ITTO20110864A1 - Aggregati supramolecolari, formulati con monomeri anfifilici funzionalizzati con agenti chelanti e con peptidi e loro impiego per la somministrazione selettiva di farmaci e/o mezzi di contrasto. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Aggregati supramolecolari, formulati con monomeri anfifilici funzionalizzati con agenti chelanti e con peptidi e loro impiego per la somministrazione selettiva di farmaci e/o mezzi di contrasto"

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda la preparazione e l'uso di aggregati supramolecolari, come ad esempio liposomi, formulati con monomeri anfifilici funzionalizzati con agenti chelanti e con peptidi analoghi del peptide bombesina (sequenza endogena, peptidi analoghi o peptidomimetici, agonisti o non agonisti). I liposomi, caricati al loro interno con farmaci citotossici, quali ad esempio la doxorubicina, agiscono da sistemi di delivery selettivo di farmaci antitumorali e possono eventualmente essere visualizzati contemporaneamente nella loro biodistribuzione mediante le tecniche della medicina nucleare (SPECT, PET) e la risonanza magnetica (MRI) per la presenza di mezzi di contrasto, quali ioni radioattivi o paramagnetici coordinati all'agente chelante.

I liposomi descritti in questa invenzione si comportano quindi da sistemi delivery selettivo di farmaci e/o agenti di contrasto su cellule tumorali esprimenti i recettori per la classe di peptidi noti come bombesina e suoi analoghi, agonisti o non agonisti. Le cellule tumorali bersaglio presentano quindi una sovraespressione dei recettori GRP, BB1, BB2, BB3, BB4 o altri recettori della bombesina e sono caratteristiche di alcuni tumori umani quali ad esempio il tumore ovarico, il tumore della prostata, ed il tumore del seno.

Stato della tecnica

Sistemi supramolecolari quali micelle e liposomi vengono correntemente utilizzati per diverse applicazioni sia di tipo diagnostico che terapeutico, come ad esempio la gene-delivery, la formulazione di vaccini, e di nuovi farmaci antitumorali, la terapia fotodinamica e la preparazione di mezzi di contrasto.

La maggior parte degli agenti terapeutici presentano una limitata applicabilità a causa di sfavorevoli proprietà farmacocinetiche, insufficiente rilascio del farmaco al tumore o ai siti metastatici, un'elevata tossicità d'organo. Un modo per ridurre la tossicità associata al farmaco e accrescere il suo indice terapeutico à ̈ la riformulazione del farmaco in liposomi. I vantaggi associati ad una riformulazione liposomiale del farmaco sono: una migliore efficacia terapeutica e una migliore stabilità, biocompatibilità e biodegradabilità. I sistemi liposomiali possono effettuare il rilascio del farmaco in modo controllato. La somministrazione di un farmaco incapsulato limita il rischio di creare sbalzi di concentrazioni plasmatiche, inoltre evita ripetute somministrazioni, e permette di mantenere la concentrazione efficace per un maggiore lasso di tempo. Attualmente sono disponibili in commercio diversi farmaci in formulazioni liposomiale (es. Abelcet®, AmBisome®, Pevaryl® lipogel, Epaxal Berna®, DauXonome®, Caelyx®, Myocet®, Visudyne®).

In particolare, Myocet<®>e Doxil<®>/Caelix<®>(Doxil à ̈ il nome commerciale in USA; Caelix in Europa) rappresentano le due formulazioni liposomiali della doxorubicina attualmente in commercio; ed entrambe sono usate per il trattamento del sarcoma di Kaposis, nei tumori ovarici e polmonari resistenti agli altri chemioterapici. Rispetto al Myocet, il Doxil presenta frammenti di PEG (polietilenglicole) sulla superficie esterna degli aggregati. Il PEG impedisce il riconoscimento del farmaco liposomiale come non-self da parte dei macrofagi, aumentandone l'emivita. Altri esempi di medicinali liposomiali in fase di sperimentazione come agenti chemioterapici sono l'Allovectin-7 e l'Aroplatin. L'Allovectin à ̈ impiegato come agente chemioterapico per il trattamento del melanoma maligno metastatico di fase III o IV ed à ̈ costituito da un complesso plasmidico/lipidico contenente sequenze di DNA che codificano HLAB7-SS2 microglobulina, che in combinazione costituiscono il complesso maggiore di istocompatibilità MHC-I, provocando una risposta immunitaria verso le cellule tumorali.

L'Aroplatin, invece, contiene il platino come principio attivo, ed à ̈ attualmente in corso di valutazione in studi clinici per il trattamento di tumori solidi e linfoma a cellule B. Questo agente chemioterapico esplica la propria azione rilasciando il platino a livello delle cellule tumorali, limitando in tal modo gli effetti tossici di quest'ultimo a livello renale e del sistema nervoso.

Una linea strategica, per raggiungere le cellule tumorali in modo selettivo, à ̈ il drug delivery selettivo, che può essere attuato mediante l'ancoraggio di opportune molecole bioattive all'aggregato supramolecolare quali anticorpi, piccole molecole di natura organica o peptidi. In letteratura sono riportati numerosi studi su immunoliposomi, costituiti da aggregati funzionalizzati con frammenti di anticorpi monoclonali (mAb). Gli anticorpi riconoscono gli antigeni espressi sulle cellule associate al tumore e la cui presenza risulta necessaria alla proliferazione cellulare. Fra questi sono stati sviluppate strutture supramolecolari coniugate sia con frammenti Fab' che scFv. Gli studi preclinici condotti dimostrano un efficiente grado di internalizzazione nelle cellule che sovraesprimono i recettori HER2, e un efficiente rilascio intracellulare del farmaco.

Analogamente à ̈ possibile trovare in letteratura diversi esempi di liposomi funzionalizzati con frammenti peptidici di varia natura quali il peptide VIP (vasoattivo intestinale), che riconosce i recettori del VIP sovraespressi nelle cellule tumorali del cervello, il peptide RGD che riconosce selettivamente vari tipi di α-integrine quali αvβ3e αvβ5entrambe sovraespresse in caso di tumore.

La localizzazione di aggregati liposomiali caricati con farmaci antitumorali come la doxorubicina può essere seguito in vivo grazie all'introduzione di un mezzo di contrasto per tecniche di imaging quali Tomografia ad emissione di positroni (PET), Tomografia computerizzata (CT) e Risonanza Magnetica Imaging (MRI). Esistono in letteratura anche esempi di liposomi per il drug delivery di farmaci e di mezzi di contrasto funzionalizzati con peptidi o anticorpi per il drug delivery selettivo verso organi tumorali. Nel 2006 J. Gao (Nano Lett., 2006, 6 (11), pp 2427-2430) ha riportato una formulazione liposomiale capace di co-incapsulare nanoparticelle di ferro superparamagnetiche (SPIO) e doxorubicina. La superficie esterna dei liposomi à ̈ funzionalizzata con il peptide cRGD che riconosce selettivamente i recettori delle integrine αvβ3sovraespressi nelle cellule tumorali.

