ITTO20141040A1 - Procedimento per la rivelazione colorimetrica di contaminazione da nucleasi - Google Patents

Procedimento per la rivelazione colorimetrica di contaminazione da nucleasi Download PDF

Info

Publication number
ITTO20141040A1
ITTO20141040A1 ITTO2014A001040A ITTO20141040A ITTO20141040A1 IT TO20141040 A1 ITTO20141040 A1 IT TO20141040A1 IT TO2014A001040 A ITTO2014A001040 A IT TO2014A001040A IT TO20141040 A ITTO20141040 A IT TO20141040A IT TO20141040 A1 ITTO20141040 A1 IT TO20141040A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
seq
oligonucleotide
sequence
sample
nuclease
Prior art date
Application number
ITTO2014A001040A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Fondazione St Italiano Tecnologia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fondazione St Italiano Tecnologia filed Critical Fondazione St Italiano Tecnologia
Priority to ITTO2014A001040A priority Critical patent/ITTO20141040A1/it
Priority to US15/533,481 priority patent/US10876146B2/en
Priority to PCT/IB2015/059541 priority patent/WO2016097952A1/en
Priority to EP15823781.8A priority patent/EP3234176B1/en
Publication of ITTO20141040A1 publication Critical patent/ITTO20141040A1/it

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/307—Single strand endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/319—Exonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/327—RNAse, e.g. RNAseH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/137—Metal/ion, e.g. metal label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/155—Particles of a defined size, e.g. nanoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/113—Detection mode being characterised by the assay principle based on agglutination/precipitation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/922—Ribonucleases (RNAses); Deoxyribonucleases (DNAses)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

DESCRIZIONE dell?invenzione industriale dal titolo: ?Procedimento per la rivelazione colorimetrica di contaminazione da nucleasi?
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la rivelazione di nucleasi in un campione liquido in cui la presenza di nucleasi viene determinata per via colorimetrica, sfruttando la nota propriet? di nanoparticelle colloidali di oro (AuNPs) di dar luogo ad una variazione visibile di colore quando, a seguito della loro aggregazione, la distanza interparticellare diventa inferiore alla dimensione (diametro) delle particelle.
Le nucleasi sono ubiquitarie e il numero di enzimi caratterizzati in questa classe ? in continuo aumento. Possono essere distinte in esonucleasi e endonucleasi, in funzione della loro capacit? di digerire il loro substrato in modo completo o non completo. Le nucleasi si distinguono anche in DNAsi e RNAsi, a seconda che, come il nome suggerisce, degradino preferibilmente DNA o RNA, rispettivamente.
Una classificazione pi? dettagliata considera anche la preferenza per caratteristiche strutturali del substrato, distinguendo tra enzimi specifici per acidi nucleici a singolo o doppio filamento, strutture eteroduplex o nicked, DNA misaccoppiato ed altre.
Il carattere ubiquitario delle nucleasi rappresenta un problema per numerose applicazioni che implicano esperimenti di biologia molecolare, in cui la contaminazione da nucleasi ? da evitare.
Soluzioni correnti per prevenire la contaminazione da nucleasi nella comune pratica di laboratorio includono l?impiego di dispositivi e strumenti sterili e l?applicazione di fasi operative quali: trattamenti termici ad alta temperatura, il trattamento con dietilpirocarbonato (DEPC), che inattiva le RNAsi, seguito da trattamento in autoclave, l?addizione di agenti chelanti, che incrementano la stabilit? dell?RNA a temperatura elevata in presenza di cationi bivalenti.
Soluzioni correnti per rivelare la contaminazione da nucleasi includono l?impiego di kit commercialmente disponibili, perlopi? basati su una lettura di fluorescenza o che richiedono una fase di gel elettroforesi, che danno un risultato qualitativo alquanto sensibile, ma che presentano svantaggi che la presente invenzione si propone di risolvere.
In primo luogo, i saggi commerciali richiedono un?apposita strumentazione per la rivelazione, come un fluorimetro o un?apparecchiatura di gelelettroforesi, che invece non ? necessaria nel saggio secondo l?invenzione che sfrutta una lettura di cambiamento di colore visibile ad occhio nudo. D?altro canto, con i saggi basati su fluorescenza, la possibilit? di interpretare i risultati ad occhio nudo si fonda sul posizionamento della provetta su di un trans illuminatore UV, ma questo metodo offre un?inferiore sensibilit? che ? anche influenzata da condizioni esterne quali la corretta illuminazione ambientale o il tipo di lampada UV utilizzata.
I saggi commerciali richiedono un controllo positivo basato su di una nucleasi che ? essa stessa una fonte potenziale di contaminazione che pu? influenzare il risultato del saggio e potenzialmente compromettere successivi esperimenti. Al contrario, il saggio secondo l?invenzione non richiede l?impiego di un controllo positivo che utilizzi una nucleasi, come descritto nel seguito.
Sul piano economico, il costo medio di analisi per i saggi commerciali ? relativamente elevato (circa ? 8 per la prova di DNAsi fino a circa ? 30 le prove di RNAsi, considerando tre campioni, includenti il saggio stesso, il controllo positivo e negativo). Uno scopo conseguito dall?invenzione ? quindi quello di fornire un saggio di basso costo.
