.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, ca-ratterizzato dal fatto che lo stadio di amplifica-zione dell'acido nucleico viene eseguito sull'acido nucleico adsorbito su detta almeno una superficie di adsorbimento senza causarne il desorbimento ed in assenza di un trattamento di passivazione di detta almeno una superficie di adsorbimento.
- 3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 o 2, caratterizzato dal fatto che lo stadio di estrazio-ne/purificazione e lo stadio di amplificazione dell'acido nucleico sono eseguiti nella stessa ca-mera o canale microfluidico, senza richiedere lo spostamento dell'acido nucleico dalla superficie di adsorbimento ad un'altra superficie di detta camera o canale.
- 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle riven-dicazioni 1 a 3, caratterizzato dal fatto che detto stadio di estrazione/purificazione di acido nucleico in detto dispositivo microfluidico è effettuato mediante iniezione in detto dispositivo di un cam-pione biologico in una soluzione di lisi non conte-nente sali o solventi caotropici e sottoponendo il campione iniettato a trattamento termico atto a de-terminare la lisi cellulare del campione biologico.
- 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle riven-dicazioni 1 a 4, caratterizzato dal fatto che detto dispositivo microfluidico è un dispositivo formato integralmente da un primo ed un secondo substrato, definenti congiuntamente un canale microfluidico, formato integralmente da polidimetilsilossano.
- 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle riven-dicazioni 1 a 4, caratterizzato dal fatto che detto dispositivo microfluidico è formato da un primo ed un secondo substrato definenti congiuntamente un canale microfluidico ove detto primo e secondo substrato sono formati da un materiale scelto tra silicio, silicio-vetro, materiali metallici, cera-mici o polimerici, presentanti superfici destinate al contatto con il campione biologico, rivestite di polidimetilsilossano .
- 7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, ca-ratterizzato dal fatto che detto dispositivo microfluidico include in detta camera o canale microfluidico strutture ausiliarie interamente costitui-te di polidimetilsilossano o con superfici rivesti-te di polidimetilsilossano.
- 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle riven-dicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto dispositivo microfluidico comprende una sin-gola camera o canale microfluidico.
- 9. Impiego di polidimetilsilossano (PDMS) non mo-dificato come materiale per l'adsorbimento di acidi nucleici in dispositivi microfluidici predisposti per saggi di estrazione/purificazione e/o amplifi-cazione di acidi nucleici.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000865A ITTO20100865A1 (it) | 2010-10-29 | 2010-10-29 | Purificazione ed amplificazione di acidi nucleici in un dispositivo microfluidico comprendente superfici di polidimetilsilossano |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000865A ITTO20100865A1 (it) | 2010-10-29 | 2010-10-29 | Purificazione ed amplificazione di acidi nucleici in un dispositivo microfluidico comprendente superfici di polidimetilsilossano |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITTO20100865A1 true ITTO20100865A1 (it) | 2012-04-30 |
Family
ID=43738404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT000865A ITTO20100865A1 (it) | 2010-10-29 | 2010-10-29 | Purificazione ed amplificazione di acidi nucleici in un dispositivo microfluidico comprendente superfici di polidimetilsilossano |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | ITTO20100865A1 (it) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006088907A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | University Of Virginia Patent Foundation | Nucleic acid isolation methods and materials and devices thereof |
| WO2008149111A1 (en) * | 2007-06-07 | 2008-12-11 | Norchip A/S | A device for carrying out cell lysis and nucleic acid extraction |
-
2010
