ITTO20130014A1 - Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca e la protezione dai danni da riperfusione - Google Patents

Description

"Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca e la protezione dai danni da riperfusioneâ€

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce in generale a un dispositivo per l’impiego nell’ingegneria tessutale. Più in particolare, l’invenzione si riferisce a uno scaffold polimerico che, in virtù della sua particolare geometria e composizione chimica, si dimostra altamente efficace nella rigenerazione del tessuto cardiaco. In forme di realizzazione preferite, lo scaffold dell’invenzione à ̈ inoltre dotato di capacità cardioprotettive dai danni da riperfusione.

La maggiore criticità nella cura delle malattie cardiovascolari à ̈ il ripristino delle funzionalità cardiache compromesse in conseguenza di un infarto.

La compromissione dell’attività cardiaca à ̈ legata alla fase acuta dell’evento infartuate con conseguente danno tissutale a livello della zona ischemica e successivamente alla scarsa capacità rigenerativa del tessuto miocardico.

Per ridurre il danno ischemico iniziale vengono adottate tecniche di riperfusione, ma la stessa riperfusione può causare un danneggiamento delle cellule che sopravvivono all’evento ischemico iniziale. Diversi studi hanno infatti dimostrato che i cosiddetti danni da riperfusione possono rappresentare più del 50% delle dimensioni della lesione del tessuto cardiaco post infarto. Per questo motivo lo sviluppo di strategie per proteggere il miocardio post-ischemico e massimizzare i benefici della riperfusione rappresenta uno dei target più importanti delle ricerca nel settore cardiovascolare.

L’ingegneria tissutale sta emergendo come nuovo approccio potenzialmente curativo per la rigenerazione del miocardio danneggiato. Onde ottenere questo risultato sono state tentate diverse strategie. Ad esempio numerosi gruppi di ricerca hanno proposto la coltura ex vivo di cellule cardiache su materiali polimerici biodegradabili, impiantabili successivamente in vivo. Tuttavia, questa strategia pone diverse problematiche e limitazioni, tra le quali si evidenzia soprattutto la limitata capacità proliferativa dei cardiomiociti.

Alcuni anni or sono à ̈ stata caratterizzata una popolazione di cellule staminali multipotenti residenti nel cuore adulto, che appare molto promettente per l’impiego nella medicina rigenerativa cardiaca. Una prospettiva interessante per la rigenerazione del tessuto cardiaco sarebbe quindi l'ingegnerizzazione di strutture di supporto (nel seguito denominate “scaffold†) realizzate in materiale polimerico biocompatibile, che fossero in grado di controllare la differenziazione di cellule staminali verso un fenotipo cardiovascolare, modulando l'ambiente spaziale delle cellule con segnali biochimici e fisici al fine di prevenire la disfunzione del miocardio.

Come strategia alternativa alla coltura ex vivo di cellule cardiache à ̈ stato quindi proposto l’impiego di scaffold realizzati in materiale polimerico biocompatibile e biodegradabile da impiantare nelle regioni infartuate, ed in particolare sulla parete miocardica attraverso sutura esterna. Tali scaffold svolgerebbero una duplice funzione: da un lato agirebbero come supporto meccanico al tessuto cardiaco danneggiato e dall’altro favorirebbero l’adesione e la proliferazione delle cellule cardiache e dei loro precursori.

In generale, i biomateriali idonei all’impiego nell’ingegneria tessutale dovrebbero soddisfare i seguenti requisiti: essere biocompatibili e bioattivi onde facilitare l’adesione e il differenziamento cellulare ed in generale l’integrazione totale dell’impianto senza innescare una risposta infiammatoria o immunitaria da parte dell’organismo; essere biodegradabili e bioriassorbibili, con una degradazione controllata ed un grado di riassorbimento tali da consentire la crescita di cellule/tessuti in vitro e/o in vivo; possedere adeguate proprietà chimico-fisiche; possedere proprietà meccaniche il più possibile simili a quelle dei tessuti che si trovano nel sito d’impianto; essere meccanicamente stabili per un tempo adeguato, in modo da mantenere la struttura tridimensionale fino alla formazione del nuovo tessuto biologico.

In particolare, il tessuto cardiaco ingegnerizzato dovrebbe presentare le stesse proprietà funzionali del tessuto muscolare cardiaco naturale e dovrebbe inoltre rimanere vitale anche dopo l’impianto. L’integrazione meccanica, elettrica e funzionale nell’architettura dell’organo dovrebbe altresì migliorare la funzione sistolica e diastolica del miocardio infartuato. Gli scaffold dovrebbero quindi essere contrattili, elettrofisiologicamente stabili, meccanicamente robusti ma flessibili, atti ad essere vascolarizzati e non immunogenici.

In anni recenti diversi tipi di polimeri, sia naturali sia di sintesi, sono stati studiati per l’impiego nell’ingegnerizzazione del tessuto cardiaco. Tra i polimeri naturali descritti a questo scopo nello stato nella tecnica vi sono il collagene, la gelatina e l’alginato. Tra i polimeri sintetici, parecchi studi sono stati effettuati su poliesteri quali acido polilattico (PLA), acido poliglicolico (PGA), policaprolattone (PCL) e poliuretani. E’ stato tuttavia osservato che i poliesteri dopo ripetuti stress dovuti ai cicli cardiaci possono andare incontro a deformazione plastica.

Oltre alle proprietà menzionate precedentemente, uno scaffold adatto per la rigenerazione cardiaca dovrebbe inoltre soddisfare i seguenti requisiti: possedere porosità elevata con una rete di pori interconnessi, in modo da consentire sia la crescita delle cellule sia il trasporto dei nutrienti e l’eliminazione dei cataboliti; essere facilmente producibile in diverse forme e dimensioni, così da consentire un’industrializzazione del processo produttivo; essere facilmente sterilizzabile con metodiche che non ne modifichino la struttura e la composizione chimica. E’ stato altresì osservato che la geometria della microstruttura e le dimensioni dei pori dello scaffold dovrebbero essere specificamente studiati e selezionati in funzione della linea cellulare di cui si vuole favorire la proliferazione. Ad esempio, à ̈ stato rilevato che l’adesione cellulare dei cardiomiociti à ̈ favorita da strutture realizzate con morfologia a nido d’ape con pori di larghezza paragonabile alle dimensioni di queste cellule.

Gli stessi inventori della presente domanda di brevetto avevano studiato scaffold polimerici a microstruttura rettangolare secondo una geometria predefinita concepita per mimare le caratteristiche anatomiche del miocardio. Tuttavia tali scaffold non si erano dimostrati efficaci nel favorire la proliferazione e il differenziamento di cellule staminali cardiache in senso cardiaco, a conferma che la sola microstrutturazione non à ̈ sufficiente a garantire la cardioinduttività.

Nonostante i numerosi studi e gli intensi sforzi di ricerca effettuati nel settore dell’ingegneria tessutale ed in particolare del tessuto cardiaco, i dispositivi fino ad ora prodotti presentano svariati limiti funzionali e non possiedono tutte le qualità richieste per un impiego clinico come sostituti del miocardio.

Vi à ̈ dunque la necessità di mettere a disposizione nuovi scaffold polimerici per la rigenerazione del tessuto cardiaco che superino i problemi della tecnica anteriore.

Secondo la presente invenzione, questo ed altri scopi sono raggiunti mediante uno scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca che comprende una struttura di supporto comprendente almeno uno strato di supporto, lo strato di supporto essendo caratterizzato dal fatto di essere realizzato in un materiale polimerico scelto dal gruppo che consiste di acido poli(lattico-co-glicolico), acido poli(3-idrossibutirrico-co-3-idrossivalerico) e poli(diossanone) eventualmente in associazione con un polimero biologico, lo strato di supporto essendo ulteriormente caratterizzato dal fatto di avere una superficie sulla quale à ̈ ricavata una pluralità di cavità disposte secondo un reticolo regolare, dette cavità essendo definite da una schiera di rilievi lineari longitudinali e da una schiera di rilievi lineari trasversali fra loro rispettivamente intersecantisi.

Grazie a tale combinazione di caratteristiche geometriche e di composizione chimica, lo scaffold polimerico dell’invenzione si à ̈ dimostrato efficace nella rigenerazione del tessuto cardiaco, come dimostrato dalle sperimentazioni condotte dagli inventori che sono illustrate nella parte sperimentale della presente descrizione e specificamente nella sezione relativa alle prove biologiche.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell’invenzione sono illustrati in maggiore dettaglio nella descrizione particolareggiata che segue, fornita a puro titolo di esempio non limitativo e riferita ai disegni allegati, nei quali:

- la figura 1a à ̈ una vista dall’alto di una forma di realizzazione dello scaffold polimerico dell’invenzione;

- la figura 1b à ̈ una sezione trasversale dello scaffold polimerico di figura 1a;

- la figura 1c à ̈ una sezione longitudinale dello scaffold polimerico figura 1a;

- la figura 2 à ̈ una vista in sezione trasversale di un’ulteriore forma di realizzazione dello scaffold polimerico dell’invenzione.

Nella figura 1a à ̈ indicato con il numero di riferimento 10 uno scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca secondo l’invenzione, che comprende una struttura di supporto indicata con il numero di riferimento 20. La struttura di supporto 20 comprende a sua volta almeno uno strato di supporto 30 realizzato in materiale polimerico, che presenta particolari caratteristiche geometriche e di composizione chimica tali da rendere lo scaffold 10 sorprendentemente efficace nella rigenerazione del tessuto cardiaco. Per ciò che concerne la composizione chimica, lo strato di supporto 30 à ̈ caratterizzato da una precisa selezione dei polimeri costitutivi, che sono scelti fra acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA), acido poli(3-idrossibutirrico-co-3-idrossivalerico) (PHBHV) e poli(diossanone) (PDS), eventualmente in combinazione con un polimero biologico che à ̈ preferibilmente scelto dal gruppo che consiste di gelatina, acido ialuronico, collagene e gellano. Per ciò che concerne le caratteristiche geometriche, lo strato di supporto 30 à ̈ caratterizzato dalla presenza di una pluralità di cavità 41 ricavate su una delle sue superfici o facce, le quali cavità 41 sono disposte secondo un reticolo regolare e sono definite da una schiera di rilievi lineari longitudinali 40a, 40b e da una schiera di rilievi lineari trasversali 40c, fra loro rispettivamente intersecantisi.