Le prove basate sulla fluorescenza presentano limitazioni per soluzioni intensamente colorate. In relazione a questo punto, l?invenzione fornisce un procedimento di elevata sensibilit? che rende possibile l?effettuazione della prova su soluzioni intensamente colorate. Mediante diluzione, fino a 10 volte del campione colorato, ? perlopi? possibile evitare interferenze con il colloide intensamente colorato soggetto al test, perdendo soltanto circa un ordine di grandezza di sensibilit? che, nella maggioranza dei casi ? pi? che sufficiente per apprezzare anche bassi livelli di contaminazione. Particolarmente, in una forma di attuazione del saggio, come illustrato nel seguito, il campione ? anche addizionato alla provetta di controllo positivo, cos? da permettere non soltanto la rivelazione della presenza nel campione di componenti potenzialmente interferenti, ma altres? di sottrarre interferenze di colore pi? lievi.
Un ulteriore svantaggio della maggioranza delle prove commerciali ? dovuto al fatto che esse sono progettate per rivelare specificatamente l?attivit? di endonucleasi; al contrario, il saggio secondo l?invenzione permette la rivelazione simultanea di endonucleasi e esonucleasi.
Un altro svantaggio si riferisce in modo specifico alle prove basate su gel-elettroforesi e colorazione con SYBR gold delle reazioni. Poich? il SYBR gold colora gli acidi nucleici, questa metodologia non consente di effettuare il saggio su campioni contenenti DNA o RNA, in quanto la colorazione di questi acidi nucleici interferisce con il risultato. Poich? il saggio sull?invenzione si basa sull?ibridazione di sequenze complementari, la presenza di altri acidi nucleici (non complementari) non interferisce con i risultati cosicch? ne risulta ampliato il campo di campioni diversi analizzabili.
Nella letteratura scientifica sono disponibili alcuni rapporti che sfruttano le propriet? ottiche di nanoparticelle di oro in diversi schemi di reazione.
Cao et al. [rif. 1] hanno riportato un saggio in cui AuNPs nude, caricate positivamente, sono esposte a DNA a singolo filamento (ssDNA), che viene adsorbito sulla loro superficie per interazioni elettrostatiche e ne causa l?aggregazione con la conseguente variazione di colore da rosso a blu. In presenza di S1 nucleasi, il ssDNA ? degradato e le AuNPs mantengono la colorazione rossa. Gli autori riportano un limite di rivelazione di 4,3x10-3U/?l con un range dinamico inferiore a 7.
Xu et al. [rif. 2] descrive un sistema basato su AuNPs funzionalizzate, che sono reticolate tramite un linker oligonucleotidico. In presenza di DNAse I l?aggregato di AuNPs viene digerito dall?enzima e le AuNPs variano la loro colorazione da violetto a rosso. Gli autori riportano un limite di rivelazione di 1x10-2U/?l e illustrano l?attuazione del saggio su di un range dinamico di 4, quantunque non affermino esplicitamente che questo sia il range dinamico finale del metodo.
Vi sono tuttavia rilevanti differenze tra il saggio ivi descritto e il saggio secondo l?invenzione. In particolare, nel saggio secondo l?invenzione la digestione enzimatica si verifica in soluzione, per cui ? molto pi? efficiente rispetto all?erosione di un grosso aggregato di AuNPs, in quanto 1) nel saggio di letteratura la degradazione del linker pu? soltanto procedere a partire dalla sua superficie esternamente esposta dell?aggregato e 2) come noto, [rif. 3] e [Rif. 4], l?efficienza di enzimi di nucleasi ? significativamente ridotta dall?interazione con AuNPs.
Inoltre il test proposto da Xu et al. funziona soltanto con DNAsiI, mentre il test secondo l?invenzione ha carattere universale. Inoltre, nel saggio secondo l?invenzione, l?attuazione della digestione enzimatica in soluzione offre la possibilit? di testare con lo stesso sistema le attivit? sia di esonucleasi, sia di endonucleasi. Ci? non sarebbe possibile in ogni caso nel contesto di un aggregato di AuNPs in quanto non vi sarebbero terminazioni libere di DNA accessibili all?enzima per iniziare la scissione esonucleolitica.
In sommario, l?invenzione si propone lo scopo di fornire un sistema che risolve i problemi sopra citati relativi ai saggi commerciali e che presenta una migliore sensibilit? e versatilit? rispetto ai saggi proposti della letteratura scientifica.
In vista di tali scopi, costituisce oggetto dell?invenzione un procedimento avente le caratteristiche definite nelle rivendicazioni che seguono, che costituiscono parte integrale della presente invenzione.
Costituisce altres? oggetto dell?invenzione un corredo per l?attuazione del saggio.
