DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Microscopia a deplezione mediante emissione stimolata (STED), con gating temporale del fascio di eccitazione e rilevamento sincrono dell’emissione di fluorescenza"
Di: FONDAZIONE ISTITUTO ITALIANO DI TECNOLOGIA, nazionalità italiana, via Morego 30, 16163 GENOVA Inventori designati: Giuseppe VICIDOMINI, Benjamin HARKE, Alberto DIASPRO
Depositata il: 13 Agosto 2013
* ;;DESCRIZIONE ;La presente invenzione riguarda le tecniche di imaging, e più specificamente le tecniche di microscopia a super risoluzione ed alta velocità in grado di risolvere dettagli al di sotto del limite di diffrazione di Abbe. ;Fra le tecniche finora sviluppate, la microscopia a deplezione mediante emissione stimolata (STED) permette l’imaging delle strutture di un campione, che sono marcate con sonde fluorescenti, con una risoluzione spaziale al disotto del limite di diffrazione. ;In un microscopio STED il fascio di eccitazione è spazialmente sovrapposto ad un secondo fascio di diseccitazione (chiamato anche fascio STED) in grado di diseccitare, mediante emissione stimolata, i marcatori fluorescenti precedentemente eccitati dal fascio di eccitazione. Poiché il fascio STED presenta almeno un punto di intensità zero (una configurazione diffusa utilizza un fascio STED con sezione a ciambella con un punto di intensità zero al centro), solo i marcatori fluorescenti in prossimità dei punti di intensità zero possono effettivamente emettere in fluorescenza (cioè emettere spontaneamente) quando ritornano allo stato fondamentale. ;Aumentando l’intensità del fascio di diseccitazione, la probabilità di diseccitare la specie fluorescente mediante emissione stimolata aumenta, e diminuisce il volume dal quale le specie fluorescenti emettono, raggiungendo dimensioni al disotto del limite di diffrazione. Muovendo i due fasci coallineati e registrando la luce fluorescente emessa spontaneamente, le strutture di interesse marcate con le specie fluorescenti vengono rilevate con una risoluzione spaziale che supera il limite di diffrazione. ;È importante notare che la probabilità di diseccitare una specie fluorescente mediante emissione stimolata non dipende solamente dall’intensità del fascio STED ma anche dalla sezione d’urto del processo di emissione stimolata della sonda fluorescente alla lunghezza d’onda del fascio STED: quanto più è grande la sezione d’urto di emissione stimolata, tanto più è maggiore la probabilità di diseccitare una specie fluorescente. Pertanto, un incremento della sezione d’urto di emissione stimolata si traduce direttamente in una riduzione dell’intensità del fascio STED richiesta per raggiungere una data risoluzione spaziale, riducendo quindi potenziali effetti di fotodanneggiamento del campione. ;Nella microscopia STED la lunghezza d’onda del fascio STED è normalmente situata verso la coda rossa del massimo di emissione delle specie fluorescenti. Lo spostamento della lunghezza d’onda del fascio STED più vicino al massimo di emissione della specie fluorescente aumenta favorevolmente la sezione d’urto di emissione stimolata. Tuttavia, a causa della non trascurabile sovrapposizione fra gli spettri di emissione e di eccitazione tale spostamento aumenta anche la probabilità di eccitare, direttamente con il fascio STED, le specie fluorescenti che sono rimaste nello stato fondamentale, provocando una indesiderata fluorescenza di fondo. Benché il volume fluorescente esplorato dal fascio di eccitazione diminuisca, potenzialmente migliorando, di conseguenza, la risoluzione spaziale, il fondo fluorescente generato dal fascio STED aumenta l’effettivo volume fluorescente complessivo, compromettendo seriamente il contrasto d’immagine. ;Fortunatamente, tale fondo indesiderato di fluorescenza non snatura comunque il contenuto in frequenze spaziali dell’immagine, ed in particolare non altera la risoluzione effettiva dell’immagine. Difatti, l’immagine grezza consiste di un’immagine standard super-risolta (sotto il limite di diffrazione) generata dal fascio di eccitazione, più un’immagine di fondo generata dal fascio STED. Pertanto, dati un sufficiente rapporto segnale/rumore ed un’affidabile registrazione separata dell’immagine di fondo, l’immagine di fondo superrisolta può essere ricuperata semplicemente sottraendo dall’immagine grezza l’immagine di fondo