Secondo una forma di realizzazione rappresentata specificamente nelle figure 1a-1c, le cavità 41 presentano una dimensione longitudinale e una dimensione trasversale, che in figura 1a sono rispettivamente indicate con l e w1. Preferibilmente, le cavità 41 hanno una dimensione longitudinale l compresa nell’intervallo di 350-600 µm e una dimensione trasversale w1compresa nell’intervallo di 30-150 µm, ma tali valori non devono essere interpretati in alcun modo in senso limitativo. La figura 1b (che rappresenta la sezione trasversale lungo il piano B-B della forma di realizzazione dello scaffold polimerico 10 di figura 1a) mostra inoltre che le cavità 41 sono caratterizzate da una profondità d, che à ̈ preferibilmente ma non limitatamente compresa nell’intervallo di 20-100 µm. Tali dimensioni sono preferite perché consentono agevolmente l’alloggiamento di cellule staminali cardiache (indicate in figura 2 con C).

Secondo la forma di realizzazione specificamente illustrata nelle figure 1a-1c, le cavità 41 hanno forma sostanzialmente rettangolare. Tuttavia nell’ambito dell’invenzione rientrano forme di realizzazione alternative, che non sono specificamente illustrate nelle figure, in cui le cavità 41 hanno forme geometriche differenti, che possono essere sostanzialmente regolari o addirittura irregolari.

Come à ̈ chiaramente visibile in figura 1a, le cavità 41 sono definite da una schiera di rilievi lineari longitudinali 40a, 40b e da una schiera di rilievi lineari trasversali 40c, fra loro rispettivamente intersecantisi. I rilievi lineari longitudinali 40a, 40b sono anche indicati in figura 1b. I rilievi lineari trasversali 40c sono anche indicati in figura 1c, che rappresenta la sezione trasversale lungo il piano A-A della forma di realizzazione dello scaffold polimerico 10 di figura 1a.

Secondo la forma di realizzazione illustrata in figura 1a, vi sono due tipologie differenti di rilievi longitudinali: rilievi larghi 40b e rilievi stretti 40a, che sono disposti in una successione alternata. I rilievi larghi 40b sono caratterizzati da una dimensione trasversale w2che à ̈ preferibilmente ma non limitatamente compresa nell’intervallo di 50-160 µm; i rilievi stretti 40a sono caratterizzati da una dimensione trasversale w3che à ̈ preferibilmente ma non limitatamente compresa nell’intervallo di 20-120 µm, con la condizione che w2sia maggiore di w3. Nella forma di realizzazione di figura 1a, tale successione alternata di rilievi larghi 40b e rilievi stretti 40a prevede un rilievo largo 40b ogni due rilievi stretti 40a, ma nell’ambito dell’invenzione sono incluse ulteriori forme di realizzazione, non specificamente illustrate nelle figure, in cui i rilievi larghi 40b e i rilievi stretti 40a si alternano secondo successioni differenti, oppure in cui vi à ̈ una sola tipologia di rilievi longitudinali, oppure in cui vi sono più di due tipologie di rilievi longitudinali che differiscono fra loro per i valori delle rispettive dimensioni trasversali.

Le figure 1a, 1b e 1c si riferiscono ad una forma di realizzazione dello scaffold polimerico 10 la cui struttura di supporto 20 comprende uno singolo strato di supporto 30. Tale forma di realizzazione à ̈ quindi denominata “a singolo strato†. In una forma di realizzazione preferita ma non limitativa, lo spessore totale del singolo strato di supporto 30 à ̈ compresa nell’intervallo di 40-250 µm.

Nella parte sperimentale che segue à ̈ descritta in dettaglio la preparazione di due forme di realizzazione specifiche dello scaffold polimerico 10 a singolo strato, che differiscono l’una dall’altra per le dimensioni d, l e w1delle cavità 41 e che sono risultate in entrambi i casi efficaci nelle applicazioni di ingegneria tessutale di interesse.

Nella figura 2 à ̈ illustrata una forma di realizzazione alternativa, denominata “a sandwich†, in cui la struttura di supporto 20 dello scaffold polimerico 10 comprende un primo e un secondo strato di supporto 30 fra i quali à ̈ interposto uno strato intermedio 33, anch’esso realizzato in materiale polimerico. Secondo questa forma di realizzazione “a sandwich†il primo e il secondo strato di supporto 30 presentano cavità 41 rispettivamente rivolte verso lati opposti della struttura di supporto 20. Il materiale polimerico di cui à ̈ costituito lo strato intermedio 33 à ̈ preferibilmente un polimero biologico biodegradabile, come ad esempio gelatina. Anche questa particolare forma di realizzazione à ̈ risultata efficace nelle applicazioni di ingegneria tessutale di interesse.

La figura 2 mostra altresì cellule C, preferibilmente cellule staminali cardiache, alloggiate all’interno delle cavità 41 dello scaffold polimerico 10 dell’invenzione il quale, conseguentemente, una volta impiantato, sarà in grado di esplicare i propri effetti cardiorigenerativi proprio grazie alla presenza di tali cellule che si moltiplicheranno e differenzieranno dando origine a nuovo tessuto cardiaco funzionale. Naturalmente, tutte le forme di realizzazione dello scaffold polimerico 10 che rientrano nell’ambito della presente invenzione sono atte ad alloggiare cellule staminali cardiache od altri tipi cellulari utili nella rigenerazione del tessuto cardiaco.

Un’ulteriore forma di realizzazione particolarmente preferita dello scaffold polimerico 10 dell’invenzione, che non à ̈ specificamente illustrata nelle figure, prevede l’inclusione all’interno dello strato di supporto 30 (cfr. figure 1a-1c) o degli strati di supporto 30 e/o dello strato intermedio 33 (cfr. figura 2) di un principio attivo farmaceutico cardioprotettivo, quale ad esempio adenosina o ciclosporina A, atto a proteggere il tessuto cardiaco dai danni da riperfusione. In tal caso lo scaffold polimerico 10 si comporterà come un “serbatoio di farmaco†, atto a rilasciare il principio farmaceutico in situ secondo i tempi e le quantità desiderate, e pertanto in grado di esplicare effetti cardioprotettivi contestualmente a quelli cardiorigenerativi. Tale forma di realizzazione risulta particolarmente innovativa, poiché, per quanto à ̈ a conoscenza degli inventori, non erano stati precedentemente descritti scaffold polimerici per l’impiego in applicazioni di ingegneria tessutale, specificamente dei tessuti cardiaci, dotati al contempo di proprietà cardioprotettive nei confronti dei danni da riperfusione e cardiorigenerative.

In tale forma di realizzazione à ̈ preferito che lo strato o gli strati di supporto 30 e/o lo strato intermedio 33 includano fra i propri materiali costituitivi un polimero biologico capace di dissolversi nel tempo quando impiantato in loco, come ad esempio la gelatina. La gelatina à ̈ una sostanza ampiamente nota ed utilizzata nell’industria farmaceutica, la cui corretta scelta ed il cui corretto dosaggio rientrano nelle capacità del tecnico del ramo e gli consentono di regolare i tempi e le velocità di rilascio del principio attivo.

In una forma di realizzazione ancor più preferita dello scaffold polimerico 101 dell’invenzione, che à ̈ descritta in dettaglio nella parte sperimentale che segue, il principio attivo farmaceutico non à ̈ direttamente incluso nella matrice polimerica dello scaffold bensì à ̈ incapsulato all’interno di nanoparticelle preferibilmente del tipo core-shell, che sono a loro volta incluse nello strato di supporto 30 o negli strati di supporto 30 e/o strato intermedio 33. Tale forma di realizzazione consente di conseguire un rilascio del principio attivo farmaceutico prolungato nel tempo.

Con lo scopo di ottenere dispositivi completamente biodegradabili che rispondano ai requisiti richiesti tra i quali, principalmente, porosità controllata, omogeneità dal punto di vista chimico e proprietà meccaniche soddisfacenti, gli scaffold polimerici oggetto della presente invenzione sono stati preparati mediante due differenti tecniche di preparazione: inversione di fase per immersione in un non-solvente e inversione di fase per evaporazione controllata di miscele di solventi. Entrambe le tecniche di preparazione sono state ottimizzate andando a valutare l’effetto di un ampio repertorio di parametri (fra cui composizione, concentrazioni delle soluzioni polimeriche, natura e quantità di solvente e non-solvente, temperature e durata delle singole fasi) sulle caratteristiche dei prodotti finali. Nella parte sperimentale che segue sono forniti diversi esempi preparativi di scaffold polimerici rientranti nell’ambito della presente invenzione, impiegando le due tecniche di preparazione sopra citate. Naturalmente gli insegnamenti tecnici forniti in tali specifici esempi preparativi sono applicabili in generale alla preparazione di qualsiasi scaffold polimerico rientrante nell’ambito dell’invenzione.

La parte sperimentale che segue illustra inoltre la preparazione di svariate forme di realizzazione specifiche dello scaffold polimerico dell’invenzione, ivi incluse forme di realizzazione a singolo strato, a sandwich e a serbatoio di farmaco, nonché la preparazione e l’impiego delle nanoparticelle del tipo core-shell atte ad incapsulare il principio attivo farmaceutico cardioprotettivo utilizzato nell’ambito dell’invenzione. Sono altresì descritti i risultati di studi di caratterizzazione meccanica, chimico-fisica e morfologica condotti su varie forme di realizzazione dello scaffold polimerico dell’invenzione, nonché i risultati di test biologici effettuati con lo scopo di verificarne la biocompatibilità, le capacità cardiorigenerative e le capacità cardioprotettive, in particolare nei confronti dei danni da riperfusione. Tale parte sperimentale à ̈ fornita a puro scopo esemplificativo e non va in alcun modo interpretata in senso limitativo della portata dell’invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni.

PARTE SPERIMENTALE

Gli esempi 1-6 descrivono la preparazione di matrici polimeriche aventi differenti composizioni e utilizzando diverse tecniche preparative. Le matrici polimeriche preparate come descritto negli esempi 1-6 sono successivamente state utilizzate per la realizzazione di scaffold polimerici come descritto nell’esempio 7.

Esempio 1: preparazione di matrici di PLGA/gelatina Sono stati condotti esperimenti per l’ottimizzazione della procedura di miscelamento di soluzioni di PLGA in solvente idoneo, in particolare diclorometano o cloroformio, e soluzioni acquose di gelatina. I parametri presi in esame sono stati: concentrazione delle soluzioni di partenza, rapporto in peso tra i componenti, selezione dei solventi, metodo di essiccamento (casting o liofilizzazione).

Preparazione mediante inversione di fase per immersione in un non-solvente

Sono state preparate soluzioni di PLGA in dimetilsolfossido (DMSO) in concentrazioni dall’1 al 5% w/v. Le soluzioni sono state stese su un supporto piano in vetro o substrato microfabbricato mediante una lama a moto orizzontale controllato ed in seguito immerse in un bagno di inversione costituito da una soluzione di acqua/DMSO (1/1 v/v) contenente gelatina in concentrazioni variabili (1%, 2%, 5% e 10% w/v) per 20 ore. Con questa procedura il polimero biologico à ̈ introdotto all’interno della struttura porosa della membrana durante la fase di inversione. Al termine del processo di inversione, le membrane ottenute sono state essiccate in stufa ventilata a 37°C /- 1°C per 24 ore.