Nel procedimento secondo l?invenzione, una piccola quantit? della soluzione da testare per la presenza di nucleasi (generalmente una quantit? di circa 50 ?l) ? introdotta in una provetta contenente linkers oligonucleotidici di DNA e/o RNA, generalmente liofilizzati, che costituiscono il substrato per DNAsi o RNAsi, rispettivamente. Il campione viene mantenuto in incubazione per un tempo sufficiente a causare la degradazione del linker oligonucleotidico da parte della nucleasi eventualmente presente nel campione. Tipicamente, pu? essere sufficiente un tempo di incubazione di circa un?ora a temperatura ambiente (ma, in alcuni casi specifici, si possono usare tempi di incubazione minori). Alternativamente, qualora sia desiderata una pi? elevata sensibilit? del saggio, l?incubazione pu? essere protratta over-night. Tuttavia, la sensibilit? conseguita dopo un?ora di incubazione ? gi? superiore alla sensibilit? di qualsiasi altro test commerciale, cosicch? un?incubazione protratta ? solo necessaria per applicazioni che richiedono un?elevata sensibilit?, cio? quando una contaminazione in tracce ? comunque indesiderabile.
Durante l?incubazione, la/le nucleasi eventualmente presenti causano la degradazione del rispettivo linker.
La quantit? di linker liofilizzato presente nel tubo di reazione ? tale che la sua concentrazione finale nella soluzione da testare ? piuttosto bassa (da 10 nM a 1 ?M, preferibilmente da 50 nM a 500 nM), cos? da massimizzare la sensibilit? del test.
La seconda e ultima fase del saggio consiste nell?addizione di sonde di AuNP. Si utilizzano nanoparticelle di oro colloidale, tipicamente protette con citrato, funzionalizzate con oligonucleotidi 1 e 2, indicate nel seguito con AuNP1 e AuNP2, ove le sequenze oligonucleotidiche 1 e 2 sono complementari ad una rispettiva porzione della sequenza nucleotidica del linker oligonucleotidico.
In presenza di un substrato intatto, a seguito dell?evento di ibridazione, le AuNPs risultano reticolate, portando ad una variazione di colore visibile da rosso a porpora/violetto/blu. Al contrario, in presenza di una contaminazione della specifica classe di nucleasi che viene testata, le AuNPs non subiscono reticolazione, a seguito della degradazione dei linkers nella prima fase e la soluzione mantiene la colorazione rossa.
Il saggio ? universale in quanto impiega sonde AuNPs universali e fino a sei diversi linkers oligonucleotidici universali, che sono substrati per le nucleasi e che coprono tutte le pi? comuni specificit? enzimatiche, includenti DNAsi specifiche per doppio filamento e singolo filamento, RNAsi specifiche per doppio e singolo filamento, nucleasi specifiche per DNA/RNA eteroduplex ed esonucleasi.
Nei disegni annessi, la figura 1 illustra una rappresentazione schematica del saggio, ove con le lettere A ad F sono indicati diverse tipologie di linkers oligonucleotidici utilizzabili; con AuNP1 e AuNP2 sono indicate le particelle d?oro colloidale funzionalizzate con il rispettivo oligonucleotide, con FL sono indicati i frammenti di linker oligonucletidico risultanti dalla degrazione enzimatica, in caso di presenza di nucleasi nel campione, con AG ? indicato un aggregato di AuNP1 e AuNP2 risultante a seguito dell?ibridazione, in caso di assenza di nucleasi, e con P ? indicata la provetta contenente il campione liquido sottoposto al saggio.
Con A e B sono indicati linkers oligonucleotidici costituiti da sequenze di ssDNA o rispettivamente ssRNA, utilizzabili nel saggio per la rivelazione di DNAsi e RNAsi specifiche per singolo filamento; questi linkers causano direttamente l?aggregazione delle AuNPs funzionalizzate.
In generale, i linkers oligonucleotidici utilizzati come substrati sono sequenze random, prive di significativa struttura secondaria e non suscettibili di dimerizzazione. Tali sequenze possono eventualmente essere chimicamente modificate. Esempi di linkers oligonucleotidici di tipo A e B sono i seguenti:
(A). 5?ATAAAGTGACAGAATAGAGTGA 3? (A1) (SEQ ID NO:1) oppure: 5?AGTGACAGAATAGA 3? (A2) (SEQ ID NO:2) (B). 5?ArUrArArArGrUrGrArCrArGrArArUrArGrArGrUrGrA 3? (B1) (SEQ ID NO:3)
oppure: 5? ArGrUrGrArCrArGrArArUrArGrAr 3? (B2) (SEQ ID NO:4)
oppure: 5? ArGrUrGrArCrArUrCrCrGrArArUrArGrAr 3? (B3) (SEQ ID NO:5)
oppure:
5?rCrArUrUrGrCrUrUrCrArUrCrUrGrUrUrUrCrGrUrCrU 3? (B4) (SEQ ID NO:6)
oppure: 5? rGrCrUrUrCrArUrCrUrGrUrUrUrC 3? (B5) (SEQ ID NO:7).
Con C, D ed E sono indicati linkers oligonucleotidici per la rivelazione, rispettivamente di nucleasi specifiche per dsDNA, dsRNA o DNA/RNA eteroduplex; in questi linkers oligonucleotidici, la stessa sequenza di linker A o B ? ibridata ad una pi? corta sequenza oligonucleotidica complementare, costituita da DNA o RNA cosicch? gli ibridi hanno almeno un?estremit? libera a singolo filamento, disegnata in modo da far s? che si verifichi uno strand displacement a seguito del legame con AuNPs funzionalizzate.