registrata. ;Si noti che, per una data lunghezza d’onda STED, la possibilità di sottrarre il segnale di fondo indesiderato (generato dal fascio STED) aumenta la scelta delle possibili specie fluorescenti che possono essere usate per l’imaging al disotto del limite di diffrazione. Come sopra indicato, data una certa lunghezza d’onda del fascio STED, convenzionalmente solo le specie fluorescenti con una trascurabile eccitazione alla lunghezza d’onda del fascio STED, e pertanto un fondo trascurabile, possono essere utilizzate con successo per l’imaging STED. Pertanto, fornire un metodo che permetta di rimuovere tale fondo permette di rilassare i vincoli sullo spettro di eccitazione per le specie fluorescenti, rendendo tale tecnica molto importante per l’imaging multicolore (più specie con diverse proprietà spettrali che marcano ciascuna una diversa struttura all’interno del campione). ;In vista di quanto sopra, la presente invenzione riguarda in particolare un metodo di microscopia ottica mediante scansione di un campione contenente una specie eccitabile, detto metodo comprendendo, per ciascun prestabilito tratto di scansione: ;- dirigere un primo fascio luminoso avente una prima lunghezza d’onda principale λ1, ed un secondo fascio luminoso avente una seconda lunghezza d’onda principale λ2, su rispettive aree parzialmente sovrapposte di detto campione, in cui detto primo fascio luminoso è previsto per eccitare elementi della specie eccitabile in uno stato di eccitazione, e detto secondo fascio luminoso è previsto per ridurre il numero di elementi eccitati in detto stato di eccitazione; e ;- rilevare un segnale ottico proveniente dal campione, detto segnale ottico comprendendo una componente principale emessa dagli elementi eccitati da detto primo fascio luminoso, ed una componente spuria, emessa da altri elementi di detta specie eccitabile, indesideratamente eccitati da detto secondo fascio luminoso, in cui detto segnale ottico viene rilevato durante una prima ed una seconda finestra temporale consecutive, aventi rispettive durate Topene Tclosee definenti un periodo T = Topen+ Tclose, detta prima finestra temporale essendo prevista per rilevare il segnale ottico per un periodo di tempo durante il quale la componente principale e la componente spuria sono entrambe presenti, e detta seconda finestra temporale essendo prevista per rilevare il segnale ottico per un periodo di tempo durante il quale la componente principale tende od è pari a zero, la componente spuria restando presente; ;detto metodo comprendendo inoltre: ;- elaborare il segnale ottico rilevato durante detta seconda finestra temporale per estrarre una stima di detta componente spuria; e ;- sottrarre detta stima della componente spuria dal segnale ottico rilevato durante detta prima finestra temporale. ;Un metodo di questo genere, descritto in Vicidomini G et al (2012), “STED with wavelengths closer to the emission maximum”, Opt. Express 20(5):5225-5236, utilizza la naturale interruzione di ogni laser pulsato per definire le finestre temporali suddette (fasi “open” e “close”). In particolare, l’intervallo di tempo fra due impulsi di eccitazione è suddiviso in due finestre temporali di pari lunghezza. Il fascio STED deve operare in onda continua (CW) o con una frequenza doppia della frequenza degli impulsi di eccitazione. Inoltre, la frequenza del fascio di eccitazione deve essere accuratamente scelta sulla base del tempo di vita media τ dello stato eccitato delle specie fluorescenti; in particolare, l’intervallo di impulso deve essere sufficientemente lungo da fornire fasi “open” e “close” efficaci (la maggior parte delle sonde fluorescenti eccitate in una certa fase devono diseccitarsi durante la stessa fase), ma un intervallo di impulso più lungo riduce il ciclo di lavoro utile della specie fluorescente ed aumenta solo il rumore. Nell’ambito di questo scenario, la frequenza degli impulsi di eccitazione deve pertanto variare a seconda del tempo di vita media della specie fluorescente, rendendo il metodo suddetto convoluto e poco flessibile. ;Inoltre, poiché il tempo di vita media τ dello stato eccitato delle specie fluorescenti nella maggioranza dei casi è di pochi nanosecondi, nel metodo noto sopra indicato il ciclo di “open” e “close” deve avvenire in poche decine di nanosecondi. Tuttavia, molti rivelatori