Infine, in WO2006/128643 A2 sono descritti aggregati supramolecolari formulati con molecole anfifiliche funzionalizzate con un peptide bioattivo per il target selettivo su recettori di membrana sovraespressi da cellule tumorali e/o con un agente chelante in grado di complessare ioni metallici radioattivi o paramagnetici per la contemporanea visualizzazione in vivo dei target sovra espressi e per studi di biodistribuzione dell'aggregato. Questi aggregati sono rivendicati per la loro duplice applicazione di delivery di farmaci e di mezzi di contrasto e sono ottenuti con vari approcci: la coaggregazione di due monomeri anfifilici, uno contenente il chelante ed uno contenente il peptide; oppure la co-aggregazione di un singolo monomero, contenente nella stessa molecola, oltre alle due code idrofobiche sia il peptide che il chelante, con un lipide commerciale; oppure dalla co-aggregazione di due composti anfifilici di tipo "gemini", uno contenente due copie del peptide, ed uno contenente due copie del chelante. Tutti questi sistemi, successivamente individuati con il termine Naposomi, si sono rilevati adatti al target sia in vitro che in vivo, di cellule tumorali esprimenti i recettori per il peptide CCK8, octeotride, analogo della somatostatina o per il peptide bombesina.

E' stato ora identificato che nell'ambito delle classi di composti descritti in WO2006/128643 A2, i sistemi liposomiali ottenuti dalla co-aggregazione di uno o più lipidi commerciali con un singolo monomero di sintesi contenente contemporaneamente nella stessa molecola: la sequenza peptidica del peptide bombesina (o suoi analoghi), l'agente chelante, e due catene alchiliche idrofobiche spaziate mediante un linker di tipo polietossilico (PEG) dal chelante e dal peptide, risultano estremamente efficaci per le proprietà di: ottima capacità di formare liposomi di dimensioni adatte ad un impiego farmaceutico mediante somministrazione in vena, basso grado di polidispersità, alta stabilità nel tempo dei liposomi, capacità di incapsulare il farmaco citotossico Doxorubicina nelle quantità più opportune nel rapporto con le molecole anfifiliche utilizzate per formulare gli aggregati, alta capacità di binding dei recettori GRP sovraespressi da cellule tumorali. Questi sistemi sembrano quindi particolarmente adatti per veicolare il farmaco doxorubicina in modo selettivo su cellule tumorali esprimenti i recettori GRP, quali quelle del tumore ovarico.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

L'oggetto dell'invenzione à ̈ definito dalle rivendicazioni annesse.

Gli aggregati supramolecolari, aventi in particolare una struttura liposomiale, oggetto della presente invenzione sono composti da: 1) uno o più surfattanti ionici normalmente utilizzati per la preparazione di liposomi; e, 2) da un monomero avente formula generale (I). Il monomero di formula generale (I) à ̈ preferibilmente presente nella composizione finale del liposoma in percentuale variabile tra 0,5 e 15% in moli, più preferibilmente tra 1 e 5%. Alla composizione finale, oltre ai surfattanti ionici possono essere aggiunti, colesterolo (per irrigidire e stabilizzare la membrana liposomiale) e zuccheri (ad esempio trealosio) per preservare l'integrità del liposoma durante eventuali processi di liofilizzazione.

Il surfattante presente in quantità predominante à ̈ un fosfolipide, preferibilmente una fosfatidilcolina, caratterizzata dalla presenza di acidi grassi saturi, insaturi o di entrambi; preferibilmente il fosfolipide potrà essere selezionato tra uno delle seguenti molecole o da loro miscele: Soy phosphatidylcholine (SPC), Egg Phosphatidylcholine (EPC) 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DOPC), 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPPC), 1,2-Disteroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), hydrogenated egg phosphatidylcholine (HEPC), phosphatidylglycerol (PG); al o ai fosfolipidi potranno essere associati altri lipidi, ad esempio colesterolo e suoi derivati.

Il monomero di formula generale (I) à ̈ costituito da tre unità fondamentali, H, P e C legate attraverso dei linker, L1e L2, ed una molecola ramificata Y. La formula generale à ̈ rappresentabile come:

H-L1-Y(C)-L2-P (I),

in cui:

- H rappresenta un gruppo idrofobico di formula (II), come definito nelle rivendicazioni annesse. - C rappresenta un gruppo chelante scelto nel gruppo costituito da: un residuo di un acido poliamminopolicarbossilico e i suoi derivati, in particolare scelto tra acido dietilentriammino pentaacetico (DTPA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7-triacetico (DO3A), acido [10-(2-idrossipropil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7-triacetico (HPDO3A), acido 4-carbossi-5,8,11-tris(carbossimetil)-1-fenil-2-ossa-5,8,11-triazatridecan-13-oico (BOPTA), N-[2-[bis(carbossimetil) ammino]-3-(4-etossifenil)propil]-N-[2-[bis(carbossimetil)ammino]etilglicina (EOB-DTPA), N,N-bis [2[(carbossimetil)[(metilcarbamoil)metil]ammino]etil] glicina (DTPA-BMA), acido 2-metil-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetico (MCTA), acido (α,α',α'',α''')-tetrametil-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetracetico (DOTMA) acido 1,4,7-Triazaciclononano N-glutarico N,N-diacetico (NO-DAGA), acido 1,4, 7-Triazaciclononano N-succinico N,N-diacetico (NODASA), acido 1,4, 7-triazaciclononano triacetico (NOTA), acido etilendiamminicotetraacetico (EDTA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclotridecano 1,4,7,10-tetraacetico (TRITA), acido 1, 4, 8,11-tetraazaciclotetradecano 1,4,8,11 tetraacetico (TETA); oppure à ̈ il residuo di un legante acido poliamminofosfato o di suoi derivati, in particolare acido N,N'-bis-(piridossal-5-fosfato)etilendiammina-N,N'-diacetico (DPDP) e acido etilenedinitrilotetrakis(metilfosfonico) (EDTP); oppure à ̈ il residuo di un legante acido poliamminofosfonico e di suoi derivati, o acido poliamminofosfinico e suoi derivati, in particolare acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetrakis[metilen(metilfosfonico)] e acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetrakis[metilen(metilfosfinico)]; oppure à ̈ il residuo di chelanti macrociclici come le texafirine, le porfirine e le ftalocianine; oppure à ̈ DTPAGlu (N,N-Bis[2-[bis[2-(1,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]-ammino]etil]-acidoL-glutammico 1-(1,1-dimetiletil) estere oppure à ̈ DTPALys (N,N-Bis[2-[bis[2-(1,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]-ammino]etil]-lysina 1-(1,1-dimetiletil) estere.

Particolare preferenza vi à ̈ per DTPA, DTPAGlu o DOTA.

Il gruppo chelante à ̈ legato ad Y attraverso un gruppo carbossilico con formazione di un legame ammidico.

Sono inclusi nell'ambito dell'invenzione aggregati supramolecolari, in cui il gruppo chelante C può formare complessi con ioni bivalenti o trivalenti degli elementi aventi numero atomico variabile fra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, o fra 57 e 83, isotopi radioattvi di metalli (<99m>Tc,<203>Pb,

<67>Ga,<68>Ga,<72>As,<111>In,<113>In,<90>Yt,<97>Ru,<82m>Rb,<62>Cu,

<64 52 52m 40>Cu, Fe, Mn,<1>La,<175>Yb,,<153>Sm,<166>Ho,<149>Pm,

<177 2>Lu,<142>Pr,<159>Gd,<21>Bi,<47>Sc,<149>Pm,<67>Cu,<111>Ag,

<199>Au,<188>Re,<186>Re,<161>Tb e<51>Cr) o ioni di metalli paramagnetici Fe<2+>, Gd<3+>, Eu<3+>, Dy<3+>, La<3+>, Yb<3+>o Mn<2+>e composti con isotopi radioattivi di alogeni (<123>I,

<125>I,<131>I,<75>Br,<76>Br,<74>Br,<77>Br,<82>Br,).