Esempi di linkers oligonucleotidici di tipo C, D ed E sono i seguenti:
(C) sequenza di dsDNA composta da (A1) e 5? TCT ATT CTG TCA CT 3? (SEQ ID NO:8)
(D) sequenza di dsRNA composta da (B1) e 5? rUrCrU-rArUrUrCrUrGrUrCrArCrU 3? (SEQ ID NO:9)
(E) DNA/RNA eteroduplex composto da (A1) e 5? rUr-CrUrArUrUrCrUrGrUrCrArCrU 3? (SEQ ID NO:9) oppure DNA/RNA eteroduplex composto da (B1) e 5? TCT ATT CTG TCA CT 3? (SEQ ID NO:8).
Infine, nel caso di esonucleasi, il linker oligonucleotidico, indicato con F1 o F2 come descritto in seguito, ? inglobato in un dsDNA con una delle 2 terminazioni tronca o sporgente per non pi? di 4 basi.
Diversi tipi di esonucleasi possono digerire DNA a doppio filamento (dsDNA) a terminazioni tronche a partire dall?estremit? 5? oppure 3?.
A seconda del tipo di esonucleasi da detectare, si possono utilizzare 2 substrati diversi, F1 ed F2. Esempi di linker oligonucleotidici di tipo F1 ed F2 sono i seguenti:
(F1) dsDNA composto dalla sequenza (A) sopra citata e 5? TATTCTGTCACTTTAT 3? (SEQ ID NO:10).
(F1bis) dsDNA composto da 5?ATA AAG TGA CAG AAT A GAG TGA CAT 3? (SEQ ID NO 11) e 5? ATGTCACTCTAT 3? (SEQ ID NO 12).
Questi substrati sono digeriti a partire dalla estremit? tronca 5? da tutte le esonucleasi con specificit? di tipo 5??3?.
L?estremit? sporgente 3?, in assenza della digestione enzimatica, provocher? l?aggregazione delle AuNPs per strand displacement.
(F2) dsDNA composto dalla sequenza (A) sopra citata e 5? TCACTCTATTCTGTC 3? (SEQ ID NO:13).
(F2bis) dsDNA composto da 5? CGTATAAAGTGACAGAATAGA-GTGA 3?(SEQ ID NO 14) e 5? GCTTATTTCACT 3? (SEQ ID NO 15).
Questi substrati sono digeriti a partire dalla estremit? tronca 3? da tutte le esonucleasi con specificit? di tipo 3??5?.
L?estremit? sporgente 5?, in assenza della digestione enzimatica, provocher? l?aggregazione delle AuNPs per strand displacement.
Come gi? indicato gli oligonucleotidi sonda con cui sono funzionalizzate le particelle di oro colloidale presentano una sequenza complementare ad almeno una rispettiva porzione della sequenza nucleotidica del linker oligonucleotidico utilizzato; in una forma di realizzazione preferita, gli oligonucleotidi sonda 1 e 2 sono ciascuno complementare a met? della sequenza del linker oligonucleotidico.
Tuttavia, il numero minimo di nucleotidi necessari all?ibridazione ? pari a 4 o 5. E? possibile che la porzione di sonda oligonucleotidica che ibrida con il linker sia pi? corta della met? del linker. Negli esempi di linker precedentemente riportati ? previsto anche questo caso. In ogni caso, la lunghezza totale dell?oligonucleotide sonda ? preferibilmente maggiore della met? del linker, a meno che il linker oligonucleotide non sia particolarmente lungo, in quanto la nano particella d?oro ? pi? stabile se funzionalizzata con sonde di una certa lunghezza.
Tipicamente, gli oligonucleotidi sonda presentano una lunghezza da 5 a 80 nucleotidi, preferibilmente da 15 a 40 nucleotidi.
Gli oligonucleotidi sonda possono essere chimicamente modificati per il legame con le nanoparticelle di oro; possono presentare sequenze distanziali (spacer) per ottimizzare l?efficienza delle reazioni. Esempi di sonde oligonucleotidiche sono i seguenti:
1. 5? ATGTCACTCTATTC 3? (SEQ ID NO:16)
oppure: 5? ATGAGACGAAACAG 3? (SEQ ID NO:17)
2. 5? TGTCACTTTATACG 3? (SEQ ID NO:18)
oppure: 5? ATGAAGCAATGACG 3? (SEQ ID NO:19).
La densit? di funzionalizzazione ? tipicamente compresa tra 2x10-4/nm2 e 2x10-1/nm2, preferibilmente tra 1x10-3/nm2 e 8x10-2/nm2.
Le particelle d?oro colloidale utilizzate, tipicamente presentano una dimensione da 1 a 500 nm, preferibilmente tra 15 e 80 nm.
