ITTO950207U1 - Corredi e dispositivi per monitorare il ciclo di ovulazione e loro impiego - Google Patents

Description

DESCRIZIONE del trovato industriale dal titolo : "Corredi e dispositivi per monitorare il ciclo di ovulazione e loro impiego" .

CAMPO DEL TROVATO Questo trovato si riferisce a procedimenti, dispositivi e corredi di prova per l'uso nel.monitoraggio del ciclo di ovulazione in mammiferi femmina specialmente umani.

Il trovato riguarda in particolare, ma non solamente, semplici procedure pratiche che possano essere applicate con facilità da persone inesperte, per esempio in casa, per . fornire informazioni affidabili che riguardano lo stato di fertilità come aiuto nella contraccezione. Uno scopo importante del trovato è quello di fornire tali informazioni pur evitando la necessità di condurre prove su base frequente (per esempio quotidiana) durante tutto il ciclo di ovulazione. La necessità di prove regolari, per esempio i cicli successivi) e vari mutamenti fisiologici quali le caratteristiche della mucosa vaginale.

Sono stati 'svolti molti eccellenti studi accademici utilizzando tali parametri. Tali studi hanno stabilito come;è possibile correlare questi parametri con lo stato di fertilità di un elemento medio di un ampio'campione di popolazione. Un esempio è Collins (et al (1981), Proc. Xth International Congress on Fertility and Sterility, Pubi MTP Ltd, p 19-;33. Uno scopo sottostante in molti di tali studi è quello di sviluppare la concezione in individui prima considerati come sterili.

Tuttavia, nel tentativo di sviluppare un sistema'di monitoraggio pratico adatto all'uso da parte di individui, si è scoperto che molti individui soggetti non si uniformano alla media in termini di durata del ciclo e/o durata e tempi della fase fertile.! L'ampiezza della variazione tra un indivìduo e un altro e, inoltre, tra un ciclo e un altro, rende i dati medi relativi alla popolazione troppo inaffidabili per un uso pratico consistente.

Comprensibilmente, poiché le pesanti conseguenze di un avvertimento imperfetto riguardante lo stato di fertilità possono essere uno stato di gravidanza indesiderata, la tendenza è stata quella di esercitare un'estrema cautela e implicare prove di parametri rilevanti o parametri durante l'intera estensione del ciclo, e in modo particolare esattamente dal momento in cui inizia il ciclo (inizio delle mestruazioni). Dal punto di vista del singolo utente, sarebbe vantaggioso se si potesse evitare la necessità di tali prove costanti e, invece, 'svolgere le prove durante una porzione comparativamente breve di ciascun ciclo. Questo può produrre benefici per l'utente non solamente in termini di convenienza, ma è possibile anche ridurre il costo del procedimento se il procedimento utilizza dispositivi di saggio a perdere e si implica durante ciascun mese solamente un piccolo·numero di tali disposativi di saggio a perdere.

Un esempio·di sistema per la rilevazione dell'inizio dell'ovulazione, che utilizza pastiglie idrogonfiabili per "misurare" il contenuto idrico del muco vaginale, che apparentemente aumenta al momento dell'ovulazione, viene descritto in US 4151833 (Polishuk). Vi si afferma che la variazione di picco delle dimensioni delle pastiglie, come conseguenza dell'assorbimento di acqua da parte del muco cervicale, è, strettamente correlata all'aumento del LH e la variazione della temperatura basale del corpo. Dai dati' sperimentali forniti in US 4151833 (figura 8), appare chiaro che il diametro della pastiglia è tuttavia strettamente correlato al momento di aumento del LH, e di conseguenza il sistema proposto non può fornire in pratica un avvertimento affidabile dell'inizio dell'ovulazione in momenti precedenti rispetto a quanto si ottiene, da una conoscenza della concentrazione del LH.