hanno un tempo morto (cioè il tempo dopo la registrazione di un fotone durante il quale il rivelatore non è in grado di registrare un altro fotone) dell’ordine delle decine di nanosecondi. Pertanto, quando un fotone viene catturato durante la fase “open” con ogni probabilità un potenziale fotone che raggiunge il rivelatore nella successiva fase “close” non viene registrato, e quindi il fondo da sottrarre risulta sottostimato. Il tempo morto complessivo del sistema di rilevamento aumenta ancora se si utilizza una scheda di conteggio di singoli fotoni temporalmente correlati (TCSPC). Inoltre, il metodo in questione non è compatibile con una microscopia STED basata su un fascio di eccitazione in onda continua. ;Un altro metodo noto, descritto in Ronzitti E et al, (2013) “Frequency dependent detection in a STED microscope using modulated excitation light”, Opt. Express 21(1):210-219, usa un generatore di impulsi per modulare il fascio di eccitazione ad una frequenza f ed un amplificatore lock-in (sin cronizzato con il generatore di impulsi) per selettivamente rilevare il segnale di fluorescenza che segue la stessa frequenza f. Poiché solo il segnale di fluorescenza generato dal fascio di eccitazione segue la stessa frequenza, il segnale di fluorescenza generato dal fascio STED viene eliminato con il filtraggio. Il segnale ottenuto dall’amplificatore lock-in viene successivamente raccolto da una scheda I/O per formare l’immagine finale. L’amplificatore lock-in rileva la differenza media fra il segnale durante la fase “open” della modulazione ed il fondo durante la fase “close” della modulazione. Poiché il generatore di impulsi e la scheda I/O che controllano la scansione sono indipendenti, il processo di scansione e la modulazione devono essere sincronizzati manualmente, rendendo poco versatile il metodo sopra descritto. ;Inoltre, il lock-in assume solamente fasi “open” e “close” aventi la stessa durata, e pertanto non è possibile massimizzare la raccolta del segnale desiderato in caso di fondo debole. Infine, l’amplificatore lock-in fornisce solo il segnale filtrato dal fondo, ovvero non è possibile accedere separatamente ai segnali “open” e “close”, non permettendo di conseguenza l’utilizzo di tecniche di post-trattamento delle immagini. ;La pubblicazione di Vicidomini G et al, (2013) “Gated CW-STED microscopy: A versatile tool for biological nanometer scale investigation”, Methods 66(2):124-130, riguarda la microscopia gated CW-STED. ;La pubblicazione di Vicidomini G et al, (2011) “Sharper low-power STED nanoscopy by time gating”, Nature Methods 8(7): 571-573, riguarda la nanoscopia STED attuata implementando un’eccitazione a laser pulsato e STED con laser a onda continua insieme con una rivelazione “time-gated”. ;La pubblicazione di Lesoine M et al, (2012) “Supercontinuum Stimulated Emission Depletion Fluorescence Lifetime Imaging”, The Journal of Phys. Chem. B 116(27): 7821-7826, riguarda l’imaging con fluorescenza STED. ;La pubblicazione di Vicidomini G et al, (2013) “STED Nanoscopy with Time-Gated Detection: Theroretical and Experimental Aspects”, Plos One 8(1): e54421-1, riguarda la nanoscopia STED con rivelazione “time-gated”. ;Uno scopo della presente invenzione è quello di rendere disponibile un metodo di microscopia ottica in grado di ovviare almeno in parte agli inconvenienti della tecnica nota suddetta. ;Questo ed altri scopi sono raggiunti secondo l’invenzione da un metodo di microscopia ottica del tipo sopra definito, in cui detto primo fascio luminoso è attivo durante la prima finestra temporale Topened è interrotto durante la seconda finestra temporale Tclose, dette finestre temporali e detto periodo T essendo tali che Topen» τ, Tclose» τ e T » τ, ove τ è il tempo di vita media di detto stato di eccitazione. ;Grazie a tale idea di soluzione si garantisce che gli elementi della specie chimica che vengono eccitati in un intervallo temporale emettano nello stesso intervallo temporale; per di più, i rischi legati a tempi morti dell’apparecchiatura di rilevamento sono notevolmente ridotti. Inoltre, il metodo secondo la presente invenzione elimina od almeno riduce i vincoli imposti alle apparecchiature utilizzabili, ed è pertanto applicabile in tutte le configurazioni di microscopia STED, sia in onda pulsata che in onda continua. ;Inoltre, il metodo secondo