ITTO20130603A1 - Strumento optogenetico per l'indirizzamento multiplo ed indipendente di finestre ottiche patternate - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Strumento optogenetico per l’indirizzamento multiplo ed indipendente di finestre ottiche patternate"

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce a un dispositivo di distribuzione di luce multi-punto, comprendente una guida d’onda che trasporta luce lungo un asse longitudinale e include una pluralità di finestre ottiche, per mezzo delle quali la luce trasportata è disaccoppiata dalla guida d’onda.

Tale dispositivo può essere usato come strumento optogenetico da usare sia per esperimenti in vitro con tessuti neuronali sia per esperimenti in vivo o applicazioni mediche. In tali esperimenti, neuroni specifici vengono presi di mira al fine di esprimere proteine sensibili alla luce o vengono esposti a composti sensibili alla luce. Esempi di proteine sensibili alla luce includono le proteine che alterano lo stato elettrico e biochimico del neurone o che attivano o reprimono enzimi specifici. I composti sensibili alla luce includono piccole molecole che quando esposte alla luce rilasciano un composto attivo come un neurotrasmettitore, un secondo messaggero, o un neuromodulatore. Pertanto, lo stato di segnalazione elettrico e biochimico di un neurone può essere regolato mediante la stimolazione ottica, tipicamente nell’intervallo spettrale visibile o nel vicino infrarosso. Il vantaggio principale della stimolazione ottica rispetto alla stimolazione elettrica o farmacologica classica è la possibilità di attivare o inattivare selettivamente una (o più) serie geneticamente definita/e di neuroni con alta precisione temporale e spaziale. Ciò può essere realizzato mediante approcci genetici che possono fornire a neuroni specifici proteine sensibili alla luce lasciando contemporaneamente le cellule confinanti immutate. Al contrario, la stimolazione elettrica o farmacologica generalmente colpisce tutte le cellule situate vicino alla punta dell’elettrodo, senza precisione cellulare.

Spesso la stimolazione ottica nel tessuto cerebrale viene effettuata contemporaneamente alla registrazione elettrica dell’attività neuronale innescata. Negli esperimenti in vivo, strumenti optogenetici comuni sono rappresentati dalle fibre ottiche usate per emettere luce visibile all’interno del cervello, combinate con sistemi di registrazione mono- o multi-elettrodo (microfili singoli, tetrodi, array multielettrodo fabbricati su steli di silicio, eccetera) per la lettura elettrica. Questi strumenti sono gestiti separatamente, e le risposte neurali possono essere monitorate vicino e lontano rispetto alla regione di stimolazione ottica. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati dispositivi completamente integrati che combinano la modulazione ottica e la registrazione elettrica in un singolo utensile impiantabile, migliorando in tal modo la compattezza e riducendo le fasi di intervento chirurgico.

Per capire il comportamento di circuiti neurali complessi e per aumentare la quantità di dati raccolti nei singoli esperimenti è cruciale la registrazione multicanale. Tuttavia, nei dispositivi standard, la luce viene distribuita nel cervello per mezzo di una singola fibra ottica in grado di distribuire la luce solo in una singola area fissa del cervello. Pertanto, il numero elevato di canali di registrazione non è accompagnato da una quantità comparabile di punti di distribuzione di luce, creando un’asimmetria in cui l’attività elettrica può essere rilevata con una risoluzione spaziale elevata, mentre l’eccitazione ottica presenta una scarsa selettività spaziale. La possibilità di selezionare dinamicamente l’area eccitata in tempo reale consentirebbe di aumentare le prestazioni dei dispositivi disponibili oggi, fornendo la possibilità di manipolare in modo causale i circuiti neurali.

Recentemente, sistemi integrati ad eccitazione ottica singola e lettura elettrica multipla sono stati riportati in Anikeeva et al. (Nature Neuroscience, vol.15, pp.163-170, 2012, doi: 10.1038/nn.2992) e Wang et al. (Journal of Neural Engineering, vol.9, p. 016001, 2012, doi:10.1088/1741-2560/9/1/016001). In Anikeeva et al., una singola fibra multimodale viene usata per trasmettere luce, mentre quattro tetrodi sono incollati ai suoi lati e si estendono per 300 µm o più oltre l’estremità della fibra ottica per registrare il segnale elettrico dalle regioni di cervello illuminate. Il sistema è compatto e leggero, idoneo per l’impianto cronico su animali liberi di muoversi. Tuttavia, questa disposizione limita la localizzazione dei siti di registrazione a una piccola regione di cervello vicino alla punta della fibra, con la distanza efficace determinata dall’intensità luminosa. L’assorbimento e la diffusione della luce in un tessuto cerebrale porta a una diminuzione nell’intensità luminosa in funzione della distanza dalla punta della fibra: le punte dell’elettrodo più vicine di 200-300 µm dalla punta della fibra risentiranno di un rumore fotoelettrico elevato, mentre i sensori più lontani di 1000 micron in generale saranno all’esterno dell’intervallo di illuminazione della luce. Pertanto, la regione efficace sarà limitata a poche centinaia di micron dalla punta della fibra.