In EP-A-385621 (Coley et al / Unilever) si descrivono i difetti dei sistemi di monitoraggio del ciclo di ovulazione che si basano principalmentè sul cambiamento nella BBT per la stima del tempo di ovulazione, e ivi proponiamo un sistema che utilizza misurazione della BBT regolari insieme a una conoscenza di altri parametri, in particolare la misurazione di alcuni livelli degli ormoni urinari. Uno scopo particolare è quello di misurare quotidianamente della BBT per tuttaila durata di ciascun ciclo e utilizzarla per stimare i tempi dei cambiamenti nello stato di fertilità durante un ciclo successivo. Nel corso di questo ciclo successivo (predetto), si controllano i livelli degli ormoni urinari in alcuni istanti per confermare che il progredire del ciclo, come predetto dalla precedente conoscenza della BBT, è consistente. Ormoni scelti particolari sono E3G, P3G e LH. Si suggerisce la misurazione del livello dell'E3G urinario almeno un giorno durante l'intervallo che va dal giorno 5 al giorno 7 del ciclo predetto, e nuovamente almeno un giorno durante l'intervallo compreso tra il giorno 10 e il giorno 15 del ciclo predetto. Secondo l'esempio in EP 385621, è sufficiente che il livello ormonale sia o "alto" o "basso" rispetto a !un valore di soglia. In tutto EP 385621 l'enfasi ·è posta dal fatto che si utilizzano misurazioni del livello ormonale occasionali per integrare un sistema di monitoraggio che si:affidi a misurazioni della BBT. Non si suggerisce il fatto che le misurazioni dell'ormone da sole potrebbero fornire la base per un affidabile sistema di monitoraggio della fertilità personalizzato per un soggetto individuale.

SCOPI DEL TROVATO

Uno scopo del presente trovato è quello di fornire un sistèma per il monitoraggio dello stato di fertilità di un soggetto individuale, che fornisca un avvertimento dell'inizio della fase fertile per permettere di fornire un avvertimento contraccettivo e che possa essere personalizzato sul soggetto individuale, pur essendo unicamente basato su misurazioni di un analito di un fluido del corpo. Si può quindi evitare l'inaffidabilità inerente, o la limitata utilità, di altri sistemi di misurazione (quali BBT). Un ulteriore scopo è quello di evitare l'uso di dati medi ottenuti da studi sulla popolazione, con il rischio inerente che in un soggetto individuale, i parametri di saggio possano variare in modo considerevole rispetto alla norma della popolazione.

Un altro scopo del trovato è quello di fornire un sistema, di monitoraggio che sia "a prova di errore", ih termini di avviso all'utente dell'inizio della <:>fase fertile, senza privare l'utente dei benefici di una semplice procedura complessiva e regime di saggio limitato.

Un ulteriore scopo è quello di fornire l'opzione di basare un sistema di monitoraggio efficace solamente, o almeno principalmente, sulla misurazione di un unico analito del corpo, quale estradiolo o un relativo metabolita. Altri vantaggi del trovato appariranno chiari dalla seguente descrizione.

Un altro scopo del trovato è quello di fornire un regime di prova che costituisca un buon bilanciamento tra il desiderio di minimizzare i problemi del la prova per l'utente e la necessità di fornire all'utente un avvertimento utile riguardante lo stato di fertilità.

Un altro scopo del trovato è quello di fornire un procedimento e dispositivi per determinare la presenza e/o la concentrazione di due o più analiti in un unico liquido campione quando almeno uno degli analiti è un analito multivalente che può essere facilmente determinato per mezzo di due agenti leganti specifici differenti in un complesso "a forma di sandwich", mentre un altro degli analiti è un analito monovalente, quale aptene, che non può essere condotto a determinazione attraverso una reazione a sandwich.

È un ulteriore scopo del trovato quello di fornire tale procedimento/dispositivo di saggio a doppio analito in cui si utilizza un'etichetta diretta in particelle per rilevare il risultato di entrambi i saggi.

L'uso di etichette dirette in particelle è già noto in sistemi di saggio più semplici. Talvolta, l'uso di etichette dirette in particelle permette la facile valutazione a occhio del risultato del saggiò. Questo può anche essere il caso durante saggi !secondo il presente trovato, sebbene si prospetti il fatto che in generale i risultati del saggio verranno più facilmente e convenientemente valutati strumentalmente.

Ancora un’Ulteriore scopo del trovato è quello di fornire un procedimento/dispósitivo di saggio in cui si' possano determinare analiti multipli in un unico campione di liquido in modo accurato in un dispositivo di saggio sotto forma di striscia che venga interpretato strumentalmente utilizzando radiazione elettromagnetica (per esempio luce) trasmessa attraverso lo spessore della striscia di saggio. Il materiale della striscia può essere trasparente o traslucido. L'estensione del legame delle etichette in particelle in una zona di rilevazione di una striscia può fornire un risultato del saggio quantitativo, poiché le particelle possono arrestare la luce o altra radiazione e quindi ridurre la trasmissione della radiazione attraverso la striscia.