la presente invenzione permette di poter utilizzare finestre temporali “open” e “close” di durata differente, e permette di accedere separatamente ai dati misurati durante tali fasi, consentendo quindi un trattamento dei dati che può essere adattato alle necessità a seconda delle condizioni sperimentali affrontate. ;Benché la presente invenzione sia stata concepita specificamente nel campo della microscopia STED, è chiaro che essa può trovare applicazione anche in altre tecniche di microscopia in superrisoluzione, complessivamente denominate con l’acronimo RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions). ;Ulteriori caratteristiche e vantaggi del metodo secondo l’invenzione diverranno più chiari con la seguente descrizione dettagliata di una forma di attuazione del trovato, fatta con riferimento ai disegni allegati, forniti a titolo puramente illustrativo e non limitativo, in cui: ;- le figure 1A ed 1B rappresentano diagrammi di temporizzazione della forma d’onda dei fasci di eccitazione e STED in un metodo secondo la presente invenzione; ;- la figura 2 è una rappresentazione schematica di un preferito microscopio STED equipaggiato per attuare il metodo secondo la presente invenzione; e - la figura 3 mostra un esempio della tecnica proposta su un campione di calibrazione (sferette fluorescenti di un diametro di 40 nm, notevolmente al di sotto del limite di risoluzione). Il pannello mostra il confronto tra tecnica classica, anche detta confocale (pannelli inferiori), cioè fascio di STED non attivo e la tecnica di superrisoluzione STED (pannelli superiore). Da sinistra a destra. (i) Segnale registrato nella fase “open” in cui fascio di eccitazione è attivo attivo. (ii) Segnale registrato nella fase “close” in cui il fascio di eccitazione viene disattivato, mentre il fascio di STED rimane attivo (notare che lo spegnimento e l’accensione del laser di eccitazione avviene per ogni pixel). (iii) Somma dei segnali registrati nelle due fasi, questo per mimare il risultato che si avrebbe senza la registrazione differenziata delle due fasi, cioè il pannello superiore rappresenta l’immagine STED grezza a basso contrasto. (iv) Sottrazione dei segnali per recuperare il contrasto dell’immagine. Quindi l’ultimo pannello superiore rappresenta il risultato della tecnica proposta. ;Il metodo di microscopia ottica secondo la presente invenzione prevede convenzionalmente la scansione di un campione contenente una specie eccitabile, tipicamente una specie che emette in fluorescenza quando passa dallo stato eccitato allo stato fondamentale. ;Per ciascun prestabilito tratto di scansione, il metodo prevede di dirigere un primo fascio luminoso (tipicamente un fascio di eccitazione) avente una prima lunghezza d’onda principale λ1, ed un secondo fascio luminoso (tipicamente un fascio di diseccitazione, in particolare un fascio di deplezione STED) avente una seconda lunghezza d’onda principale λ2tale che λ2≥ λ1, su rispettive aree parzialmente sovrapposte del campione. Il primo fascio luminoso è previsto per eccitare elementi della specie eccitabile in uno stato di eccitazione, ed il secondo fascio luminoso è previsto per ridurre il numero di elementi eccitati che si trovano nello stato di eccitazione. ;Nella descrizione che segue si assume per semplicità che il prestabilito tratto di scansione coincida con un pixel di scansione. Tuttavia, tale tratto di scansione può comprendere più pixel di scansione consecutivi, in particolare un’intera linea di scansione. L’invenzione pertanto contempla anche il caso in cui i cicli di illuminazione e rilevamento siano associati ad un tratto di scansione più lungo di un pixel, ed in particolare pari ad una linea di scansione (si veda nel seguito). ;Il metodo prevede quindi di rilevare un segnale ottico proveniente dal campione; tale segnale ottico comprende una componente principale emessa dagli elementi eccitati dal primo fascio luminoso, ed una componente spuria (fondo), emessa da altri elementi della specie chimica eccitabile, indesideratamente eccitati dal secondo fascio luminoso. ;A tal proposito, il metodo secondo la presente invenzione sfrutta uno schema di rilevamento sincrono per stimare in modo fedele e successivamente sottrarre il fondo (di fluorescenza) indesiderato generato dall’eccitazione diretta della specie fluorescente con il