Preparazione per inversione di fase mediante evaporazione controllata di miscele di solventi

Sono state preparate miscele contenenti due soluti (PLGA e gelatina) e tre solventi secondo rapporti volumetrici fissati in base al diagramma di fase delle miscele ternarie.

Sono state preparate soluzioni polimeriche di PLGA in concentrazioni pari a 1% e 5% w/v in diclorometano o cloroformio e acetone o acetonitrile. A queste sono state aggiunte soluzioni acquose di gelatina, neutre o acidificate con acido acetico allo 0,5%v/v, in concentrazioni pari a 1% e 5% w/v. Il volume di soluzione di gelatina à ̈ stato fatto variare fino ad aggiungere una quantità di soluto tale da ottenere differenti rapporti in peso percentuali del sistema PLGA/gelatina (95/5, 85/15, 75/25, 70/30).

Esempio 2: preparazione di matrici di PHBHV/gelatina

Anche per queste matrici, le procedure di preparazione sono state ottimizzate con lo scopo di ottenere scaffold polimerici aventi porosità elevata e interconnessa, omogenei dal punto di vista chimico e caratterizzati da una struttura stabile con proprietà meccaniche adeguate. Le matrici a base di PHBHV/gelatina sono state preparate mediante una serie di tecniche di preparazione basate sull'inversione di fase per evaporazione controllata di miscele di solventi e successiva procedura di casting o liofilizzazione. Sono state preparate matrici di PHBHV/gelatina in differenti composizioni percentuali: 95/5, 90/10, 85/15, 80/20 e 75/25 (w/w).

Preparazione per evaporazione controllata di miscela di solventi.

Esempio A

Sono state preparate soluzioni di PHBHV in cloroformio, in concentrazioni pari a 1% o 5% w/v. A queste soluzioni sono state aggiunte soluzioni acquose di gelatina in concentrazioni pari a 1% o 5%. La quantità di soluzione di gelatina introdotta dipende dal rapporto di composizione del sistema bioartificiale che si vuole ottenere e, in particolare, sono stati preparati con questa tecnica sistemi con le seguenti composizioni percentuali PHBHV/gelatina (w/w): 95/5, 90/10, 85/15, 80/20 e 75/25. In seguito al miscelamento, le soluzioni sono state agitate in maniera vigorosa per permettere la dispersione del componente biologico ed in seguito deposte in capsule Petri in vetro o stampi microfabbricati e poste in stufa ventilata (T = 25°C+/-1°C, ovvero 30°C+/-1°C) per due ore o liofilizzate.

Esempio B

Sulla base di dati ricavati da diagramma di fase di due miscele ternarie di solventi state preparate miscele contenenti i due soluti e tre solventi (primo solvente: diclorometano o cloroformio, secondo solvente: acetone, o acetonitrile, terzo solvente: acqua). Sono state preparate le soluzioni di PHBHV in diclorometano o cloroformio con concentrazioni pari a 1%, 2%, 3%, 4% e 5%. A tali soluzioni à ̈ stato aggiunto il secondo solvente ed infine la soluzione acquosa di gelatina, la cui concentrazione dipende dalla quantità di soluto che si vuole introdurre nel sistema bioartificiale finale.

Esempio 3: preparazione di matrici di PDS/gelatina I materiali bioartificiali a base di PDS e gelatina sono stati ottenuti a partire da soluzioni di PDS al 10% w/v, introducendo una quantità di gelatina pari al 5% w/w di PDS. 4 ml di soluzioni cosi ottenute sono state deposte in capsule Petri in vetro (Φ = 5,5, volume 4 ml) o stampi microfabbricati, la soluzione à ̈ stata addensata per mezz’ora su piastra riscaldata a 80°C, quindi il campione à ̈ stato immerso in un primo bagno di inversione, costituito da una miscela di H2O/DMSO (50/50 v/v) per un'ora, ed in seguito in un secondo bagno di inversione, costituito da H2O per un'ora. Infine, il non-solvente à ̈ stato eliminato per casting in stufa ventilata a 40°C.

Esempio 4: preparazione di matrici PDS/gellano Matrici a base di PDS/gellano sono state preparate mediante inversione di fase per evaporazione controllata di solventi o inversione di fase per immersione in non-solvente e a seguire casting o liofilizzazione.

Preparazione per evaporazione controllata da miscela di solventi

Sono state preparate soluzioni di PDS in DMSO a caldo (60°C). In seguito alla completa solubilizzazione del polimero, à ̈ stato aggiunto il gellano in quantità tale da ottenere un sistema bioartificiale PDS/gellano con composizione percentuale 90/10 (w/w). Infine, à ̈ stato aggiunto il cloroformio in quantità tale da raggiungere il rapporto percentuale DMSO/cloroformio in volume pari a 1/2 . La soluzione così ottenuta à ̈ stata deposta in una capsula Petri in vetro o stampo in PDMS e mantenuta alla temperatura di 55°C fino alla completa evaporazione dei solventi.

Preparazione per inversione di fase per immersione in non-solvente

Esempio A

Sono state preparate soluzioni di PDS (al 6% e 10% w/v) in DMSO e soluzioni di gellano in DMSO che sono state miscelate fra loro in rapporto in peso 90/10. La miscela ottenuta à ̈ stata dispensata in capsule Petri o stampi che sono stati posti su piastra riscaldante a 50 °C per mezz’ora in modo da aumentarne la viscosità. Quindi la miscela à ̈ stata introdotta, in alcuni test previo congelamento a -20°C, in un bagno di inversione costituito da acqua per 2 ore.

Esempio B

Una seconda procedura ha previsto l’impiego di un bagno di inversione costituito da una miscela acqua/DMSO 50/50 per un’ora e in seguito di un secondo bagno costituito da sola acqua per un’ora. Alla fine della preparazione appare di aspetto biancastro, omogenea e piuttosto resistente.

L’impiego di una lama a moto orizzontale controllato permette di depositare la miscela iniziale PDS/Gellano 90/10 in modo omogeneo e con spessore controllato. Prove effettuate variando lo spessore della miscela depositata hanno permesso di ricavare una corrispondenza tra questo valore e lo spessore finale della membrana dopo liofilizzazione. Ad esempio, se lo strato depositato prima della fase di inversione à ̈ di 500 Î1⁄4m, lo spessore finale della membrane à ̈ di circa 200 Î1⁄4m.

Esempio 5: preparazione di matrici PDS/collagene Matrici a base di PDS/collagene sono state realizzate mediante tecnica di inversione di fase secondo due diverse metodologie: evaporazione controllata dei solventi e immersione in non-solvente. Sono state preparate matrici PDS/collagene in composizione percentuale pari a 95/5, 90/10, 80/20 w/w.

Preparazione mediante evaporazione controllata dei solventi

Sono state preparate soluzioni di PDS in miscele cloroformio/DMSO 2/1 v/v a concentrazioni 1 %, 2%, 5% w/v, sotto costante agitazione a 70°C. Le soluzioni sono quindi depositate su capsule Petri o stampi e poste su piastra riscaldante a 40°C. Le membrane ottenute sono state modificate chimicamente mediante agente reticolante (carbodiimide e/o succinimmide) e successivamente immerse in soluzioni variabili con concentrazioni di collagene variabili (0,1 %-1% w/v) a pH fisiologico per 12 ore al fine di ottenere le composizioni sopramenzionate. Preparazione per immersione in non-solvente

Sono state preparate soluzioni di PDS in DMSO a concentrazioni di 3 % e 10% w/v, sotto costante agitazione a 70°C. Le soluzioni sono quindi depositate su capsule Petri in vetro poste su piastra riscaldante a 70°C per aumentarne la viscosità. Le capsule sono quindi collocate all'interno di un bagno di coagulazione che prevede due fasi, la prima consiste in una miscela acqua/DMSO 50/50 per un’ora a temperatura ambiente, la seconda consiste in acqua bidistillata per un’ora a temperatura ambiente. Infine, le matrici così ottenute sono sottoposte all'eliminazione del non-solvente mediante casting a 40 °C.

Successivamente le membrane sono state modificate chimicamente mediante agente reticolante e immerse in soluzioni variabili (0,1 %-1% w/v) di collagene a pH fisiologico per 12 ore al fine di ottenere le composizioni sopramenzionate.

Esempio 6: preparazione di matrici PDS/acido ialuronico.

Matrici a base di PDS/acido ialuronico (PDS/HA) sono state preparate mediante tecnica di inversione di fase e successiva procedura di casting. Sono stati preparati sistemi PDS/HA a composizione variabile nell’intervallo di composizione percentuale 80/20 - 40/60 (w/w).

Sono state preparate soluzioni dell’estere attivato di PDS mediante derivatizzazione chimica (idrolisi acida e successiva aggiunta di agente reticolante a base di carbodiimmide) in DMSO, in concentrazione pari al 10% w/v. Le soluzioni depositate su capsule o stampi sono state sottoposte ad una prima fase di addensamento su piastra a 70 °C per aumentare la viscosità del sistema. I sistemi sono quindi collocati all'interno di un bagno di coagulazione che prevede due fasi (miscela acqua/DMSO 50/50 per un’ora e solo acqua per la seconda ora, a temperatura ambiente)e sottoposte all'eliminazione del non solvente mediante casting a 40 °C.

Soluzioni acquose di HA sono state addizionate alle membrane porose a base di PDS funzionalizzato chimicamente in modo da ottenere sistemi bioartificiali a interazione ionica PDS/HA aventi composizioni in peso variabili.

La procedura di preparazione e stata condotta sotto costante agitazione, a T ambiente per 6 ore.

Esempio 7: realizzazione degli scaffold polimerici Le matrici polimeriche preparate come descritto negli esempi 1-6 sono state impiegate per la realizzazione di scaffold polimerici secondo la presente invenzione. A tale scopo, le soluzioni polimeriche sono state depositate su stampi in silicone derivati da master in silicio ottenuti mediante soft lithography. Gli stampi presentano sulla loro superficie caratteristiche geometriche in conformità con la presente invenzione, concepite per mimare le caratteristiche anatomiche del miocardio.

Una serie di disegni produttivi ottenuti mediante sistemi CAD (es. AutoCAD Mathematical)sono stati realizzati secondo le schiere di rilievi e cavità sopramenzionati, in un ampio intervallo di dimensioni da 1x1 cm a 6x3 cm, adatti a test cellulari e impianto in vivo.