Il secondo approccio suggerisce una fibra ottica rastremata posizionata al centro di un array di microelettrodi bidimensionale costituito da 30 punte di silicio microfabbricate per la registrazione elettrica. La fibra ottica è rastremata soltanto al fine di evitare danni tissutali. La fibra può anche essere coperta da uno strato metallico per fornire un sito di registrazione elettrica supplementare (si veda anche Zhang et al, Journal of Neural Engineering, Vol.6, p.055007, 2009, doi: 10.1088/1741-2560/6/5/055007). La distanza inter-elettrodo e la distanza fibra-elettrodo minima vengono determinate dalla microfabbricazione (nel dispositivo proposto, essa è 400 micron). L’intensità luminosa viene regolata per eccitare i neuroni dalla punta della fibra ai vicini elettrodi dell’array. Il volume di cervello eccitato può nuovamente essere espanso aumentando la potenza ottica emessa, tuttavia aumentare l’intensità luminosa per raggiungere siti di registrazione lontani porterà a un aumento degli artefatti elettrici sui siti più vicini.

Gli optrodi disponibili in commercio (NeuroNexus) combinano anch’essi un array lineare di siti di registrazione fabbricato su un singolo stelo di silicio con una fibra ottica nuda montata in modo collineare sulla parte superiore dell’array (si veda anche Royer et al., European Journal of Neuroscience, Vol.31, pp.2279-2291, 2010, doi:10.1111/j.1460-9568.2010.07250.x). Ancora, la distanza punta della fibra/elettrodi viene determinata dall’intensità luminosa: distanze ridotte richiedono una potenza ottica inferiore per evitare il rumore fotoelettrico e pertanto vengono eccitati volumi di cervello ridotti. Tipicamente, distanze di fibra intermedie di 200 micron dal pad più vicino vengono fornite come standard commerciale.

Pertanto, è evidente che gli optrodi basati su una sorgente a singolo punto di emissione luminosa hanno limitazioni significative per quanto riguarda l’integrazione di sistemi di registrazione multisito. La distribuzione di luce multi-punto è stata suggerita da Zorzos et al. (Optics Letters, Vol.15, pp.4133-4135, 2010; Optics Letters, Vol. 37, pp.

4841-4843, 2012) e Stark et al. (Journal of Neurophysiology, vol. 108, pp. 349-363, 2012). Gli approcci di Zorzos et al. comprendono un array parallelo di guide d’onda ottiche aventi un taglio terminale a 45° coperto da alluminio, in modo tale che sia ottenuta l’emissione della luce a 90°, perpendicolare all’asse della sonda. Ciascun guida d’onda può essere accoppiata separatamente a sorgenti di luce differenti o alla stessa sorgente laser condivisa da tutte le guide d’onda per mezzo di dispositivi a micro-specchio, ottenendo in tal modo punti di stimolazione ottica separati in ambienti bi- e tridimensionali. Sebbene la registrazione elettrica non sia descritta in questi congegni, è suggerita l’integrazione con steli di silicio e molteplici siti di registrazione. Analogamente, Stark et al. propongono l’uso di molteplici gruppi diodo-fibra, in cui ciascuna fibra ottica a nucleo singolo è incollata a uno stelo di silicio differente con siti di registrazione singoli o multipli. In questo caso, ciascuna fibra viene eccitata indipendentemente ed è possibile usare molteplici lunghezze d’onda e potenze di luce. Entrambe le strategie consentono una distribuzione migliorata dell’intensità luminosa nel volume di cervello studiato, ma ciò viene ottenuto ricorrendo a molteplici sorgenti di luce e a strategie di accoppiamento complicate e ingombranti.

WO 2011/057137 descrive un dispositivo di interfaccia neurale con guida d’onda in grado di prendere di mira regioni di cervello differenti. È basato sulla combinazione di alcuni dei lavori descritti sopra e copre un’ampia area di possibili configurazioni del dispositivo. In particolare, sono previsti elementi di orientamento della luce su guide d’onda e/o su fibre ottiche al fine di reindirizzare la luce lontano dall’asse longitudinale della guida d’onda. Questi elementi consentono l’illuminazione di zone specifiche del tessuto circostante il dispositivo e, come asserito dagli inventori, possono essere “uno o più di svariate variazioni, incluse una o più caratteristiche che rifrangono, riflettono, focalizzano, e/o disperdono la luce, e/o realizzano una qualsiasi manipolazione idonea della luce”. Cioè, la luce viene ridiretta e/o manipolata per mezzo di elementi di orientamento della luce realizzati su una guida d’onda, mentre lo scopo della guida d’onda è solo quello di trasportare la luce agli elementi riflettenti. Secondo WO 2011/057137, la guida d’onda può essere rastremata come misura per ridurre il danno tissutale.

