ITTO20120331A1 - Dispositivo per l'ottenimento di colture cellulari in tre dimensioni, procedimento per la sua realizzazione e impiego di tale dispositivo - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo: “Dispositivo per l’ottenimento di colture cellulari in tre dimensioni, procedimento per la sua realizzazione e impiego di tale dispositivoâ€

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un dispositivo per l’ottenimento di colture cellulari in tre dimensioni, ad un procedimento per la sua realizzazione e ad un impiego di tale dispositivo per l’ottenimento di cellule sospese non adese al substrato.

La disposizione di una cellula ad aderire, crescere e differenziarsi su un substrato (o supporto) compatto o su un’intelaiatura avente funzione di sostegno à ̈ uno degli aspetti più importanti dell’ingegneria dei tessuti e della caratterizzazione di biomateriali.

La maggior parte dei processi cellulari fisiologici e patologici come la crescita, l’adesione, la migrazione, la secrezione e la morte sono influenzati dall’organizzazione tridimensionale della matrice extra-cellulare. Le cellule rispondono alle concentrazioni locali di un grande numero di molecole che possono essere disciolte in mezzi extracellulari (gas, amminoacidi, ioni, farmaci), presenti sulla superficie di crescita e sulla membrana delle cellule adiacenti (recettori di membrana).

Nelle colture tridimensionali il rapporto fra le cellule e il substrato à ̈ controllato dalle caratteristiche geometriche e dalle proprietà chimiche e fisiche del supporto, allo scopo di realizzare colture cellulari in vitro con un'organizzazione ed una funzionalità il più possibile vicine a quelle dei tessuti nativi.

È noto che il comportamento di una cellula può essere controllato e guidato attraverso cambiamenti nelle caratteristiche topografiche della superficie del supporto, su scala micro e nano-metrica. E’ proprio in questo contesto che controllare la bagnabilità può anche avere un ruolo molto importante nell’ottimizzazione delle prestazioni di substrati biocompatibili.

Imponendo specifiche geometrie alla superficie di un dispositivo solido biocompatibile e modificandone le caratteristiche di bagnabilità à ̈ possibile aumentarne il rapporto superficie-volume, rendendo anche compatibili, dal punto di vista dimensionale, le caratteristiche geometriche del dispositivo con le caratteristiche morfologiche del tipo di cellula usato.

Per questo motivo, la bagnabilità e la rugosità dei supporti di crescita sono da considerarsi tra i più importanti fattori regolanti la diffusione, l’allineamento e la migrazione delle cellule.

Una delle teorie che giustifica questi comportamenti delle cellule à ̈ la teoria del “contact guide effect†, in cui i contatti focali mediati da integrine trasferiscono gradi variabili di tensione e/o compressione agli elementi del citoscheletro seguendo le variazioni topografiche della superficie. Tale teoria à ̈ descritta nell’articolo di Tan, J. L. et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 1484-1489, doi:10.1073/pnas.0235407100 (2003).

La capacità di crescere rispondendo alle caratteristiche topografiche del supporto di crescita sono ben note per diversi tipi cellulari; essi mostrano interessanti risposte di crescita se piastrati su substrati caratterizzati in superficie da differenti geometrie e gradi diversi di superidrofobicità.

Esistono tuttavia tipi di cellule che normalmente crescono adese alla superficie del substrato, come le cellule neuronali. Per tali tipi di cellule non sono noti substrati in grado di consentire una loro crescita sospesa.

Il documento WO 2010/023635 descrive un dispositivo in cui, su un substrato, sono realizzate una pluralità di micro-strutture distanziate tra loro in maniera periodica in modo tale da rendere superidrofobico il substrato, finalizzato all’impiego per la concentrazione e la localizzazione di un soluto in una ristretta porzione di spazio.

Tra i sistemi usati più di recente per la crescita di cellule in tre dimensioni si hanno matrici di polimeri biodegradabili sintetici o naturali. In relazione alle diverse applicazioni, i polimeri possono essere realizzati, con diverse porosità, in dispositivi quali membrane, film e nano tubi, come descritto in Langer, R. & Tirrell, D. A. Designing materials for biology and medicine. Nature 428, 487-492, doi: 10.1038/nature02388 (2004).

Ad esempio vengono utilizzati tubi di matrice di collagene per promuovere la rigenerazione del tessuto nervoso, e materiali in forma di gel sono utilizzati prevalentemente per l’isolamento o come substrati per la rigenerazione del tessuto connettivo.

