ITTO20130229A1 - Microscopia a deplezione mediante emissione stimolata (sted) ad accesso casuale - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Microscopia a deplezione mediante emissione stimolata (STED) ad accesso casuale"

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda le tecniche di imaging, e più specificamente le tecniche di microscopia a super risoluzione ed alta velocità in grado di risolvere dettagli al di sotto del limite di diffrazione di Abbe.

Fra le tecniche finora sviluppate per lo studio di materiali biologici, la microscopia multi-fotone (MP) à ̈ uno strumento fondamentale per l’imaging di tali materiali. Combinata con modelli animali transgenici di malattie e sonde fluorescenti molecolari o geneticamente codificate di funzioni cellulari, quali indicatori sensibili alla tensione od al calcio, la microscopia MP à ̈ considerata attualmente il mezzo migliore per studiare il tessuto cerebrale vivo.

I neuroni comunicano informazione mediante variazioni dell’ordine dei millisecondi del loro potenziale di membrana. La registrazione dell’attività cerebrale richiede una tecnica di microscopia in grado di lavorare a differenti scale spaziali, in tre dimensioni e ad un’elevata risoluzione temporale. Infatti, anche considerando l’attività di un singolo neurone, il segnale neuronale à ̈ differentemente distribuito nello spazio e nel tempo lungo i segmenti dendritici ed assonali.

È stato dimostrato che taluni aspetti di larga scala delle funzioni cerebrali possono originare dalle proprietà elettriche dei singoli neuroni. Ciononostante, neuroni disposti ravvicinati possono avere pattern di attività enormemente differenti, mentre cellule ben separate possono appartenere allo stesso circuito funzionale, influenzandosi reciprocamente attraverso lunghi processi assonali. Pertanto, un metodo efficace per analizzare sistematicamente le funzioni cerebrali richiede di monitorare simultaneamente l’attività elettrica di molte cellule in un volume cerebrale.

Sono state sviluppate diverse tecnologie per realizzare misurazioni tridimensionali (3D) rapide su tessuto cerebrale, fra cui lenti liquide veloci, specchi deformabili, multiplexing temporale e spaziale, imaging basato su illuminazione axicon o planare, scansione olografica, e piezo-scansione con risonanza sinusoidale e non lineare. Deflettori acusto-ottici (AOD) privi di inerzia sono stati utilizzati per effettuare un imaging ad accesso casuale e variare rapidamente la focalizzazione di un fascio laser senza movimenti meccanici, come à ̈ descritto in US 2007/0201123. La combinazione di microscopia MP con questa forma di scansione di fascio bidimensionale (2D) o tridimensionale (3D) (microscopia multi-fotone ad accesso casuale -RAMP) rappresenta uno dei migliori approcci allo studio del funzionamento cerebrale.

Nonostante l’intrinseco vantaggio del sezionamento ottico della microscopia MP, la risoluzione spaziale di quest’ultima à ̈ limitata dalla diffrazione e risente del valore relativamente alto della sua lunghezza d’onda di eccitazione. Pertanto, la risoluzione spaziale della microscopia RAMP deve ancora essere migliorata, senza però pregiudicarne l’elevata risoluzione temporale.

Attualmente, uno dei metodi migliori per superare il limite di diffrazione ed aumentare la risoluzione spaziale della microscopia in fluorescenza à ̈ la tecnica a deplezione mediante emissione stimolata (STED). Il principio fondamentale di tale metodo si basa sull’inibizione dell’emissione spontanea di fluorescenza in corrispondenza di predefinite coordinate del campione, in modo tale che elementi adiacenti emettano sequenzialmente nel tempo mediante un processo di emissione stimolata. L’architettura STED più generale sfrutta un fascio laser di eccitazione regolarmente focalizzato, sovrapposto ad un secondo fascio laser di differente lunghezza d’onda che induce l’emissione stimolata e presenta almeno un punto di intensità zero, ad esempio una forma focale toroidale.

Nel 2009 à ̈ stata proposta una tecnica di microscopia STED multi-fotone che combina i vantaggi dell’eccitazione a due fotoni (2PE) con la superrisoluzione della STED. Un recente progresso nella microscopia STED sfrutta una medesima lunghezza d’onda per l’eccitazione a due fotoni e la deplezione ad un fotone, semplificando così sia l’architettura che lo schema di formazione delle immagini di tali microscopi a super-risoluzione (si vedano US 2009/0121153 ed US 2011/0031411).