La configurazione del dispositivo descritta da WO 2011/057137 può essere alquanto complessa e ingombrante, in modo particolare quando deve essere previsto un numero elevato di elementi di orientamento della luce nella guida d’onda.

Pertanto, uno scopo dell’invenzione è fornire un dispositivo di distribuzione di luce multi-punto capace di superare gli inconvenienti dei dispositivi noti.

Secondo questo scopo, l’invenzione propone un dispositivo del tipo definito all’inizio, in cui detta guida d’onda comprende una regione rastremata lungo la quale sono distribuite dette finestre ottiche, e in cui ciascun finestra ottica disaccoppia un sottoinsieme specifico di modi di propagazione della luce trasportata, al quale è abbinata detta finestra ottica.

Il dispositivo di distribuzione di luce secondo l’invenzione è basato su un principio di demultiplazione modale fondato sulla selettività modale di una fibra ottica rastremata. Lo scopo della rastremazione è quello di selezionare e modificare i modi iniettati nell’estremità distale della fibra, mentre le aperture ottiche realizzate sulla regione rastremata definiscono i punti in corrispondenza dei quali sottoinsiemi di modi di propagazione possono essere disaccoppiati nell’ambiente circostante. Come conseguenza, nella presente invenzione è possibile sfruttare una singola fibra per indirizzare indipendentemente la luce a molteplici finestre ottiche, manipolando la luce principalmente per mezzo della stessa guida d’onda e non mediante elementi di orientamento della luce. Questa caratteristica è di fondamentale importanza quando sono desiderate una dimensione contenuta e una semplicità di realizzazione, come per esempio negli esperimenti e nelle applicazioni di optogenetica.

Ulteriori vantaggi del dispositivo secondo l’invenzione sono:

- indirizzabilità indipendente dalle finestre ottiche, anche se viene usata una singola fibra ottica;

- invasività minimizzata pur mantenendo il comportamento di emissione multi-punto;

- rumore fotoelettrico minimizzato quando elettrodi ed elementi di emissione luminosa sono realizzati sullo stesso stelo o su steli adiacenti (impatto ridotto dell’effetto Becquerel sui segnali ottenuti tramite il dispositivo di interfaccia neurale e accuratezza migliorata dei dati raccolti nel dispositivo di interfaccia neurale);

- minimizzazione dei requisiti di cablaggio.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi del dispositivo proposto risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata che si riferisce ai disegni allegati, forniti puramente a titolo di esempio non limitativo, in cui:

- la figura 1 è una vista schematica ed in sezione trasversale che illustra un dispositivo di distribuzione di luce multi-punto secondo l’invenzione;

- la figura 2 è una vista prospettica che illustra uno strumento optogenetico incorporante il dispositivo della figura 1;

- la figura 3 è una vista prospettica che illustra una seconda forma di realizzazione di uno strumento optogenetico incorporante il dispositivo della figura 1;

- la figura 4 mostra: (a) una vista SEM a volo d’uccello di due finestre ottiche su una rastremazione di fibra ottica. La prima e la seconda finestra sono rispettivamente distanti 300 µm (L) e 900 µm (H) dalla punta della fibra. (b, c) Micrografia SEM di finestre ottiche quadrate (pannello (b)) e circolari (pannello (c)), fresate perpendicolarmente all’asse della fibra. (d) Configurazione ottica usata per un esperimento. (e) Immagine in campo bianco di una fetta di cervello coronale di topo e della fibra ottica inserita. La fetta di cervello è stata marcata con fluoresceina. (f) Immagine di fluorescenza della regione di tessuto eccitata per θ = θ1=7°. La luce guidata viene emessa prevalentemente dal foro più vicino alla punta. (g) Immagine di fluorescenza della regione di tessuto eccitata per θ = θ2=11°. La luce guidata è emessa prevalentemente dal foro più lontano dalla punta. (h) È la controparte del pannello (d) ottenuta con un’illuminazione a campo ampio al fine di assicurare l’inserimento efficace della fibra nella fetta di cervello;

- la figura 5 mostra: (a) un’immagine di microscopia ottica di un optrodo realizzato secondo la forma di realizzazione mostrata in figura 2: la fibra ottica strutturata è posta accanto a un array lineare di elettrodi progettato per la registrazione extracellulare. Le finestre ottiche sulla fibra rastremata sono state orientate al fine di emettere luce nella regione appena al di sopra dei pad di registrazione. (b) Istogramma della frequenza dei potenziali d’azione per θ=3°. (c) Istogramma della frequenza dei potenziali d’azione per θ=8° ottenuto con il dispositivo riportato in (a) impiantato in un topo transgenico con testa vincolata; e

- le figure 6(a) e 6(b) sono viste in sezione trasversale schematiche che illustrano un sistema di distribuzione di farmaco incorporante il dispositivo della figura 1, mostrato in due posizioni funzionanti differenti.