Nella maggior parte dei casi si tratta di dispositivi costituiti da una matrice porosa su cui attecchiscono le cellule. All’interno dei pori, oltre alle cellule, deve trovare spazio anche il fluido che ha il compito di nutrirle. La crescita cellulare à ̈ fortemente correlata alla quantità di nutrienti presenti nel mezzo di coltura e al tipo di moto che il fluido possiede. Volendo ottenere una coltura uniforme all’interno di tutto il costrutto cellulare, sarà necessario che il fluido nutriente riesca ad invadere ogni poro della matrice. D’altro canto, la crescita cellulare, con il tempo, va a riempire i vuoti presenti nella matrice, causando una diminuzione del flusso dei nutrienti.

I dispositivi noti di supporto per la crescita tridimensionale di cellule sospese non sono perfettamente in grado di fornire una quantità sufficiente di nutritivi e, allo stesso tempo, rimuovere adeguatamente i prodotti di scarto.

Inoltre, le limitazioni dei trattamenti standard delle lesioni di nervi periferici, che richiedono l’impianto di un nervo autologo portando ad un deficit al sito del donatore e richiedendo una chirurgia addizionale, hanno motivato la ricerca di soluzioni di bioingegneria per la realizzazione di impianti artificiali che consentano di ottenere una buona rigenerazione del tessuto nervoso.

Scopo della presente invenzione à ̈ dunque quello di proporre un dispositivo per l’ottenimento di colture cellulari in tre dimensioni, che sia in grado di superare i problemi sopra citati e che permetta la crescita di cellule sospese anche per tipi di cellule che normalmente crescono adese al substrato, in particolare per applicazioni di rigenerazione di tessuto nervoso.

Ulteriore scopo della presente invenzione à ̈ quello di proporre un procedimento per la realizzazione del dispositivo sopra citato e un impiego di tale dispositivo per l’ottenimento di cellule sospese non adese al substrato.

Questi ed altri scopi vengono raggiunti con un dispositivo le cui caratteristiche sono definite nella rivendicazione 1, con un procedimento di realizzazione di tale dispositivo le cui caratteristiche sono definite nella rivendicazione 8 e con un impiego di tale dispositivo per l’ottenimento di cellule sospese non adese al substrato come descritto nella rivendicazione 14.

Modi particolari di realizzazione formano oggetto delle rivendicazioni dipendenti, il cui contenuto à ̈ da intendersi come parte integrale ed integrante della presente descrizione.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell’invenzione appariranno dalla descrizione dettagliata che segue, effettuata a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali:

- la figura 1 à ̈ una vista dall’alto di un dispositivo secondo l’invenzione,

- la figura 2 Ã ̈ un ingrandimento in prospettiva di una delle nano-strutture del dispositivo di figura 1, e

- la figura 3 Ã ̈ una vista laterale della nanostruttura di figura 2.

In sintesi, l’invenzione utilizza tecniche di micro-fabbricazione per la realizzazione di un dispositivo superidrofobico avente strutture con pareti laterali almeno parzialmente nano-sagomate (nano-patterned), usato nei procedimenti di coltura cellulare per l’ottenimento di cellule sospese, ovvero non totalmente adese al substrato, in particolare per la crescita tridimensionale di cellule neuronali ippocampali e per la crescita di cocoltura di neuroni ippocampali e cellule gliali.

Tale dispositivo combina due tipologie di dettagli topografici, aventi rispettivamente dimensioni di diversa scala, in particolare strutture micrometriche che conferiscono alla superficie del substrato la superidrofobicità, mentre caratteristiche nano-metriche di tali strutture micrometriche rendono possibile la stratificazione in tre dimensioni delle colture cellulari.

La geometria della superficie dei supporti à ̈ caratterizzata da ampi spazi liberi tra una microstruttura e quella adiacente, e questo consente un miglior ricircolo delle sostanze nutritive e più agevoli scambi gassosi tra le cellule e il mezzo di coltura

Rispetto alle tradizionali colture cellulari in vitro, il dispositivo della presente invenzione permette di raggiungere risultati qualitativamente superiori fornendo alle cellule la giusta quantità di nutrienti e stimoli meccanici appropriati per lo sviluppo di co-culture e di tessuti per applicazioni biomedicali più riproducibili ed economicamente sostenibili.

L’invenzione mira quindi alla realizzazione di dispositivi superidrofobici nano-strutturati per la crescita tridimensionale di cellule normali (anche in co-coltura), per lo studio dell’arrangiamento spaziale di colture cellulari tumorali; per test di screening farmacologici e tossicologici in vitro, finalizzati alla terapia cellulare.

L’invenzione permette di eseguire applicazioni di ingegneria tissutale quali la rigenerazione nervosa.

