ITTO20131070A1 - Applicazione terapeutica di un derivato di creatina - Google Patents
Applicazione terapeutica di un derivato di creatinaInfo
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: “Applicazione terapeutica di un derivato di creatina”
DESCRIZIONE
La presente invenzione rientra in generale nel settore terapeutico e più in particolare nel settore della terapia di patologie neoplastiche.
L’enzima creatina chinasi (EC 2.7.3.2, CK) svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo energetico delle cellule (Saks et al 1975; Seraydarian e Abbott 1976). Si tratta di un enzima ubiquitario in grado di trasferire gruppi fosfato dall’ATP alla creatina e dalla fosfocreatina all’ADP, consentendo la ricarica ATP. In prossimità dei mitocondri, l’enzima creatina chinasi catalizza la fosforilazione della creatina generando ADP e fosfocreatina. Nelle aree della cellula che richiedono più energia, la creatina chinasi trasferisce il gruppo fosfato dalla fosfocreatina all'ADP per ripristinare ATP, sostenendo così il fabbisogno energetico della cellula.
L’enzima creatina chinasi ha un peso molecolare di circa 60KDa ed è composto da quattro subunità: due citosoliche, M-CK e B-CK, e due mitocondriali, “ubiquitaria” uMt-CK e “sarcomerica” sMt-CK (Joseph et al 1997; Griffiths 1982).
Le due subunità citosoliche sono la subunità M (da muscle) e la subunità B (da brain). I geni che le esprimono sono dislocati su due cromosomi differenti: per la subunità B sul cromosoma 14q32 e per la subunità M sul cromosoma 19q13 (Stallings et al 1988). La loro combinazione porta a tre isoforme diverse espresse nei distretti a maggiore richiesta energetica (Walliman et al 1992; Wyss et al 1992): l’isoenzima muscolare (CK-MM), l’isoenzima cardiaco (CK-MB) e l’isoenzima cerebrale (CK-BB). I tre isoenzimi catalizzano la stessa reazione, ossia il trasferimento reversibile del gruppo fosfato gamma dell'ATP al gruppo guanidinico della creatina, ottenendo fosfocreatina e ADP.
In diversi lavori è stato dimostrato che l'attività dell’enzima creatina chinasi è coinvolta nello sviluppo del cancro (Joseph et al 1997; Li et al 2013; Zhang et al 2009), con diversi ruoli dei suoi vari isoenzimi nei tessuti neoplastici (Kristensen et al 1999). Ad esempio, l’isoenzima cerebrale (CK-BB) è stato osservato essere implicato nel processo di tumorigenesi (Kaddurah-Daouk et al 1990).
Sono noti alcuni inibitori chimici dell’enzima creatina chinasi. La iodoacetamide è un agente alchilante che fornisce un’inibizione completa ed irreversibile sull’enzima (Rodriguez et al 2003 ; Ren et al 2009). Il 3-butil-1-fenil-2-(phenyltelluro)oct-en-1-one è un chetone α-βinsaturo utilizzato in diverse produzioni industriali e come additivo antidetonante nella benzina (Fairhill 1969; Yarema e Curry 2005). Si tratta di un inibitore competitivo dell’enzima creatina chinasi (De Andrade et al 2010; De Andrade et al 2012).
In considerazione del ruolo svolto dalla creatina chinasi nello sviluppo del cancro, è stato studiato l’impiego della ciclocreatina come antitumorale (Martin et al 1994). Questa molecola è risultata atta ad inibire linee cellulari tumorali che esprimono elevato livello di creatina chinasi (Lillie et al 1993). È stata inoltre valutata l’azione antitumorale di altri analoghi della creatina (Bergnes et al 1996).
I derivati di creatina finora studiati per l’inibizione della creatina chinasi presentano tuttavia l’inconveniente di operare una inibizione non modulabile e irreversibile dell’enzima.
Onde superare questi ed altri inconvenienti della tecnica nota, la presente invenzione mette ora a disposizione un nuovo agente antitumorale atto ad inibire l’enzima creatina chinasi in maniera reversibile e modulabile, la (Boc)2-creatina. Tali proprietà rendono la (Boc)2-creatina particolarmente vantaggiosa nella terapia antitumorale, in quanto essa è in grado di inibire in maniera reversibile e modulabile la crescita cellulare bloccando l’enzima creatina chinasi, fonte energetica della cellula. Un aspetto importante è che il blocco operato dalla (Boc)2-creatina può essere modulato in base alla necessità, fino al blocco totale dell’attività enzimatica.
La (Boc)2-creatina è un derivato della creatina ottenuto mediante sintesi chimica (Millo et al 2012; Garbati et al 2013), che presenta 2 gruppi t-Boc (tert-butossicarbonile) sul gruppo guanidinico. La formula di struttura della (Boc)2-creatina è rappresentata qui di seguito:
OO
O N
OH
O NH N
O
La (Boc)2-creatina impiegata dai presenti inventori negli esperimenti descritti nel seguito è stata sintetizzata secondo il procedimento descritto nella domanda di brevetto italiano TO2012 A001098 depositata in data 18 dicembre 2012.