Un corredo per l?attuazione del procedimento pu? comprendere:
- un aliquota di particelle di oro colloidale, preferibilmente con protezione di citrato, sufficiente per l?attuazione di uno o pi? saggi,
- oligonucleotidi sonda di tipo 1 e 2 precedentemente citati, ovvero in alternativa
- particelle di oro colloidale gi? funzionalizzate con detti oligonucleotidi sonda 1 e 2, e
- uno o pi? linkers oligonucleotidici del tipo sopra citato preferibilmente in forma liofilizzata. Preferibilmente, il corredo comprende linkers oligonucleotidici nelle sei forme precedentemente citate.
In funzione del tipo di contaminazione da nucleasi che l?utilizzatore desidera verificare, l?utilizzatore pu? decidere se utilizzare in parallelo tutti i substrati o soltanto una loro parte. La reazione sar? tuttavia sostanzialmente identica per tutte le prove includendo: l?addizione del campione alla provetta rilevante contenente il rispettivo linker oligonucleotidico ed eventualmente a provette di controllo, il mantenimento in incubazione (ad esempio per un?ora o per tempi inferiori o superiori come precedentemente menzionato) e l?addizione delle particelle d?oro colloidali funzionalizzate con gli oligonucleotidi sonda di tipo 1 e 2 e la determinazione visiva dell?eventuale cambiamento di colore.
Il procedimento pu? comprendere l?effettuazione di un controllo negativo, effettuato con l?impiego soltanto delle particelle di oro funzionalizzate e del rispettivo linker oligonucleotidico, ma in assenza del campione da analizzare, sostituito da una quantit? equivalente di acqua esente da nucleasi; il controllo negativo d? luogo ad una colorazione porpora/violetto o blu della soluzione dovuta all?aggregazione delle AuNPs. Se la soluzione del campione testato vira al colore porpora/violetto/blu, come il controllo negativo, ci? significa che il campione ? esente da contaminazione della nucleasi che si intende rivelare.
L?attuazione del procedimento pu? comprendere l?attuazione di una prova di controllo positivo, con l?utilizzo di una soluzione contenente soltanto le particelle di oro colloidale funzionalizzate e il campione da testare, ma senza utilizzo del rispettivo linker oligonucleotidico.
Nell?effettuazione del controllo positivo, la soluzione manterr? la propria colorazione rossa, o in caso di interferenza con i componenti del campione da testare, fornir? un?indicazione che nel caso specifico il saggio non pu? essere attuato; ci? pu? verificarsi, ad esempio, qualora si desideri sottoporre a rivelazione una soluzione concentrata e/o fortemente colorata. In questo modo la prova di controllo positivo non richiede l?addizione di una nucleasi, come invece ? richiesto nella maggioranza dei test commerciali, e ci? rende il saggio secondo l?invenzione pi? sicuro in quanto evita che il saggio stesso sia una fonte potenziale di contaminazione da nucleasi in laboratorio o nell?ambiente di lavoro.
Il limite di rivelazione testato nelle prove effettuate nel saggio secondo l?invenzione ? di 8x10-5 U/?l o di 2x10-3 Unit? nel volume totale di reazione, per la reazione rivolta a testare DNAsi I. Per RNAsi A, la sensibilit? ? ancor pi? elevata in quanto raggiunge valori di 1,75x10-7 U per reazione. Il saggio presenta inoltre un elevato valore di range dinamico pari a 1000 per DNAsi I (da 2U a 2x10-3 U) e 100000000 (da 17,5 U a 1,75x10-7) per RNAsi A.
Esempio 1: Detection di DNAsi: un?aliquota della soluzione da testare pari a 50 ?l viene aggiunta a un tubo di reazione contenente una piccola quantit? di substrato liofilizzato (A1) oppure (C), oppure ad entrambi. La concentrazione finale del substrato nella soluzione ? 100 nM. Vengono preparati diversi tubi di reazione, contenenti quantit? variabili dell?enzima DNAsi I (da 200 Unit? a 2x10-
4 Unit?). La soluzione viene lasciata a incubare per un?ora, o meno in specifici casi, a temperatura ambiente. In un secondo identico tubo di reazione (controllo negativo) contenente lo stesso substrato, viene aggiunta una identica quantit? (50 ?l ) di acqua esente da nucleasi. Un terzo tubo (controllo positivo) ? invece vuoto. Ad esso viene aggiunta una identica aliquota della soluzione da testare. Al termine dell?incubazione, a tutti i tubi viene aggiunta una mix di nanoparticelle di oro colloidali (AuNPs), che raggiungono nella soluzione finale la concentrazione di 1 nM. Questa mix contiene in uguale rapporto AuNPs funzionalizzate con due diverse sequenze sonda di DNA, l?oligonucleotide sonda 1, con sequenza 5? ATGTCAC-TCTATTC 3? (SEQ ID NO:12), e l?oligonucleotide sonda 2, con sequenza 5? TGTCACTTTATACG 3? (SEQ ID NO:14). Dopo una breve incubazione si osserva l?eventuale cambiamento di colore, indicativo della assenza di contaminazioni. Nel controllo negativo il cambiamento di colore si osserva in ogni caso. Nel controllo positivo non si osserva il cambiamento di colore, a meno che nella soluzione siano presenti sostanze che interferiscano col test colorimetrico. In questo caso, questo controllo offre la possibilit? di sottrarre visivamente piccole interferenze, oppure di decidere l?eventuale nontestabilit? del campione, se l?interferenza ? eccessiva. Tale campione contenente interferenti pu? comunque essere opportunamente diluito e testato nuovamente. Nei campioni contenenti DNAsi I, il cambiamento di colore non si osserva per i campioni che contengono da 200 Unit? a 2x10 Unit? di DNAsi I. 2x10-3 Unit? rappresenta quindi il limite di detection del test per la DNAsi I.