- 2010-10-29 IT IT000865A patent/ITTO20100865A1/it unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006088907A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | University Of Virginia Patent Foundation | Nucleic acid isolation methods and materials and devices thereof |
| WO2008149111A1 (en) * | 2007-06-07 | 2008-12-11 | Norchip A/S | A device for carrying out cell lysis and nucleic acid extraction |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ALLEMAND J-F ET AL: "pH-dependent specific binding and combing of DNA", BIOPHYSICAL JOURNAL, BIOPHYSICAL SOCIETY, US, vol. 73, 1 October 1997 (1997-10-01), pages 2064 - 2070, XP002974837, ISSN: 0006-3495 * |
| ANNEGRET BENKE: "Aufbau nanoskopischer Netzwerke aus DNA und Bindeproteinen", THESIS,, 25 October 2007 (2007-10-25), pages 1 - 109, XP009148066, Retrieved from the Internet <URL:http://d-nb.info/987096206/34> * |
| RANJIT PRAKASH A ET AL: "Small volume PCR in PDMS biochips with integrated fluid control and vapour barrier", SENSORS AND ACTUATORS B, ELSEVIER SEQUOIA S.A., LAUSANNE, CH, vol. 113, no. 1, 17 January 2006 (2006-01-17), pages 398 - 409, XP025111741, ISSN: 0925-4005, [retrieved on 20060117], DOI: DOI:10.1016/J.SNB.2005.03.049 * |
| XIANG Q ET AL: "Miniature real time PCR on chip with multi-channel fiber optical fluorescence detection module", BIOMEDICAL MICRODEVICES, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, vol. 9, no. 4, 30 January 2007 (2007-01-30), pages 443 - 449, XP019524262, ISSN: 1572-8781, DOI: DOI:10.1007/S10544-007-9048-4 * |
| XIANG Q ET AL: "Real Time PCR on Disposable PDMS Chip with a Miniaturized Thermal Cycler", BIOMEDICAL MICRODEVICES, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, vol. 7, no. 4, 1 December 2005 (2005-12-01), pages 273 - 279, XP019205114, ISSN: 1572-8781, DOI: DOI:10.1007/S10544-005-6069-8 * |
| XING CHEN ET AL: "High Purity DNA Extraction with a SPE Microfluidic Chip Using KI as the Binding Salt", CHINESE CHEMICAL LETTERS, ELSEVIER LTD, GB, vol. 17, no. 8, 1 January 2006 (2006-01-01), pages 1101 - 1104, XP009148134, ISSN: 1001-8417 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2280905B1 (en) | Multilevel microfluidic systems and methods | |
| US8389960B2 (en) | Microfluidic devices and methods | |
| CN103282121B (zh) | 用于核酸提取和分级分离的微流体装置 | |
| Shin et al. | Solid phase nucleic acid extraction technique in a microfluidic chip using a novel non-chaotropic agent: dimethyl adipimidate | |
| Park et al. | Selection and elution of aptamers using nanoporous sol-gel arrays with integrated microheaters | |
| US9250169B2 (en) | Selective capture and release of analytes | |
| JP2019515308A (ja) | 集積型マイクロ流体チップおよび使用方法 | |
| JP2017514686A (ja) | マルチインデックス検出マイクロ流体チップおよび使用方法 | |
| JP2011522219A (ja) | マイクロ流体チップ装置およびその使用 | |
| US8092999B2 (en) | Biological sample reaction chip and biological sample reaction method | |
| WO2014112671A1 (ko) | 핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법 | |
| US20190309346A1 (en) | Combined Extraction and PCR Systems | |
| KR101816520B1 (ko) | 다중 분자진단을 위한 칩 구조 | |
| Potrich et al. | OncomiR detection in circulating body fluids: a PDMS microdevice perspective | |
| Sung et al. | Isolation and quantification of extracellular vesicle-encapsulated microRNA on an integrated microfluidic platform | |
| WO2003106031A1 (en) | Method and device for detecting the presence of an analyte in a test sample | |
| Huang et al. | An automated microfluidic DNA microarray platform for genetic variant detection in inherited arrhythmic diseases | |
| Xu et al. | Microfluidic single‐cell multiomics analysis | |
| CN111250177A (zh) | 一种生物分子检测方法 | |
| CN103667011A (zh) | 用于环介导等温扩增的微流控芯片、其制备方法和应用 | |
| Zhu et al. | A microfluidic device for multiplex single-nucleotide polymorphism genotyping | |
| KR20130066293A (ko) | 핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법 | |
| ITTO20100865A1 (it) | Purificazione ed amplificazione di acidi nucleici in un dispositivo microfluidico comprendente superfici di polidimetilsilossano | |
| US20160258005A1 (en) | Methods for rapid ribonucleic acid fluorescence in situ hybridization | |
| WO2014043528A1 (en) | Microfluidic device for biological sample preparation |