Un altro scopo del trovato è quello di produrre combinazioni migliorate di dispositivi per la lettura dei risultati di saggi e dispositivi di prova dei campioni associati che possano fornire informazioni di saggio quantitative accurate in modo semplice, rapido e economicamente efficace.

DESCRIZIONE.GENERALE DEL TROVATO

A solo scopo di illustrazione, si descriverà il trovato in relazione alla misurazione di analisi urinari, e specialmente "E3G" (estrone-3-glucuronide) e "LH" (ormone luteinizzante) .

Oltre all'estrone-3-glucuronide già citato, metaboliti dell'estradiolo che si possono anche saggiare per gli scopi del trovato includono estradiolo-3-glucuronide, estradiolo-17-glucuronide, estriolo-3-glucuronide, estriolo-16-glucuronide, e (principalmente in soggetti non umani) estrone-3-solfato. Come si apprezzerà dalla presente descrizione, il trovato può facilmente essere applicato a dati ricavati dalla misurazione di concentrazioni in fluidi del corpo o altri analiti aventi significato riguardo allo stato del ciclo di ovulazione. Generalmente, gli analiti più adatti sono ormoni e i loro metaboliti. L'ormone follicolostimolante (FHS) è un esempio. Esempi di fluidi del corpo alternativi, che siano relativamente accessibili, sono saliva, fluido crevicolare, sudore, sebo, lacrime, e fluido vaginale. In principio si possono utilizzare fluidi' interni, quali il sangue, ma generalmente non sono preferiti, poiché l'accesso ad essi può avvenire solamente per mezzo di tecniche invasive.

Il lettore esperto avrà anche apprezzato il fatto che non è necessario misurare in termini assoluti la "concentrazione" nel fluido del corpo dell'analito o analiti scelti, sebbene si possa fare ciò se lo si 1desidera. Generalmente, sarà sufficiente saggiare un analito in modo che fornisca un segnale, convertibile in dati numerici, correlato alla concentrazione effettiva, in modo tale da poter comparare i dati con dati simili ottenuti in ;corrispondenza di uno stadio differente nel ciclo per determinare se o no si è verificato un cambiamento significativo nella concentrazione effettiva. Di conseguenza, nel caso in cui la descrizione e le rivendicazioni seguenti si riferiscano alla "concentrazione" di un analito, questa espressione dovrebbe essere interpretata in senso ampio.

Secondo un aspetto, il trovato fornisce un corredo di prova per l'uso nel monitoraggio del ciclo di ovulazione di un mammifero umano, in modo speciale un umano, che comprende una moltitudine di dispositivi di prova a perdere per il campionamento e la prova di fluidi del corpo, quali urina, e fornire segnali leggibili indicativi delle concentrazioni di almeno due analiti nel .fluido del corpo, detti analiti essendo significativi rispetto allo stato di fertilità del ciclo di ovulazione, insieme a un lettore/monitor elettronico ’per la lettura e l'interpretazione di detti segnali leggibili per fornire all'utente indicazioni 'relative a detto stato di fertilità, ,in cui:

a) detti segnali leggibili vengono letti mentre uno tra detti dispositivi di prova è posizionato in mezzi di ricezione di detto lettore/monitor;

b) detti segnali leggibili vengono creati concentrando 'un primo materiale rilevabile, preferibilmente un reagente marcato, in una prima zona di rilevazione di un supporto poroso, quale una striscia di prova, in detto dispositivo di prova e concentrando un secondo materiale rilevabile, preferibilmente un reagente marcato, in una seconda zona di rilevazione di detto supporto poroso, mentre detto fluido del corpo campionato sta scorrendo, per esempio per capillarità, attraverso detto supporto poroso, e detta seconda zona di rilevazione preferibilmente trovandosi a valle rispetto a detta prima zona di rilevazione rispetto a una porzione di ricezione di detto dispositivo di prova che entra in contatto con detto fluido del corpo per iniziare la prova;

c) detto primo segnale della zona di rilevazione è indicativo della concentrazione nel fluido del corpo di un primo analito, preferibilmente ormone luteinizzante (LH), che presenta un cambiamento di concentrazione significativo strettamente associato al tempo di ovulazione effettivo.; e

d) detto secondo segnale della zona di rilevazione è significativo della concentrazione in un ‘fluido del corpo di un secondo analito, preferibilmente estradiolo o un relativo metabolita quale estrone-3-glucuronide (E3G), che presenta un cambiamento significativo nella concentrazione prima dell'inizio della fase fertile di detto ciclo di ovulazione.