In figura 1 à ̈ illustrato il dispositivo secondo l’invenzione che comprende un substrato 1 ad esempio di silicio o di materiale polimerico biocompatibile o bioerodibile, e una pluralità di microstrutture 2, in particolare micro-cilindri, che si estendono dal substrato.

Tali micro-strutture 2 possono vantaggiosamente avere una sezione di forma circolare, quadrata, rettangolare, esagonale o di qualsiasi altra forma.

Tali micro-strutture 2 sono preferibilmente disposte ortogonalmente alla superficie del substrato 1 e sono sistemate sul substrato 1 secondo un reticolo periodico in modo tale da rendere superidrofobico il substrato 1.

Con il termine superidrofobico nella presente descrizione si intende una superficie su cui l’angolo di contatto che una goccia di acqua (distillata) forma con la superficie stessa à ̈ maggiore di 150°. L’angolo di contatto à ̈ l’angolo formato dalla tangente all’interfaccia liquido-vapore con la tangente all’interfaccia liquido solido. L’ottenimento di superfici micro-strutturate superidrofobiche à ̈ funzione della densità areica e della dimensione trasversale delle micro-strutture. I principi di progetto per la realizzazione delle suddette superfici micro-strutturate superidrofobiche sono di per sé noti e descritti ad esempio in de Angelis, F. et al. “Breaking the diffusion limit with super-hydrophobic delivery of molecules to plasmonic nanofocusing SERS structures†, Nature Photonics, Volume 5, Issue 11, pp. 682-687 (2011), incorporato alla presente per effetto di tale citazione.

Il substrato 1 ha vantaggiosamente una resistività di circa 5-10Ω/cm.

Le micro-strutture 2 sono ottenute mediante processi di litografia e attacco, oppure micromolding, di per sé noti, come descritto in seguito.

Le micro-strutture 2 sono distanziate sul substrato 1 di una distanza 4 predeterminata preferibilmente compresa nell’intervallo 15-30µm.

Le micro-strutture 2 hanno preferibilmente una larghezza di base compresa nell’intervallo 5-20µm, e un’altezza compresa nell’intervallo 5-30µm.

Con il termine larghezza alla base si intende nella presente descrizione la dimensione minima tra quelle che definiscono la forma della sezione.

La larghezza di base e la distanza 4 tra le micro-strutture 2 vengono scelte secondo un criterio di per sé noto dall’articolo sopra indicato.

In questo modo, si ottiene una piccola frazione di materiale solido del dispositivo complessivo che, nel caso di micro-cilindri, Ã ̈ pari a:

f= *

dove l à ̈ la distanza 4 e d à ̈ il diametro dei microcilindri.

Tale frazione f permette di aumentare l’idrofobicità del substrato 1 che diventa quindi in grado di raggiungere angoli di contatto che si avvicinano ai 170°. Il parametro f à ̈ tuttavia ancora sufficientemente grande da evitare il collasso della goccia ai primi stadi dell’evaporazione.

Ai fini dell’utilizzo del dispositivo per le finalità oggetto dell’invenzione à ̈ preferibile l’applicazione sulla superficie del dispositivo di rivestimenti idonei a favorire la crescita di colture cellulari mantenendo le proprietà di superidrofobicità o imponendo tali proprietà. A tal fine può essere contemplata l’applicazione di un rivestimento biocompatibile (laddove il substrato non sia già esso stesso biocompatibile), ad esempio metallico, vetroso o vetroceramico, e di un eventuale strato di ancoraggio per detto rivestimento biocompatibile, applicato sulla superficie del substrato. Un sottile rivestimento polimerico idrofobico, ad esempio un polimero fluorurato quale si ottiene da polimerizzazione di octafluorociclobutano, può infine essere applicato al rivestimento biocompatibile, in spessori tali da non alterare la biocompatibilità superficiale del dispositivo.

Nella figura 2 Ã ̈ illustrato un ingrandimento in prospettiva di una delle micro-strutture del dispositivo di figura 1.

Le pareti laterali della micro-struttura 2 non sono lisce bensì sagomate, cioà ̈ presentano sporgenze 14 e incavi 16 alternati, con un predeterminato passo (o distanza spaziale) che dipende dalla durata della fase di attacco secco isotropico al plasma e della fase di deposizione di uno strato di passivazione descritte in seguito.

L’altezza delle sporgenze 14 o incavi 16 può essere costante lungo tutta la parete di una microstruttura, oppure può variare, così come l’altezza tra sporgenze 14 e incavi 16 adiacenti può essere uguale o differente.

Nella presente descrizione con il termine liscia si intende che la parete laterale di una micro-struttura, vista in sezione di un piano parallelo all’asse principale di estensione della microstruttura, ha un profilo rettilineo r non presenta sporgenze e incavi.