Particolarmente preferiti sono i complessi con Fe<2+>, Gd<3+>, Eu<3+>, Dy<3+>, La<3+>, Yb<3+>, Mn<2+>, Fe<3+>, Cu<2+>, Cr<3+>, per la visualizzazione mediante MRI, o con radioisotopi come<51>Cr,<67>Ga,<68>Ga,<111>In,<99m>Tc,<140>La,

<175>Yb,<153>Sm,<166>Ho,<90>Y,<149>Pm,<177>Lu,<47>Sc,<142>Pr,<159>Gd,

<212>Bi per la visualizzazione mediante le tecniche SPECT e PET.

- P Ã ̈ un peptide appartenente alla classe dei peptidi noti come Bombesina, quindi la sequenza endogena del peptide bombesina (SEQ ID NO:1).

Il gruppo P include inoltre:

- frammenti C-terminali del peptide Bombesina, contenenti 6-9 residui amminoacidici;

- analoghi del frammento C-terminale del peptide bombesina aventi formula generale:

AA1-Gln-Trp-Ala-Val-AA2-His-AA3-AA4-NH2

(SEQ ID NO:2)

dove:

AA1 à ̈ DPhe, D-Tyr, D-Trp o à ̈ assente;

AA2 à ̈ NMeGly, Gly o β-Ala;

AA3 Ã ̈ Leu, Cha, Sta, Met, Nle;

AA4 Ã ̈ Met, Leu o Nle;

in cui Cha significa cicloesilalanina e Sta significa statina.

Tutti i peptidi scelti come unità P della molecola a formula (I) sono in grado di legarsi con affinità nanomolare alla classe di recettori GRP, BB1, BB2, BB3, BB4 o altri recettori della bombesina, e possono o no attivare questi recettori. I peptidi sono legati ad L2attraverso il gruppo amminico N-terminale della sequenza amminoacidica con formazione di un legame ammidico. Le sequenze peptiche preferite, contenenti amminoacidi naturali o non naturali, sono riportate in Tabella 1.

Tabella 1:

# Sequenze peptidiche preferite SEQ ID NO ) -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nle-NH23 ) -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Cha-Nle-NH24 ) -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Cha-Nle-Glu-NH25 ) -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH26 ) -Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Sta-Leu-NH27 ) -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH28 ) -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Cha-Nle-NH29 ) -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Sta-Leu-NH210 ) -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH211 0) -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Leu-Nle-NH212 - Y à ̈ una molecola ramificata contenente almeno tre funzioni reattive, preferibilmente due funzioni amminiche ed una funzione carbossilica per poter legare, mediante formazione di legami ammidici, L1, C e L2. Le molecole preferite sono amminoacidi naturali come Lisina o non naturali quali Ornitina e acido 2,3-diamminopropionico (Dap). In alternativa Y può essere una molecola ramificata contenente due funzioni carbossiliche ed una funzione amminica quale ad esempio acido glutammico o acido aspartico per formare legame ammidico con un chelante C avente una funzione amminica libera.

- L1Ã ̈ uno spaziatore di tipo poliossietilenico (Peg o analoghi) o una sequenza di molecole contenenti funzioni poliossietileniche, sequenzialmente legate preferibilmente mediante legami ammidici, con peso molecolare complessivo compreso tra 1200 e 1800 Dalton, dove L1contiene almeno una funzione amminica ed una funzione carbossilica necessarie per la formazione di legami ammidici con H e Y, rispettivamente.

- L2Ã ̈ uno spaziatore di tipo poliossietilenico (Peg o analoghi) o una sequenza di molecole contenenti funzioni poliossietileniche, sequenzialmente legate preferibilmente mediante legami ammidici, con peso molecolare complessivo compreso tra 200 e 800 Dalton, dove L2contiene almeno una funzione amminica ed una funzione carbossilica necessarie per la formazione di legami ammidici con Y e P, rispettivamente.

Risulta dalla presente invenzione che à ̈ necessario uno spaziatore L1di lunghezza elevata e comunque maggiore rispetto ad L2, al fine di favorire le proprietà di aggregazione e di stabilità dei liposomi. In particolare, uno spaziatore L1di lunghezza compresa tra 1200 e 1800 Dalton consente di avere il gruppo chelante C ed il peptide P sufficientemente lontani dalla superficie dei liposomi e che quindi non interferiscono nel processo di aggregazione dei monomeri. Questo aspetto innovativo migliora notevolmente le proprietà di aggregazione (forma, dimensione e stabilità dei liposomi) rispetto a quanto verificato precedentemente e riportato in WO 2006/128643 A2.

I composti di formula (I) possono essere sintetizzati con tecniche note, quali sintesi peptidica in fase solida, sintesi peptidica in soluzione, metodiche sintetiche di chimica organica, oppure una qualunque combinazione fra di esse. Di preferenza sono utilizzate metodiche sintetiche basate su appropriate combinazioni di tecniche in fase solida e di metodi classici in soluzione, che comportano bassi costi produttivi, in particolare su scala industriale.

Nel dettaglio, tali metodiche consistono nei seguenti steps: 1) sintesi in fase solida della sequenza peptidica, 2) introduzione sempre in fase solida del linker individuato come L2, 3) introduzione della molecola Y ortogonalmente protetta sulle due funzioni amminiche, 4) deprotezione di una delle due funzioni amminiche, 5) introduzione del sistema chelante C, protetto sulle funzioni amminiche o carbossiliche, 6) introduzione sempre in fase solida del linker individuato come L1, 7) introduzione della molecola H, 8) distacco dalla resina del peptide protetto e purificazione del composto finale mediante tecniche cromatografiche.

Esempi

Esempio 1: Sintesi del monomero a formula (I).

Il monomero di formula (I) mostrato in figura 1 à ̈ stato sintetizzato mediante sintesi in fase solida (SPPS) con chimica Fmoc, facendo crescere il peptide su un supporto di tipo polimerico, come discusso in Chang, W.C. and White, P.D.; Fmoc solid phase peptide synthesis; Oxford Univ.Press (2000), New York. Il monomero di formula generale (I) mostrato in figura 1 à ̈ stato sintetizzato mediante sintesi in fase solida. Nella presente invenzione, la resina prescelta à ̈ la Rink-amide (0,78 mmoli/g, 0,5 mmoli scale, 0,64 g) che rilascia il peptide carbossammide all'estremità C-terminale. Come prima operazione si rimuove il gruppo protettore Fmoc dalla resina mediante una miscela di DMF/pip 70/30.

Successivamente si sintetizza il frammento peptidico appartenente alla classe dei peptidi noti come Bombesina, frammenti C-terminali contenenti 6-9 residui amminoacidici, analoghi stabilizzati grazie all'introduzione di amminoacidi non naturali, analoghi peptidomimetici, analoghi agenti come agonisti sul recettore, analoghi agenti come antagonisti. Le sequenze peptiche sintetizzate sono riportate sopra. La sintesi della porzione peptidica viene effettuata mediante accoppiamenti sequenziali dei singoli amminoacidi protetti. Tutti gli accoppiamenti sono ripetuti due volte in DMF per 1h, utilizzando un eccesso 4 di equivalenti per il singolo derivato amminoacidico.