I presenti inventori hanno verificato che la (Boc)2-creatina è efficace come bloccante modulabile dell’enzima creatina chinasi. Tale azione sull’enzima creatina chinasi rende la (Boc)2-creatina una molecola particolarmente promettente come farmaco ad azione antineoplastica, in quanto l’enzima può essere sottoposto al desiderato grado di inibizione modificando la concentrazione della (Boc)2-creatina.
Per quanto è a conoscenza degli inventori, non è stato finora descritto alcun impiego terapeutico della (Boc)2-creatina.
Un primo aspetto della presente invenzione è quindi la (Boc)2-creatina per l’impiego come medicamento.
Un secondo aspetto della presente invenzione è la (Boc)2-creatina per l’impiego per il trattamento di patologie tumorali.
Per tali scopi, la (Boc)2-creatina può essere somministrata da sola o in combinazione con o più ulteriori agenti antitumorali. Esempi non limitativi di ulteriori agenti antitumorali che possono essere impiegati in combinazione con la (Boc)2-creatina sono: agenti alchilanti quali cisplatino e melphalan, derivati della ciclofosfamide e carmustina. La (Boc)2-creatina o la combinazione di (Boc)2-creatina con uno o più ulteriori agenti antitumorali può essere somministrata al paziente in una idonea forma di dosaggio farmaceutica comprendente eccipienti e veicoli convenzionali nella tecnologica farmaceutica ed attraverso svariate vie di somministrazione, ivi incluse, ma senza limitazione, la via topica, la via enterale e la via parenterale. La quantità di (Boc)2-creatina somministrata, eventualmente in combinazione con uno o più ulteriori agenti antitumorali, è una quantità terapeuticamente efficace, ossia capace di produrre nel paziente il desiderato effetto di inibizione dell’enzima creatina chinasi e quindi di inibizione o riduzione della proliferazione cellulare. In base agli esperimenti effettuati dai presenti inventori ed illustrati nel seguito, una quantità terapeuticamente efficace è una quantità atta a fornire una concentrazione di (Boc)2-creatina compresa nell’intervallo da 0,25 mM a < 2 mM, preferibilmente compresa nell’intervallo di 0,25 mM a 1,9 mM, oppure 0,25 mM a 1,7 mM, oppure ,25 mM a 1,5 mM, oppure 25 mM a 1,3 mM, più preferibilmente compresa nell’intervallo di 0,25 mM a 1 mM. Naturalmente, l’effettiva quantità di (Boc)2-creatina da somministrare dipenderà da svariati fattori quali ad esempio il peso e l’età del paziente, il tipo e la severità della patologia da trattare, altri parametri medici, nonché lo scopo desiderato del trattamento.
Gli esempi che seguono sono forniti a scopo meramente illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione.
Esempi
METODI
Attività dell’enzima creatina chinasi in presenza di (Boc)2-creatina
L'attività dell’enzima creatina chinasi è stata misurata mediante metodo di accoppiamento enzimatico (Bergmeyer 1974). In questo metodo l'idrolisi dell’ATP è accoppiata all'ossidazione NADH, che viene monitorata, per mezzo di uno spettrofotometro, dalla diminuzione di assorbanza a 340 nm (ε340 = 6,22 mM<-1>cm<-1>).
Dosaggio dell’enzima creatina chinasi e determinazione delle sue costanti cinetiche in presenza di (Boc)2-creatina
Il dosaggio della creatina chinasi è stato effettuato allo spettrofotometro a 340 nm, seguendo l’ossidazione del coenzima piridinico NADH, che si traduce come una diminuzione dell’assorbanza. Per poter eseguire il dosaggio la reazione della creatina chinasi sono state abbinate ad altre due reazioni enzimatiche catalizzate dalla piruvato chinasi e dalla lattico deidrogenasi, rispettivamente (Bergmeyer 1974). Questo metodo, definito metodo accoppiato, è necessario perché sia i substrati che i prodotti della creatina chinasi non sono direttamene visibili allo spettrofotometro. In particolare la soluzione di dosaggio conteneva i seguenti composti: 100 mM Tris HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 75 mM KCl, 2 mM ATP, 0,5 mM fosfoenolpiruvato, 0,16 mM NADH, 10 IU di piruvato chinasi e di lattico deidrogenasi, in un volume finale di 1 ml. La reazione inizia per aggiunta di 2 mM di creatina. Il dosaggio viene eseguito in continuo, ovvero l’attività dell’enzima viene seguita in tempo reale durante lo svolgimento della reazione. L’andamento del dosaggio è monitorato tramite un registro collegato allo spettrofotometro. Nella cuvetta avvengono le reazioni illustrate in figura 1.
Per verificare l’effetto inibitorio della (Boc)2-creatina, sono state aggiunte alla soluzione di dosaggio concentrazioni comprese tra 0,25 e 2 mM, prima dell’aggiunta della creatina.