secondo fascio luminoso (fascio STED). ;È importante notare che nel contesto dell’imaging il rilevamento sincrono è effettuato pixel per pixel (con i vantaggi che verranno discussi nel seguito). Con riferimento alla figura 1, lo schema di rilevamento sincrono richiede una periodica interruzione del fascio di eccitazione, ovvero il fascio di eccitazione è attivo per un tempo Topen(finestra temporale o fase “open”) ed interrotto per un tempo Tclose(finestra temporale o fase “close”); pertanto f = 1/(Topen+ Tclose) e T = Topen+ Tcloserappresentano rispettivamente la frequenza ed il periodo del segnale ad onda quadra utilizzato per interrompere periodicamente il fascio di eccitazione. L’interruzione periodica del fascio di eccitazione può essere ottenuta utilizzando le caratteristiche di modulazione della sorgente laser che genera il fascio luminoso, o dispositivi esterni quali modulatori acusto-ottici (AOM), otturatori meccanici veloci, modulatori elettro-ottici (EOM) o filtri sintonizzabili acusto-ottici (AOTF). ;Il segnale ottico proveniente dal campione viene quindi rilevato, in modo sincrono con la temporizzazione del fascio di eccitazione, durante le finestre temporali “open” e “close” consecutive; la prima finestra temporale “open” è prevista per rilevare il segnale ottico per un periodo di tempo durante il quale la componente principale e la componente spuria del segnale ottico sono entrambe presenti, mentre la seconda finestra temporale “close” è prevista per rilevare il segnale ottico per un periodo di tempo durante il quale la componente principale tende od è pari a zero, la componente spuria restando presente. ;Nella stima del fondo di fluorescenza devono essere seguiti alcuni vincoli: ;(i) il tempo di permanenza Tpsu ciascun pixel di scansione deve essere un multiplo del periodo T, cioè Tp= aT con a � [1, 2, …, N]; ;(ii) il periodo T deve essere molto più lungo del tempo di vita media τ dello stato di eccitazione della specie chimica eccitabile, affinché gli elementi della specie chimica eccitati in un intervallo temporale (fase) emettano nello stesso intervallo temporale. In particolare, T deve essere di almeno due ordini di grandezza più grande di τ, ovvero tale che (T/τ) ≥ 10<2>. Tale caratteristica è facilmente ottenibile poiché normalmente Tp, che può essere sostanzialmente dello stesso ordine di grandezza di T, è di tre (o più) ordini di grandezza più grande di τ; ;(iii)la fase “close” deve essere di durata più breve od uguale a quella della fase “open”, ma dello stesso ordine di grandezza, 1 ≤ (Topen/Tclose) ≤ 10. Più è breve la fase “close” (rispetto alla fase “open”), peggiore è la stima del fondo fluorescente. Una fase “close” più lunga può essere utilizzata per massimizzare la raccolta del segnale desiderato per un tempo dato e quindi velocizzare l’acquisizione (ovvero ridurre il tempo di permanenza sul pixel). ;Lo schema di rilevamento sincrono usa due differenti contatori ed un singolo rivelatore. Entrambi i contatori usano lo stesso rivelatore come sorgente di segnale. Il rivelatore può essere analogico (convenzionalmente un tubo fotomoltiplicatore (PMT)) o digitale (convenzionalmente un fotodiodo a valanga (APD)). In una realizzazione digitale, basata sul cosiddetto “gated photon counting”, il primo contatore conta gli impulsi APD (fotoni) durante la fase “open” e pertanto misura il segnale più il fondo. Il secondo contatore conta gli impulsi APD (fotoni) durante la fase “close” e quindi misura solo (o quasi solo) il fondo. La differenza fra i conteggi copendella fase “open” ed i conteggi cclosedella fase “close” (pesati con un fattore che tiene conto della differenza di tempo delle due fasi) è il segnale recuperato s = copen– (Topen/Tclose)cclose. Si noti che nell’esempio qui descritto il rilevamento sincrono utilizza la sottrazione per recuperare il segnale s, ovvero l’approccio più naturale e rapido. Tuttavia, dati i valori copene cclosepossono essere progettati approcci differenti e più robusti (si veda nel seguito). Concettualmente il caso analogico, ovvero la cosiddetta “gated integration”, è identico al gated photon counting tranne per il fatto che vengono contati solo gli impulsi PMT che superano un certo livello di discriminazione di soglia. Nel caso di molti cicli, cioè a > 1, i dati vengono semplicemente accumulati prima di spostarsi