ITTO20111077A1 - Strategia migliorata per il saggio di enzimi e miscele di enzimi per l'idrolisi di biomassa lignocellulosica - Google Patents

Strategia migliorata per il saggio di enzimi e miscele di enzimi per l'idrolisi di biomassa lignocellulosica Download PDF

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Description

“Strategia migliorata per il saggio di enzimi e miscele di enzimi per l’idrolisi di biomassa lignocellulosica†,
DESCRIZIONE SFONDO
La selezione e la caratterizzazione di un enzima oppure di una miscela di enzimi verso una specie di biomassa lignocellulosica richiede tempo e spesso più una tecnica che scienza. Poiché viene posta più attenzione a processi di commercializzazione che idrolizzano una biomassa lignocellulosica, vi à ̈ una maggiore necessità di enzimi migliori e più attivi. Esiste quindi la necessità di un procedimento per il saggio di enzimi e miscele di enzimi per l'idrolisi di biomassa lignocellulosica. Esiste la necessità di un saggio di enzimi e miscele di enzimi per l'idrolisi di biomassa lignocellulosica che possa venire eseguito in modo efficiente per quanto riguarda il tempo, separatamente dall'idrolisi della biomassa lignocellulosica.
SOMMARIO
La presente descrizione descrive un procedimento per il saggio di enzimi e miscele di enzimi per l'idrolisi di biomassa lignocellulosica. Il procedimento descritto in questa descrizione comprende le fasi di: a) misurare la concentrazione di proteine di un enzima oppure una miscela di enzimi, b) aggiungere l'enzima oppure la miscela di enzimi ad una pluralità di fiale di test creando una frazione liquida nella pluralità di fiale di test, in cui ciascuna fiala di test nella pluralità di fiale di test contiene un substrato differente, c) incubare ciascuna provetta per un periodo di tempo sufficiente per ottenere la conversione del substrato in ciascuna fiala di test della pluralità di fiale di test allo stesso pH e temperatura mentre, se necessario, si applica almeno agitazione sufficiente per mantenere il substrato in sospensione, d) bloccare la reazione, ed e) analizzare l’assorbanza ottica della frazione liquida di almeno una fiala di test della pluralità di fiale di test.
La presente descrizione descrive inoltre che almeno una fiala di test della pluralità di fiale di test contiene un substrato di carta da filtro.
La presente descrizione descrive inoltre che almeno una fiala di test della pluralità di fiale di test contiene un substrato di CMC.
La presente descrizione descrive inoltre che almeno una fiala di test della pluralità di fiale di test contiene un substrato di salicina.
La presente descrizione descrive inoltre che almeno una fiala di test della pluralità di fiale il test contiene un substrato di xilano.
La presente descrizione descrive inoltre che almeno una fiala di test della pluralità di fiale di test contiene un substrato di Avicel.
La presente descrizione descrive inoltre che almeno una fiala di test della pluralità di fiale di test contiene almeno un substrato di PNP scelto dal gruppo costituito da α-L-arabinofuranoside, β-D-galattopiranoside, β-D-glucuronide, α-D-glucopiranoside, β-D-mannopiranoside, α-D-galattopiranoside.
La presente descrizione descrive inoltre che la fase di bloccaggio della reazione viene eseguita aggiungendo un reagente che arresta l’azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi sulla carta da filtro, ad almeno una fiala di test contenente un substrato di carta da filtro.
La presente descrizione descrive inoltre che la fase di bloccaggio della reazione viene eseguita aggiungendo un reagente che arresta l'azione dell’enzima oppure della miscela di enzimi su CMC, all'almeno una fiala di test contenente un substrato di CMC.
La presente descrizione descrive inoltre che la fase di bloccaggio della reazione viene eseguita aggiungendo un reagente che arresta l’azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi su salicina, all'almeno una fiala di test contenente un substrato di salicina.
La presente descrizione descrive inoltre che la fase di bloccaggio della reazione viene eseguita aggiungendo un reagente che arresta l'azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi su Avicel, all'almeno una fiala di test contenente un substrato di Avicel.