Uno scopo della presente invenzione à ̈ quello di rendere disponibile un sistema di scansione per un’apparecchiatura di microscopia o di litografia a super-risoluzione che permettano lo studio di fenomeni ad alta velocità o, rispettivamente, la produzione di oggetti nano-strutturati.

Un altro scopo dell’invenzione à ̈ quello di rendere disponibile un sistema di scansione ottica in grado di dirigere in modo rapidamente variabile il fuoco di due fasci luminosi in una pluralità di posizioni predefinite in un volume dato.

Questi ed altri scopi sono raggiunti secondo l’invenzione da un sistema di scansione ottica, comprendente

un sistema ottico per guidare un primo ed un secondo fascio luminoso, e

mezzi deflettori per deflettere in modo direzionalmente variabile detti primo e secondo fascio luminoso,

in cui detti mezzi deflettori comprendono almeno un deflettore acusto-ottico, e detto sistema ottico à ̈ disposto in modo tale che detti primo e secondo fascio luminoso siano contro-propaganti attraverso detto almeno un deflettore acusto-ottico, detto almeno un deflettore acusto-ottico essendo comandabile per deflettere simultaneamente od in sequenza di impulsi detti primo e secondo fascio luminoso.

Benché la presente invenzione sia stata concepita specificamente nel campo della microscopia in fluorescenza e dell’imaging funzionale del tessuto cerebrale, essa può avere infatti utilità in altri campi, come ad esempio nella nanolitografia, nanofabbricazione, archiviazione e recupero ottico di dati, ed altri campi in cui sono presenti fenomeni ad alta velocità.

Secondo l’invenzione, i due fasci luminosi entrano nel sistema di scansione ad accesso casuale da lati opposti e contro-propagano attraverso ciascun elemento AOD. Tale configurazione sfrutta la massima efficienza di deflessione degli AOD, qualora entrambi i fasci concordino con la polarizzazione richiesta dagli AOD ed entrambi i fasci abbiano la stessa lunghezza d’onda; in questo modo à ̈ sufficiente una sola onda acustica di comando per ciascun elemento AOD. A seconda del numero di elementi AOD à ̈ inoltre possibile realizzare un sistema in grado di effettuare una scansione su più direzioni: con un solo AOD à ̈ possibile implementare una scansione monodimensionale (1D), mentre con 4 AOD à ̈ possibile implementare una scansione tridimensionale (3D).

In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, la presente invenzione riguarda un’apparecchiatura per irradiare un materiale bersaglio al fine di eccitare elementi di una specie chimica eccitabile contenuta in detto materiale bersaglio in uno stato di eccitazione, comprendente un sistema di scansione ottica secondo l’invenzione, in cui detto primo fascio luminoso à ̈ atto ad eccitare detti elementi in detto stato di eccitazione, e detto secondo fascio luminoso à ̈ atto a ridurre il numero di elementi eccitati in detto stato di eccitazione, e

mezzi per dirigere detti primo e secondo fascio luminoso su detto materiale bersaglio, in modo tale che detti primo e secondo fascio luminoso abbiano rispettive aree di irraggiamento mobili, parzialmente sovrapposte, su detto materiale bersaglio.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, la presente invenzione propone uno schema ottico che combina la tecnologia RAMP e le tecnologia STED a due fotoni di eccitazione e a singola lunghezza d’onda (SW 2PE-STED), realizzando una microscopia veloce a super-risoluzione che può essere definita come microscopia a deplezione mediante emissione stimolata, ad accesso casuale (RA-STED). Una tale tecnica fornisce un metodo per l’imaging in super-risoluzione di siti di interesse in un campione senza i tempi relativamente lunghi dei sistemi di scansione raster convenzionali. I-noltre, tale scansione ad alta velocità à ̈ necessaria per osservare fenomeni quali la trasmissione di segnali elettrici in neuroni.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi del sistema secondo l’invenzione diverranno più chiari con la seguente descrizione dettagliata di una forma di realizzazione del trovato, fatta con riferimento ai disegni allegati, forniti a titolo puramente illustrativo e non limitativo, in cui:

- la figura 1 Ã ̈ una rappresentazione schematica di un deflettore acusto-ottico secondo la tecnica nota, con onda acustica a frequenza costante;

- la figura 2 à ̈ una rappresentazione schematica di un deflettore acusto-ottico con onda acustica a frequenza costante, che deflette secondo l’invenzione due fasci di luce contro-propaganti;

- la figura 3 Ã ̈ una rappresentazione schematica di un preferito microscopio STED a superrisoluzione multi-fotone, ad accesso casuale, bidimensionale;

- la figura 4 Ã ̈ una rappresentazione schematica di una preferita maschera di fase da applicare in un dispositivo di sagomatura di fascio nel microscopio di figura 3, per migliorare la risoluzione del microscopio; e

- la figura 5 Ã ̈ una rappresentazione schematica di un preferito sistema di scansione AOD tridimensionale.