In figura 3 à ̈ mostrata una vista laterale della micro-struttura 2 di figura 2 in cui sono evidenziate rispettivamente l’altezza h della microstruttura 2 e l’altezza h1che separa due sporgenze 14 adiacenti.

In una variante dell’invenzione, le microstrutture 2 non hanno pareti laterali interamente sagomate ma presentano un’alternanza di zone (fasce) sagomate e zone (fasce) lisce prive delle sporgenze 14 e degli incavi 16.

Preferibilmente, il dispositivo della presente invenzione comprende anche una pluralità di elettrodi, ciascuno associato ad una micro-struttura 2 (sia essa del tipo a pareti laterali interamente sagomate o del tipo a pareti laterali con alternanza di zone lisce e zone sagomate), collegati a delle tracce conduttive realizzate in modo per sé noto nel substrato 1. In tal modo, à ̈ possibile applicare delle tensioni a tali elettrodi, e quindi a tali micro-strutture 2, realizzando un dispositivo elettrico.

Vantaggiosamente, il dispositivo della presente invenzione comprende anche una pluralità di micro-canali, realizzabili in modo per sé noto, che consentono cambi controllati di terreno o test di cito-tossicità.

Vantaggiosamente, il dispositivo della presente invenzione comprende una griglia alfanumerica posizionata nella zona periferica del substrato 1, in modo da permettere facilmente di contare le cellule e localizzarle, per consentire un’analisi con differenti tecniche quali microscopio ottico confocale o microscopio a forza atomica, spettroscopia Raman o anche SEM.

Verranno ora descritti i procedimenti di realizzazione del dispositivo sopra descritto, rispettivamente per il caso in cui il substrato sia di silicio o di materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile.

Nel caso in cui il substrato 1 sia di silicio, esso viene inizialmente pulito in modo per sé noto.

Successivamente, si esegue una fase di litografia ottica di per sé nota, utilizzando una maschera ottica realizzata con un processo di scrittura laser.

In particolare, si ottiene uno schema (pattern) regolare di dischi (o altri poligoni) all’interno di uno strato di copertura che era stato precedentemente depositato con spin coating sul substrato 1 pulito.

Si realizza quindi una maschera di copertura comprendente una pluralità di dischi o poligoni eseguendo una litografia ottica su uno strato di copertura uniforme depositato sul substrato 1, ad esempio resist, utilizzando in modo noto un fascio di luce avente una predeterminata lunghezza d’onda λ compresa nell’intervallo tra 350 e 450nm.

Successivamente si elimina, in modo noto, lo strato di copertura all’esterno dei dischi (o poligoni) e al passo seguente si esegue una fase di attacco secco, di tipo DRIE, del substrato 1, utilizzando la maschera di copertura precedentemente preparata.

Dopo l’attacco si ottengono le micro-strutture 2 sopra descritte (aventi dunque tutte le caratteristiche di disposizione spaziale sopra illustrate) e aventi un rapporto di forma (aspect ratio), cioà ̈ il rapporto tra l'altezza della micro-struttura 2 e l’area della sua base, maggiore di 2.

Il processo DRIE utilizzato alterna ripetutamente tre fasi:

- una deposizione di uno strato di passivazione chimicamente inerte;

- un attacco secco al plasma isotropico;

- una pulizia del substrato 1 e della camera dove si esegue l’attacco.

Grazie a questa alternanza di fasi, si ottengono micro-strutture 2 aventi pareti laterali nanosagomate come mostrato in figura 2.

Le fasi di passivazione, attacco secco e pulizia hanno rispettive durate di tempo t1, t2e t3; il rapporto r=t1/t2ha un valore predeterminato, ad esempio compreso tra 0.5 e 1.5, ed à ̈ da tale valore che deriva la possibilità di ottenere microstrutture 2 con pareti sostanzialmente verticali.

Qualsiasi deviazione da r sbilancerebbe il processo: se t1/t2fosse maggiore di r, la fase di passivazione dominerebbe sull’attacco secco e così le micro-strutture 2 avrebbero la forma di tronchi di cono; se t1/t2fosse minore di r, l’attacco secco dominerebbe sulla fase di passivazione e le microstrutture 2 avrebbero la forma di tronchi di cono capovolti.

Il tempo totale t= t1+t2+t3definisce la lunghezza totale di un ciclo; ricordando che t1/t2deve essere mantenuto costante al valore predeterminato come sopra definito, il tempo totale t può essere scelto a piacere. Più lungo à ̈ t, più lunghi saranno gli incavi 16 delle pareti laterali.

Successivamente, lo strato di copertura viene rimosso in modo per sé noto con una soluzione di rimozione.