Con riferimento alla figura 1, è mostrato un dispositivo di distribuzione di luce multi-punto secondo l’invenzione. Questo dispositivo comprende una guida d’onda 1, una sezione della quale è mostrata nella figura 1. Questa guida d’onda è una fibra ottica comprendente convenzionalmente un nucleo 2 e un mantello 3. La guida d’onda 1 si estende lungo un asse longitudinale, tra un’estremità distale (non mostrata nella figura 1), che è atta a essere accoppiata a una sorgente di luce, e un’estremità prossimale 5. La luce iniettata dalla sorgente di luce viene trasportata mediante la guida d’onda 1 lungo il suo asse longitudinale, e disaccoppiata dall’estremità prossimale 5 della guida d’onda 1. L’estremità prossimale 5 è una regione rastremata della guida d’onda 1, estendentesi tra una base di rastremazione 6 adiacente al resto della guida d’onda 1, e una punta di rastremazione 7. La regione rastremata 5 della guida d’onda è rivestita con un rivestimento riflettente. Una pluralità di finestre ottiche 10 è formata lungo la regione rastremata 5.

Il dispositivo della figura 1 può essere usato come strumento optogenetico in grado di prendere di mira selettivamente e dinamicamente regioni differenti di tessuti neuronali o un qualsiasi materiale o ambiente sensibile alla radiazione ottica. È basato sulla selettività modale di una fibra ottica micro-strutturata e rastremata, che irradia nel tessuto circostante soltanto sottoinsiemi definiti di modi di propagazione per mezzo di finestre ottiche correttamente progettate.

Un insieme determinato di modi di propagazione {s1,…,sN} viene iniettato nella fibra ottica 1 per mezzo di una sorgente di luce esterna. Questi modi si propagano fino alla regione rastremata 5 coperta con un materiale estremamente riflettente. Quando entra nella rastremazione, ciascun modo viene sottoposto a un processo di manipolazione e selezione modale per il fatto che la rastremazione non supporta più tutte i modi permessi nella fibra nucleomantello 1 rettilinea. In particolare, minore è il diametro della rastremazione, minore è il numero di modi propaganti verso la punta di rastremazione 7. Al fine di permettere un disaccoppiamento dei modi di propagazione nell’ambiente circostante, sono realizzate finestre ottiche 10 lungo la rastremazione e/o sulla sua punta. Ciascuna finestra ottica 10 comprende essenzialmente un recesso formato sulla superficie esterna della regione rastremata, e viene ottenuta rimuovendo parte del rivestimento riflettente o anche perforando parzialmente la rastremazione, in base all’applicazione. In generale, una finestra ottica può essere un qualsiasi sistema in grado di disaccoppiare alcuni dei modi guidati nell’ambiente circostante. In effetti, su o all’interno di ciascuna singola finestra possono anche essere implementate strategie ottiche già presentate in letteratura per definire i sottoinsiemi modali disaccoppiati. Ad esempio, accanto alla finestra ottica possono essere create strutture cristalline fotoniche mono, bi o tridimensionali, metamateriali nanostrutturati o antenne/risonatori plasmonici.

Una caratteristica fondamentale dell’approccio proposto è che l’i-esima finestra disaccoppia soltanto un sottoinsieme dei modi guidati Si={sm,…,sn,…,sg} al quale è abbinata, mentre la rimanente radiazione viene ancora sottoposta alla selezione modale prodotta dalla rastremazione. Il numero e il tipo di modi disaccoppiati in corrispondenza di ciascuna finestra 10, come pure l’efficienza di disaccoppiamento del sottoinsieme, dipendono da svariati parametri strutturali del dispositivo e della finestra stessa, inclusi:

- Dimensione nucleo/mantello e apertura numerica della fibra 1;

- Angolo e lunghezza della regione rastremata 5; - Forma, dimensioni laterali e profondità della finestra 10;

- Distanza delle finestre 10 dalla base 6 della rastremazione.