Preferibilmente, detti segnali leggibili vengono letti per mezzo di trasmissione ottica attraverso detto dispositivo di prova. Idealmente, per ottenere questo, il lettore/monitor comprende:

a) una sorgente di luce diffusa avente una lunghezza d'onda che venga fortemente assorbita da detti materiali rilevabili;

b) mezzi di rilevazione per la rilevazione di luce,incidente da detta sorgente;

c) mezzi per ricevere e trattenere detto dispositivo di prova con ciascuna di dette zone di rilevazione immersa in un percorso luminoso tra detta sorgente e detto sensore; e d) mezzi elettronici connessi a detti mezzi di rilevazione, detti mezzi elettronici - essendo programmati per derivare dalla luce incidente rilevata una misura del punto fino al quale il materiale istaccabile si è concentrato in ciascuna di dette zone di rilevazione.

Preferibilmente detti segnali leggibili vengono creati concentrando reagenti inarcati in particelle nelle rispettive zone di rilevazione.

Preferibilmente il corredo di prova contiene una moltitudine sufficiente di dispositivi di prova a perdere da permettere a un utente di condurre prove su base quotidiana per un massimo di 16 giorni durante un qualsiasi ciclo di ovulazione. Una forma di attuazione importante del trovato è costituita da un pacchetto di rifornimento, che contiene una moltitudine, preferibilmente non più di 12, e idealmente 7 a 10, di dispositivi di prova a perdere per completare un corredo di prova preferibilmente insieme a istruzioni per l'utente per l'uso di tutti i detti dispositivi di prova durante lo svolgersi di un ciclo di ovulazione.

Il trovato fornisce anche un procedimento per il monitoraggio del ciclo umano di ovulazione, utilizzando un corredo di prova come descritto in precedenza in cui le prove vengono svolte almeno una volta durante l'intervallo che copre i giorni 1 a 7 inclusi calcolati dall'inizio delle mestruazioni, per stabilire un valore o segnale di concentrazione di riferimento di detto secondo analito durante il ciclo attuale, detta prova viene momentaneamente sospesa, e quindi si compie la prova almeno una volta (preferibilmente quotidianamente) durante un periodo di giorni che parte almeno 5, preferibilmente 6 giorni numerici prima del giorno numerico medio in cui si è verificata<' >l'ovulazione effettiva durante uno o più dei cicli di ovulazione precedenti nello stesso soggetto individuale, i valori o i segnali della concentrazione del secondo anelito ottenuti durante detto periodo di giorni essendo comparati con il valore o segnale di concentrazione di riferimento per determinare se si sta verificando o si è verificato a partire dalla prova precedente un cambiamento della concentrazione indicativo dell'ovulazione imminente. Come prestazione preferita a prova di errore, si dichiara l'inizio della fase fertile se il cambiamento significativo atteso nella concentrazione del secondo analito non è stato rilevato prima di ‘almeno 2, preferibilmente almeno 3, giorni prima del giorno numerico durante il ciclo attuale in cui è previsto che si verifichi il ciclo di ovulazione effettivo, in base a conoscenze 'derivate dalle misurazioni della concentrazione del primo analito ottenuta durante uno o più cicli precedenti.

Più generalmente, il trovato fornisce un procedimento per il monitoraggio dello stato di fertilità di un soggetto mammifero femmina individuale, che implica prove relative alla concentrazione -nei, fluidi del corpo di un analito, specialmente estradìolo o un relativo metabolita, nel quale procedimento detta prova viene condotta almeno una volta durante l'intervallo che copre i giorni 1 a 7 inclusi del ciclo attuale, per stabilire un valore o segnale di concentrazione di riferimento per il ciclo attuale, e detta prova viene anche condotta nel seguito durante il· ciclo attuale, dopo una temporanea cessazione, e si compara il valore o segnale di concentrazione ottenuto con il valore o segnale di riferimento.