Infine, si depositano sul substrato i rivestimenti sopra descritti.

Nel caso in cui il substrato 1 del dispositivo dell’invenzione sia di materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile, inizialmente si realizza uno stampo (master) di un materiale rigido e indeformabile quale ad esempio silicio. Lo stampo viene fabbricato, partendo da un substrato di partenza, in maniera analoga a quanto sopra descritto in riferimento alle fasi di realizzazione delle microstrutture 2. I parametri d, l ed f rimangono invariati ed ispirati agli stessi criteri di design.

Il processo di realizzazione dello stampo prevede l’impiego delle stesse tecniche di microlitografia ottica descritte in precedenza. In particolare, si utilizza lo stesso strato di copertura per ottenere una maschera di copertura complementare a quella descritta in precedenza.

Sul substrato di partenza per la realizzazione dello stampo si deposita, mediante spin coating, uno strato uniforme di copertura sul quale si realizza, in modo per sé noto mediante un processo litografico, uno schema (pattern) regolare di dischi (o altri poligoni).

Si ottiene quindi una maschera di copertura. Successivamente si elimina, in modo noto, lo strato di copertura all’interno dei dischi (o altri poligoni) e al passo seguente si esegue una fase di attacco secco, di tipo DRIE, come sopra descritto, grazie alla quale si erode il substrato di partenza in corrispondenza dei dischi ottenendo uno stampo comprendente una pluralità di buchi aventi le stesse caratteristiche delle micro-strutture 2 descritte in precedenza.

In particolare tali buchi, grazie all’alternanza di fasi del processo DRIE, hanno pareti laterali nano-sagomate.

Dopo la fase di attacco secco la maschera di copertura viene rimossa in modo noto e lo stampo viene poi ulteriormente pulito.

Preferibilmente, lo stampo così ottenuto viene silanizzato in una campana di reazione in vuoto e successivamente viene “cotto†a temperature comprese tra 100°C e 120°C.

A questo punto del materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile viene portato a fusione in modo noto su un supporto.

In seguito lo stampo viene adagiato a contatto con detto materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile fuso, evitando la formazione di bolle d’aria all’interfaccia tra lo stampo e il materiale biocompatibile, in modo da eseguire un processo di micromolding come qui descritto.

Si esegue in modo noto una fase di formatura o stampaggio dello strato di materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile.

Il processo di formatura o stampaggio comprende due fasi:

1) formatura o stampaggio a pressione costante;

2) solidificazione a pressione costante fino al raggiungimento della temperatura ambiente.

Infine, si stacca il materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile dallo stampo prima rimuovendo il supporto ed in seguito separando lo stampo e il substrato di materiale biocompatibile con una leggera trazione.

Nel seguito vengono descritti due esempi di realizzazione dei procedimenti sopra descritti, tali esempi essendo forniti solo a titolo illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione. Esempio di attuazione n°1

Un primo esempio di attuazione della presente invenzione comprende l’utilizzo di un substrato 1 di silicio drogato di tipo P e le micro-strutture 2 sono disposte sul substrato 1 secondo un reticolo periodico esagonale e sono distanziate di una distanza 4 pari a 20µm. Le micro-strutture 2 hanno una larghezza di base pari a 10µm e un’altezza pari a 10µm.

Le micro-struttura 2, aventi un nucleo 6 di silicio drogato P, sono rivestite con un primo strato 8 di titanio, che ricopre interamente il nucleo 6, un secondo strato 10 di oro, che ricopre il primo strato 8 ed un terzo strato 12, che ricopre il secondo strato 10, di un polimero idrofobico ottenuto eseguendo una polimerizzazione di octafluorociclobutano (C4F8).

Per ottenere tale dispositivo il substrato di silicio viene inizialmente pulito con acetone e isopropanolo, e dopo immersione in una soluzione di acido fluoridrico al 4%, viene pulito con acqua deionizzata e asciugato con azoto.

Per la litografia ottica si utilizza un Mask Aligner del tipo MA6/BA6, SUSS MICROTEC e si ottiene uno schema (pattern) regolare di dischi (o altri poligoni) all’interno di uno strato di copertura di resist negativo del tipo AZ5214.

Il Mask Aligner realizza quindi una maschera di resist, eseguendo una litografia ottica su uno strato di resist uniforme depositato sul substrato 1, utilizzando in modo noto un fascio di luce avente una lunghezza d’onda λ compresa tra 350 e 450nm.