I modelli CAD sono stati applicati alla tecnica di soft lithography per la realizzazione di master in silicio. Una serie di stampi in polidimetilsilossano (PDMS) sono stati preparati utilizzando un prodotto Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (Dow Corning Corporation). Inizialmente, una miscela di monomero e agente reticolante, in rapporto in peso 10:1, à ̈ stata preparata mediante blando miscelamento dei due componenti per 10 minuti. Le fasi di miscelamento e polimerizzazione sono state condotte in camera oscura per evitare l’inibizione dell’attività catalitica. La miscela à ̈ stata depositata su master in silicio e posti in stufa per 24 ore. Gli stampi in PDMS sono dotati di bordi esterni verticali in modo che il volume della soluzione da depositare sia contenuto all’interno dello stampo. Con questa tecnica sono stati realizzati scaffold di PLGA/gel, PHBHV/gel, PDS dei quali à ̈ stata dimostrata la capacità cardiorigenerativa. Gli scaffold sono caratterizzati da una superficie dotata di cavità rettangolari e da uno spessore totale compreso nell’intervallo di 40-250 µm. La profondità d delle lacune à ̈ compresa nell’intervallo di 20-200 µm. Le cavità hanno una dimensione longitudinale l compresa nell’intervallo di 350-600 µm e una dimensione trasversale w1compresa nell’intervallo di 30-150 µm. Vi sono rilievi lineari longitudinali larghi e stretti che presentano rispettivamente una dimensione trasversale w2compresa nell’intervallo di 50-160 µm e una dimensione trasversale w3compresa nell’intervallo di 20-120 µm. Nella tabella sottostante sono riportate le dimensioni espresse in micron (µm) misurate con riferimento a tre forme di realizzazione specifiche dello scaffold polimerico dell’invenzione ottenute con il procedimento sopra descritto.

Rilievi Spessore Cavità

lineari totale L W1d W2W3PHBHV/gel 400 30 20 160 120 70 Tipo 1

PHBHV/gel

485 85 40 60 25 100

Tipo 2

15-

PLGA/gel 350 60 60 30 40

20

Le cellule staminali che sono state seminate sugli scaffold a singolo strato prodotti come precedentemente descritto (vedi test biologici descritti nel seguito) hanno permesso di dimostrare che la combinazione fra la particolare composizione chimica e la particolare geometria degli scaffold polimerici dell’invenzione favorisce la colonizzazione e il differenziamento in senso cardiaco. Infatti né il solo materiale né la sola microstruttura (come sperimentato dagli inventori per analoghe microstrutture a base di altri materiali polimerici) sono in grado di produrre un analogo effetto cardioinduttivo.

Di particolare rilevanza sono stati i risultati della caratterizzazione meccanica. Dopo aver calcolato la sezione geometrica reale, sono stati misurati i moduli elastici degli scaffold polimerici sia in direzione longitudinale sia in quella trasversale data la struttura anisotropa dei microfabbricati. In particolare il valore del modulo elastico valutato in direzione longitudinale à ̈ significativamente maggiore del valore misurato in direzione trasversale in accordo con l’anisotropia di struttura della biomatrice progettata per replicare le caratteristiche del tessuto cardiaco. Inoltre, i valori di modulo elastico registrati in ambiente acquoso sono risultati più bassi rispetto a quelli registrati nelle prove a secco e più simili in termini di valore assoluto al corrispondente valore del miocardio nativo.

Inoltre à ̈ stato condotto lo studio della biodegradazione degli scaffold polimerici per un tempo complessivo di 6 mesi. Sono stati considerati tre distinti mezzi di degradazione, ossia acqua bidistillata, tampone PBS (phosphate buffered saline) e un mezzo di coltura (DMEM) che consente di simulare al meglio le condizioni in vitro e in vivo. Per quanto concerne il sistema PHBHV/gelatina 95/5 l’analisi del pH del mezzo di incubazione ha fornito valori di pH pressoché costanti in un intervallo fisiologico nell’intero arco temporale. Questo risultato suggerisce due importanti interpretazioni: a) lo scaffold di PHBHV/gelatina si mantiene stabile e non produce quantità elevate di prodotti di degradazione, la stabilità della struttura si riflette quindi sulla stabilità del pH; b) la quantità, sia pur bassa ma rilevabile dalle prove di perdita in massa, dei prodotti di degradazione non altera le condizioni di pH. Questo risultato indica che lo scaffold PHBHV/gelatina non induce un processo infiammatorio in vivo indotto da acidosi.

Per quanto concerne il sistema PLGA/gelatina 70/30, l’analisi del pH del mezzo di incubazione ha fornito valori di pH stabili se misurati nelle soluzioni tampone, PBS e DMEM, mentre una riduzione del pH si verifica già dopo 15 giorni in acqua. Questo risultato à ̈ dovuto alla più rapida velocità di degradazione del sistema a base di PLGA, come confermato dalle prove gravimetriche. Da osservare, tuttavia, una maggiore stabilità del pH per il sistema PLGA/gelatina in mezzo di coltura, condizione più vicina a quella fisiologica, rispetto agli altri due mezzi con valori percentuali di perdita in peso ridotti e valori di pH mai inferiori a 6 anche dopo degradazione completa.

I risultati dello studio di degradazione dal punto di vista morfologico evidenziano che gli scaffold dell’invenzione mantengono le caratteristiche geometriche superficiali, senza modifiche significative ai vari tempi del processo di biodegradazione, in modo da garantire ai materiali la capacità di guidare i processi rigenerativi anche a tempi prolungati. L’aspetto che distingue le tre diverse tipologie di scaffold sottoposte a test à ̈ la velocità di biodegradazione, pertanto la scelta su quale delle biomatrici dovrà essere impiegata sarà legata principalmente alle modalità e ai tempi chirurgici di impianto e soprattutto alla velocità di ricrescita del tessuto naturale in corrispondenza della zona alterata.

Esempio 8: realizzazione di scaffold a serbatoio di farmaco

A titolo di esempio, il metodo più appropriato per realizzare scaffold multistrato di PLGA/gelatina consiste nella deposizione di strati intermedi di soluzioni acquose di gelatina a concentrazioni di 2-10% w/v. In dettaglio, una soluzione di gelatina à ̈ stata interposta tra due strati microfabbricati realizzati come descritto precedentemente e il tutto tenuto insieme mediante pressofusione ai bordi. Per effettuare la pressofusione, sono predisposti stampi di metallo a forma di cornice quadrati o rettangolari con dimensioni dei profili scelti in funzione della dimensione della biomatrice. Gli stampi sono riscaldati ad una temperatura predeterminata (intorno ai 50°C per il PLGA, ai 90°C per il PHBHV) e posizionati ai bordi del multistrato. La procedura di pressofusione utilizzata consente di mantenere l’adesione tra gli strati anche dopo contatto con l’ambiente fisiologico ed il conseguente rilascio di gelatina. Il dispositivo multistrato offre una serie di vantaggi: resistenza più elevata alla sutura, aumentata sezione e migliori proprietà meccaniche e la possibilità di incorporare, chimicamente o fisicamente, molecole bioattive (per esempio adenosina) per ottenere un efficiente e rapido sistema di rilascio.

Gli scaffold multistrato sono stati funzionalizzati con adenosina quale agente cardioprotettivo. Sono state individuate tre diverse strategie di funzionalizzazione con il farmaco cardioprotettivo da seguire separatamente o in combinazione tra loro: caricamento diretto negli strati di supporto, caricamento diretto nello strato intermedio a base di gelatina, caricamento negli strati di supporto e/o intermedio previo incapsulamento in nanoparticelle del tipo core-shell. La funzionalizzazione degli scaffold polimerici oggetto dell’invenzione con l’agente cardioprotettivo à ̈ stata effettuata nell’intento di raggiungere due obiettivi fondamentali, che consistono nel caricare la quantità massima di adenosina o altro agente cardioprotettivo nella biomatrice in forma solubilizzata e nel garantire un rilascio immediato ed elevato in un brevissimo arco temporale (dai primi minuti fino alle 24 ore). L’incapsulamento in nanoparticelle permette di conseguire una ulteriore protezione dai danni da riperfusione, in quanto determina un rilascio del principio attivo farmaceutico di bassa entità ma prolungato nel tempo.

Valutazioni preliminari della solubilità dell’adenosina in soluzioni acquose contenenti anche gelatina sono state condotte aumentando la temperatura delle soluzioni. Il limite di solubilità à ̈ stato stimato pari a 10 mg/ml, di poco superiore al limite riportato in letteratura di adenosina in acqua, che corrisponde a 8 mg/ml.

A titolo di esempio, si descrive qui di seguito la procedura di preparazione di uno scaffold multistrato costituito da due strati di supporto a base di PLGA/gelatina 70/30 e uno strato intermedio ottenuto a partire da una soluzione acquosa di gelatina al 10% w/w. Lo scaffold multistrato à ̈ stato caricato con adenosina sia negli strati di supporto sia nello strato intermedio. La quantità totale di adenosina caricata nello scaffold à ̈ di 17,6 mg per un dispositivo avente una superficie di 10 cm<2>e spessore totale di 600±50 micron.

Realizzazione di scaffold a singolo strato PLGA/gelatina/adenosina a serbatoio di farmaco Per la preparazione di uno scaffold a singolo strato di PLGA/gelatina funzionalizzato con adenosina, à ̈ stata utilizzata la procedura precedentemente descritta con le seguenti modifiche. L’adenosina à ̈ stata dissolta in acqua bidistillata ad una concentrazione di 10 mg/ml a temperatura di 50°C.). Quantità predefinite di gelatina sono state aggiunte alla soluzione di adenosina, in seguito la miscela acquosa gelatina/adenosina à ̈ stata aggiunta alla soluzione di PLGA in diclorometano e acetone o acetonitrile. Ad esempio 1 g di gelatina à ̈ stato aggiunto a 10 ml di soluzione di adenosina (10mg/ml) e aliquote di questa soluzione sono state aggiunte ad una soluzione di PLGA in diclorometano e acetone o acetonitrile. La deposizione della miscela bioartificiale à ̈ stata condotta come segue: a) 1 ml di soluzione di PLGA/gelatina/adenosina à ̈ stata depositata su un substrato microfabbricato in PDMS (per un’area di superficie di 10 cm<2>) b); dopo 10 minuti a temperatura ambiente à ̈ stata ripetuta una seconda deposizione con 1 ml di soluzione, b) essiccamento lento e controllato, c) distacco del singolo strato dal substrato.

Gli scaffold a singolo strato di PLGA/gelatina/adenosina ottenuti sono anche stati utilizzati per preparare degli scaffold multistrato caricati con adenosina, come descritto nell’esempio 10 che segue.