Gli α-amminoacidi vengono attivati in situ mediante procedure standard della SPPS che utilizzano HOBt/PyBop/DIPEA come agenti attivanti. Al termine della reazione di accoppiamento, il gruppo protettore Fmoc in catena principale à ̈ rimosso sottoponendo la resina a due cicli di deprotezione con DMF/Pip 70/30 per 7 minuti. Dopo ogni step di deprotezione dal gruppo Fmoc e dopo ogni condensazione amminoacidica si controlla il risultato mediante un test analitico qualitativo (test della ninidrina). Al termine della sintesi del frammento peptidico, si rimuove il gruppo protettore Fmoc dall'ultimo residuo amminoacidico e si esegue la condensazione di L2, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (Peg o analoghi) con peso molecolare compreso tra 200 e 800, che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica. La funzione carbossilica à ̈ libera, e dà luogo alla formazione del legame ammidico con il peptide in crescita sulla resina, mentre la funzione amminica à ̈ protetta mediante gruppo Fmoc.

Lo spaziatore L2viene condensato in un singolo accoppiamento di 1h utilizzando due equivalenti di L2rispetto alla scala di sintesi. Dopo aver rimosso il gruppo protettore Fmoc, si esegue la condensazione della molecola Y mediante doppio accoppiamento con 4 equivalenti in condizioni standard. Y à ̈ una molecola ramificata (lisina, ornitina, Dap, acido aspartico o acido glutammico) contenente due funzioni amminiche ed una funzione carbossilica oppure due funzioni carbossiliche ed una amminica per poter legare, mediante formazione di legami ammidici, L1, C e L2. La molecola Y, oltre al gruppo protettore Fmoc in catena principale, contiene un gruppo protettore ortogonale in catena laterale, che può essere rimosso in condizioni acide o basiche blande.

Dopo aver rimosso il gruppo ortogonale, mediante le procedure standard, à ̈ stato condensato il gruppo C usando un eccesso di 2 equivalenti, come attivante l'HATU e 4 equivalenti di DIPEA in DMF. C rappresenta un gruppo chelante (DTPA, DOTA, DO3A, HPDO3A, BOPTA, EOB-DTPA, DTPA-BMA, MCTA, DOTMA, DPDP, EDTP, DTPAGlu e DTPALys) protetto su tutte le funzioni reattive (carbossiliche) ad esclusione di quella che deve reagire per la formazione del legame ammidico. Particolare preferenza vi à ̈ per i chelanti DTPA, DTPAGlu o DOTA.

A questo punto si prosegue rimuovendo il gruppo protettore Fmoc dalla catena principale del residuo di lisina e condensando lo spaziatore etossilico L1. L1à ̈ uno spaziatore di tipo poliossietilenico (Peg o analoghi) con peso molecolare compreso tra 1200 e 1800. L1viene condensato usando un eccesso di 2 equivalenti, come attivante l'HATU e 4 equivalenti di DIPEA in DMF. Dopo rimozione del gruppo protettore Fmoc, viene condensata alla funzione terminale αNH2libera un residuo di acido N,N-diottadecilsuccinaminico utilizzando un eccesso di 4 equivalenti e come attivante HBTU e HOBt disciolti in una soluzione composta da DCM/DMF/NMP in parti uguali.

Dopo aver lavato e seccato la resina con DMF, DCM ed etere si à ̈ proceduto al distacco del derivato peptidico dalla resina adoperando come miscela di cleavage una soluzione di TFA/acqua/TIS in rapporto 95,5/2,5/2,0, lasciando il sistema sotto agitazione per 2 h. La precipitazione del grezzo avviene in etere/acqua a freddo secondo le modalità standard. Il peptide grezzo à ̈ disciolto in acqua e acetonitrile e liofilizzato.

Il derivato peptidico à ̈ purificato mediante cromatografia preparativa (Metodo 3, colonna a fase inversa Phenomenex C4; eluenti H2O 0,1% TFA e CH3CN 0,1% TFA; gradiente di eluizione: dal 5%B al 70%B in 10 min, dal 70% B al 95% B in 10 minuti) e successivamente caratterizzato mediante LC/MS (colonna Phenomenex C4).

Tabella 2: In tabella sono specificati per ogni singolo esempio: la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2i tempi di ritenzione (Rt) e la massa dei composti di formula generale H-L1-Y(C)-L2-P sintetizzati purificati e caratterizzati secondo le procedure standard

riportate nell'esempio 1.

Esempio Sequenza peptidica SEQ ID Chelante Spaziatore Spaziatore Rt MW (P) NO (C) (L1) (L2) (min) (Da) 1 a Gln-Trp-Ala-Val-Gly- 3 DTPA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 18,7 3664 His-Leu-Nle-NH2

1 b DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 8 DTPA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 18,5 3851 Gly-His-Sta-Leu-NH2

1 c DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 9 DTPA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 19,2 3849 Gly-His-Cha-Nle-NH2

1 d DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 10 DTPA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 19,0 3868 NMeGly-His-Sta-Leu-NH2

1 e Gln-Trp-Ala-Val-Gly- 11 DTPA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 18,2 3682 His-Leu-Met-NH2

1 f DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 12 DTPA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 18,7 3825 NMeGly-His-Leu-Nle-NH2

1 g Gln-Trp-Ala-Val-Gly- 3 DOTA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 19,5 3675 His-Leu-Nle-NH2

1 h DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 8 DOTA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 19,3 3862 Gly-His-Sta-Leu-NH2

1 i DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 9 DOTA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 20,1 3860 Gly-His-Cha-Nle-NH2

1 j DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 10 DOTA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 20,0 3879 NMeGly-His-Sta-Leu-NH2

1 k Gln-Trp-Ala-Val-Gly- 11 DOTA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 19,1 3693 His-Leu-Met-NH2

1 l DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 12 DOTA H-Peg27-OH H-AhOh-OH 19,6 3826 NMeGly-His-Leu-Nle-NH2

Gln-Trp-Ala-Val-Gly- 3 DTPA H-Peg27-OH H-dPeg(8)- 18,4 3753 His-Leu-Nle-NH2OH

DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 10 DTPA H-Peg27-OH H-dPeg(8)- 18,7 3957 NMeGly-His-Sta-Leu-NH2OH

DPhe-Gln-Trp-Ala-Val- 12 DTPA H-Peg27-OH H-Peg(12)- 18,4 4425 NMeGly-His-Leu-Nle-NH2OH

Esempio 1.a

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il

monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso

à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato

in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la

sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori

L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel

presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 1

riportata in Tabella 1 (-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nle-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DTPA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina, utilizzando il

derivato protetto su 4 dei 5 gruppi carbossilici

mediante esteri tert-butilici (DTPA(OtBu)4-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2Ã ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno

spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso

molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 18,7 min e presenta una massa atomica pari a 3664 Da.

Esempio 1.b

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 6 riportata in Tabella 1 (-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DTPA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina, utilizzando il derivato protetto su 4 dei 5 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DTPA(OtBu)4-OH);

- lo spaziatore L1à ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH; - lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 18,5 min e presenta una massa atomica pari a 3851 Da.

Esempio 1.c

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 7 riportata in Tabella 1 (-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Cha-Nle-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DTPA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina, utilizzando il derivato protetto su 4 dei 5 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DTPA(OtBu)4-OH); - lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 19,2 min e presenta una massa atomica pari a 3849 Da.