Con riferimento inizialmente alla fig. 1, un dispositivo di pilotaggio 140 crea un’onda acustica 130 che à ̈ trasmessa attraverso un deflettore acusto-ottico (AOD) 100. L’onda acustica 130 ha frequenza costante ed à ̈ trasmessa attraverso l’AOD 100. L’AOD 100 riceve inoltre un fascio di luce incidente 110, una porzione del quale, indicata con 120, à ̈ diffratta o deflessa a causa dell’interazione tra il fascio luminoso 110 e l’onda acustica 130. Il fascio luminoso deflesso 120 à ̈ deflesso di una misura pari all’angolo Î ̧, dipendente dalla frequenza dell’onda acustica 130 (per una discussione più approfondita del principio si rimanda alla descrizione di US 2007/0201123, qui incorporata per riferimento). Pertanto, variando la frequenza dell’onda acustica 130 si varia l’angolo Î ̧ con il quale il fascio incidente à ̈ deflesso. Come à ̈ imposto dal principio di conservazione della quantità di moto, il fascio luminoso deflesso 120 viene deflesso nella stessa direzione in cui si propaga l’onda acustica 130 (cioà ̈, in allontanamento dal dispositivo di pilotaggio 140).

Poiché l’AOD 100 à ̈ simmetrico rispetto alla sua direzione di trasmissione, se un secondo fascio luminoso 110b entra nell’AOD 100 dal lato opposto ri spetto al primo fascio luminoso 110, simultaneamente od in sequenza di impulsi rispetto a tale primo fascio 110, una porzione 120, 120b di ciascuno dei fasci incidenti 110, 110b à ̈ diffratta o deflessa a causa dell’interazione fra l’onda acustica 130 ed i fasci luminosi 110 e 110b, rispettivamente con angolo Î ̧ e Î ̧b.

In fig. 3 Ã ̈ presentato uno schema del preferito microscopio STED ad accesso casuale.

Il microscopio suddetto comprende una sorgente luminosa 10, in particolare una sorgente laser, ad esempio un laser Ti:zaffiro ultraveloce ad impulsi accordabile, operante ad una frequenza di ripetizione di 80 MHz con una lunghezza di impulso di 140 fs. La sorgente 10 emette un fascio laser polarizzato 15, che passa attraverso una lamina a semionda 16 e quindi attraverso un beam splitter polarizzante 17 per ottenere due fasci luminosi 110 e 110b. Il primo fascio luminoso, 110, serve come fascio di eccitazione multi-fotone, mentre il secondo fascio luminoso, 110b, serve come fascio di deplezione. Poiché gli impulsi dei due fasci devono essere sincronizzati quando raggiungono il campione, una linea di ritardo 21 à ̈ prevista lungo il percorso ottico del secondo fascio luminoso 110b. Il secondo fascio luminoso 110b viene inoltre allungato mediante un dispositivo allungatore di impulso 22 per raggiungere una lunghezza di impulso di 250 ps. Preferibilmente, il dispositivo allungatore à ̈ implementato con tre barre di vetro di 20 cm ed una fibra ottica conservante la polarizzazione (PM) ed a modo singolo di 100 m; l’uscita della fibra viene ruotata per farne corrispondere la polarizzazione a quella del primo fascio luminoso 110. Sono tuttavia possibili altre implementazioni per il dispositivo allungatore, cioà ̈ mediante reticoli o prismi.

Per pre-compensare la dispersione temporale del primo fascio luminoso 110, lungo il percorso ottico di quest’ultimo à ̈ disposto un dispositivo di prechirping 23. Preferibilmente, tale dispositivo può essere realizzato mediante un reticolo, ma può essere ad esempio basato su prismi.