La presente descrizione descrive inoltre che la fase di bloccaggio della reazione viene eseguita aggiungendo un reagente che arresta l'azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi su xilano, all'almeno una fiala di test contenente un substrato di xilano.
La presente descrizione descrive inoltre che la fase di bloccaggio della reazione viene eseguita aggiungendo un reagente che arresta l'azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi su almeno uno dei sei differenti substrati di PNP, all'almeno una fiala di test contenente uno dei sei substrati di PNP differenti.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
Nella descrizione si descrive un procedimento per il saggio di tutte le attività che costituiscono un enzima oppure una soluzione di enzimi che possono venire usati per convertire materiale lignocellulosico in zuccheri monomerici. Il procedimento descritto à ̈ utile per la valutazione rapida di enzimi e miscele di enzimi per l'idrolisi di biomassa lignocellulosica.
Il procedimento segue le fasi di: a) opzionalmente misurare la concentrazione di proteine di un enzima oppure una miscela di enzimi, b) aggiungere l'enzima oppure la miscela di enzimi ad una pluralità di fiale di test creando una frazione liquida nella pluralità di fiale di test, in cui ciascuna fiala di test della pluralità di fiale di test contiene un substrato differente, c) incubare ciascuna fiala di test per un periodo di tempo sufficiente per ottenere l'idrolisi del substrato in ciascuna fiala di test della pluralità di fiale di test, d) bloccare la reazione, ed e) analizzare l’assorbanza ottica della frazione liquida di almeno una fiala di test della pluralità di fiale di test.
Le fiale di test vengono caratterizzate come qualsiasi fiala che sia in grado di contenere un liquido, come una provetta oppure un pallone.
Preferibilmente, ciascuna fiala di test nella pluralità di fiale di test contiene solo un substrato. La preparazione dei substrati contenuti nella pluralità di fiale di test richiede la preparazione di un tampone. Differenti enzimi possono venire saggiati in differenti tamponi che variano come tipo, composizione e pH. Tamponi possono venire preparati come soluzione base 1 N che può venire diluita a 0,05 M per preparare una soluzione operativa. A scopo di esempio, ma non di limitazione, una soluzione di tampone citrato può venire preparata come soluzione base 1 N miscelando preferibilmente 210 g di acido citrico monoidrato con 750 ml di acqua ultrapura e aggiungendo fra 50 e 60 g di NaOH, la quantità di NaOH essendo determinata dalla quantità necessaria per raggiungere un pH di 4,5.
La soluzione operativa 0,05 M viene quindi preparata miscelando 50 ml della soluzione base 1 N con 950 ml di acqua ultrapura e aggiungendo CaCl21 M (1 ml) e/oppure DTT 0,45M (22 ml), a seconda delle caratteristiche dell'enzima, e regolando il pH al valore richiesto.
Preferibilmente, almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test comprende un substrato come un substrato di carta da filtro che à ̈ utile per quantificare l'attività di degradazione della cellulosa degli enzimi oppure delle soluzioni di enzimi. Preferibilmente, il substrato di carta da filtro à ̈ costituito da una striscia di 15 mg di carta da filtro Whatman n. 1 (0,55 x 3,29 cm).
Preferibilmente, almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test comprende un substrato come un substrato di Avicel che à ̈ utile per quantificare l'attività di esocellulasi degli enzimi oppure delle soluzioni di enzimi. Preferibilmente, il substrato di Avicel viene preparato usando 5 g di Avicel (Sigma, 11365) in combinazione con 100 ml di un tampone citrato 50 mM mantenuto in continua agitazione usando un agitatore magnetico.
Preferibilmente, almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test comprende un substrato come un substrato di carbossimetilcellulosa (CMC) che à ̈ utile per quantificare l'attività di endocellulasi degli enzimi oppure delle soluzioni di enzimi. Preferibilmente, il substrato di CMC viene preparato usando 2 g di carbossimetilcellulosa CMC 7L2 (SIGMA, 419273) in combinazione con 100 ml di tampone citrato 50 mM.