Realizzazione di scaffold multistrato PLGA/gelatina/adenosina a serbatoio di farmaco Come descritto in precedenza, 1 g di gelatina à ̈ stato aggiunto a 10 ml di una soluzione di adenosina a concentrazione di 10 mg/ml. La soluzione gelatina/adenosina à ̈ stata depositata su un singolo strato dal lato privo di cavità e rilievi. Un volume di 500 µl di soluzione gelatina/adenosina à ̈ stato dapprima omogeneamente distribuito sull’intera superficie, in seguito una seconda aliquota di 500 µl à ̈ stata depositata e distribuita sulla stessa superficie. Un seconda membrana microfabbricata à ̈ stata assemblata lasciando la superficie avente la profilatura al lato libero. Infine i due strati sono stati fatti aderire mediante pressofusione blanda condotta, come precedentemente descritto, a 50°C. I sistemi a serbatoio di farmaco sono stati essiccati e conservati in congelatore prima delle caratterizzazioni biologiche in vitro e in vivo.

In maniera analoga a quanto descritto per gli scaffold di PLGA/gelatina sono state preparati degli scaffold multistrato a serbatoio di farmaco a base di PHBHV, PDS e gelatina o altri polimeri biologici. La procedura di assemblaggio dei singoli strati ha previsto il raggiungimento di temperature di pressofusione più elevate, fino a 80-90°C, data la maggiore resistenza al calore di questi materiali.

Sterilizzazione dello scaffold finale caricato con adenosina

La sterilizzazione à ̈ stata condotta introducendo lo scaffold in una capsula contenente una soluzione acquosa di etanolo al 70% per 15 minuti e ripetendo cinque volte il lavaggio con soluzione fresca. In seguito, la soluzione à ̈ stata rimossa e lo scaffold à ̈ stato essiccato completamente sotto cappa sterile a flusso laminare. La fase finale à ̈ consistita nell’irradiare i campioni con raggi UV per 15 minuti su entrambi i lati.

Test di rilascio, caratterizzazione chimico-fisica e morfologica degli scaffold finali

Sugli scaffold multistrato a serbatoio di farmaco PLGA/gelatina 70/30 funzionalizzati con adenosina sono state condotte prove di rilascio anche dopo sterilizzazione e dopo aver verificato l’eventuale perdita di farmaco nella soluzione di etanolo. I risultati delle analisi HPLC hanno fatto registrare un rilascio parziale di adenosina nella soluzione di etanolo utilizzata per la sterilizzazione, tuttavia la maggior parte dell’adenosina caricata permane all’interno della biomatrice (valori superiori al 70%). Gli scaffold finali sterilizzati sono stati introdotti in tubi contenenti acqua bidistillata a 37°C sotto costante agitazione e a intervalli prestabiliti (1,2,10,30,60 minuti e 24 ore). Il surnatante à ̈ stato prelevato ed analizzato mediante analisi HPLC. È stato evidenziato un rilascio apprezzabile per tutti i tempi analizzati, da 1 minuto fino ad 1 ora. La quantità di adenosina registrata dopo 24 ore di rilascio corrisponde al 43% rispetto alla quantità inizialmente introdotta, una percentuale elevata in accordo con gli obiettivi iniziali e in linea con le dosi somministrate di adenosina per via endoluminale.

Sono state condotte osservazioni al microscopio elettronico SEM degli scaffold finali multi strato a serbatoio di farmaco funzionalizzati con adenosina. Dopo 24 ore in acqua bidistillata à ̈ stata osservata la presenza di vuoti, non presenti inizialmente, originatisi dalla dissoluzione dell’adenosina e della gelatina a livello degli singoli strati di supporto e intermedi, mentre le caratteristiche geometriche superficiali degli scaffold (cavità e rilievi) si sono conservate pressoché inalterate. Queste osservazioni al SEM indicano un rilascio completo sia di gelatina sia di adenosina dopo 24 ore. I risultati ottenuti confermano la validità del metodo di caricamento adottato, mostrando che lo scaffold così assemblato costituisce una piattaforma ottimale per un rilascio rapido e sostenuto di agente cardioprotettivo. Una volta espletata la funzione di rilascio per ridurre i danni da riperfusione, lo scaffold può così continuare a svolgere l’altra funzione di induzione dei processi rigenerativi del tessuto cardiaco.

Il completo rilascio dell’adenosina à ̈ anche stato confermato mediante analisi FT-IR Chemical Imaging.

Gli scaffold sono inoltre stati sottoposti a test di suturabilità e di afferraggio al delivery device in vista dell’impianto in vivo. Le prove sono state superate con successo.

Esempio 9: Funzionalizzazione di nanoparticelle con SDF-1 α e adenosina

Come indicato in precedenza, gli scaffold multistrato a serbatoio di farmaco della presente invenzione sono anche stati funzionalizzati con agente cardioprotettivo incapsulato in nanoparticelle del tipo core-shell, con lo scopo di ottenere un rilascio prolungato del farmaco.

Produzione di nanoparticelle P(BMA-co-(PEG)MEMA) per il rilascio di adenosina e SDF-1 α

Sono state prodotte nanoparticelle a riserva interna di P(BMA-co-(PEG)MEMA) per il caricamento di principi attivi da inglobare negli scaffold dell’invenzione. Si tratta di nanosistemi capaci di combinare le caratteristiche dimensionali nanometriche alla struttura a riserva interna ossia dotate di una cavità interna che consente di massimizzare l’efficienza di incapsulamento. Tali nanoparticelle sono state utilizzate per l’incorporazione sia di adenosina, sia del fattore SDF-1α.

La preparazione delle nanoparticelle polimeriche core-shell prevede l’impiego di un core polimerico “sacrificale†, costituito da nanoparticelle di sintesi, che in seguito sono utilizzate come stampo per la sintesi di uno strato superficiale reticolato che forma lo shell. Successivamente il core viene rimosso utilizzando solventi idonei, ottenendo così nanoparticelle a riserva altresì denominate nanocapsule.

Secondo il presente esempio, il core utilizzato à ̈ costituito da polimetilmetacrilato (PMMA), mentre lo shell esterno à ̈ stato ottenuto dalla copolimerizzazione di butilmetacrilato (BMA) e polietilen glicol metileteremetacrilato con peso molecolare medio di 300 g/mol ((PEG)MEMA)300 in presenza di un reticolante, il trimetilolpropano trimetacrilato (TRIM). Il prodotto di reazione à ̈ stato recuperato, ultracentrifugato (14000 rpm) e sottoposto a rimozione del core. In seguito le nanocapsule ottenute sono state caricate per adsorbimento con adenosina o SDF-1α.

Nella tabella sottostante si riportano i materiali utilizzati per la sintesi delle nanocapsule di P(BMA-co-(PEG)MEMA) precisandone lo scopo di utilizzo.

Nome Formula Caratteristiche Uso

chimica

MONOMERI:

Metilmetacrilato Sigma Aldrich<®>, den- Monomero per sintesi del core (MMA) sità 0,936 g/ml

(25°C)

Butilmetacrilato Sigma Aldrich<®>, peso

(BMA) molecolare 142,20

g/mol, densità 0,894

g/ml (25°C).

Co-monomeri per Polietilenglicol meti- Sigma Aldrich<®>, pe-sintesi dello shellleteremetacrilato so molecolare medio ((PEG)MEMA) 300 g/mol e una densità di 1,05 g/ml (25

°C)

Trimetilolpropano Sigma Aldrich<®>, peso Agente reticolante trimetacrilato

(TRIM) molecolare 338,40

g/mol, densità 1,060

g/ cm3(25°C)

COPPIA REDOX:

Persolfato di ammo-<(NH>nio<4)2S2O8>Carlo Erba<®>, purezza

98% Iniziatori, coppia Metabisolfito di so- arlo Erba<®>, purezza<redox>dio<Na>2<O>5<S>C

2 97%

SOLVENTI:

Diclorometano

Usato come sol-Carlo Erba<®>, purezza vente del core sadel 99,5% crificale (estrazione)

2-propanolo Usato per la purificazione delle nanocapsule. Rimo-Sigma Aldrich<®>, pu- zione di una posrezza del 99% sibile frazione di omopolimero PBMA presente nel prodotto di reazione ALTRI MATERIALI:

Sodio dodecil solfato

(SDS) Surfattante utiliz-Sigma Aldrich<®>zato per la polimerizzazione in emulsione Tampone fosfato a-(PBS) Sigma Aldrich<®>Utilizzato per v lutare la cinetica di rilascio di farmaco e di assorbimento Adenosina

Sigma Aldrich<®>, peso

molecolare 267.24

g/mol, purezza del Molecola segnale

99%

SDF-1α Santa Cruz Biotechnology, Inc., peso

molecolare 35 kDa, Molecola segnale 68 aminoacidi di origine umana

Di seguito sono descritte le tre fasi di preparazione delle nanoparticelle a riserva: sintesi del core (polimero: PMMA)

sintesi dello shell (polimero: P(BMA-co-(PEG)MEMA)) estrazione del core

Sintesi del core (PMMA)

Le particelle da utilizzare come core sono state sintetizzate direttamente in forma nanoparticellare utilizzando come monomero di partenza MMA. Il mezzo di reazione à ̈ costituito da una miscela 60/40 (v/v) di acqua ed etanolo, contenente come surfattante il sodio dodecilsolfato. Come iniziatore della reazione radicalica à ̈ stata utilizzata una coppia redox a base di metabisolfito di sodio e persolfato di ammonio.

L'apparato di reazione consiste in un pallone a tre colli dalla capacità di 1000 ml immerso in un bagno d'olio mantenuto per l’intera durata della reazione (3h) alla temperatura di 37°C attraverso una termocoppia; la reazione à ̈ condotta sotto costante agitazione mediante l’impiego di una agitatore a pala (Heidolf RZR 2020 da 50 W), settato su 1600 rpm.

Nella tabella sottostante sono riportati le componenti utilizzate per effettuare la sintesi del core di PMMA:

Reagenti Quantità

MMA 0,25 mol

SDS 2g

Persolfato di ammonio 0,003 mol

Metabisolfito di Sodio 0,003 mol

H2O 350 ml

Etanolo 150 ml

Per la sintesi si à ̈ proceduto inserendo nel pallone 250 ml di acqua e SDS. Una volta ottenuta una emulsione omogenea sono stati aggiunti 150 ml di etanolo e il monomero MMA. La coppia redox à ̈ stata preventivamente solubilizzata in 100 ml di H2O a 37 °C; la soluzione à ̈ stata quindi aggiunta alla fase di reazione; quest’ultima à ̈ stata degassata con azoto anidro per alcuni minuti, in modo da rimuovere l’ossigeno che potrebbe inibire l’inizio della reazione. La sintesi à ̈ stata condotta a 37°C per 2 ore sotto un regime di agitazione di 1600 rpm. Al termine il prodotto di reazione à ̈ stato posto in stufa ventilata a 37 °C per allontanare acqua ed etanolo. Le nanoparticelle ottenute sono state sottoposte a lavaggi con acqua bidistillata alla temperatura di 80°C per eliminare residui di monomero non reagito e il surfactante, quindi nuovamente essiccate. Infine, il materiale particellare à ̈ stato frantumato con un mortaio per eliminare eventuali aggregati e analizzato al microscopio a scansione elettronica.