Ingegnerizzando questi parametri, la struttura può essere progettata al fine di ottenere il disaccoppiamento di uno specifico sottoinsieme modale prevalentemente da una finestra 10. Ciò crea un demultiplatore modale in base alla rastremazione della fibra. Come conseguenza, iniettando nella sezione nucleo-mantello della fibra 1 soltanto i sottoinsiemi modali Si, la radiazione nell’ambiente circostante sarà ottenuta prevalentemente dall’iesima finestra. Inoltre, se l’iniezione è commutata tra i sottoinsiemi Sie Sj, la radiazione passerà tra le finestre i-esima e j-esima, permettendo in questo modo la distribuzione dinamica della luce in due regioni differenti del tessuto circostante la rastremazione. La commutazione dinamica tra punti luce differenti usando una singola fibra invece di molteplici guide d’onda consente a una singola sorgente di luce di essere accoppiata al sistema, semplificando in tal modo i requisiti di iniezione. Inoltre, l’iniezione di sottoinsiemi modali definiti in corrispondenza dell’ingresso della fibra può essere ottenuta con soluzioni ottiche molto semplici, principalmente in base a considerazioni otticogeometriche. Vale la pena notare che questa strategia consente ancora l’uso di lunghezze d’onda differenti nello stesso momento per stimolare e/o inibire l’attività neuronale.

La possibilità di controllare il comportamento modale della luce disaccoppiata consente un buon controllo della direzione di radiazione, consentendo l’emissione perpendicolare e/o parallela (vale a dire l’emissione rispettivamente tramite le finestre laterali e/o la finestra della punta) rispetto all’asse della guida d’onda, secondo i volumi di cervello da indagare. Il controllo della forma e della posizione delle finestre ottiche secondo la lunghezza d’onda di lavoro può anche essere sfruttato per creare frange di interferenza.

Il dispositivo a fibra singola ed emissione multi-punto 1 può essere accoppiato a sistemi di registrazione singoli o multipli con geometrie arbitrarie; un esempio è riportato nella figura 2, che mostra un array di elettrodi di registrazione 20 supportati da uno stelo 21, e un’unità di supporto 23 che fornisce supporto al dispositivo a fibra singola 1 e allo stelo 21, e connessioni elettriche all’array di elettrodi 20. Microfili singoli o multipli, tetrodi e array microlavorati bidimensionali simili a quelli suggeriti da Wang et al. possono essere integrati con il dispositivo secondo l’invenzione. In particolare, dopo un corretto isolamento esterno del rivestimento riflettente depositato sulla rastremazione della fibra, un singolo microfilo o tetrodo può essere posto vicino a ciascuna finestra ottica e incollato alla fibra, oppure contatti elettrici costituiti da pad metallici di registrazione indipendenti 30 (uno per ciascuna finestra ottica) e percorsi metallici 31 per la connessione esterna possono essere fabbricati direttamente sulla fibra stessa (si veda per esempio la figura 3). Come ulteriore opzione, la fibra singola può essere incollata in corrispondenza della parte posteriore degli array lineari di siti di registrazione (analoghi agli array disponibili in commercio da NeuroNexus) ed è possibile fresare fori passanti nello stelo di silicio verso la fibra rastremata retroconnessa vicino ai siti di registrazione. Queste e ulteriori opzioni per strumenti optogenetici integrati multi-registrazioni e multiemissione sono possibili data la versatilità del sistema ottico suggerito. È persino possibile indirizzare ciascun sito di registrazione con un punto di emissione personalizzato. La lunghezza d’onda della radiazione, lo schema di radiazione e l’intensità luminosa possono essere sintonizzati per ottenere una stimolazione (o inibizione) precisa di un piccolo numero di neuroni vicino al sito di registrazione, riducendo contemporaneamente l’illuminazione diretta del pad metallico stesso.

È importante che le finestre ottiche possano essere ingegnerizzate al fine di ottenere un’eccitazione ottica uniforme della regione del cervello lungo la rastremazione della fibra 5. Ciò consente la stimolazione di un volume di cervello più ampio usando una singola fibra ottica e senza ricorrere a una potenza di ingresso maggiore, che diversamente può causare artefatti fotoelettrici e un riscaldamento tissutale dannoso. Inoltre, una corretta ingegnerizzazione delle proprietà di emissione di ciascuna finestra al fine di evitare l’illuminazione diretta dei siti di registrazione, insieme a requisiti di potenza di ingresso ridotti, può migliorare fortemente il rapporto segnale-arumore dell’attività elettrica registrata durante la stimolazione ottica in virtù di un ridotto rumore fotoelettrico. Ciò consente l’interrogazione di ampie reti neuronali attivando/inattivando otticamente sotto-reti specifiche composte da numeri inferiori di neuroni. Per esempio, sarebbe possibile registrare attraverso tutti gli strati della neocorteccia del cervello attivando o inattivando strati specifici.