Esempio 2: detection di RNAsi. un?aliquota della soluzione da testare pari a 50 ?l viene aggiunta a un tubo di reazione contenente una piccola quantit? di substrato liofilizzato (B1) oppure (D). La concentrazione finale del substrato nella soluzione ? 75 nM. Vengono preparati diversi tubi di reazione, contenenti quantit? variabili dell?enzima RNAsi A (da 1,75 Unit? a 1,75x10-7 Unit?). La soluzione viene lasciata a incubare per un?ora, o meno in specifici casi, a temperatura ambiente. In un secondo identico tubo di reazione (controllo negativo) contenente lo stesso substrato, viene aggiunta una identica quantit? (50 ?l ) di acqua esente da nucleasi. Un terzo tubo (controllo positivo) ? invece vuoto. Ad esso viene aggiunta una identica aliquota della soluzione da testare. Al termine dell?incubazione, a tutti i tubi viene aggiunta una mix di nanoparticelle di oro colloidali (AuNPs), che raggiungono nella soluzione finale la concentrazione di 1 nM. Questa mix contiene in uguale rapporto AuNPs funzionalizzate con due diverse sequenze sonda di DNA, l?oligonucleotide sonda 1, con sequenza 5? ATGTCACTCTATTC 3? (SEQ ID NO:12), e l?oligonucleotide sonda 2, con sequenza 5? TGTCAC-TTTATACG 3? (SEQ ID NO:14). Dopo una breve incubazione si osserva l?eventuale cambiamento di colore, indicativo della assenza di contaminazioni, analogamente a quanto descritto nell?esempio 1. Nei campioni contenenti RNAsi A, il cambiamento di colore non si osserva per i campioni che contengono da 1,75 Unit? a 1,75x10-7 Unit? di RNAsi A. 1,75x10-7 Unit? rappresenta quindi il limite di detection del test per l?RNAsi A.
Il procedimento secondo l?invenzione ? stato convalidato con l?impiego di diverse nucleasi, includente DNAsi I, RNAsi A, nucleasi Mung Bean, nucleasi di Micrococco, nucleasi Bal-31, RNAsi H e DNAsi extracellulari batteriche. Il procedimento ha dimostrato di essere in grado di rivelare tutti gli enzimi testati che presentano diversa specificit? di substrato. Come gi? indicato, il procedimento ? stato ottimizzato per sei diversi substrati, permettendo cos? di testare sei classi di enzimi, inclusivi degli enzimi sopra citati. Si intende, tuttavia, che il saggio pu? essere esteso ad altre nucleasi, utilizzando lo stesso principio di saggio.
Il saggio risulta pertanto ampiamente applicabile in tutte quelle situazioni ove si desidera un accurato e rapido controllo della presenza di una qualsiasi contaminazione da nucleasi, ad esempio in prove di controllo di qualit? della pratica di laboratorio e cos? pure nel controllo di qualit? di reagenti per biologia molecolare e di utensili di plastica da laboratorio, nonch? in applicazioni di ricerca scientifica.
Il saggio consente, inoltre, di ottenere informazioni sul tipo specifico di contaminazione presente nel campione, permettendo di definire specifiche strategie di inattivazione, che possono essere pi? idonee rispetto a procedure generalizzate di decontaminazione da nucleasi.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per rivelare la presenza di nucleasi in un campione, caratterizzato dal fatto che comprende le operazioni di: - incubare il campione da testare per la presenza di nucleasi con almeno un linker oligonucleotidico costituente il substrato per la nucleasi da rivelare, per un tempo sufficiente a causare la degradazione di detto linker oligonucleotidico da parte della nucleasi eventualmente presente nel campione, - addizionare al campione, a seguito dell?incubazione, nanoparticelle di oro colloidale comprendenti nanoparticelle di oro funzionalizzate con un primo oligonucleotide sonda e nanoparticelle di oro funzionalizzate con un rispettivo secondo oligonucleotide sonda, detto primo e secondo oligonucleotide sonda essendo complementari ad una rispettiva porzione della sequenza nucleotidica del linker oligonucleotidico, e - esaminare l?eventuale variazione di colore del campione a seguito dell?addizione di dette nanoparticelle, una variazione di colore del campione al colore che le particelle di oro colloidale assumono quando aggregate ad una distanza inferiore alla loro dimensione essendo indicativa dell?assenza del campione della nucleasi in esame.
  2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, per la rivelazione di DNAsi o RNAsi specifiche per DNA o rispettivamente RNA a singolo filamento, in cui il linker oligonucleotidico ? una sequenza di DNA o RNA a singolo filamento priva di struttura secondaria e non dimerizzante.