La fase di attacco secco viene eseguita con uno strumento ICP-RIE, SI 500, Sentech Instrument GmbH e il processo DRIE utilizzato alterna ripetutamente tre fasi:

- una deposizione di uno strato uno strato di un polimero ottenuto da polimerizzazione di octafluorociclobutano (C4F8);

- un attacco secco al plasma isotropico con esafluoruro di zolfo (SF6);

- una pulizia del substrato 1 e della camera dove si esegue l’attacco.

Il valore r=t1/t2ha un valore compreso tra 0.5 e 1.5 e con t1=8s, t2=7s e t3=4s si ottengono incavi 16 aventi una periodicità spaziale di 500nm.

Infine, lo strato di copertura viene rimosso con H2SO4:H2O2=3:1 v/v.

A questo punto si deposita sul substrato 1, mediante sputtering, un primo strato titanio avente uno spessore di 5nm e un secondo strato di oro avente uno spessore di 100nm. Lo strato di titanio migliora l’adesione dello strato di oro.

Infine, si copre il secondo strato con un terzo strato pari a 5nm di un polimero idrofobico ottenuto eseguendo una polimerizzazione di octafluorociclobutano (C4F8).

Esempio di attuazione n°2

Un secondo esempio di attuazione della presente invenzione comprende l’utilizzo di un substrato 1 di Policaprolattone (PLC), e le micro-strutture 2 sono disposte sul substrato 1 secondo un reticolo periodico esagonale e sono distanziate di una distanza 4 pari a 20µm. Le micro-strutture 2 hanno una larghezza di base pari a 10µm e un’altezza pari a 10µm.

In questo caso, non sono previsti rivestimenti.

Si realizza un master di silicio impiegando le stesse tecniche di micro-litografia ottica descritte in precedenza. In particolare, si utilizza uno strato di resist negativo del tipo AZ5214 per ottenere una maschera di copertura complementare a quella descritta in precedenza.

Dopo l’attacco DRIE e l’ottenimento di uno stampo comprendente una pluralità di buchi aventi le stesse caratteristiche delle micro-strutture 2 come descritto in precedenza, si rimuove la maschera di copertura mediante sonicazione in acetone a 55°C, e si pulisce lo stampo mediante una soluzione piranha.

Lo stampo così ottenuto viene silanizzato in una campana di reazione in vuoto e successivamente viene “cotto†a 112°C.

Si porta a fusione su un vetrino silanizzato disposto su una piastra a 133° del policaprolattone del tipo Sigma, con Mw=77000 e Tmelt= 65°C in pellet.

In seguito lo stampo viene adagiato a contatto con il policaprolattone come descritto in precedenza e si esegue la fase di formatura o stampaggio mediante pressa tipo Nanoimprinter, Obducat.

Il processo di formatura o stampaggio comprende le fasi di:

1) formatura o stampaggio a pressione costante a 5 bar a 68°C;

2) solidificazione a pressione costante a 5 bar fino al raggiungimento della temperatura ambiente.

Infine, si stacca policaprolattone dallo stampo prima rimuovendo il vetrino ed in seguito separando in acqua lo stampo e il substrato di policaprolattone con una leggera trazione.

Il processo così descritto à ̈ ottimizzato per piccole superfici di stampaggio (ad esempio, circa 1 cm<2>) e spessori finali dello strato di materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile elevati (ad esempio, ciarca 500 µm), ma ulteriormente ottimizzabile per superfici di stampaggio e spessori differenti.

Verrà ora descritto un procedimento per ottenere colture cellulari in tre dimensioni di cellule sospese.

Se si posiziona una goccia di terreno di coltura, del tipo descritto in seguito, sulla superficie del dispositivo della presente invenzione, essa mantiene una forma quasi sferica con un angolo di contatto all’interfaccia aria-acqua che può essere predetto teoricamente in modo per sé noto, utilizzando il modello di Cassie e Baxter. Secondo tale modello, il comportamento di bagnabilità della superficie del dispositivo à ̈ raggruppato nel solo parametro f. Quando f tende a zero, all’interfaccia con il substrato 1 del dispositivo il liquido “sente†di più l’aria e la goccia assomiglia di più a una sfera perfetta.

Grazie a ciò, il dispositivo può convenientemente essere usato per manipolare differenti campioni di interesse biomedico.

È generalmente noto che le proprietà idrorepellenti dei materiali superidrofobici riducono l’area di contatto dell’acqua sulla loro superficie, minimizzando in tal modo l’assorbimento di particelle o molecole. La superficie superidrofobica nano-sagomata del dispositivo dell’invenzione viene usata come substrato per colture cellulari. Per far in modo che sul dispositivo sopra descritto si riescano ad ottenere colture cellulari tridimensionali à ̈ indispensabile provvedere alla semina delle cellule in condizione di superidrofobicità.