Preferibilmente, almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test comprende un substrato come un substrato di salicina che à ̈ utile per quantificare l'attività di beta-glucosidasi degli enzimi oppure delle soluzioni di enzimi. Preferibilmente, il substrato di salicina viene preparato usando 1 g di salicina (Sigma S0625) in combinazione con 100 ml di tampone citrato 50 mM.
Preferibilmente, almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test comprende un substrato come un substrato di xilano che à ̈ utile per quantificare l'attività di xilanasi degli enzimi oppure delle soluzioni di enzimi. Preferibilmente, il substrato di xilano viene preparato usando 2 g di xilano di legno di betulla (Sigma X0502) in combinazione con 70 ml di acqua ultrapura riscaldata all'ebollizione sotto agitazione, e quindi raffreddata a temperatura ambiente mentre si aggiungono 5 ml di una soluzione base di tampone 1N.
Almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test può anche comprendere un substrato come il substrato di α-L-arabinofuranoside che à ̈ utile per quantificare l'attività di arabinasi di un enzima oppure di una soluzione di enzimi. Preferibilmente, il substrato di α-L-arabinofuranoside viene preparato usando 2,5 mg di P-nitrofenil- α-L-arabinofuranoside (Sigma N3641) in combinazione con 1,84 ml di tampone citrato di 50 mM.
Almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test può anche comprendere un substrato come il substrato di β-D-galattopiranoside che à ̈ utile per quantificare l'attività di galattosidasi di un enzima oppure di una soluzione di enzimi. Preferibilmente, il substrato di β-D-galattopiranoside viene preparato usando 2,8 mg di P-nitrofenil- β-D-galattopiranoside (Sigma N1252) in combinazione con 1,86 ml di tampone citrato di 50 mM.
Almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test può anche comprendere un substrato come un substrato di β-D-glucuronide che à ̈ utile per quantificare l'attività di glucuronidasi di un enzima o di una soluzione di enzimi. Preferibilmente, il substrato di β-D-glucuronide viene preparato usando 10,8 mg di P-nitrofenil- β-D-glucuronide (Sigma N1627) in combinazione con 6,85 ml di tampone citrato di 50 mM.
Almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test può anche comprendere un substrato come un substrato di α-D-glucopiranoside che à ̈ utile per quantificare l'attività di β-glucosidasi di un enzima oppure di una soluzione di enzimi. Preferibilmente, il substrato di α-D-glucopiranoside viene preparato usando 8 mg di P-nitrofenil-α-D-glucopiranoside (Sigma N1377) in combinazione con 5,31 ml di tampone citrato di 50 mM.
Almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test può anche comprendere un substrato come un substrato di β−D-mannopiranoside che à ̈ utile per quantificare l'attività di mannosidasi di un enzima oppure di una soluzione di enzimi. Preferibilmente, il substrato di β−D-mannopiranoside viene preparato usando 8 mg di P-nitrofenil- β−D-mannopiranoside (Sigma N1268) in combinazione con 5,31 ml di tampone citrato di 50 mM.
Almeno uno dei substrati contenuti in almeno una della pluralità di fiale di test può anche comprendere un substrato come un substrato di α−D-galattopiranoside che à ̈ utile per quantificare l'attività di galattosidasi di un enzima oppure di una soluzione di enzimi. Preferibilmente, il substrato di α−D-galattopiranoside viene preparato usando 8 mg di P-nitrofenil- α−D-galattopiranoside (Sigma N0877) in combinazione con 5,31 ml di tampone citrato di 50 mM.
Quando i substrati appropriati sono stati preparati e aggiunti alla pluralità di fiale di test, si deve aggiungere l'enzima oppure la soluzione di enzimi. Per confrontare direttamente soluzioni di enzimi differenti, à ̈ preferibile che ciascuna soluzione di enzimi venga diluita alla stessa concentrazione finale di enzimi. In alcuni casi, può essere preferibile preparare più di una diluizione per stimare meglio i contenuti di attività.