  3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il linker oligonucleotidico ? scelto dal gruppo che consiste di: (A). 5?ATAAAGTGACAGAATAGAGTGA 3?(A1) (SEQ ID NO:1) oppure: 5?AGTGACAGAATAGA 3? (A2) (SEQ ID NO:2) (B). 5?ArUrArArArGrUrGrArCrArGrArArUrArGrArGrUrGrA 3? (B1) (SEQ ID NO:3) oppure: 5? ArGrUrGrArCrArGrArArUrArGrAr 3? (B2) (SEQ ID NO:4) oppure: 5? ArGrUrGrArCrArUrCrCrGrArArUrArGrAr 3? (B3) (SEQ ID NO:5) oppure: 5?rCrArUrUrGrCrUrUrCrArUrCrUrGrUrUrUrCrGrUrCrU 3? (B4) (SEQ ID NO:6) oppure: 5? rGrCrUrUrCrArUrCrUrGrUrUrUrC 3? (B5) (SEQ ID NO:7).
  4. 4. Procedimento secondo la rivendicazione 1 per la rivelazione di una nucleasi specifica per dsDNA, dsRNA e/o DNA/RNA eteroduplex, in cui il linker oligonucleotidico comprende una sequenza di DNA o rispettivamente RNA ibridata ad una pi? corta sequenza complementare per formare una sequenza ibrida avente almeno un?estremit? libera a singolo filamento, ove la suddetta pi? corta sequenza complementare ? suscettibile di strand displacement a seguito dell?ibridazione dell?estremit? a singolo filamento con una porzione complementare dell?oligonucleotide sonda che funzionalizza le nanoparticelle.
  5. 5. Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto linker oligonucleotidico ? scelto dal gruppo che consiste di: (C) sequenza di dsDNA composta da SEQ ID NO:1 e 5? TCT ATT CTG TCA CT 3? (SEQ ID NO:8) (D) sequenza di dsRNA composta da SEQ ID NO:3 e 5? rUrCrUrArUrUrCrUrGrUrCrArCrU 3? (SEQ ID NO:9) (E) DNA/RNA eteroduplex composta da SEQ ID NO:1 e 5? rUrCrUrArUrUrCrUrGrUrCrArCrU 3? (SEQ ID NO:9) oppure DNA/RNA eteroduplex composto da SEQ ID NO:3 e 5? TCT ATT CTG TCA CT 3? (SEQ ID NO:8).
  6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 1 per rivelazione di un?esonucleasi in cui il linker oligonucleotidico ? inglobato in una sequenza di dsDNA con una delle due estremit? tronca o sporgente per non pi? di 4 basi.
  7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, incui il linker oligonucleotidico ? una sequenza di dsDNA con una terminazione tronca composta da SEQ ID NO:1 e 5? TATTCTGTCACTTTAT 3? (SEQ ID NO: 10) oppure da SEQ ID NO:1 e 5? TCACTCTATTCTGTC 3? (SEQ ID NO:13) oppure da 5?ATA AAG TGA CAG AAT A GAG TGA CAT 3? (SEQ ID NO 11) e 5? ATGTCACTCTAT 3? (SEQ ID NO 12), oppure da SEQ ID NO:1 e 5? TCACTCTATTCTGTC 3? (SEQ ID NO:13), oppure da 5? CGTATAAAGTGACAGAA-TAGAGTGA 3?(SEQ ID NO 14) e 5? GCTTATTTCACT 3? (SEQ ID NO 15).
  8. 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto primo e secondo oligonucleotide sonda presentano una lunghezza da 5 a 80 nucleotidi, preferibilmente da 15 a 40 nucleotidi.
  9. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detto primo e secondo oligonucleotidi sonda sono scelti dal gruppo che consiste di 1. 5? ATGTCACTCTATTC 3? (SEQ ID NO:16) oppure: 5? ATGAGACGAAACAG 3? (SEQ ID NO:17) 2. 5? TGTCACTTTATACG 3? (SEQ ID NO:18) oppure: 5? ATGAAGCAATGACG 3? (SEQ ID NO:19).
  10. 10. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui dette nanoparticelle di oro colloidale presentano una dimensione a 1 a 500 nm, preferibilmente da 15 a 80 nm.
  11. 11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dette nanoparticelle di oro colloidale sono funzionalizzate con detti oligonucleotidi sonda con una densit? di funzionalizzazione da 2x10-4/nm2 a 2x10-1/nm2, preferibilmente da 1x10-3/nm2 a 8x10-2/nm2.
  12. 12. Corredo per la rivelazione di nucleasi in un campione comprendente: - nanoparticelle di oro colloidale funzionalizzate con un primo e un secondo oligonucleotide sonda e - uno o pi? linker oligonucleotidici costituenti il substrato per la/le nucleasi da rivelare ove detto primo e secondo oligonucleotide sonda sono complementari ad una rispettiva porzione della sequenza nucleotidica di uno o pi? di detti linker oligonucleotidici.