Esempio 1.d

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 8 riportata in Tabella 1 (DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Sta-Leu-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DTPA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina, utilizzando il derivato protetto su 4 dei 5 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DTPA(OtBu)4-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 19,0 min e presenta una massa atomica pari a 3868 Da.

Esempio 1.e

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 9 riportata in Tabella 1 (-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2):

- il chelante (C) Ã ̈ il DTPA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina, utilizzando il derivato protetto su 4 dei 5 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DTPA(OtBu)4-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 18,2 min e presenta una massa atomica pari a 3682 Da.

Esempio 1.f

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 10 riportata in Tabella 1 (-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Leu-Nle-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DTPA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina, utilizzando il derivato protetto su 4 dei 5 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DTPA(OtBu)4-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 18,7 min e presenta una massa atomica pari a 3825 Da.

Esempio 1.g

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 1 riportata in Tabella 1 (-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nle-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DOTA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina utilizzando il derivato protetto su 3 dei 4 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DOTA(OtBu)3-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 19,5 min e presenta una massa atomica pari a 3675 Da.

Esempio 1.h

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 6 riportata in Tabella 1 (-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DOTA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina utilizzando il derivato protetto su 3 dei 4 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DOTA(OtBu)3-OH):

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 19,3 min e presenta una massa atomica pari a 3862 Da.

Esempio 1.i

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 7 riportata in Tabella 1 (-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Cha-Nle-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DOTA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina utilizzando il derivato protetto su 3 dei 4 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DOTA(OtBu)3-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 20,1 min e presenta una massa atomica pari a 3860 Da.

Esempio 1.j

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 8 riportata in Tabella 1 (DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Sta-Leu-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DOTA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina utilizzando il derivato protetto su 3 dei 4 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DOTA(OtBu)3-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 20,0 min e presenta una massa atomica pari a 3879 Da.

Esempio 1.k

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 9 riportata in Tabella 1 (-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DOTA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina utilizzando il derivato protetto su 3 dei 4 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DOTA(OtBu)3-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-AhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 19,1 min e presenta una massa atomica pari a 3683 Da.

Esempio 1.l

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 10 riportata in Tabella 1 (-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Leu-Nle-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DOTA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina utilizzando il derivato protetto su 3 dei 4 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DOTA(OtBu)3-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-AhOh-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 330 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto FmocAhOh-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 19,6 min e presenta una massa atomica pari a 3826 Da.

Esempio 1.m

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 9 riportata in Tabella 1 (-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Sta-Leu-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DTPA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina, utilizzando il derivato protetto su 4 dei 5 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DTPA(OtBu)4-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH.

- lo spaziatore L2à ̈ H-dPeg(8)-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 425 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto FmocdPeg(8)-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 18,4 min e presenta una massa atomica pari a 3753 Da.

Esempio 1.n

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 8 riportata in Tabella 1 (DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Sta-Leu-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DTPA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina, utilizzando il derivato protetto su 4 dei 5 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DTPA(OtBu)4-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-dPeg(8)-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 425 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto FmocdPeg(8)-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 18,7 min e presenta una massa atomica pari a 3957 Da.

Esempio 1.o

Il composto riportato nel presente esempio à ̈ il monomero di formula (I) mostrato in figura 1. Esso à ̈ stato sintetizzato, purificato e caratterizzato in accordo con le procedure di sintesi riportate nell'esempio 1. Di seguito sono specificate la sequenza peptidica P; il chelante C, gli spaziatori L1ed L2del presente composto:

- la sequenza peptidica (P) sintetizzata nel presente esempio à ̈ rappresentata dalla sequenza # 10 riportata in Tabella 1 (-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Leu-Nle-NH2);

- il chelante (C) Ã ̈ il DTPA, introdotto sulla catena laterale del residuo di lisina, utilizzando il derivato protetto su 4 dei 5 gruppi carbossilici mediante esteri tert-butilici (DTPA(OtBu)4-OH);

- lo spaziatore L1Ã ̈ l'H-Peg27-OH, introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg27-OH;

- lo spaziatore L2à ̈ H-Peg(12)-OH, ovvero uno spaziatore di tipo poliossietilenico (di peso molecolare di circa 600 uma), che possiede sia una funzione carbossilica che una funzione amminica, ed à ̈ introdotto utilizzando il derivato protetto Fmoc-Peg(12)-OH.

Il prodotto purificato viene eluito in RP-HPLC ad un tempo di ritenzione Rt: 18,4 min e presenta una massa atomica pari a 4425 Da.

Esempio 2: Formulazione degli aggregati liposomiali I liposomi vengono preparati mediante la tecnica evaporazione del film lipidico. In breve, la miscela lipidica composta da un fosfolipide (DPPC, DSPC, o altri) ed un composto di tipo sintetico a formula generale (1), contenente il peptide ed il chelante, à ̈ solubilizzata in una miscela organica contenente cloroformio/metanolo (2:1 v/v). La soluzione organica à ̈ trasferita in un pallone di vetro da 50 mL ed il solvente à ̈ evaporato in rotovapor a pressione ridotta in presenza di azoto. Il risultante film lipidico à ̈ idratato con 1 ml di tampone solfato di ammonio o citrato di ammonio (250 mM) a pH 5,5 o pH 4,0, rispettivamente; in presenza di biglie di vetro per 2 ore a 65°C.

La risultante sospensione liposomiale à ̈ poi estrusa mediante estrusore facendo passare ripetutamente la sospensione attraverso delle membrane di policarbonato con pori del diametro decrescente da 0,4 a 0,1 µm sotto corrente di azoto. La sospensione liposomiale à ̈ purificata attraverso colonne di Sephadex G-50 ed eluita in acqua deionizzata per eliminare il tampone esterno. Dopo estrusione e dopo purificazione su colonna gli aggregati liposomiali ottenuti sono caratterizzati mediante Photon Correlation Spectroscopy (PCS) per determinare il valore del raggio idrodinamico (Rh) e l'indice di polidispersità (IP). Queste misure sono effettuate anche in funzione del tempo per verificare la stabilità nel tempo dei liposomi in soluzione.

Esempio 2.a

Nel presente esempio i liposomi sono formulati a partire da DPPC (1·10<-2>M), e da uno dei composti di formula generale H-L1-Y(C)-L2-P (0,1 mM) (corrispondente ad un rapporto fosfolipide/monomero a formula (1) 99/1), la cui sintesi à ̈ stata descritta negli esempi 1.a-1.f. I composti relativi agli esempi 1.a-1.f, che presentano come unica differenza la sequenza peptidica (vedi Tabella 2) non mostrano sostanziali modifiche strutturali (Rhed IP). Infatti tutti gli aggregati ottenuti dopo estrusione presentano un Rhpari a 143,0 ± 40,1 nm ed un IP pari a 0,150 ± 0,04. Questi valori rimangono invariati dopo purificazione, e nel tempo.