Sintesi dello shell (P(BMA-co-(PEG)MEMA))

È stata condotta la copolimerizzazione di due monomeri (PEG)MEMA e BMA a rapporto molare 20/80. Alla miscela di reazione à ̈ stato aggiunto il reti colante TRIM in quantità pari al 20% rispetto alle moli di monomero, in modo da mantenere la struttura copolimerica formatasi intorno al core anche dopo la sua estrazione. Si utilizzano le stesse condizioni di temperatura e velocità di agitazione e lo stesso apparato di reazione descritto per la sintesi del core. La composizione della miscela di reazione à ̈ riportata nella tabella sottostante.

BMA 0,1 mol

(PEG)MEMA 0,025 mol

TRIM 0,025 mol

SDS 2g

Persolfato di ammonio 0,0012 mol

Metabisolfito di Sodio 0,0012 mol

Acqua bidistillata 350 ml

Etanolo 150 ml

Nel reattore, si introducono inizialmente 250 ml di acqua e SDS; quindi si procede all’aggiunta di etanolo e 5 g di particelle di PMMA precedentemente purificate, essiccate e frantumate.

In seguito sono addizionati i monomeri e la coppia redox, precedentemente dissolta in 100 ml di acqua a 37°C. Infine la miscela di reazione à ̈ stata degassata con azoto per 10 minuti e mantenuta per due ore a temperatura (37°C) e agitazione (600 rpm) costanti. Al termine della reazione, il prodotto ottenuto à ̈ stato recuperato e posto in stufa ventilata a 37°C per eliminare i solventi, acqua ed etanolo.

Estrazione del core

La terza fase consiste nell'eliminazione del core di PMMA in modo da ottenere una particella “cava†costituita dal solo copolimero reticolato P(BMA-co-(PEG)MEMA).

È stato selezionato il diclorometano come solvente di estrazione in quanto capace di dissolvere il PMMA ma non dissolvere il copolimero dello shell. Le nanoparticelle sono state immerse in un volume di solvente di 20 ml e poste in agitazione a temperatura ambiente per 15 minuti. Si à ̈ proceduto con l’eliminazione della soluzione diclorometano-PMMA mediante filtrazione, in seguito le nanoparticelle recuperate sono state collocate in un secondo solvente, il 2-propanolo, per 15 minuti allo scopo di rimuovere eventuali residui di omopolimero PBMA. Le particelle dopo filtrazione sono state poste in stufa ventilata a 37 °C per eliminare i residui di solvente e una volte essiccate sono state sottoposte a lavaggi in acqua bidistillata a 80°C, e infine di nuovo essiccate in stufa ventilata. Al termine della procedura, la resa di particelle estratte rispetto a quelle utilizzate inizialmente non estratte corrisponde a circa il 44%.

Procedura di caricamento di adenosina nelle nanoparticelle

Prima del caricamento le nanoparticelle sono state precondizionate in PBS per 18 ore, ponendo i materiali a contatto con una soluzione di PBS a temperatura ambiente. Per il caricamento dell'adenosina sono state preparate tre soluzioni di adenosina in PBS a diversa concentrazione: 2 mg/ml (soluzione A), 1 mg/ml (soluzione B), 0,5mg/ml (soluzione C). Sono stati preparati almeno tre campioni di nanoparticelle per ogni soluzione di caricamento. Il processo di adsorbimento di adenosina sulle nanoparticelle à ̈ stato condotto a temperatura ambiente per un tempo complessivo di 4 ore. Ad intervalli di un’ora 0,5 ml di ogni soluzione a contatto con le particelle sono stati prelevati e analizzati, dopo ciascun prelievo 0,5 ml delle rispettive soluzioni di adenosina erano reintegrate. Dopo ogni prelievo i campioni sono stati agitati vigorosamente utilizzando il vortex per 15 minuti, in seguito sono stati centrifugati per 15 minuti a 14000 rpm. Al termine della procedura di caricamento, i campioni polimerici sono stati separati dalla soluzione di assorbimento residua centrifugando per 30 minuti a 14000 rpm ed eliminando il surnatante residuo. Infine i campioni così caricati sono stati posti in stufa ventilata a 37°C per 12 ore.

Procedura di caricamento di SDF-1 α

AAl termine della procedura di condizionamento, condotta come descritto prima, le particelle sono state messe a contatto con 1 ml di soluzione di SDF-1α in PBS a concentrazione di 1µg/ml. Ad intervalli di tempo regolari per un periodo complessivo di 2 ore sono state prelevate aliquote di 100 Î1⁄4l del mezzo di assorbimento, ad ogni prelievo il mezzo era reintegrato con 100 Î1⁄4l di soluzione fresca contenente il principio attivo. I campioni sono stati agitati vigorosamente utilizzando il vortex per 15 minuti, in seguito sono stati centrifugati per 15 minuti a 14000 rpm. Al termine della centrifugazione sono stati sottoposti ad analisi quantitative mediante HPLC allo scopo di valutare la cinetica di assorbimento del fattore stromale. Al termine della procedura di caricamento, i campioni polimerici sono stati separati dalla soluzione di assorbimento residua centrifugando per 30 minuti a 14000 rpm ed eliminando il surnatante residuo. Infine i campioni nanoparticellari contenenti SDF-1α sono stati collocati in stufa ventilata a 37°C per 12 ore.

TEST BIOLOGICI

Lo studio delle interazioni che si verificano fra lo scaffold e la componente cellulare rappresenta un campo di elevato interesse scientifico e tecnologico. I saggi condotti in vitro che utilizzano colture cellulari permettono di ottenere informazioni relative alla compatibilità biologica dei materiali in studio, risultando indispensabili sia alla comprensione dei meccanismi di interazione cellula-materiale, sia al miglioramento della risposta biologica ottenuta, prima di procedere con saggi in vivo.

Altamente sensibili e specifiche, le tecniche in vitro permettono di valutare parametri quali, ad esempio, la morfologia superficiale, la porosità, la composizione chimica dei materiali in esame e di valutare in modo diretto come questi materiali influenzino gli aspetti chiave dell'attività cellulare: adesione, proliferazione, attività metabolica, vitalità. Gli studi sono proseguiti con l’analisi dei caratteri fenotipici acquisiti dalle cellule staminali dopo coltura sulle biomatrici, poiché à ̈ fondamentale la capacità delle biomatrici di indirizzare le cellule verso il fenotipo cardiaco.

La riperfusione, anche se necessaria per ridurre i danni provocati dall’assenza di ossigeno e di nutrienti, provoca ulteriori danni proprio nella zona perimetrale colpita dalla necrosi, danni che però possono essere limitati. Per questo motivo si à ̈ deciso di funzionalizzare gli scaffold con un fattore cardioprotettivo, per agire nei primissimi momenti post-infartuali limitando il più possibile i danni da riperfusione, quindi puntando sulla salvaguardia del tessuto ancora sano.

Esempio 10: Valutazione della biocompatibilità Cellule ritenute rilevanti per la semina sugli scaffold

MSC: cellule staminali mesenchimali

Le cellule staminali mesenchimali adulte (MSC) sono una popolazione di cellule multipotenti che risiede principalmente nel midollo osseo, anche se queste cellule possono essere isolate anche da tessuti quali placenta, cordone ombelicale, polmone, fegato, muscolo scheletrico, grasso e polpa dentaria. Le MSC sono contraddistinte dal poter differenziare facilmente, in vitro, in tessuto osseo, cartilagineo ed adiposo. Recentemente, à ̈ stato osservato un loro importante ruolo paracrino a livello miocardico e suggerito un possibile transdifferenziamento in senso cardiomiocitario, rendendo queste cellule di estremo interesse nel campo della rigenerazione cardiaca. Questi effetti paracrini includono la secrezione di fattori che possono attenuare l’apoptosi dei cardiomiociti endogeni e delle cellule endoteliali, la promozione dell’angiogenesi, e l’attivazione delle cellule staminali cardiache residenti.

Infine, un ulteriore meccanismo con cui le cellule staminali midollari possono contribuire alla riparazione miocardica à ̈ attraverso il mantenimento del pool di cellule staminali cardiacospecifiche dopo un danno. Le cellule staminali midollari localizzandosi nel miocardio dopo un danno vanno incontro a modificazioni fenotipiche per adattarsi al fenotipo di cellula cardiaca residente. Queste cellule potrebbero contribuire alla capacità di riparazione endogena a lungo termine del cuore. CSC: cellule staminali cardiache residenti

Negli ultimi anni, sono emerse evidenze che dimostrano una certa capacità rigenerativa del tessuto miocardico. Studi recenti hanno evidenziato che il cuore presenta una riserva di piccole cellule esprimenti markers di staminalità (c-kit<+>, OCT 3/4 CD90) e dotate di attività telomerasica, tipica delle cellule capaci di replicazione. Le cellule staminali cardiache (CSC) residenti sono indirizzate verso un percorso differenziativo che porterà alla formazione di cardioblasti e successivamente di cardiomiociti. Cellule staminali cardiache caratterizzate da un basso tasso di replicazione, danno origine a progenitori “lineage ristretti†altamente proliferanti che diventeranno precursori “committed†verso il differenziamento cardiaco e infine raggiungeranno l’arresto della crescita e il differenziamento terminale. L’identificazione di tali cellule spiega l’osservazione di eventi mitotici interspersi nel miocardio adulto, la cui frequenza aumenta drammaticamente in risposta da uno stress (es. insufficienza cardiaca, sovraccarico pressorio). Grazie allo studio di queste popolazioni si vuole raggiungere la prospettiva di una terapia cellulare autologa, effettuata con cellule staminali cardiache, con tutti i possibili vantaggi che tale approccio terapeutico può comportare.

METODI

Semina delle cellule sulle biomatrici

La semina viene effettuata su biomatrici poste in pozzetti distinti di una piastra da 24 well. Per migliorare la capacità di adesione à ̈ necessario seminare le cellule in una goccia di circa 50 µl di terreno di coltura, questo fa sì che le cellule aderiscano alla matrice piuttosto che al fondo del pozzetto a cui aderirebbero se la goccia non fosse localizzata solamente sulla superficie della matrice. La capacità della matrice di trattenere la goccia va così ad influenzare la capacità di adesione delle cellule alla matrice stessa.