Un aspetto ;importante del trovato è un procedimento per il ·monitoraggio della stato attuale di fertilità di una femmina umana individuale, che implica la prova della concentrazione di fluidi del corpo dì estradìolo o un relativo metabolita e la comparazione dei risultati della prova con un valore o segnale di riferimento per accertare se è presente una concentrazione 'elevata indicativa di un'ovulazione imminente, in cui il valore o il segnale di concentrazione di riferimento del ciclo attuale vengono stabiliti provando la concentrazione dei fluidi del corpo nello stesso individuo almeno una volta durante l'intervallo che si estende dal giorno 1 al giorno 7 inclusi del ciclo attuale.

In una forma di attuazione preferita il trovato fornisce un procedimento per il monitoraggio dello;stato di fertilità attuale di un mammifero femmina individuale, che implica la rilevazione della variazione di un parametro indicativo di un imminente ingresso nella fase fertile, in cui si dichiara l'inizio della fase fertile se il cambiamento del parametro atteso non è stato rilevato prima di almeno 2, preferibilmente 3, giorni prima del giorno numerico durante il ciclo attuale in cui si prevede che si verifichi l'ovulazione effettiva, in base a conoscenze ottenute durante i cicli precedenti sullo stesso individuo. Per lo scopo di prevedere il giorno di ovulazione, è possibile utilizzare la procedura di "giorno di ovulazione medio" descritta qui nel seguito . Si può combinare questa dichiarazione a prova di errore della fase fertile per ottenerne vantaggio con una qualsiasi delle ;tecniche di monitoraggio del ciclo descritte qui nel seguito.

Più in particolare il trovato fornisce un procedimento periil monitoraggio dello stato di fertilità attuale di una femmina umana individuale, che ;implica la prova della concentrazione nei fluidi del corpo di estradiolo o un relativo metabolita e la comparazione dei risultati della prova con un valore o segnale di riferimento per accertare se è presente una concentrazione elevata indicativa di un'imminente ovulazione, in cui ;si stabilisce il valore o segnale di riferiménto del ciclo attuale per mezzo della concentrazione nel fluido del corpo nello stesso individuo almeno una volta durante l'intervallo che copre i giorni 4 a 7 inclusi, preferibilmente i giorni 5 e/o 6, del ciclo attuale, si ricomincia la prova il giorno 9 del ciclo attuale e la si continua dopo questo almeno su base quotidiana almeno fino a quando si rileva una concentrazione significativamente elevata, e si dichiara che lo<1 >stato del ciclo attuale è "fertile" per l'intervallo che parte dal giorno di rilevazione della concentrazione significativamente elevata e per almeno i 12 giorni immediatamente successivi o fino a quando si è ottenuta l'evidenza della terminazione del ciclo (per esempio; inizio delle mestruazioni), qualsiasi si verifichi prima.

Un altro aspetto importante del trovato è un procedimento per la contraccezione umana, che implica:

a) prova della concentrazione urinaria dell'estradiolo o ,un relativo metabolita nel partner femmina almeno una volta durante l'intervallo che copre i giorni 4 a 7 inclusi, preferibilmente durante i giorni 5 e/o 6, del ciclo attuale per stabilire un valore o segnale di riferimento del ciclo attuale;

b) il , provare la concentrazione urinaria nuovamente almeno su base quotidiana a partire dal giorno 9 del ciclo attuale e continuando fino al giorno 15 (preferibilmente il giorno 14) di ciclo attuale; e

c) evitare rapporti senza protezione durante l'intervallo che dura almeno Ί2 giorni immediatamente dopo il giorno in cui si è rilevata una concentrazione urinaria significativamente ,elevata o, se non viene rilevata una concentrazione urinaria significativamente 1 elevata dal giorno 15 (preferibilmente il giorno 14), evitare rapporti non protetti durante l'intervallo che dura almeno 14, preferìbilmente 15, giorni immediatamente dopo il giorno 15 (preferibilmente il giorno 14), in ogni caso ' l'intervallo terminando opzionalmente in anticipo nel caso in cui si ottenga evidenza di terminazione del ciclo (per esempio inizio delle mestruazioni).