Come prima operazione del procedimento di uso del dispositivo superidrofobico nano-sagomato (DSN) della presente invenzione, si riveste tale dispositivo con un materiale promotore di adesione per le cellule da crescere, quale ad esempio poli-D-lisina.

Successivamente, si depositano sul dispositivo delle cellule da crescere, preferibilmente si deposita un predeterminato numero di tali cellule in una singola goccia di un predeterminato terreno di coltura (Plating Medium -PM).

La goccia posizionata sulla superficie del DSN adotta una forma quasi sferica con angolo di contatto maggiore di 160°, che viene mantenuto dall’umidità relativa presente nell’incubatore della coltura cellulare. L’alto tasso di umidità relativa impedisce la veloce evaporazione del PM e la riduzione del diametro della goccia di terreno in cui sono disperse le cellule.

A questo punto, si lasciano le cellule in incubazione in superidrofobicità per un intervallo di tempo predeterminato compreso tra 4 e 6 ore e successivamente si elimina il PM e lo si sostituisce con del terreno di mantenimento.

Le cellule prima disperse nel PM, durante l’incubazione in superidrofobicità, migrano verso l’interfaccia liquido-aria-superficie del dispositivo. Le cellule si accumulano in una regione molto localizzata, aumentando la loro densità, rafforzando l’adesione cellulare e la loro capacità di formare estensioni che formano ponti che si estendono da una micro-struttura 2 ad una adiacente.

Nel seguito viene descritto un esempio di procedimento per ottenere colture cellulari in tre dimensioni di cellule sospese, tale esempio essendo fornito a titolo illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione.

Esempio di attuazione

Si riveste un dispositivo avente un’area di 1cm<2>con della poli-D-lisina (in concentrazione da 1-100µg/ml).

Successivamente, si depositano sul dispositivo 50.000 cellule ippocampali in una singola goccia di 100µl di PM contenente il 10% di siero di cavallo e 2mM di glutammina e antibiotici.

La goccia adotta una forma quasi sferica con angolo di contatto maggiore di 160° mantenuto dall’umidità relativa maggiore dell’80% presente nell’incubatore della coltura cellulare a 37°C.

A questo punto, si lasciano le cellule in incubazione.

Trascorse 4 ore di coltura in superidrofobicità, si elimina il terreno di coltura e lo si sostituisce con 2ml di terreno di mantenimento del tipo Neurobasal contenente 2% B27 2mM glutamina e antibiotici.

Eseguendo un’analisi al microscopio confocale e al SEM si osserva che a partire dalle prime 4 ore di crescita i neuriti aderiscono alle microstrutture 2 sagomate e con la crescita spingono i neuroni in una posizione di ponte sospeso.

Il dispositivo della presente invenzione à ̈ quindi particolarmente adatto per applicazioni di rigenerazione dei nervi, se realizzato con materiali biocompatibili e biodegradabili. In particolare, può fornire un aiuto integrando i principi di:

- co-impianto di linee cellulari di nervi o cellule gliali che svolgono un ruolo vitale nel supportare la rigenerazione degli axoni dopo ferite ai nervi periferici;

- realizzazione di larghi canali (10-20µm) orientati verso il tessuto organico per aumentare l’infiltrazione di cellule, la migrazione e l’interruzione tessutale.

Il tipo di crescita cellulare sopra descritto ha permesso di enfatizzare le implicazioni di queste osservazioni per il design di futuri biomateriali applicabili, oltre che nel contesto della rigenerazione nervosa, anche in altri settori di ingegneria tissutale, oppure per applicazioni legate ai test di tossicità e di invasività cellulare, nonché per studi di optogenetica in cui l’integrazione tra cellule e fibre ottiche risulta facilitata dalla loro disposizione lungo l’asse z.

Un’ultima applicazione à ̈ legata alla manipolazione di DNA su intelaiature superidrofobiche, per la manipolazione di acidi nucleici e l’implementazione di sistemi trasfezione.

Riepilogando, un dispositivo di silicio sagomato verticalmente con micro-strutture 2 allineate e distanziati in maniera periodica à ̈ in grado di controllare la bagnabilità e avere un ruolo distintivo nella coltura tridimensionale di cellule.

Aggiungendo la terza dimensione alle tecniche di coltura bidimensionali classiche si ottengono differenze significative nelle caratteristiche delle cellule così coltivate, che mostrano comportamenti molto simili a quelli delle cellule dei tessuti originali.

Questo nuovo tipo si dispositivo per la crescita tridimensionale può essere facilmente seminato attraverso un processo automatizzato, rendendo possibile la messa in high-throughput di qualsiasi laboratorio.