Preferibilmente, la lunghezza di impulso del fascio di eccitazione à ̈ minore di 1 ps, ed in modo particolarmente preferito pari a 150 fs in corrispondenza del punto focale; preferibilmente, la lunghezza di impulso del fascio di deplezione à ̈ maggiore di 50 ps, ed in modo particolarmente preferito nell’intervallo fra 200 ps e 2 ns.

I componenti sopra descritti compongono un blocco di generazione 30, il quale produce i due fasci luminosi ad impulsi sincronizzabili 110 e 110b con le caratteristiche sopra indicate. In alternativa ad una singola sorgente laser, il blocco di generazione può comprendere un sistema di più sorgenti.

Attraverso due rispettivi set di specchi 35, i fasci luminosi 110 e 110b entrano in un sistema di scansione ottica 80 bidimensionale ad accesso casuale, basato su deflettori acusto-ottici (AOD). I fasci luminosi 110 e 110b hanno la stessa polarizzazione e la stessa lunghezza d’onda e sono accoppiati nel sistema di scansione da due beam splitter polarizzanti 81. Preferibilmente, il primo fascio luminoso 110 incontra un primo AOD 100.1 previsto per la scansione lungo un asse x prestabilito, poi incontra un secondo AOD 100.2 ruotato di 90 gradi, per la scansione lungo l’asse y, e quindi un elemento di compensazione della dispersione spaziale 83 che può essere implementato mediante un reticolo od un altro AOD, entrambi ruotati di 45 gradi. A questo punto il primo fascio luminoso 110 all’uscita del sistema di scansione 80 attraverso il beam splitter 81 ha una polarizzazione ortogonale rispetto a quella che aveva all’ingresso di tale sistema. Per questo motivo il sistema di scansione 80 comprende un numero dispari di elementi birifrangenti. Tuttavia, poiché l’elemento di compensazione della dispersione spaziale 83 à ̈ ruotato di 45 gradi, esso comprende due lamine a semionda con un AOD od un reticolo fra esse interposto. Per un discussione più approfondita su un sistema di scansione a fascio singolo basato su una serie di AOD si rimanda alla descrizione di US 2007/0201123, qui incorporata per riferimento.

Il secondo fascio luminoso 102 viaggia in direzione opposta rispetto al primo fascio, passando attraverso i tre elementi 100.1, 100.2 ed 83 in ordine inverso, ovvero prima attraverso l’elemento 83, poi attraverso l’elemento 100.2, ed infine attraverso l’elemento 100.1.

Il secondo fascio luminoso 110b che lascia il sistema di scansione 80 passa attraverso un dispositivo di sagomatura di fascio 40, preferibilmente una lamina di fase a vortice. Alcuni esempi noti di maschere di fase sono rappresentati in figura 4; con 41 à ̈ rappresentata una maschera di fase a vortice, con 42 à ̈ rappresentata una maschera di fase concentrica, e con 43 à ̈ rappresentata una maschera di fase a mezzaluna. Tali maschere possono essere ottenute con una lamina di fase od un modulatore spaziale di luce. La maschera a mezzaluna à ̈ preferibilmente utilizzata in un sistema con scansione 1D, mentre la maschera concentrica lo à ̈ in un sistema con scansione 3D. In ogni caso, sono possibili tutte le combinazioni.

I due fasci luminosi 110 e 110b sono ora combinati per mezzo di una lamina a semionda 45, che ruota la polarizzazione del fascio luminoso 110b di 90 gradi, e di un beam splitter polarizzante 46. I fasci combinati, avendo ora polarizzazione lineare ortogonale fra di essi, sono diretti verso una lente di obiettivo 50 attraverso un beam splitter passabasso 51 ed una lamina a quarto d’onda 52, per rendere la polarizzazione dei fasci luminosi circolare, e focalizzati su un campione fluorescente 60. La luce fluorescente 63 emessa dal campione à ̈ raccolta dalla lente di obiettivo 50 e dopo aver passato il beam splitter 51 à ̈ acquisita da un rilevatore 70, che preferibilmente à ̈ un tubo fotomoltiplicatore.

Il sistema di scansione 80 à ̈ controllato da un elaboratore 75 (che controlla il rispettivo dispositivo di pilotaggio associato a ciascun AOD), che inoltre ricostruisce e visualizza l’immagine acquisita dal rilevatore 70.