Per identificare il tipo di inibizione, sono state valutate le costanti cinetiche velocità massima (Vmax) e costante di Michaelis Menten (Km). Per poter eseguire l’esperimento, per ogni concentrazione di (Boc)2-creatina, il dosaggio è stato condotto in presenza di diverse concentrazioni di substrato (creatina). I dati sono stati analizzati con il grafico dei doppi reciproci di Lineweaver–Burk. RISULTATI
Dalla figura 2 si può osservare che la massima inibizione (95%) della creatina chinasi si ottiene con 1 mM di (Boc)2-creatina. Tuttavia, già ad una concentrazione di (Boc)2-creatina pari a 0,25 mM si osserva un’inibizione del 21%, che aumenta progressivamente a 39% e 75% quando la concentrazione di (Boc)2-creatina utilizzata è 0,5 mM o 0,75 mM, rispettivamente. Questi dati confermano che l’inibizione dell’enzima può essere modulata, utilizzando diverse concentrazioni di (Boc)2-creatina.
Per capire quale tipo di inibizione la (Boc)2-creatina causi all’enzima creatina chinasi, sono stati eseguiti altri esperimenti variando sia la concentrazione della (Boc)2-creatina (0 mM; 5 mM; 1mM) che la concentrazione di creatina (il substrato dell’enzima; compresa tra 0 e 2 mM). Come si può osservare dalla figura 3, l’inibizione provocata da (Boc)2-creatina è di tipo competitivo perché non interferisce con la velocità massima (Vmax; intercetta asse delle y) della catalisi enzimatica, ma influisce sulla capacità di legare il substrato al sito attivo dell’enzima (Km; intercetta asse delle x). In altre parole, la (Boc)2-creatina compete con la creatina per legarsi al sito dell’enzima creatina chinasi e quindi ne rallenta l’attività.
Il grafico in figura 3 permette di individuare due dei più comuni parametri cinetici enzimatici, Velocità massima (Vmax) e Costante di Michaelis-Menten (Km). La prima indica la massima velocità con cui l’enzima metabolizza il proprio substrato in un determinato arco di tempo. La seconda indica l’affinità dell’enzima per il substrato, ovvero la capacità di legare la creatina al sito attivo. La Vmaxè rappresentata dal reciproco dell’intercetta dell’asse delle Y, mentre la Kmdal reciproco negativo dell’intercetta con l’asse delle X. Come si può osservare, pur variando la concentrazione della (Boc)2-creatina, il valore dell’intercetta con l’asse delle Y non varia, mentre cambia il valore dell’intercetta con l’asse delle X, aumentando proporzionalmente alla concentrazione di (Boc)2-creatina. Questo suggerisce che (Boc)2-creatina compete con la creatina per legarsi al sito attivo dell’enzima creatina chinasi, determinando una inibizione di tipo competitivo.
Discussione dei risultati
I risultati sopra descritti dimostrano che la (Boc)2-creatina è un inibitore competitivo dell’enzima creatina chinasi. Essa si lega al sito attivo dell’enzima impedendo in tal modo il legame del substrato naturale, la creatina. Quest’azione risulta nel blocco dell’attività enzimatica con un conseguente effetto citostatico e di blocco della progressione di tutte le fasi del ciclo cellulare.
Naturalmente, elevate concentrazioni di (Boc)2-creatina avranno un effetto citotossico. Infatti fettine di ippocampo di topo incubate con (Boc)2-creatina 2mM per 3 ore a 36°C non si dimostrano vitali. Poiché lo sviluppo tumorale è dovuto ad una progressione cellulare non controllata, una molecola in grado di controllare la principale fonte energetica della cellula fornisce un valido mezzo di controllo della proliferazione cellulare.
Dagli esperimenti di cinetica enzimatica effettuati dai presenti inventori, si deduce che l’inibizione dell’enzima avviene in maniera proporzionale alla concentrazione di (Boc)2-creatina presente. Infatti, ad una concentrazione di (Boc)2-creatina pari a 0,25 mM si ha un’inibizione del 21% e tale inibizione è proporzionalmente incrementata dall’aumento della concentrazione di (Boc)2-creatina fino alla massima inibizione (95%) della creatina chinasi che si ottiene quando la concentrazione della molecola sale ad 1 mM.
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Claims (6)
- RIVENDICAZIONI 1. Il composto (Boc)2-creatina per l’impiego come medicamento.
- 2. Il composto (Boc)2-creatina per l’impiego secondo la rivendicazione 1, per il trattamento di patologie tumorali.
- 3. Il composto (Boc)2-creatina per l’impiego secondo la rivendicazione 1 o 2, in combinazione con uno o più altri agenti antitumorali.
- 4. Il composto (Boc)2-creatina per l’impiego secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in una forma di dosaggio farmaceutica atta a fornire una concentrazione di (Boc)2-creatina compresa nell’intervallo di 0,25 a < 2mM.
- 5. Il composto (Boc)2-creatina per l’impiego secondo la rivendicazione 4, in una forma di dosaggio farmaceutica atta a fornire una concentrazione di (Boc)2-creatina compresa nell’intervallo di 0,25 a 1,9 mM.
- 6. Il composto (Boc)2-creatina per l’impiego secondo la rivendicazione 4, in una forma di dosaggio farmaceutica atta a fornire una concentrazione di (Boc)2-creatina compresa nell’intervallo di 0,25 a 1 mM.
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