In una prima forma di attuazione, il trovato fornisce ’un procedimento per il monitoraggio dello stato di fertilità di un soggetto mammifero individuale femmina, che implica la prova di concentrazione in fluidi del corpo di almeno un analito significativo rispetto allo stato del ciclo di ovulazione durante la fase di pre-ovulazione, in cui si conduce' la prova di detto analito almeno una volta durante l'intervallo che copre i giorni 1 a 7 inclusi del ciclo attuale calcolato a partire dall'inizio delle mestruazioni (il giorno 1 essendo il giorno durante il quale per primo si osservano le mestruazioni), per stabilire un segnale o valore della concentrazione di riferimento di detto analito durante il ciclo attuale e in seguito si conduce la prova almeno una volta (generalmente ripetutamente, per esempio quotidianamente) prima di un giorno in cui è probabile che si verifichi l'ovulazione durante il ciclo, i valori o segnali di concentrazione dell'analito ottenuti durante detta ultima o ripètuta prova essendo comparati con il valore o segnale di concentrazione di riferimento per determinare se si sta verificando o se si è verificato un cambiamento nella concentrazione indicativo dell'ovulazione a partire dalla prova precedente.

In una forma di attuazione preferita, il trovato fornisce un procedimento per il monitoraggio dello stato di fertilità di un soggetto femmina individuale, che implica la prova di concentrazione in fluidi del corpo di almeno un analito avente relazione significativa con lo stato del ciclo di ovulazione durante la fase pre-ovulazione, in cui si conduce la prova di questo analito; almeno una volta durante l'intervallo che copre i giorni 1 a 7 inclusi calcolato a partire dall'inizio delle mestruazioni (il giorno 1 essendo il giorno in cui per la prima volta si osservano le mestruazioni), per stabilire un valore o segnale di concentrazione di riferimento di detto analito durante il ciclo attuale, e quindi si conduce la prova almeno una volta (generalmente in maniera ripetuta, per esempio quotidianamente) durante un periodo di giorni che parte almeno 5, e più preferibilmente 6, giorni numerici prima del giorno numerico medio durante il quale si è verificata l'ovulazione effettiva in uno o più cicli di ovulazione precedenti nello stesso soggetto individuale, valori o segnali della concentrazione dell'analito ottenuti durante detto periodo di giorni essendo comparati con il valore o segnale di concentrazione di.riferimento per determinare se si sta verificando-o se si è verificato a partire dal la prova precedente un cambiamento nella concentrazione indicativo di un'ovulazione imminente. Generalmente, non è necessario cominciare le prove ripetute prima di circa 9 giorni prima del ciclo di ovulazione medio .

Preferibilmente, si stabilisce il valore di concentrazione di riferimento con una prova(e) condotta durante l'intervallo che copre i giorni 4 a 7 inclusi, più preferibilmente da una prova(e) condotta durante il giorno 5 e/o 6, e più preferibilmente da una singola prova condotta durante il giorno 6.

Si noterà in generale un cambiamento significativo nella -concentrazione dell'analito indicativo dell'ovulazione imminente, particolarmente appropriato quando l'analito è estradiolo o un relativo metabolita, quando il rapporto tra concentrazione di riferimento [r] e concentrazione di prova [i] soddisfa i seguenti criteri:

In particolare, specialmente nel caso in cui l'analito è E3G e il valore di riferimento viene stabilito il giorno 6:

Se il formato di saggio scelto per mezzo del .quale si ottengono i dati relativi alla concentrazione produce un segnale che è inversamente proporzionale alla concentrazione effettiva, come può avvenire in saggi per competizione, il lettore esperto apprezzerà il fatto che la relazione tra i segnali di [i] e [r] sarà l'inverso di quella fornita in precedenza.

Si prospetta in generale che vi-sarà un intervallo di almeno un giorno, e più usualmente diversi giorni, tra la valutazione del valore di concentrazione di riferimento e l'inizio delle prove a ripetizione, durante il quale intervallo non è necessario svolgere prove. Così, nella situazione ideale, l'utente svolge una singola prova in corrispondenza di uno stadio precoce del ciclo, per esempio il giorno 6, e alcuni giorni più tardi comincia una successione relativamente breve di prove ripetute, cioè quotidiane, che termina dopo la derivazione di una quantità sufficiente di informazione per l'identificazione della fase fertile, preferibilmente includente un'identificazione del termine della fase fertile durante quel ciclo. Tipicamente, questa fine delle prove avverrà' il giorno dell'aumento del LH, o pochi giorni più tardi, cosicché il resto del ciclo non prevede prove.