Esempio 2.b

Nel presente esempio i liposomi sono formulati a partire da DPPC (1·10<-2>M), e da uno dei composti di formula generale H-L1-Y(C)-L2-P (0,3 mM) (corrispondente ad un rapporto fosfolipide/monomero a formula (1) 97/3), la cui sintesi à ̈ stata descritta negli esempi 1.a-1.f. I composti relativi agli esempi 1.a-1.f, che presentano come unica differenza la sequenza peptidica (vedi Tabella 2) non mostrano sostanziali modifiche strutturali (Rhed IP). Infatti tutti gli aggregati ottenuti dopo estrusione presentano un Rhpari a 131,1 ± 42,4 nm ed un IP pari a 0,184 ± 0,05. Questi valori rimangono invariati dopo purificazione e nel tempo.

Esempio 2.c

Nel presente esempio i liposomi sono formulati a partire da DSPC (1·10<-2>M), e da uno dei composti di formula generale H-L1-Y(C)-L2-P (0,2 mM) (corrispondente ad un rapporto fosfolipide/monomero a formula (1) 98/2), la cui sintesi à ̈ stata descritta negli esempi 1.a-1.f. I composti relativi agli esempi 1.a-1.f, che presentano come unica differenza la sequenza peptidica (vedi Tabella 2) non mostrano sostanziali modifiche strutturali (Rhed IP). Infatti tutti gli aggregati ottenuti dopo estrusione presentano un Rhpari a 122,5 ± 20,4 nm ed un IP pari a 0,093 ± 0,06. Dopo purificazione l'Rhrimane invariato, mentre si verifica un aumento dell'IP (0,151).

Esempio 2.d

Nel presente esempio i liposomi sono formulati a partire da DSPC (1·10<-2>M), e dal composto di formula generale H-L1-Y(C)-L2-P (0,3 mM) (corrispondente ad un rapporto fosfolipide/monomero a formula (1) 97/3), la cui sintesi à ̈ stata descritta nell'esempio 1.a-1.f. I composti relativi agli esempi 1.a-1.f, che presentano come unica differenza la sequenza peptidica (vedi Tabella 2) non mostrano sostanziali modifiche strutturali (Rhed IP). Infatti tutti gli aggregati ottenuti dopo estrusione presentano un Rhpari a 136,5 ± 23,5 nm ed un IP pari a 0,113 ± 0,08. Dopo purificazione l'Rhrimane invariato, mentre si verifica un aumento dell'IP (0,180).

Esempio 2.e

Nel presente esempio i liposomi sono stati formulati a partire da DPPC (1·10<-2>M), e dal composto di formula generale H-L1-Y(C)-L2-P (0,1 mM), (corrispondente ad un rapporto fosfolipide/monomero a formula (1) 99/1), la cui sintesi à ̈ stata descritta nell'esempio 1.g-1.l. I composti relativi agli esempi 1.g-1.l, che presentano come unica differenza la sequenza peptidica (vedi Tabella 2) non mostrano sostanziali modifiche strutturali (Rhed IP). Infatti tutti gli aggregati ottenuti dopo estrusione presentano un Rhpari a 141,4 ± 38,4 nm ed un IP pari a 0,165 ± 0,05. Questi valori rimangono invariati dopo purificazione.

Esempio 2.f (comparativo)

Nel presente esempio i liposomi sono formulati a partire da DSPC (1·10<-2>M), e dal composto denominato MonY a concentrazioni variabili (0,1 mM, 0,2 mM o 0,3 mM). Il composto MonY Ã ̈ analogo al composto di formula generale (1) e contiene: come porzione peptidica P, il frammento [7-14]BN; come chelante C, il DTPA; come parte idrofobica H, un'ammide carbossilata a formula generale C1C2N-C(O)-X-C(O), in cui C1 e C2 sono ammine alifatiche sature a 18 atomi di carbonio. Ed X Ã ̈ una catena alchilica di formula generale (CH2)n con n = 2; come spaziatori L1e L2, frammenti di tipo poliossietilenico (Peg) di peso molecolare di 144 e 288 Dalton, rispettivamente.

Non rientra pertanto nella descrizione del composto di formula generale (1) perché L1<L2e L1non rientra nel range di peso molecolare compreso tra 1200 e 1800 Dalton. Tutti gli aggregati ottenuti (ai vari rapporti molari DSPC/MonY) presentano un Rhpari a 210,2 ± 71,5 nm ed un IP pari a 0,85 ± 0,1. Queste formulazioni liposomiali contenenti il MonY in cui L1<L2, a causa di un IP troppo elevato vengono reputate non idonee ad un utilizzo in vivo. In particolare, si ritiene che avendo uno spaziatore L1di dimensioni ridotte il chelante DTPA ed il peptide influenzano il processo di aggregazione dando luogo a liposomi di elevata polidispersità e meno stabili.

Esempio 3: Preparazione di aggregati liposomiali contenenti Doxorubicina (DOX) e loro caratterizzazione

Alle sospensioni liposomiali descritte negli esempi 2.a ÷ 2.f à ̈ stata aggiunta una soluzione acquosa di crioprotettore (trealosio, sucrosio o lattosio). I liposomi sono stati congelati in azoto liquido e liofilizzati per 24 ore. La formulazione liofilizzata à ̈ stata poi conservata a -20°C. Ciascuna formulazione à ̈ stata preparata in triplicato. Gli aggregati liposomiali ottenuti sono successivamente ripresi in soluzione e mescolati con una soluzione tampone contenente DOX.

In breve, la soluzione tampone di HEPES a pH 7,4 Ã ̈ aggiunta alla polvere liofilizzata contenente gli aggregati liposomiali (Reagente A) e alla DOX (Reagente B). Il reagente A ed il reagente B sono mescolati ed incubati a 60°C per 30 min (rapporto in grammi di Doxorubicina /lipidi = 0,100).

Il diametro medio dei liposomi, prima e dopo liofilizzazione, à ̈ stato determinato mediante Photon Correlation Spectroscopy (PCS). Ciascun campione à ̈ stato diluito con acqua deionizzata e filtrata ed analizzato a 20°C. Per ciascun campione, il diametro medio e la distribuzione dimensionale sono stati ottenuti dalla media di tre misure. Per ogni formulazione, il diametro medio e l'indice di polidispersità (I.P.) sono stati calcolati dalla media di tre differenti lotti.

La quantità di PC nelle formulazioni liofilizzate à ̈ stata determinata mediante il saggio di Stewart (Stewart JC. Anal Biochem. 1980). In breve, 100 Î1⁄4l di sospensione liposomiale sono stati diluiti con 400 Î1⁄4l di acqua contenente ferrotiocianato di ammonio (0,1 N); la soluzione à ̈ stata poi addizionata a 500 Î1⁄4l cloroformio. La concentrazione di fosfolipide à ̈ stata determinata dalla misura dell'assorbanza della fase organica a 485 nm.

La quantità di doxorubicina non incapsulata negli aggregati liposomiali à ̈ stata determinata come segue: 1 ml di liposomi contenenti DOX à ̈ stato ultracentrifugato (Optima Max E, Beckman Coulter, USA) a 80,000 giri/min, a 4°C, per 40 min. I surnatanti sono stati accuratamente prelevati e la concentrazione di DOX à ̈ stata determinata mediante spettrofotometria UV/Vis alla lunghezza d'onda di 480 nm. I risultati sono stati espressi come efficienza di incapsulazione, calcolata come rapporto tra la quantità di DOX presente nei surnatanti e la quantità di DOX teoricamente caricata.