Un ulteriore vantaggio dell’invenzione per la stimolazione multi-sito risiede nella sua compattezza, che dovrebbe ridurre al minimo la lesione neuronale durante l’inserimento. Infatti la fibra rastremata viene progettata per essere acuminata e liscia anche al fine di evitare un danno tissutale importante, ma anche sufficientemente rigida e rettilinea per un corretto inserimento nel cervello. Inoltre, l’integrazione della fibra ottica rastremata con il sistema per la registrazione elettrica implica che le sorgenti di luce e gli elettrodi di registrazione siano uniti in una relazione fissa; pertanto, le relative posizioni di eccitazione e i punti di registrazione vengono configurati in anticipo e non devono essere dedotti in una successiva analisi.

Un prototipo di un demodulatore modale ad emissione multi-punto basato su una fibra rastremata è stato sviluppato e caratterizzato in laboratorio. Una fibra ottica multi-modo (diametro del nucleo 50 µm, diametro del mantello 125 µm, indice di rifrazione del nucleo n1=1,464, indice di rifrazione del mantello n2=1,448, apertura numerica N.A.= 0,22, angolo di rastremazione circa 5,7°, spessore del rivestimento riflettente di oro 300 nm, apertura sul diametro di punta di rastremazione 200 nm (si vedano le micrografie SEM nella figura 4(a)), è stata acquistata da Nanonics. Per realizzare le finestre ottiche, la fibra ottica è stata inserita in un sistema combinato FIB/SEM (Fascio ionico focalizzato/microscopio elettronico a scansione), FEI® Helios ™ NanoLab™ 600i DualBeam™, attrezzato con la colonna FIB Tomahawk. Per ciascuna finestra un’area 20 µm x 20 µm è stata sottoposta a scansione mediante fascio ionico Ga<+>perpendicolarmente all’asse della fibra (potenziale di accelerazione 30 keV, corrente di sonda 9,3 nA, tempo di residenza 1 ms, tempo di processo 14 minuti), ottenendo una profondità fresata di circa 6 µm.

Le due finestre ottiche realizzate per questa dimostrazione di concetto, di seguito indicate come L e H, sono state rispettivamente patternate a una distanza di 300 µm e 900 µm dalla punta di rastremazione (si veda la figura 4(a)). Sebbene la seguente disamina sia focalizzata su finestre quadrate (figura 4(b)), è altresì possibile realizzare altre forme per mezzo della fresatura FIB (si veda, per esempio, l’apertura a forma circolare mostrata nella figura 4(c)). Come menzionato sopra, la rastremazione della fibra effettua una selezione dei modi di propagazione ed evanescenti: maggiore è l’ordine del modo, minore sarà la sua distanza di propagazione nella rastremazione. Infatti, se il diametro della punta è sufficientemente piccolo, solo il modo fondamentale raggiunge l’estremità della rastremazione, mentre tutti gli altri modi diventano evanescenti. Come conseguenza, modi di ordine elevato si propagano su sezioni di rastremazione molto lontane dalla punta, mentre a modi di ordine inferiore è consentito di raggiungere sezioni più vicine alla punta rastremata.

I modi iniettati nella sezione nucleo-mantello della fibra sono stati controllati per mezzo di una soluzione ottica semplice, basata sulla regolazione dell’angolo di accoppiamento di ingresso θ in corrispondenza dell’estremità distale della fibra, come mostrato nella figura 4(d). Nella sua forma più semplice, la configurazione ottica è composta da uno specchio fisso (M1) e da uno specchio scorrevole (M2), la cui posizione definisce l’angolo di accoppiamento di ingresso θ (figura 4(d)). Quando lo specchio è nella posizione Home, il fascio laser si sposta perpendicolarmente attraverso il centro di una lente convergente piano-convessa L1, che focalizza la radiazione ottica coassialmente rispetto all’asse della fibra ottica. Se lo specchio è invece mosso lungo l’asse ottico, la focalizzazione avviene con un angolo θ differente.

Al fine di verificare l’efficacia del dispositivo suggerito nella distribuzione dinamica della luce in regioni di cervello definite, la rastremazione strutturata è stata inserita in fette coronali di cervello di topo con spessore di 300µm, come mostrato nell’immagine in campo luminoso visualizzata nella figura 4(e). Le fette di cervello sono state preventivamente marcate con molecole di fluoresceina (lunghezza d’onda di emissione circa 530 nm) e un laser di eccitazione (lunghezza d’onda ~473nm) è stato accoppiato nella fibra a vari θ.