La piastra contenente le matrici viene successivamente riposta, con movimenti delicati per non fare muovere la goccia dal substrato, in incubatore a 37°C, 5% CO2 e atmosfera satura di vapore acqueo, per permettere l’adesione delle cellule. Dopo circa 3 ore (tempo di adesione) vengono aggiunti delicatamente ulteriori 450 µl di terreno completo per ogni biomatrice al fine di ricoprirla; la piastra viene nuovamente riposta in incubatore.

La concentrazione di cellule da seminare, per le cellule in adesione, viene sempre calcolata come numero di cellule per cm<2>e tiene quindi conto delle dimensioni delle superfici utilizzate per la semina che, nel caso dei substrati da noi utilizzati, à ̈ di 1 cm2. Per valutare la concentrazione ottimale di cellule da seminare à ̈ stata effettuata una semina con concentrazioni crescenti di cellule, dalle 5000 alle 30000 per ogni matrice. Basandosi sui risultati così ottenuti à ̈ possibile valutare la concentrazione di cellule migliore da seminare in base alla differente finalità dell’esperimento.

Adesione, proliferazione e vitalità cellulare sulle biomatrici

La presenza di un particolare ambiente extracellulare concorre nel determinare se e quando la cellula si dividerà. Stimoli non adatti provenienti dall’ambiente esterno possono anche indurre alla morte della cellula stessa. Ciò può avvenire per necrosi o apoptosi. Il controllo della proliferazione delle cellule e della loro sopravvivenza su biomateriali à ̈ fondamentale per la rigenerazione dei tessuti. Per poter valutare la proliferazione su biomatrice à ̈ necessario un primo passaggio, cioà ̈ valutare la capacità delle cellule di aderirvi e questo viene effettuato in maniera standard dopo 24 ore dalla semina. Per ottenere un'efficiente rigenerazione à ̈ fondamentale che le cellule aderiscano alla matrice: diversi esperimenti sembrano confermare che le cellule aderiscono maggiormente a substrati microstrutturati rispetto a substrati lisci. I substrati microstrutturati infatti riescono ad intrappolare le cellule penetrate all’interno, che presentano un maggior numero di adesioni focali. Test indiretto CellTiter-Blue â„¢ Reagent

Questo saggio utilizza un indicatore di crescita fluorimetrico/colorimetrico per rilevare l'attività metabolica cellulare. E' costituito da una soluzione tamponata contenente una molecola altamente purificata, la resazurina, che à ̈ di colore blu scuro e ha poca fluorescenza intrinseca. Le cellule metabolicamente attive possiedono enzimi che sono in grado di ridurre la resazurina ad un’altra molecola, la resorufina, che à ̈ rosa ed à ̈ altamente fluorescente, con un massimo di eccitazione a 579 nm e un massimo di emissione a 584 nm. La resorufina viene rilasciata nel terreno di coltura e grazie alla sua fluorescenza può essere rilevata con l’utilizzo di un lettore di micropiastre. La misura di fluorescenza à ̈ facile da ottenere per il fatto che la molecola utilizzata à ̈ in grado di uscire spontaneamente dalle cellule, senza danneggiarle, e può essere quindi ripetuta sugli stessi campioni a diversi giorni dalla semina.

La quantificazione del numero di cellule si basa sull’estrapolazione del dato da una curva di taratura. Inoltre le cellule restano vitali e quindi il trattamento può essere ripetuto più volte sulla stessa biomatrice a differenti tempistiche, permettendo così di avere informazioni a lungo termine. Proprio questo importante vantaggio, aggiunto alla relativa facilità di esecuzione del test, ha fatto sì che venisse scelto questo come test di elezione per i nostri esperimenti di adesione e di proliferazione.

Per ottenere un dato riguardante l’adesione delle cellule alla matrice à ̈ necessario seminare le cellule parallelamente sia sulle matrici da testare (3D) che direttamente sulla piastra 24 pozzetti (in 2D). Le cellule in 2D vengono seminate con concentrazioni note e crescenti, questo permette di avere una curva di taratura: ogni numero noto di cellule seminate (x) avrà un relativo valore di fluorescenza (y). Inserendo i valori, ottenuti dai campioni per la taratura, in un grafico si può ottenere una curva dalla quale si ricava una retta di regressione lineare che permette di estrapolare il numero di cellule (x) effettivamente adese alla matrice delle quali si conosce il valore di fluorescenza (y). O-gni linea cellulare avrà una sua curva di riferimento in quanto ogni tipo cellulare ha una propria attività metabolica intrinseca.

Il test per valutare l’adesione cellulare viene effettuato il giorno successivo alla semina (a 24 ore di distanza) per permettere alle cellule di aderire in maniera adeguata al substrato. Il tempo di incubazione viene definito dal cambiamento di colore del mezzo durante l’incubazione con il CellTiter Blue. Quando si ritiene che la tempistica di incubazione sia corretta per avere una buona sensibilità, si può procedere alla lettura con lettore di micropiastre.

Per valutare la proliferazione à ̈ necessario utilizzare la stessa tempistica di incubazione con il CellTiter-blue per tutti gli esperimenti effettuati sullo stesso campione, in questo modo l’aumento di fluorescenza rilevata sarà dovuta solamente ad un aumento del numero di cellule. Si può quindi avere un dato indiretto del numero di cellule presenti andando ad estrapolare il numero di cellule del campione rispetto alla curva di taratura seminata e letta alle 24 h.

E’ quindi possibile normalizzare tutti i valori di fluorescenza successivi rispetto al primo che si à ̈ ottenuto alle 24 ore: questo ci darà quindi un valore indicativo dell’incremento di fluorescenza e quindi dell’aumento del numero di cellule. Il primo valore di fluorescenza viene posto come uguale al valore 1, se si ha un aumento del numero di cellule si avranno dei valori maggiori, se invece si ha una diminuzione del numero di cellule si avranno dei valori compresi tra 0 e 1. Esprimendo in grafico questi valori si ottiene un istogramma che permette in modo molto intuitivo di confrontare la proliferazione avvenuta su biomatrici differenti, questo dato à ̈ però indipendente dalla quantità di cellule che aveva inizialmente aderito.

Test con Calceina-AM

La Calceina-AM à ̈ un colorante vitale che permette di ottenere informazioni protratte nel tempo sulla salute delle cellule. Può essere così valutata la vitalità delle cellule che presentano colorazione verde intenso quando vitali e contemporaneamente si possono ottenere dati semiquantitativi sull’attività metabolica, poiché la molecola viene tagliata da esterasi citoplasmatiche presenti quando il metabolismo à ̈ attivo. Inoltre la Calceina colora l’intero citoplasma mettendo in evidenza la morfologia cellulare e permette di osservare le cellule sui supporti a diversi giorni dalla semina. RISULTATI

I dati sperimentali ottenuti dai presenti inventori permettono di osservare come l’adesione delle cellule sia favorita qualora il substrato presenti una microstrutturazione: inoltre la geometria della microstrutturazione à ̈ in grado di favorire la disposizione ordinata delle cellule.

La percentuale di adesione cellulare su matrici a base di PHBHV, PLGA e PDS e polimeri biologici che presentano microstrutturazione varia tra il 40 e il 70%, mentre il saggio eseguito sulle stesse matrici non microstrutturate ha rivelato una percentuale di adesione rilevabile solo in pochi casi.

E’ stato inoltre dimostrato che l’adesione sulle matrici à ̈ favorita in presenza della componente naturale: i dati ottenuti rivelano che sul supporto PDS senza componente naturale à ̈ in grado di aderire un minor numero di cellule, se paragonato ai supporti in cui essa à ̈ presente.

La proliferazione à ̈ favorita in presenza della microstrutturazione i dati evidenziano una maggiore proliferazione sulle matrici microstrutturate oggetto dell’invenzione, rispetto alle stesse non microstrutturate.

I sistemi 3D a base di materiali polimerici bioartificiali oggetto della presente invenzione si sono dimostrati essere degli ottimi supporti per l’adesione e la proliferazione cellulare, in particolar modo quelli che presentano una struttura geometrica studiata appositamente per mimare la matrice extracellulare della parete cardiaca. E’ interessante notare come la presenza della componente naturale possa influenzare positivamente la capacità di adesione cellulare.

Esempio 11: Valutazione della cardioinduttività L’ambiente in cui vengono coltivate le cellule staminali à ̈ molto importante perché à ̈ in grado di influenzare il fenotipo cellulare, cioà ̈ l’insieme dei caratteri manifestati dalle cellule, definito da specifici marcatori caratteristici di ogni tipo cellulare. In particolare, à ̈ stato osservato che, per l’iniziale orientamento verso un determinato fenotipo differenziato, à ̈ fondamentale il tipo di supporto al quale le cellule staminali aderiscono e su cui crescono, sia per le sue caratteristiche chimico-fisiche che per la sua geometria.

Gli esperimenti di crescita cellulare da noi effettuati sulle biomatrici avevano messo in evidenza un rallentamento della proliferazione delle cellule tra il giorno 11 e il giorno 15 dalla semina. E’ stato quindi ipotizzato un possibile inizio di differenziamento, che ci ha indotti ad indagare specificatamente possibili variazioni del fenotipo cellulare.

Dopo aver valutato accuratamente i più importanti marcatori di staminalità e di differenziamento, sono stati selezionati c-kit come marcatore di staminalità e GATA 4 come marcatore di differenziamento precoce in senso cardiomiocitario. Le tecniche scelte per studiare i marcatori sono la qPCR e l’immunofluorescenza: la prima à ̈ una tecnica molto sensibile che à ̈ in grado di rilevare anche piccolissime variazioni di espressione genica tra cellule seminate in 2D e su matrice. Per confermare che a possibili variazioni di trascritto corrispondano anche variazioni di espressione proteica, abbiamo messo a punto esperimenti di immunofluorescenza.

Dai risultati ottenuti dall’analisi dell’espressione genica di fattori trascrizionali, emerge che la particolare geometria, in associazione ai materiali polimerici bioartificiali usati nell’invenzione, à ̈ in grado di indirizzare le cellule mesenchimali staminali (MSC) verso un iniziale differenziamento precoce in senso cardiomiocitario, sottolineato dall’aumento significativo del marcatore GATA 4, portandole parallelamente ad una perdita di staminalità, con diminuzione del marcatore c-kit.

Le cellule staminali residenti cardiache (CSC) coltivate sulle biomatrici, mostrano dei movimenti significativi di alcuni marcatori più tardivi di differenziamento, geni la cui espressione darà origine a importanti proteine strutturali e funzionali.