Le procedure seguenti sono necessarie per l'analisi per quantificare l'attività che avviene in una fiala di test contenente un substrato di carta da filtro, un substrato di CMC, un substrato di salicina, un substrato di xilano e/oppure un substrato di Avicel. Preferibilmente, la temperatura della pluralità di provette viene equilibrata ponendole in un termomiscelatore ad una temperatura corrispondente alla velocità di reazione massima dell'enzima per cinque minuti prima di aggiungere l'enzima oppure la soluzione di enzimi. Le provette contenenti il substrato di Avicel vengono preferibilmente regolate a 1000 giri/minuto. Quando l'enzima oppure la soluzione di enzimi viene aggiunta alla provetta, essa viene incubata nel termomiscelatore per un tempo preferibilmente tra 10 minuti e 60 minuti. Preferibilmente, un reagente viene aggiunto all'enzima oppure alla miscela di enzimi per bloccare la velocità di reazione, e la combinazione risultante viene incubata ad una temperatura di preferibilmente 99°C per un tempo preferibilmente di almeno 7 minuti per ridurre sufficientemente o arrestare la reazione dell'enzima oppure della miscela di enzimi. La preparazione del reagente dipenderà dal tipo di enzima o miscela di enzimi usati. Preferibilmente, il reagente deve essere una soluzione di acido 3,5-dinitrosalicilico. La preparazione del reagente dipenderà dal tipo di enzima o miscela di enzimi in uso. L’assorbanza ottica viene preferibilmente letta a 540 nm.
Le procedure seguenti sono necessarie per l'analisi per quantificare l'attività che avviene in una fiala di test contenente un substrato di α-L-arabinofuranoside, un substrato di β-D-galattopiranoside, un substrato di β-D-glucuronide, un substrato di α-D-glucopiranoside, un substrato di β-D-mannopiranoside, e/oppure un substrato di α-D-galattopiranoside. Preferibilmente, la temperatura della pluralità di provette viene equilibrata ponendole in un termomiscelatore ad una temperatura scelta per l'adattamento ottimale all'enzima, per cinque minuti prima di aggiungere l'enzima oppure la soluzione di enzimi. Il termomiscelatore deve preferibilmente contenere un adattatore per una piastra di microtitolazione (MTP) e preferibilmente venire regolato a 500 giri/minuto mentre si copre la piastra con una pellicola di plastica. Quando l'enzima oppure la soluzione di enzimi vengono aggiunti alla provetta, essa viene coperta con una pellicola di plastica e incubata nel termomiscelatore a preferibilmente 50°C per un tempo preferibilmente fra 10 minuti e 60 minuti. La riduzione della velocità di reazione dell'enzima richiede che una quantità di reagente venga aggiunta all’enzima oppure alla miscela di enzimi, e che la combinazione risultante venga incubata preferibilmente a 500 giri/minuto ad una temperatura preferibilmente di 25°C per un tempo preferibilmente di almeno 10 minuti, mantenendo preferibilmente la piastra con una pellicola di plastica, per arrestare l'azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi. Preferibilmente, il reagente deve essere una soluzione di Na2CO31 M. L'assorbanza ottica viene preferibilmente letta a 405 nm.
Il bloccaggio della reazione à ̈ caratterizzato da una riduzione sufficiente della velocità di reazione affinché l'analisi della composizione delle fiale possa venire ottenuta accuratamente in corrispondenza del tempo in cui le fiale vengono rimosse dall'ambiente a temperatura controllata. Tipicamente, la velocità di reazione verrà ridotta ad una velocità nel campo dallo 0 al 20% della velocità della reazione che viene valutata. Più preferibilmente, la velocità sarà nel campo dallo 0 al 10%, con dallo 0 al 5% essendo ancora più preferito, con dallo 0 al 2% essendo molto preferito.