In modo conveniente, il fluido del corpo può essere urina. Un analito molto adatto è perciò l'estradiolo o un relativo metabolita, quale estrone-3-glucuronide.

Preferibilmente, in una forma di attuazione del trovato, si deriva il giorno di ovulazione medio dai dati raccolti durante almeno 3, e più preferibilmente almeno 5, cicli precedenti consecutivi.

Idealmente; il giorno di ovulazione medio utilizzato per il calcolo dell'intervallo di tempo allo scopo del ciclo attuale viene derivato dai dati ottenuti durante almeno il ciclo immediatamente precedente.

Un procedimento particolarmente conveniente implica la determinazione del giorno di ovulazione medio da dati ottenuti da una base di riferimento a rotazione" che consiste di un numero fisso di cicli consecutivi immediatamente precedenti al ciclo attuale. Preferibilmente, questa base ruotante consiste dei 3 a 12 cicli immediatamente precedenti, più preferibilmente i 5 o 6 cicli immediatamente precedenti. Mantenendo tale base di riferimento a rotazione, si può rilevare qualsiasi "deriva" progressiva nel presentarsi dell'ovulazione nell'individuo in questione e tenerne conto nel posizionamento del giorno di inizio delle prove successivo.

Il trovato include un corredo di prova che comprende uno o più dispositivi di prova per determinare la concentrazione (in termini relativi o assoluti) di almeno detto un analito in detto fluido del- corpo, insieme a.istruzioni che avvisano l'utente dì. cominciare dette prove durante detto intervallo di tempo, e mezzi che permettono a detto utente di derivare detto intervallo di tempo e/o un preciso giorno di inizio delle prove ;dalla conoscenza del giorno numerico durante il quale si è verificata l'ovulazione effettiva durante almeno un ciclo di ovulazione precedente dell'utente.

Un altro' aspetto indipendente del trovato, che può essere comunque incorporato per avvantaggiarsi con qualsiasi procediménto descritto in precedenza, implica:

a) il fornire l'utente di una moltitudine di dispositivi di prova di un fluido del corpo a perdere, detta moltitudine essendo preferibilmente almeno pari a 7, ma preferibilmente non maggiore di 12; e

b) dirigere l'utente all'uso di tutti i detti dispositivi di prova forniti durante un ingolo ciclo di ovulazione, secondo una procedura di prova predeterminata, indipendentemente dal fatto che si sia ottenuta un'indicazione di un'ovulazione imminente prima dell'uso di tutti i detti dispositivi di prova forniti.

Preferibilmente, si dirige l'utente allo svolgimento di una prova durante il giorno 6, e all'uso di tutti i rimanenti dispositivi di prova su base quotidiana durante il periodo di prova ripetuto.

Il trovato fornisce anche un corredo per l'uso in uno qualsiasi dei procedimenti descritti in precedenza, comprendente una moltitudine di dispositivi di prova di fluidi del corpo a perdere, insieme a mezzi per la lettura e l'interpretazione dei risultati delle prove svolte utilizzando detti dispositivi di prova.

Il trovato comprende anche un pacchetto di rifornimento dì dispositivi di prova di fluidi del corpo a perdere per l'uso in uno qualsiasi dei procedimenti descritti in precedenza, con istruzioni per l'utente per l'uso di tutti i detti dispositivi di prova a perdere contenuti durante il corso di un singolo ciclo di ovulazione. Preferibilmente il pacchetto non contiene più di 12 dispositivi di prova, più preferibilmente almeno 7 ma non più di 10 dispositivi.