Esempio 4: Marcatura e prove di binding in vitro su cellule esprimenti i recettori GRP

Gli esperimenti di binding cellulare sono stati eseguiti su liposomi target selettivi DPPC/H-L1Y(C)-L2-P (97/3) e DSPC/H-L1-Y(C)-L2-P (97/3) marcati con l'isotopo 111 dell'Indio radioattivo. E-sperimenti con liposomi non target selettivi DPPC/(C18)2DTPA (99,9/0,1) e DSPC/(C18)2DTPA (99,9/0,1), e liposomi in cui il peptide P, analogo della bombesina, Ã ̈ stato sostituito con un peptide di sequenza scramble (PS) DPPC/H-L1-Y(C)-L2-PS(97/3) e DSPC/H-L1-Y(C)-L2-PS(97/3), sono stati utilizzati come controlli negativi.

La marcatura degli aggregati supramolecolari à ̈ stata eseguita ad una concentrazione finale di 2*10<-4>M. Tracce di<111>InCl3sono state aggiunte ad 1 mL di liposomi e la soluzione à ̈ stata portata ad un volume finale di 2 mL mediante aggiunta di tampone acetato di sodio (0,4 M, pH 5,0). La miscela à ̈ stata incubata per 30 minuti a 90°C. La completezza e l'efficienza della reazione sono state verificate mediante gel-filtrazione su colonna pre-impaccata Sephadex G-50 (Pharmacia Biotech). Gli esperimenti di binding sono stati effettuati su cellule PC-3 overesprimenti il recettore GRP. Le cellule sono state inoculate il giorno prima su piastre 6-well plate ad una densità di 800000÷ 1000000 cellule per pozzetto. ;Il giorno dell'esperimento si rimuove il mezzo cellulare, si lavano le cellule due volte con mezzo fresco (DMEM con l'1% di siero bovino fetale, pH 7,4) e incubate per almeno 1 ora a 37°C. Le cellule sono state incubate (in triplicato) con 100 Î1⁄4L di liposomi marcati con Indio 111/ Indio naturale a diversi tempi (30 min, 1h, 2h, 4h). Il volume finale à ̈ pari ad 1 mL, e la concentrazione liposomiale finale à ̈ pari a 2*10<-4>M. Al termine dell'incubazione, il mezzo cellulare, contenente la radioattività non legata, viene separato dalle cellule.

La radioattività legata alle cellule à ̈ stata recuperata mediante digestione triptica dopo due rapidi lavaggi con PBS ghiacciato seguiti da 1h di incubazione e misurata con un gamma counting. La differenza di binding dei liposomi contenenti H-L1-Y(C)-L2-P con il peptide bombesina, rispetto a quando il peptide à ̈ assente à ̈ chiaramente visibile in figura 2. Esperimenti sono stati condotti con vari monomeri di tipo (1) nella formulazione liposomiale, variando le sequenze peptidiche ed il chelante, quali quelli descritti negli esempi 1a–1o. Non si riscontrano sostanziali differenze nelle proprietà di binding target selettive. A titolo esemplificativo, in figura 2 à ̈ riportato il risultato concernente i liposomi contenenti il monomero 1a.

Esempio 5: Saggi di citotossicità in vitro su cellule esprimenti i recettori GRP.

Gli esperimenti di citotossicità sono stati effettuati su cellule PC-3 overesprimenti il recettore GRP, utilizzando il test MTT. Le cellule sono state inoculate su piastre 96-well plate ed incubate per la notte per ottenerne l'adesione alla piastra. Il giorno dopo il mezzo di cultura viene rimosso e le cellule incubate con una sospensione di liposomi a due concentrazioni di Doxorubicina (100ng/mL and 300ng/mL). I sistemi studiati sono il composto liposomiale a formula DSPC/H-L1-Y(C)-L2-P (97/3) caricato con Doxorubicina, come riportato nell'esempio 3, (abbreviato in Figura 3 come DSPC/MonY-DOXO) in cui il monomero H-L1-Y(C)-L2-P à ̈ il composto riportato nell'esempio 1a, ed il composto liposomiale costituito da solo DSPC caricato con Doxorubicina (abbreviato in Figura 3 come DSPC-DOXO). Sono stati anche studiati per confronto, gli analoghi sistemi liposomiali senza Doxorubicina (abbreviati in Figura 3 come DSPC/MonY e DSPC).

Come mostrato in Figura 3, incubazione delle cellule con la soluzione liposomiale di DSPC/H-L1-Y(C)-L2-P (97/3) caricati con Doxorubicina, mostra una significativamente più bassa sopravvivenza cellulare rispetto alla incubazione con la soluzione liposomiale costituita da solo DSPC caricato con equivalente quantità di Doxorubicina, indicando binding selettivo dei lipsomi funzionalizzati esternamente con il peptide bombesina a sequenza: Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nle-NH2.

Esempio 6: Saggi di attività in vivo.

Esperimenti in vivo sono stati effettuati su topi femmine BALB/c nude mice di sei settimane. Il volume del tumore indotto dalla inoculazione di cellule PC-3 à ̈ stato valutato ogni due giorni a partire da 28 giorni dalla inoculazione delle cellule. Il trattamento con il sistema liposomiale à ̈ stato effettuato 36 giorni dopo l'inoculazione delle cellule.

Un gruppo di 6 topi à ̈ stato trattato con composto liposomiale a formula DSPC/H-L1-Y(C)-L2-P (97/3) caricato con Doxorubicina in cui il monomero H-L1-Y(C)-L2-P à ̈ il composto riportato nell'esempio 1a. Un secondo gruppo di sei topi à ̈ stato trattato con il composto liposomiale costituito da solo DSPC caricato con Doxorubicina. La quantità di sospensione liposomiale iniettata (100 microlitri) corrisponde ad una dose di Doxorubicina di 10 mg/Kg di peso del topo. Un terzo gruppo di topi à ̈ stato trattato con solo soluzione salina. I risultati, riportati in Figura 4 (media su sei topi ± e.s.), indicano che la crescita del tumore nei topi à ̈ fortemente rallentata utilizzando il sistema liposomiale DSPC/MonY-DOXO rispetto ai topi trattati con il sistema liposomiale senza peptide, DSPC-DOXO, e rispetto ai topi non trattati.