al pixel successivo. ;In principio la presente invenzione può essere applicata a qualunque microscopio STED esistente, indipendentemente dal tipo di sorgente di eccitazione e sorgente STED. In caso di laser pulsati la frequenza di interruzione del fascio di eccitazione deve essere scelta in modo da effettivamente creare fasi “open” e “close”, e pertanto deve essere scelta tenendo conto dell’intervallo di impulso del fascio di eccitazione; in particolare, deve essere scelta in modo da essere molto più piccola della frequenza di impulso del fascio di eccitazione. ;Lo schema pixel per pixel aiuta a stimare un valore reale per il fondo, poiché minimizza molte fonti indesiderate di fluttuazione di segnale, quali il photobleaching della specie chimica fluorescente od il drifting del campione. Analogamente, la scelta della frequenza f per l’interruzione del fascio di eccitazione rappresenta un parametro importante per minimizzare la sorgente di fluttuazione di segnale fra le fasi “open” e “close”. Come sopra indicato, la scelta di tale frequenza è limitata dal tempo di vita media della specie chimica fluorescente (limite superiore) e dal tempo di permanenza sul pixel (limite inferiore). Tuttavia, come regola generale una frequenza elevata (ma, comunque, tale da avere un periodo T più grande di τ) evita differenze fra il fondo misurato indipendentemente (fase “close”) ed il contributo del fondo nel segnale “open” (a meno del rumore da conteggi). Usando una frequenza elevata le fasi “open” e “close” sono misurate virtualmente contemporaneamente. L’interruzione ad alta frequenza del fascio di eccitazione cancella cioè molte delle indesiderate fluttuazioni di segnale dovute ad instabilità in uscita del laser, bleaching, drifting ed altri fattori. ;Come di consueto, l’efficienza del sistema di rilevamento sincrono è fondamentalmente limitata dal rapporto segnale/rumore (SNR). Il metodo secondo l’invenzione ottiene il numero di fotoni fluorescenti che rappresentano il segnale, Ndes, sottraendo il numero di fotoni fluorescenti che rappresentano il fondo, Nback, (raccolti durante la fase “close”) dal numero totale di fotoni fluorescenti (raccolti durante la fase “open”). ;Pertanto, il segnale fluorescente desiderato può essere recuperato se Ndes> √(Ndes+ 2Nback) o, equivalentemente, se il SNR = Ndes/√(Ndes+ 2Nback) del segnale sottratto è > 1. Si noti che tale relazione tiene conto solo del rumore di conteggio dei fotoni, assumendo che tutte le altre sorgenti di rumore siano escluse dall’interruzione ad alta frequenza del fascio di eccitazione (sotto questo aspetto il rilevamento sincrono è equivalente a qualsiasi schema di rilevamento lock-in). Tuttavia, in caso di fasi non uguali, cioè Topen/Tclose> 1, si diminuisce la precisione nella stima di Nback, e quindi il SNR effettivo può peggiorare ulteriormente. Per questo motivo è importante utilizzare fasi di durata differente solo nel caso di un fondo fluorescente Nbackdebole (rispetto al segnale di fluorescenza Ndesdesiderato). ;Per implementare il metodo sopra proposto possono essere utilizzati differenti dispositivi e strategie. L’implementazione più immediata e versatile utilizza solamente una scheda di input/output (I/O) che fornisce tutte le funzioni di interfaccia richieste dal metodo. La figura 2 mostra un possibile esempio di realizzazione di un microscopio STED equipaggiato per attuare il metodo secondo l’invenzione. ;Una prima sorgente luminosa 1, in particolare una sorgente laser, fornisce un primo fascio luminoso FB avente una lunghezza d’onda principale λ1nell’intervallo dello spettro visibile, ad esempio 532 nm. La sorgente 1 può essere ad onda continua oppure ad impulsi. Il primo fascio FB è il fascio di eccitazione previsto per eccitare elementi di una specie chimica eccitabile contenuta in un campione da analizzare (non illustrato). ;Un modulatore acusto-ottico AOM è previsto dopo la sorgente luminosa 1 per modulare il primo fascio FB con una frequenza di interruzione f. In alternativa, tale modulatore può essere sostituito ad esempio da un modulatore elettro-ottico (EOM) od un filtro acusto-ottico sintonizzabile (AOTF). In una forma di realizzazione alternativa, non illustrata, la sorgente luminosa è in grado da sola di generare un fascio di eccitazione modulato, per cui il modulatore separato può essere