La fibra ottica della configurazione sperimentale supporta circa 2163 modalità, ciascuna delle quali ha un vettore di propagazione kj, in cui j è l’ordine del modo. La propagazione del j-esimo modo nella guida d’onda è indotta mediante l’angolo d’accoppiamento θ all’ingresso. L’efficienza con la quale ciascun modo viene eccitato nella fibra è proporzionale all’integrale di sovrapposizione tra la funzione modale j-esima e la radiazione di ingresso. Modificando θ, viene modificato il j-esimo integrale di sovrapposizione, ottenendo in tal modo una redistribuzione di intensità luminosa tra i modi guidati [Khijwania, S. K., et al.. Fiber and Integrated Optics 29, 62-75 (2009)], come segue. Si assuma il vettore di propagazione come la somma di un componente assiale e trasversale, vale a dire kj= kjT+ kjA. In generale kjT≤ k(j+1)T, e maggiore è l’ordine del modo, maggiore è il rapporto kjT/kjA. Tutti i modi eccitati si propagano fino alla sezione rastremata, in corrispondenza della quale il loro comportamento viene fortemente modificato, in termini sia di parte reale sia di parte immaginaria della costante di propagazione. Infatti, la rastremazione non supporta più tutti i modi eccitati nella fibra ottica: maggiore è l’ordine del modo, più breve sarà la sua distanza di propagazione nella rastremazione. Inoltre, kjTè in funzione della posizione lungo la rastremazione, e aumenta mano a mano che il diametro della guida d’onda diminuisce.

Quando θ=θ1=7°, i modi eccitati raggiungono la sezione rastremata in corrispondenza della quale è stata realizzata la finestra L con un kjTsuperiore a quello della finestra H. Come mostrato nella figura 4(f), al sottoinsieme modale iniettato viene consentito di disaccoppiarsi nell’ambiente circostante dall’apertura L, mentre si osserva una perdita di luce trascurabile da H. Con θ crescente, il numero di modi che raggiungono L diminuisce, poiché vengono preferenzialmente eccitati i modi di ordine superiore. Tuttavia, i modi di ordine superiore raggiungono un valore elevato di kjTper distanze di propagazione più brevi nella rastremazione, in modo tale che la maggior parte della luce sia disaccoppiata in corrispondenza della finestra H, come dimostrato dall’immagine riportata nella figura 4(g).

Test in vivo e impianti sono stati effettuati collocando un array di elettrodi per la registrazione extracellulare del segnale neuronale accanto a una rastremazione strutturata, come mostrato nella figura 5(a). In questo caso sette finestre ottiche sono state aperte lungo la rastremazione. Il dispositivo così realizzato è stato esaminato in vivo nel cervello di topi transgenici vigili con testa vincolata, inserendo la fibra attraverso una craniotomia con ampiezza di alcuni millimetri. I risultati dei test in vivo vengono mostrati nella figura 5(b,c): per θ=3° soltanto gli elettrodi posti vicino alla punta della fibra (Ch1 e Ch2) hanno rilevato un segnale neuronale fotostimolato, mentre a θ=8° l’attività neuronale fotostimolata si allontana dalla punta rastremata (sull’ elettrodo Ch3).

È stata anche analizzata l’emissione multilunghezza d’onda usando due differenti strategie. Nella prima strategia, laser a differenti lunghezze d’onda sono stati accoppiati all’estremità distale della fibra con differenti angoli di accoppiamento in ingresso, permettendo così il disaccoppiamento di una specifica lunghezza d’onda in corrispondenza di ciascuna finestra ottica. Nel secondo approccio, un nanocomposito di PDMS/nanoparticelle colloidali emittenti nel rosso (nanoparticelle CdSe/CdS dotin-rod che emettono a λ = 620nm) è stato preparato disperdendo nanoparticelle colloidali in monomero PDMS a una concentrazione dell’8% in peso. La mescola in fase liquida è stata colata per gocciolamento su tre delle finestre ottiche e lasciata polimerizzare all’aria a temperatura ambiente per 24 ore. Un laser ad emissione blu è stato accoppiato alla fibra e le proprietà di emissione sono state esaminate mediante imaging confocale. In particolare, variando la frazione di luce blu incidente è possibile regolare le intensità relative della radiazione blu e rossa uscente dalle finestre schermate. Il rapporto di intensità può anche essere modificato variando la frazione in peso delle nanoparticelle fluorescenti disperse.

Anche se il dispositivo proposto è stato concepito dapprima come utensile per la modulazione optogenetica e ottica dello stato neurale nei campi della ricerca e medico, può trovare ulteriore applicazione nella ricerca fisica fondamentale e applicata che sfrutta l’emissione di luce localizzata (pinze ottiche, microscopia ottica in campo vicino, eccetera), dal momento che spot ad emissione multipunto potrebbero essere utilizzati per allargare le aree ispezionate o per aumentare il grado di parallelizzazione della loro attività. Applicazioni possono anche essere concepite nella chirurgia assistita da laser.

Un esempio di applicazione del dispositivo dell’invenzione in una tecnica di somministrazione di farmaci è mostrato nelle figure 6(a) e 6(b).