In figura 3 Ã ̈ inoltre rappresentato un sistema di lenti 77, che serve a posizionare otticamente tutti gli AOD e la maschera di fase in un piano coniugato.

In figura 5 à ̈ rappresentata l’implementazione di un’unità di scansione ad accesso casuale tridimensionale. Ad elementi corrispondenti a quelli rappresentati in figura 3 sono stati assegnati gli stessi riferimenti numerici.

Nell’implementazione di figura 5 sono previsti quattro AOD 100.1, 100.2, 100.3, 100.4, i quali sono in grado di effettuare una scansione con lo spot focale dei due fasci 110 e 110b nelle direzioni laterale ed assiale, ed anche di compensare la dispersione spaziale (a tal proposito, si veda US 2007/0201123); una lamina a semionda 84 à ̈ inserita per avere un numero dispari di elementi birifrangenti.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Sistema di scansione ottica (80), comprendente un sistema ottico (81) per guidare un primo ed un secondo fascio luminoso (110, 110b), e mezzi deflettori per deflettere in modo direzionalmente variabile detti primo e secondo fascio luminoso, caratterizzato dal fatto che detti mezzi deflettori comprendono almeno un deflettore acustoottico (100.1, 100.2; 100.3, 100.4), e detto sistema ottico à ̈ disposto in modo tale che detti primo e secondo fascio luminoso siano contro-propaganti attraverso detto almeno un deflettore acusto-ottico, detto almeno un deflettore acusto-ottico essendo comandabile per deflettere simultaneamente od in sequenza di impulsi detti primo e secondo fascio luminoso.
2. 2. Sistema secondo la rivendicazione 1, associato a mezzi generatori (30) per generare detti primo e secondo fascio luminoso, detti mezzi generatori essendo predisposti in modo tale che primo e secondo fascio luminoso presentino, in ingresso a detto almeno un deflettore acusto-ottico, stesse lunghezza d’onda e polarizzazione.
3. 3. Apparecchiatura per irradiare un materiale bersaglio al fine di eccitare elementi di una specie chimica eccitabile contenuta in detto materiale bersaglio in uno stato di eccitazione, comprendente un sistema di scansione ottica secondo la rivendicazione 2, in cui detto primo fascio luminoso à ̈ atto ad eccitare detti elementi di una specie chimica eccitabile in detto stato di eccitazione, e detto secondo fascio luminoso à ̈ atto a ridurre il numero di elementi eccitati in detto stato di eccitazione, e mezzi per dirigere detti primo e secondo fascio luminoso su detto materiale bersaglio, in modo tale che detti primo e secondo fascio luminoso abbiano rispettive aree di irraggiamento mobili, parzialmente sovrapposte, su detto materiale bersaglio.
4. 4. Apparecchiatura secondo la rivendicazione 3, comprendente ad esempio un’apparecchiatura per microscopia ottica a deplezione mediante emissione stimolata (STED), in cui detto primo fascio à ̈ costituito da un fascio di eccitazione ad impulsi corti e detto secondo fascio à ̈ costituito da un fascio di deplezione ad impulsi lunghi.
5. 5. Apparecchiatura secondo la rivendicazione 4, in cui la lunghezza d’onda del fascio di eccitazione à ̈ in una finestra spettrale in cui à ̈ possibile l’emissione spontanea per fluorescenza della specie chimica eccitabile, e la sezione d’urto di fluorescenza per eccitazione multi-fotone à ̈ non nulla.
6. 6. Apparecchiatura secondo la rivendicazione 4 o 5, in cui la lunghezza di impulso del fascio di eccitazione à ̈ minore di 1 ps, e preferibilmente pari a 150 fs in corrispondenza del punto focale, ed in cui la lunghezza di impulso del fascio di deplezione à ̈ maggiore di 50 ps, e preferibilmente nell’intervallo fra 200 ps e 2 ns.
7. 7. Apparecchiatura secondo una delle rivendicazioni 4 a 6, in cui il fascio di eccitazione ed il fascio di deplezione in ingresso a detto sistema di scansione ottica sono entrambi linearmente polarizzati.
8. 8. Apparecchiatura secondo una delle rivendicazioni 4 a 7, comprendente un dispositivo di sagomatura di fascio (40) per sagomare il fascio di deplezione, disposto preferibilmente in un piano coniugato dopo il sistema di scansione ottica e prima di un punto di combinazione di detti primo e secondo fascio luminoso.