omesso. Nell’esempio illustrato, il modulatore AOM si avvale per il suo funzionamento di un segnale modulante ad onda quadra generato da una scheda I/O controllata da un elaboratore. ;Un sistema ottico, di tipo convenzionale per le tecniche RESOLFT, è atto a dirigere il fascio di eccitazione FB su un’area prestabilita del campione da analizzare, essendo inoltre equipaggiato per effettuarne un scansione, e quindi spostare l’area di focalizzazione lungo la superficie del campione. Tale sistema ottico può comprendere convenzionalmente specchi, specchi dicroici DM, specchi galvanometrici GMs, una lente di scansione SL, una tube lens TL, una lamina a quarto d’onda QWP ed una lente di obiettivo OL. ;Una seconda sorgente luminosa 2, in particolare una sorgente laser, fornisce un secondo fascio luminoso SB, in particolare un fascio di diseccitazione, avente una lunghezza d’onda maggiore della lunghezza d’onda del fascio di eccitazione, ad esempio 642 nm. La sorgente 2 può essere ad onda continua oppure ad impulsi. Il fascio di diseccitazione SB è previsto per ridurre il numero di elementi eccitati in detto stato di eccitazione. In una forma di realizzazione alternativa, non illustrata, è possibile prevedere che fascio di eccitazione e fascio di diseccitazione siano generati da una medesima sorgente in grado di generare differenti lunghezze d’onda. ;Nell’esempio illustrato, dopo la sorgente 2 sono disposti uno specchio, una lamina a semionda HWP, una maschera di fase PM una piastra di ritardo di fase PP, ed il sistema ottico sopra descritto. ;Tale sistema ottico è atto a focalizzare anche il fascio di diseccitazione SB su un’area prestabilita del campione da analizzare, parzialmente sovrapposta all’area di focalizzazione del fascio di eccitazione FB, e che può essere spostata insieme ad essa lungo la superficie del campione. ;Tipicamente, il fascio di diseccitazione SB produce sul campione uno spot a forma di ciambella, il quale è sovrapposto ad una porzione periferica di un spot centrale prodotto dal fascio di eccitazione. Il campione emette quindi un segnale ottico OS determinato dalla sovrapposizione degli effetti di fascio di eccitazione e fascio di diseccitazione. Tipicamente, si tratta di un segnale di fluorescenza. Come è stato detto in precedenza, il segnale ottico emesso comprende una componente principale generata dall’interazione del fascio di eccitazione FB con la specie chimica eccitabile contenuta nel campione, ed una componente spuria, più o meno intensa, generata dall’eccitazione indesiderata della specie chimica eccitabile provocata dal fa scio di diseccitazione SB. ;Attraverso il sistema ottico suddetto il segnale di fluorescenza OS è trasmesso, attraverso un filtro passa banda BPF, un doppietto acromatico AD ed una fibra multimodale MF, ad un fotodiodo a valanga APD atto a rilevare tale segnale ottico ed a rendere disponibile un corrispondente segnale elettrico di rilevamento. Il fotodiodo APD può essere sostituito ad esempio da un tubo fotomoltiplicatore. ;Il segnale elettrico fornito dal fotodiodo viene infine ricevuto dall’elaboratore attraverso la scheda I/O. ;Nella configurazione sopra descritta, la scheda I/O fornisce il segnale ad onda quadra che interrompe periodicamente il fascio di eccitazione e sincronizza l’apertura e la chiusura dei due contatori (rispettivamente per le fasi “open” e “close”). I due contatori sono forniti dalla scheda I/O, e quindi non sono necessari dispositivi esterni. Al termine di ciascun pixel di scansione la scheda I/O fornisce due valori che sono proporzionali ai fotoni raccolti rispettivamente durante le fasi “open” e “close”. Inoltre, poiché normalmente il processo di scansione è controllato dalla stessa scheda I/O, la sincronizzazione del processo di scansione con lo schema di rilevamento time-gated (contatori) è anche di immediata realizzazione. Ciò è conveniente poiché il tempo di permanenza Tpcambia normalmente a seconda dell’applicazione e del campione. Di conseguenza, la frequenza f di interruzione del fascio di eccitazione e la sincronizzazione delle finestre di rilevamento devono variare in modo corrispondente. Tutte queste operazioni sono implementate automaticamente dalla scheda I/O, dal momento che questa agisce come master per il processo di scansione, l’interruzione del fascio di eccitazione ed il rilevamento