È noto che i farmaci per la terapia di malattie croniche o gravi possono avere effetti collaterali pericolosi. Una soluzione convenzionale a questo problema è quella di proteggere il corpo umano da interazioni pericolose con i farmaci racchiudendoli all’interno di micro- o nano-capsule, fino al momento in cui possono essere rilasciati solo nel tessuto che deve essere sottoposto alla terapia. Realizzando composti a base di farmaci incapsulati in polimeri o altri materiali che si degradano quando assorbono la luce, è stato dimostrato che è possibile innescare la distribuzione del farmaco mediante una radiazione ottica a lunghezze d’onda sia nel visibile sia infrarosse. A questo proposito, il dispositivo ad emissione multi-punto proposto può essere usato come veicolo di farmaci otticamente somministrabili al fine di raggiungere tessuti biologici specifici, come le regioni cerebrali profonde e/o di accoppiarsi a strati specifici della corteccia cerebrale. Come già discusso, il dispositivo è costituito da una serie di finestre ottiche realizzate sulla superficie esterna di una fibra ottica rastremata. La dimensione e la forma delle aperture ottiche possono essere ingegnerizzate al fine di facilitare il loro riempimento con uno o più composti medicali D1, D2, D3, agendo in tal modo da serbatoi di farmaco (si veda la rappresentazione schematica nella figura 3(a)). In virtù del principio di demultiplazione modale, la luce accoppiata nella fibra può passare attraverso una sola (o alcune) delle finestre ottiche riempite, permettendo in tal modo la distribuzione dei farmaci soltanto in una (o in alcune) regione/i del tessuto circostante, come visualizzato schematicamente nella figura 3(b). Vale la pena menzionare che ciascuna finestra può essere riempita con un farmaco differente e che i sottoinsiemi modali iniettati in corrispondenza dell’estremità distale della fibra possono essere scelti al fine di distribuire in modo personalizzato l’intensità luminosa tra le aperture. Ciò consente di mettere a punto la dose di distribuzione per ciascuno dei farmaci distribuiti, fornendo in tal modo la possibilità di progettare terapie complesse a base di farmaci differenti rilasciati a tassi differenti. Inoltre, poiché è possibile realizzare composti che si degradano a lunghezze d’onda differenti, ciascuna finestra può essere riempita con due o più farmaci la cui distribuzione può essere controllata modificando la lunghezza d’onda della luce iniettata in corrispondenza dell’estremità distale della fibra.

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo di distribuzione di luce multipunto, comprendente una guida d’onda (1) che trasporta luce lungo un asse longitudinale e include una pluralità di finestre ottiche (10), per mezzo delle quali la luce trasportata è disaccoppiata dalla guida d’onda; caratterizzato dal fatto che detta guida d’onda comprende una regione rastremata (5) lungo la quale sono distribuite dette finestre ottiche, in cui ciascuna finestra ottica disaccoppia un sottoinsieme specifico di modi di propagazione della luce trasportata, al quale è abbinata detta finestra ottica.
2. 2. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, in cui detta pluralità di finestre ottiche include almeno una finestra ottica formata su una superficie laterale della regione rastremata della guida d’onda.
3. 3. Dispositivo secondo la rivendicazione 2, in cui detta pluralità di finestre ottiche include inoltre una finestra ottica formata su una punta (7) della regione rastremata della guida d’onda.
4. 4. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta regione rastremata ha un angolo di rastremazione fra 1° e 10°, e preferibilmente fra 3° e 6°.
5. 5. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui almeno una di dette finestre ottiche è configurata come un serbatoio per contenere un composto medicale (D1, D2, D3), detto composto medicale essendo otticamente somministrabile per mezzo della luce che è disaccoppiata dalla finestra ottica.
6. 6. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta guida d’onda è una singola fibra ottica.
7. 7. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, detto dispositivo essendo previsto per illuminare un materiale o ambiente sensibile alla radiazione ottica, ed essendo associato ad un array di elettrodi (20; 30, 31) accoppiato alla guida d’onda (1) per registrare segnali elettrici derivanti dal materiale o ambiente illuminato.
8. 8. Dispositivo secondo la rivendicazione 7, in cui detto array di elettrodi è disposto su una superficie laterale di detta regione rastremata.
9. 9. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto dispositivo è uno strumento di interfaccia neuronale impiantabile in un tessuto neuronale.
10. 10. Dispositivo secondo una qualsiasi delle riven dicazioni 1-8, in cui detto dispositivo è un dispositivo optogenetico impiantabile in un tessuto o sistema biologico sensibile alla luce.
11. 11. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, in cui detto dispositivo è un dispositivo per endoscopia o chirurgia laser.