Naturalmente, fermo restando il principio dell'invenzione, le forme di attuazione ed i particolari di realizzazione potranno essere ampiamente variati rispetto a quanto à ̈ stato descritto ed illustrato a puro titolo di esempio non limitativo, senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione come definito nelle annesse rivendicazioni.

Claims (3)

1. RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo per l’ottenimento di colture cellulari in tre dimensioni comprendente: - un substrato (1); - una pluralità di micro-strutture (2) che protrudono dalla superficie del substrato (1) e sono disposte su tale substrato (1) secondo un reticolo periodico in modo da rendere superidrofobico il substrato (1); il dispositivo essendo caratterizzato dal fatto che le micro-strutture (2) hanno pareti laterali almeno parzialmente nano-sagomate presentanti sporgenze (14) ed incavi (16) alternati con una distanza predeterminata.
2. 2. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, in cui le pareti laterali delle micro-strutture (2) hanno zone nano-sagomate alternate a zone lisce prive di sporgenze (14) e incavi (16).
3. 3. Dispositivo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui ciascuna micro-struttura (2) comprende un nucleo di silicio, un rivestimento biocompatibile ed eventualmente uno strato di ancoraggio per detto rivestimento biocompatibile, applicato alla superficie del substrato (1). 5. Dispositivo secondo la rivendicazione 4, comprendente inoltre uno strato di rivestimento polimerico idrofobico, applicato al rivestimento biocompatibile, in spessori tali da non alterare la biocompatibilità superficiale del dispositivo. 6. Dispositivo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui ciascuna micro-struttura (2) comprende un nucleo di un materiale polimerico biocompatibile e bioerodibile. 7. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente cellule da crescere sospese e non adese al substrato (1). 8. Procedimento per la produzione di un dispositivo per l’ottenimento di colture cellulari secondo una delle rivendicazioni da 1 a 7, o di uno stampo, comprendente un substrato a superficie microstrutturata ove detto substrato à ̈ di silicio o di materiale polimerico biocompatibile, il procedimento comprendendo le operazioni di: a) litografia ottica per la realizzazione di una maschera di copertura, a partire da uno strato di copertura precedentemente depositato sul substrato, di materiale suscettibile di attacco secco, in cui detta maschera di copertura definisce: i) un motivo formato da una pluralità di microaree disposte secondo un reticolo periodico corrispondente al reticolo periodico di disposizione della pluralità di micro-strutture (2), ovvero ii) un motivo complementare a detto reticolo periodico; b) attacco secco per la rimozione del materiale non coperto da detta maschera di copertura; il procedimento essendo caratterizzato dal fatto che la fase di attacco secco alterna ripetutamente una deposizione di uno strato di passivazione, un attacco secco al plasma isotropico e una pulizia del substrato di partenza portando così alla formazione di micro-strutture (2) o buchi con pareti laterali almeno parzialmente nano-sagomate presentanti sporgenze (14) ed incavi (16) alternati con una distanza predeterminata. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che comprende la realizzazione di una maschera di copertura complementare a detto reticolo tale per cui la fase b) porta all’ottenimento di una superficie microstrutturata a buchi complementari alla superficie del dispositivo che si intende realizzare ed in cui detta superficie micro-strutturata complementare à ̈ utilizzata come stampo per micromolding di un materiale polimerico bicompatibile. 10. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui detta maschera di copertura à ̈ del tipo i) e il materiale suscettibile di attacco à ̈ silicio. 11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, comprendente inoltre l’operazione di applicare al silicio, al termine della fase di attacco secco, un rivestimento biocompatibile ed eventualmente uno strato di ancoraggio per detto rivestimento biocompatibile. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 11, comprendente inoltre l’operazione di applicare, sul rivestimento biocompatibile, uno strato di rivestimento polimerico idrofobico in spessori tali da non alterare la biocompatibilità superficiale del dispositivo. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui lo strato di passivazione à ̈ uno strato polimerico ottenuto da polimerizzazione di octafluorociclobutano (C4F8) e l’attacco secco al plasma isotropico viene eseguito utilizzando esafluoruro di zolfo. 14. Impiego di un dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 per l’ottenimento di cellule sospese non adese al substrato (1). 15. Impiego secondo la rivendicazione 14, comprendente le operazioni di: - rivestire detto dispositivo con un materiale promotore di adesione cellulare; - depositare sul dispositivo così rivestito un predeterminato numero di cellule in una singola goccia di un predeterminato terreno di coltura; - lasciare le cellule in incubazione; - eliminare il terreno di coltura e sostituirlo con una quantità predeterminata di terreno di mantenimento.