sincronizzato. ;Ogni volta che il processo di scansione passa a un nuovo pixel i segnali conteggiati attraverso le due finestre temporali, ovvero i segnali “open” e “close”, vengono sottratti per generare il segnale recuperato s, e le immagini ripristinate vengono costruite in tempo reale. ;Allo stesso tempo, è possibile ottenere anche le due immagini intere rappresentanti le due fasi. Tale possibilità potrebbe essere molto utile quando la sottrazione pixel per pixel è sostituita da algoritmi più sofisticati, quali ad esempio un algoritmo di deconvoluzione di immagine. Anche se il metodo di sottrazione è veloce ed immediato, esso è fondamentalmente limitato dalla riduzione del SNR e non tiene conto delle correlazioni spaziali. Producendo due immagini che rappresentano rispettivamente le fasi “open” e “close”, è possibile fonderle tramite una deconvoluzione di immagine che tiene conto anche della correlazione fra pixel vicini e migliora di conseguenza il SNR. ;Gli inventori hanno sviluppato un prototipo in grado di attuare l’invenzione, applicando un metodo di rilevamento sincrono ad un setup CW-STED esistente in modo tale da ottenere l’architettura rappresentata in figura 2. ;Nel setup CW-STED il fascio di eccitazione era fornito da un laser a semiconduttore otticamente pompato (OPSL) ad onda continua emittente a 532 nm, mentre il fascio STED era fornito da un laser a fibra CW emittente a 642 nm (MPB Communications, Canada). Una piastra di fase a vortice (RPC Photonics, USA) disposta nel percorso del fascio STED generava il ritardo di fase richiesto per formare sul campione una distribuzione luminosa a ciambella. I fasci di eccitazione e STED venivano combinati da uno specchio dicroico (AHF Analysentechnik, Germania), deviati da due specchi di scansione galvanometrici (CTI-Cambridge) e diretti verso la lente di obiettivo (HCX PL APO 100x/1,40-0,70 Oil, Leica Microsystems) dallo stesso set di lenti di scansione e a tubo utilizzato in un microscopio a scansione commerciale (Leica TCS SP5, Leica Microsystems). La fluorescenza veniva de-scansionata e separata dai fasci riflessi di eccitazione e STED tramite uno specchio dicroico (AHF Analysentechnik) ed un filtro fluorescente passa banda (AHF Analysentechnik). La fluorescenza filtrata veniva focalizzata su una fibra multimodale (Thorlabs, Germania) agente come foro stenopeico corrispondente ad un diametro di 1 unità di Airy. L’uscita della fibra era collegata ad un diodo a valanga a singolo fotone (SPAD). La scansione e l’elaborazione dati del segnale raccolto era controllata utilizzando una scheda FPGA (PCI-7833R, National Instruments, USA) e software Imspector (Abberior Instruments, Germania). Per trasformare il microscopio sopra descritto in un microscopio in grado di attuare l’invenzione, nel percorso del fascio di eccitazione è stato introdotto un modulatore acusto-ottico (AA Optoelectronic, Francia) che periodicamente interrompeva il fascio di eccitazione secondo un’onda quadra generata dalla scheda FPGA. La scheda FPGA controllava inoltre l’apertura e la chiusura sincronizzate delle due porte che contavano rispettivamente i fotoni della fase “open” e della fase “close”. ;La figura 3 mostra alcune immagini a titolo di esempio del miglioramento ottenuto utilizzando il metodo secondo l’invenzione, rispetto ad un’architettura CW-STED convenzionale. In particolare, sono state utilizzate sferette fluorescenti rosse da 40 nm che sono caratterizzate da una forte eccitazione alla lunghezza d’onda utilizzata per il fascio STED. ;Come accennato in precedenza, l’invenzione contempla anche il caso in cui i cicli di illuminazione e rilevamento siano associati ad un tratto di scansione più lungo di un pixel, ed in particolare pari ad una linea di scansione. In questo caso si avrà/avranno il/i ciclo/cicli di interruzione del fascio di eccitazione non al livello del pixel, ma a livello di linea della immagine. Cioè viene acquisita una linea dell’immagine con entrambi i fasci accessi, e successivamente la stessa linea viene acquisita utilizzando però solo il fascio STED. A questo punto si elaborano (in particolare, si sottraggono) i segnali dei due passaggi della linea e si passa alla successiva. Ovviamente il processo per ogni linea può essere ripetuto più volte, analogamente alle più interruzioni del fascio sullo stesso pixel (a>1). *