ITTO2014A001040A 2014-12-15 2014-12-15 Procedimento per la rivelazione colorimetrica di contaminazione da nucleasi ITTO20141040A1 (it)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITTO2014A001040A ITTO20141040A1 (it) 2014-12-15 2014-12-15 Procedimento per la rivelazione colorimetrica di contaminazione da nucleasi
US15/533,481 US10876146B2 (en) 2014-12-15 2015-12-11 Method for the colorimetric detection of contamination with nucleases
PCT/IB2015/059541 WO2016097952A1 (en) 2014-12-15 2015-12-11 Method for the colorimetric detection of contamination with nucleases
EP15823781.8A EP3234176B1 (en) 2014-12-15 2015-12-11 Method for the colorimetric detection of contamination with nucleases

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITTO2014A001040A ITTO20141040A1 (it) 2014-12-15 2014-12-15 Procedimento per la rivelazione colorimetrica di contaminazione da nucleasi

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ITTO20141040A1 true ITTO20141040A1 (it) 2016-06-15

Family

ID=52464515

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ITTO2014A001040A ITTO20141040A1 (it) 2014-12-15 2014-12-15 Procedimento per la rivelazione colorimetrica di contaminazione da nucleasi

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10876146B2 (it)
EP (1) EP3234176B1 (it)
IT (1) ITTO20141040A1 (it)
WO (1) WO2016097952A1 (it)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2602597A (en) * 2016-07-14 2022-07-06 Rightangled Ltd Method and assay kit to detect an analyte
WO2018167666A1 (en) * 2017-03-14 2018-09-20 Tubitak Method for rapid identification of microorganisms producing nuclease enzymes
CN110736833B (zh) * 2019-11-13 2022-10-14 浙江工商大学 基于咖啡环效应的甲壳类精氨酸激酶检测试剂盒及其检测方法
EP3933046A1 (en) * 2020-07-03 2022-01-05 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Method for colorimetric detection of bacteria in food samples
CN111751540B (zh) * 2020-07-20 2023-03-03 烟台大学 一种用于核酸酶检测的sers横向流动试纸条及检测方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7892734B2 (en) 2005-08-11 2011-02-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Aptamer based colorimetric sensor systems
US20090155785A1 (en) 2007-01-25 2009-06-18 Northwestern University Real-time colorimetric screening inhibitors of endonuclease with gold nanoparticle substrate

Also Published As

Publication number Publication date
US20170335366A1 (en) 2017-11-23
WO2016097952A1 (en) 2016-06-23
EP3234176A1 (en) 2017-10-25
US10876146B2 (en) 2020-12-29
EP3234176B1 (en) 2019-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sina et al. Epigenetically reprogrammed methylation landscape drives the DNA self-assembly and serves as a universal cancer biomarker
Feng et al. Fluorescent conjugated polymer-based FRET technique for detection of DNA methylation of cancer cells
Yin et al. Sensitive detection of microRNA in complex biological samples via enzymatic signal amplification using DNA polymerase coupled with nicking endonuclease
Ding et al. Surface plasmon resonance biosensor for highly sensitive detection of microRNA based on DNA super-sandwich assemblies and streptavidin signal amplification
Plassart et al. Evaluation of the ISO standard 11063 DNA extraction procedure for assessing soil microbial abundance and community structure
Shin et al. Label-free methylation specific sensor based on silicon microring resonators for detection and quantification of DNA methylation biomarkers in bladder cancer
Sina et al. DNA methylation-based point-of-care cancer detection: challenges and possibilities
JP2016516437A (ja) 標的核酸の多重化分析
WO2011050147A1 (en) Methods and related devices for single molecule whole genome analysis
EP3234176B1 (en) Method for the colorimetric detection of contamination with nucleases
Delkhahi et al. Design and fabrication a gold nanoparticle-DNA based nanobiosensor for detection of microRNA involved in Alzheimer's disease
Soraya et al. An interdigitated electrode biosensor platform for rapid HLA-B* 15: 02 genotyping for prevention of drug hypersensitivity
Uchimoto et al. Considering the effect of stem-loop reverse transcription and real-time PCR analysis of blood and saliva specific microRNA markers upon mixed body fluid stains
JP2013090622A (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
JP2018528780A (ja) 短いホモポリマー反復の改良された検出
Zhang et al. Optical biosensor based on the dual-functional gold nanoparticles for rapid and accurate multiplex detection of influenza A and B viruses
EP3596228B1 (en) Method for rapid identification of microorganisms producing nuclease enzymes
Santini et al. Innovative microRNA purification based on surface properties modulation
KR101546887B1 (ko) 산화효소 활성을 가지는 산화세륨 나노입자를 이용한 핵산 및 생체물질 검출방법
Li et al. A “Turn-on” fluorescence sensing strategy based on DNA-templated silver nanoclusters for the detection of antibiotic resistance genes
Xie et al. Strategy for the detection of mercury ions by using exonuclease III-aided target recycling
JP5151167B2 (ja) Ｄｎａメチル化測定方法
CN107723341A (zh) 一种检测单碱基突变的方法
Stafford-Allen et al. Development of HyBeacon® probes for specific mRNA detection using body fluids as a model system
Ren et al. Dual-signal, one-step simultaneous monitoring of genetic mutation in multiple gene regions using Fe3O4@ Au and MOF