Un procedimento per preparare un reagente può comportare le fasi di; a) disciogliere una quantità di acqua distillata con una quantità di acido dinitrosalicilico ed una quantità di idrossido di sodio, b) aggiungere una quantità di tartrato doppio di potassio e sodio, c) aggiungere una quantità di fenolo, e d) aggiungere una quantità di metabisolfito di sodio (Na2S2O5). Preferibilmente, la quantità di acqua distillata à ̈ 1416 ml. Preferibilmente, la quantità di acido dinitrosalicilico à ̈ 10,6 g. Preferibilmente, la quantità di idrossido di sodio à ̈ 19,8 g. Il tartrato doppio di potassio e sodio può comprendere, ma non à ̈ limitato a questo, il tartrato di sodio e potassio e KNaC4H4O6•4H2O. Il tartrato doppio di potassio e sodio viene preferibilmente aggiunto in una quantità di 306 g. I fenoli vengono preferibilmente aggiunti in una quantità di 7,6 ml. Il metabisolfito di sodio (Na2S2O5) viene preferibilmente aggiunto in una quantità di 8,3 g.
Un altro procedimento per preparare un reagente può comportare la preparazione di una soluzione di Na2CO3mediante dissoluzione di una quantità di Na2CO3in acqua ultrapura fino a un volume finale. Preferibilmente, la quantità di Na2CO3à ̈ 10,6 g. Preferibilmente, il volume finale à ̈ 100 ml.
Dopo bloccaggio della reazione, il campione può venire raffreddato in ghiaccio per un tempo di preferibilmente 10 minuti.
Se à ̈ necessaria diluizione, la fase dell'analisi di assorbanza ottica della frazione liquida di almeno una fiala di test della pluralità richiede di posizionare preferibilmente una porzione del campione direttamente in un pozzetto di, preferibilmente, una piastra a 96 pozzetti e l'aggiunta di acqua ultrapura e la miscelazione vigorosa del campione per ottenere un campione appropriatamente diluito.

Claims (3)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la caratterizzazione di un enzima e di miscele di enzimi per l’idrolisi di biomassa lignocellulosica, comprendente le fasi di a. aggiungere l'enzima oppure la miscela di enzimi ad una pluralità di fiale di test creando una frazione liquida nella pluralità di fiale di test, in cui vi à ̈ almeno una fiala di test contenente un substrato di carta da filtro, almeno una fiala di test contenente uno substrato di CMC, almeno una fiala di test contenente un substrato di salicina, almeno una fiala di test contenente un substrato di xilano, almeno una fiala di test contenente un substrato di Avicel, e almeno una fiala di test contenente un substrato di PNP scelto dal gruppo costituito da α-L-arabinofuranoside, β-D-galattopiranoside, β-D-glucuronide, α-D-glucopiranoside, β-D-mannopiranoside, α-D-galattopiranoside; b. incubare ciascuna fiala di test per un periodo di tempo sufficiente per ottenere idrolisi del substrato in ciascuna fiala di test della pluralità di fiale di test allo stesso pH e temperatura mentre, se necessario, si applica almeno agitazione sufficiente per mantenere il substrato in sospensione, c. bloccare la reazione, d. analizzare l’assorbanza ottica della frazione liquida di almeno una fiala di test della pluralità.
  2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la fase di bloccaggio della reazione viene effettuata aggiungendo un reagente che arresta la reazione dell'enzima oppure della miscela di enzimi sulla carta da filtro, ad almeno una fiala di test contenente carta da filtro, un reagente che arresta l'azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi su CMC, all'almeno una fiala di test contenente CMC, un reagente che arresta l'azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi su salicina, all'almeno una fiala di test contenente salicina, un reagente che arresta l’azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi su Avicel, all'almeno una fiala di test contenente Avicel, un reagente che arresta l'azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi su xilano, all'almeno una fiala di test contenente xilano, un reagente che arresta l'azione dell'enzima oppure della miscela di enzimi su almeno uno di 6 substrati di PNP differenti, all'almeno una fiala di test contenente l'almeno uno dei 6 substrati di PNP differenti.
  3. 3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2, in cui la fase (b) di aggiunta dell'enzima viene preceduta dalla misurazione della concentrazione di proteine di un enzima oppure miscela di enzimi.
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