I marcatori di staminalità, invece, hanno un andamento variabile: questo à ̈ probabilmente indice del fatto che le CSC sono una popolazione mista già indirizzata verso un percorso differenziativo, quindi hanno già in parte perso le caratteristiche di staminalità. L’analisi svolta sui marcatori di differenziamento precoce ha nuovamente messo in luce dati variabili per ciò che concerne il fattore trascrizionale GATA 4.

Risultati più incisivi si ottengono quando vengono studiati marcatori per l’espressione di geni codificanti proteine strutturali e funzionali, importanti per la funzione cardiaca, come la Connessina 43, responsabile delle connessioni elettriche tra le cellule, la Troponina C, di fondamentale importanza nella fase di eccitazione-contrazione muscolare scheletrica e α-SMA, con caratteristiche funzionali di tipo contrattile. Infatti le CSC aumentano significativamente l’espressione di due di questi marcatori analizzati, sottolineando la capacità di questo tipo di cellule staminali, se opportunamente stimolate, di aumentare il loro già parziale differenziamento. Anche per questo motivo l’espressione di GATA 4, marcatore molto precoce di differenziamento, non raggiunge livelli significativi, mentre il fattore trascrizionale MEF2C subisce una evidente downregolazione, non presente per hMSC coltivate su matrice, evidenziando come vi sia un indirizzamento verso il differenziamento cardiaco e non semplicemente verso il differenziamento in muscolo striato.

Questi dati di espressione genica, sia per le MSC che per le CSC, sono stati confermati sulle corrispondenti proteine tramite saggi di immunofluorescenza e microscopia confocale.

I risultati ottenuti sulle biomatrici hanno dimostrato come la loro precisa geometria, che richiama la struttura della parete ventricolare, in associazione ai materiali polimerici bioartificiali usati nella presente invenzione, possa indurre le cellule staminali verso un iniziale differenziamento in senso cardiomiocitario. L’analisi dei marcatori scelti ha messo in evidenza come le MSC, dopo 15 giorni di coltura, siano in grado di diminuire le caratteristiche staminali e di acquisire le caratteristiche fenotipiche cardiache precoci. Le cellule staminali residenti cardiache, CSC, poste nelle stesse condizioni delle MSC, sono in grado di esprimere marcatori ancora più avanzati di differenziamento cardiomiocitario, poiché esse sono cellule staminali in una fase già più avanzata di differenziamento: lo stimolo fisico della matrici le spinge quindi ad un ulteriore passo nel processo differenziativo.

Esempio 12: Valutazione della capacità cardioprotettiva nei confronti dei danni da riperfusione Per poter salvaguardare il tessuto ancora sano presente nelle prime fasi post-infarto, sarebbe importante agire limitando i danni causati dalla riperfusione. Infatti, la riapertura della coronaria provoca danni causati proprio dal nuovo apporto di sangue che conduce ad una elevata infiammazione e stress ossidativo. Durante la fase di riperfusione si assiste, oltre ad un sovraccarico cellulare di Calcio, al rilascio di radicali liberi (primo fra tutti l’anione superossido) da parte dell’endotelio del vaso coronario e da parte dei granulociti che sono adesi alle pareti dell’endotelio coronario. Questi eventi determinano l’apertura del poro di transizione mitocondriale, con conseguente innesco del processo di morte cellulare per apoptosi.

La fibra miocardica ischemica produce l’adenosina, un fattore che determina vasodilatazione coronarica in caso di maggiori richieste di ossigeno, quindi anche in condizioni di ipossia. L’adenosina possiede sia azione vasodilatatrice che azione protettrice sul miocardio e ne determina una riduzione del metabolismo, con conseguente minor richiesta di ossigeno. Inoltre l’adenosina determina una maggior apertura dei canali per il potassio e questo porta ad una accelerata ripolarizzazione con riduzione del plateau e di conseguenza si riduce il tempo disponibile al calcio per entrare nella cellula. Questo significa che viene impedito il sovraccarico di calcio, con conseguente riduzione del danno ischemico.

L’azione dell’adenosina si esplica anche a livello mitocondriale: può infatti limitare i processi apoptotici che i cardiomiociti sofferenti mettono in atto. La molecola cardioprotettiva à ̈ in grado di limitare l’apertura del poro di transizione mitocondriale, localizzato in alcuni punti di contatto tra le due membrane mitocondriali, impedendo l’uscita di protoni che porterebbero ad un’alterazione del potenziale di membrana, con conseguente ingresso di liquidi nel mitocondrio, scoppio della membrana esterna e liberazione di fattori apoptotici (caspasi 9 e citocromo C).

Inoltre vi à ̈ attivazione della proteina anti apoptotica Bcl 2 che si esplica attraverso due pathway indipendenti innescati dall’adenosina: il primo vede la fosforilazione della proteina PKCε che a sua volta fosforila e attiva ERK, mentre il secondo pathway porta alla fosforilazione di AKT che a sua volta fosforila e attiva GSK3β. Fosfo ERK e GSK3β possono così trasferirsi a livello mitocondriale e agire su Bcl 2 inibendo il processo apoptotico che le cellule sofferenti mettono in atto dopo la riperfusione.

Per questi motivi si à ̈ deciso di funzionalizzare le biomatrici con adenosina, per poter potenziare l’effetto protettivo che, in piccola parte, il cuore mette in atto già in maniera endogena. L’adenosina dovrà, quindi, iniziare ad essere rilasciata già nei primi momenti dopo l’impianto e in questo modo verranno limitati i danni causati dal nuovo apporto sanguigno nella zona lesionata.

Gli esperimenti condotti in vitro hanno dimostrato che le biomatrici funzionalizzate con il fattore cardioprotettivo adenosina sono in grado di proteggere le cellule staminali mesenchimali sottoposte ad ipossia per 72 ore seguite da 3 ore di recupero in normossia, situazione che mima la condizione di ischemia seguita dalla riperfusione. Questo dato à ̈ confermato sia dalla capacità delle cellule di mantenere una buona vitalità, sia dall’analisi delle proteine coinvolte nel processo di inibizione del processo apoptotico.

Il saggio con CellTiter Blue, che ha messo in evidenza la vitalità delle cellule, à ̈ stato eseguito prima dello stimolo ipossico e durante le 3 ore di recupero: le misure di fluorescenza ottenute durante le 3 ore di recupero sono state normalizzate sulle misure ottenute prima dello stimolo ipossico, al fine di valutare il mantenimento della vitalità. I dati ottenuti mostrano che le MSC, in presenza della biomatrice funzionalizzata, subiscono un danno limitato se paragonate alle stesse cellule nelle stesse condizioni, ma senza matrice. Inoltre la vitalità à ̈ maggiore rispetto alle stesse MSC che hanno ricevuto la sola adenosina.

Le successive analisi hanno permesso di valutare l’innesco dei pathway associati al processo di cardioprotezione nelle cellule coltivate con la biomatrice funzionalizzata, ovvero la presenza di alcune delle proteine effettrici nel processo anti apoptotico, come ERK e AKT in forma fosforilata. I risultati ottenuti mostrano come queste proteine in cellule coltivate con la biomatrice funzionalizzata con adenosina, presentino una fosforilazione paragonabile alle stesse proteine di cellule coltivate in presenza di adenosina nel terreno di coltura, dimostrando quindi l’efficacia del rilascio della molecola cardioprotettiva.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10), comprendente una struttura di supporto (20) comprendente almeno uno strato di supporto (30) caratterizzato dal fatto di essere realizzato in un materiale polimerico scelto dal gruppo che consiste di acido poli(lattico-co-glicolico), acido poli(3-idrossibutirrico-co-3-idrossivalerico) e poli(diossanone) eventualmente in associazione con un polimero biologico, lo strato di supporto (30) essendo ulteriormente caratterizzato dal fatto di avere una superficie sulla quale à ̈ ricavata una pluralità di cavità (41) disposte secondo un reticolo regolare, dette cavità (41) essendo definite da una schiera di rilievi lineari longitudinali (40a, 40b) e da una schiera di rilievi lineari trasversali (40c) fra loro rispettivamente intersecantisi.
2. 2. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo la rivendicazione 1, in cui dette cavità (41) hanno una profondità d compresa nell’intervallo di 20 a 100 µm.
3. 3. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui dette cavità (41) hanno una dimensione longitudinale 1 compresa nell’intervallo di 350 a 600 µm e una dimensione trasversale w1compresa nell’intervallo di 30 a 150 µm.
4. 4. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazion1 1 a 3, in cui detta schiera di rilievi lineari longitudinali (40a, 40b) comprende una successione alternata di rilievi larghi (40b) e rilievi stretti (40a), in cui la dimensione trasversale w2dei rilievi larghi (40b) à ̈ compresa nell’intervallo di 50 a 160 µm e la dimensione trasversale w3dei rilievi stretti (40a) à ̈ compresa nell’intervallo di 20 a 120 µm, con la condizione che w2> w3.
5. 5. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo la rivendicazione 4, in cui detta successione alternata prevede un rilievo largo (40b) ogni due rilievi stretti (40a).
6. 6. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui dette cavità (41) hanno forma sostanzialmente rettangolare.
7. 7. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui detto polimero biologico à ̈ scelto dal gruppo che consiste di gelatina, acido ialuronico, collagene e gellano.
8. 8. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, in cui detta struttura di supporto (20) comprende un primo e un secondo di detti strati di supporto (30) ed uno strato intermedio (33) di materiale polimerico interposto fra detti primo e secondo strati di supporto (30), detti primo e secondo strati di supporto (30) avendo cavità (41) rispettivamente rivolte verso lati opposti della struttura di supporto (20).
9. 9. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo la rivendicazione 8, in cui detto materiale polimerico dello strato intermedio (33) Ã ̈ un polimero biologico.
10. 10. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo la rivendicazione 9, in cui detto materiale polimerico dello strato intermedio (33) Ã ̈ gelatina.
11. 11. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 10, comprendente inoltre un principio attivo farmaceutico cardioprotettivo.
12. 12. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo la rivendicazione 11, in cui detto principio attivo farmaceutico cardioprotetti vo à ̈ adenosina o ciclosporina A.
13. 13. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo la rivendicazione 11 o 12, in cui detto principio attivo farmaceutico à ̈ incluso nello strato intermedio (33) e/o nello strato o negli strati di supporto (30).
14. 14. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11 a 13, in cui detto principio attivo farmaceutico à ̈ incapsulato in nanoparticelle del tipo core-shell.
15. 15. Scaffold polimerico per la rigenerazione cardiaca (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 14, comprendente inoltre una pluralità di cellule staminali cardiache (C) alloggiate in dette cavità (41).