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Aggregato supramolecolare avente struttura liposomiale comprendente: a) uno o più surfattanti ionici con struttura di fosfolipide b) una molecola anfifilica di formula generale (I) H-L1-Y(C)-L2-P (I), in cui: - H à ̈ una molecola con struttura di ammide carbossilata di formula generale C1 N-C(O)-X-C(O) (II), C2 dove C1 e C2 sono catene idrocarburiche idrofobiche, alifatiche uguali (C1 = C2) o diverse fra loro (C1≠ C2) con un numero di atomi di carbonio compreso tra 8 e 24, preferibilmente tra 12 e 18 e possono essere sature, insature o polinsature, e X à ̈ una catena alchilenica di formula generale (CH2)n con 1< n <6, - C à ̈ un gruppo chelante scelto nel gruppo che consiste di: - un residuo di acido poliammino policarbossilico; - un residuo di un legante acido poliammino fo sfato; - un residuo di un legante acido poliammino fosfonico o acido poliammino fosfinico; - un residuo di chelanti macrociclici scelti tra texafirine, porfirine e ftalocianine; oppure - scelto tra DTPAGlu e DTPALys; il sistema chelante essendo legato a Y attraverso un gruppo carbossilico con formazione di un legame ammidico; - Y à ̈ una molecola ramificata contenente almeno tre funzioni reattive per poter legare, preferibilmente mediante la formazione di legami ammidici, L1, C e L2; - P à ̈ un peptide scelto tra: - la sequenza endogena del peptide bombesina (SEQ ID NO:1); - frammenti C-terminali del peptide bombesina contenti 6-9 residui amminoacidici; - analoghi del frammento C-terminale del peptide bombesina aventi formula generale: AA1-Gln-Trp-Ala-Val-AA2-His-AA3-AA4-NH2 (SEQ ID NO:2), dove AA1 à ̈ DPhe, D-Tyr, D-Trp o à ̈ assente; AA2 à ̈ NMeGly, Gly o β-Ala; AA3 à ̈ Leu, Cha, Sta, Met, Nle; AA4 à ̈ Met, Leu o Nle; - L1à ̈ uno spaziatore di tipo poliossietilenico contenente almeno una funzione amminica ed una funzione carbossilica necessarie per formazione di legami ammidici con H e Y, rispettivamente, oppure una sequenza di molecole contenenti funzioni poliossietileniche, sequenzialmente legate mediante legami ammidici, detto spaziatore avendo un peso molecolare complessivo compreso tra 1200 e 1800 Dalton; - L2à ̈ uno spaziatore di tipo poliossietilenico contenente almeno una funzione amminica ed una funzione carbossilica necessarie per formazione di legami ammidici con Y e P, rispettivamente, oppure una sequenza di molecole contenenti funzioni poliossietileniche, sequenzialmente legate mediante legami ammidici, detto spaziatore avendo un peso molecolare complessivo compreso tra 200 e 800 Dalton.
2. 2. Aggregato supramolecolare secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che C à ̈ un residuo di un acido poliamminocarbossilico scelto tra acido dietilentriammino pentaacetico (DTPA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7-triacetico (DO3A), acido [10-(2-idrossipropil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7-triacetico (HPDO3A), acido 4-carbossi-5,8,11-tris(carbossimetil)-1-fenil-2-ossa-5,8,11-triazatridecan-13-oico (BOPTA), N-[2-[bis(carbossimetil)ammino]-3-(4-etossifenil)propil]-N-[2-[bis(carbossimetil)ammino]etilglicina (EOB-DTPA), N,N-bis[2-[(carbossimetil) [(metilcarbamoil)metil]ammino]etil]glicina (DTPA-BMA), acido 2-metil-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetico (MCTA), acido (α,α',α'', α''')-tetrametil-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4, 7,10-tetracetico (DOTMA) acido 1,4,7-triazaciclononano N-glutarico N ,N-diacetico (NODAGA), acido 1,4, 7-Triazaciclononano N-succinico N,N-diacetico (NODASA), acido 1,4, 7-triazaciclononano triacetico (NOTA), acido etilendiamminicotetraacetico (EDTA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclotridecano 1,4,7,10-tetraacetico (TRITA), acido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano 1,4,8,11-tetraacetico (TETA).
3. 3. Aggregato supramolecolare secondo la rivendicazione 1, in cui il gruppo C Ã ̈ un residuo di un legante acido poliamminofosfato, scelto dal gruppo che consiste di acido N,N'-bis-(piridossal-5-fosfato)etilendiammina-N,N'-diacetico (DPDP) e acido etilenedinitrilotetrakis(metilfosfonico) (EDTP).
4. 4. Aggregato supramolecolare secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il gruppo C Ã ̈ scelto dal gruppo che consiste di acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetrakis[metilen(metilfosfonico)] e acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetrakis[metilen(metilfosfinico)].
5. 5. Aggregato supramolecolare secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il gruppo C Ã ̈ scelto tra DTPA, DTPAGlu e DOTA.
6. 6. Aggregato supramolecolare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, caratterizzato dal fatto che P Ã ̈ un peptide scelto dal gruppo che consiste di -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nle-NH2(SEQ ID NO:3), -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Cha-Nle-NH2(SEQ ID NO:4), -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Cha-Nle-Glu-NH2(SEQ ID NO:5), -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2(SEQ ID NO:6), -Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Sta-Leu-NH2(SEQ ID NO:7), -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2(SEQ ID NO:8), -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Cha-Nle-NH2(SEQ ID NO:9), -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Sta-Leu-NH2(SEQ ID NO:10), -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(SEQ ID NO:11), -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-NMeGly-His-Leu-Nle-NH2(SEQ ID NO:12).
7. 7. Aggregato supramolecolare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, caratterizzato dal fatto che Y Ã ̈ un amminoacido naturale, scelto dal gruppo che consiste di lisina, acido glutammico o acido aspartico o un amminoacido non naturale, scelto dal gruppo che consiste di ornitina ed acido 2,3-diamminoproprionico (Dap).
8. 8. Aggregato supramolecolare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, caratterizzato dal fatto che detto surfattante ionico con struttura di fosfolipide à ̈ scelto da gruppo che consiste di Soy phosphatidylcholine (SPC), Egg Phosphatidylcholine (EPC) 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DOPC), 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPPC), 1,2-Disteroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), hydrogenated egg phosphatidylcholine (HEPC), phosphatidylglycerol (PG).
9. 9. Aggregato supramolecolare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la molecola anfifilica di formula generale (I) Ã ̈ presente nella composizione finale del liposoma in percentuale da 0,5% a 15% in moli, preferibilmente tra 1% e 5% in moli.
10. 10. Aggregato supramolecolare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il gruppo chelante C Ã ̈ complessato con ioni bivalenti o trivalenti degli elementi aventi numero atomico variabile fra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, o fra 57 e 83, isotopi radioattivi di metalli scelti tra<99m>Tc,<203>Pb,<67>Ga,<68>Ga,<72>As,<111>In, <113 90>In, Yt,<97>Ru,<82m>Rb,<62>Cu,<64>Cu,<52>Fe,<52m>Mn,<140>La, <175>Yb,<153>Sm,<166>Ho,<149>Pm,<177>Lu,<142>Pr,<159>Gd,<212>Bi, <47>Sc,<149>Pm,<67>Cu,<111>Ag,<199>Au,<188>Re,<186>Re,<161>Tb e<51>Cr o con ioni di metalli paramagnetici Fe<2+>, Gd<3+>, Eu<3+>, Dy<3+>, La<3+>, Yb<3+>o Mn<2+>e composti con isotopi radioattivi di alogeni scelti tra<123>I,<125>I,<131>I, <75>Br,<76>Br,<74>Br,<77>Br,<82>Br.
11. 11. Aggregato supramolecolare secondo la rivendicazione 10, in forma di complesso con Fe<2+>, Gd<3+>, Eu<3+>, Dy<3+>, La<3+>, Yb<3+>, Mn<2+>, Fe<3+>, Cu<2+>, Cr<3+>, con radioisotopi come<51>Cr,<67>Ga,<68>Ga,<111>In,<99m>Tc,<140>La,<175>Yb, <153>Sm,<166>Ho,<90>Y,<149>Pm,<177>Lu,<47>Sc,<142>Pr,<159>Gd,<212>Bi.
12. 12. Aggregato supramolecolare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in funzione del suo impiego per la somministrazione di un farmaco antitumorale.
13. 13. Aggregato supramolecolare secondo la rivendicazione 12, in funzione del suo impiego per veicolare il farmaco doxorubicina in modo selettivo su cellule tumorali esprimenti recettori GRP.