Richiedendo all'utente di utilizzare tutti quelli di un gruppo di lavorazione o insieme singolo dal piccolo numero dei dispositivi di prova a perdere per ciclo, si conseguono vantaggi sìa per l'utente che per il fabbricante dei dispositivi. L'utente consegue benefici poiché si' semplifica la procedura di prova "mensile" - non c'è necessità di prendere decisioni sul momento in cui arrestare le prove ripetute, o relative all'uso durante cicli successivi di dispositivi di prova avanzati da cicli precedenti. Per il fabbricante, si assicura che i dati da un singolo ciclo vengano derivati da un pacchetto di lavorazione singolo dei dispositivi di prova, così eliminando i problemi relativi alla standardizzazione che potrebbero altrimenti sorgere, e riducendo la complessità di qualsiasi dispositivo di prova necessario per l'interpretazione dei dati. Non si implica alcuna attività da parte dell'utente per assicurare la calibrazione dei saggi. I dispositivi di prova a perdere possono essere forniti in pacchetti di rifornimento "mensili" standard, snellendo l'operazione di impacchettamento. Poiché si elimina il problema dei dispositivi di prova "avanzati", si evita anche una causa possibile di richieste da parte dell'utente.

Un vantaggio dei procedimenti del presente trovato è costituito dal fatto che si può conseguire il monitoraggio effettivo del ciclo di ovulazione utilizzando dati derivati unicamente dalla misurazione della concentrazione (i) di un analito nel fluido del corpo. Non è necessario combinare questi dati con altri parametri. In particolare, non è necessario aggiungere a questi dati con misurazioni di routine della temperatura basale.

Adottando un valore di riferimento della concentrazione dai dati nella parte iniziale del ciclo attuale, i procedimenti del trovato evitano la necessità di calibrazione e assicurano che il riferimento della linea di base sia personale per il soggetto in prova. Questo conduce a un'indicazione più chiara del significativo cambiamento di concentrazione pre-ovulazione, rispetto ai procedimenti proposti in precedenza basati su misurazioni quotidiane.

L'analito scelto per fornire un avvertimento dell'ovulazione imminente non è critico per il trovato, avendo fatto sì che l'analito fornisca un cambiamento di concentrazione rilevabile nell'intervallo di tempo compreso tra l'inizio delle prove (come qui determinato) e un periodo sicuro prima dell'ovulazione effettiva durante il ciclo attuale.

È possibile applicare il trovato in un procedimento qualsiasi per il monitoraggio dello stato dell'attuale ciclo di ovulazione di un soggetto femmina individuale che implica la misurazione di un analito di un fluido del corpo avente significato rispetto allo stato del ciclo di ovulazione e che presenta un cambiamento rilevabile durante la fase pre-ovulazione che si presenta almeno 2 e preferibilmente 3 giorni prima del giorno dell'ovulazione effettiva.

Si fornisce la seguente descrizione, solamente a titolo di esempio, rispetto agli ormoni urinari E3G, ormone luteinizzante (LH), e pregnandiolo-3-glucuronide (P3G), sebbene si apprezzerà facilmente il fatto che è possibile utilizzare i principi del procedimento rispetto ad altri segnalatori biomedici, per esempio gli ormoni estradiolo e progesterone, che si trovano per esempio nel sangue o nella saliva. È possibile utilizzare il procedimento del trovato in combinazione con osservazioni di altri segni fisiologici del livello di fertilità di una femmina, del quale è a conoscenza, o del quale può essere facilmente avvertita di, per esempio segnalatori in altri fluidi del corpo.

È possibile determinare l'ovulazione per mezzo di uno qualsiasi dei parametri chimici o fisiologici noti, sebbene un procedimento preferito sia la misurazione del livello di LH. Una volta rilevata l'aumento del LH, si può dire che l'ovulazione è imminente. Inoltre, si può annotare per futuro riferimento il giorno del ciclo in cui si è verificata l'ovulazione. Se si rileva l'aumento del LH, e quindi si annota il giorno dell'ovulazione in modo accurato, si può indicare all'utente con un elevato grado di certezza il fatto che il soggetto non sarà più fertile per quattro giorni da allora (3 giorni dopo l'ovulazione). A scopi pratici, si può trattare la concentrazione urinaria di LH di 20 mIU/ml come soglia universale indicativa dell'aumento del LH virtualmente in tutte le circostanze.

Si utilizza qui l'espressione "aumento del LH" per indicare l'improvvisa crescita nella concentrazione del LH che precede l'evento dell'ovulazione. Nella tecnica, si fa anche riferimento al "massimo di LH", cioè la concentrazione di picco del LH. Nella maggior parte degli individui, questi sono a tutti gli scopi pratici simultanei, quando il ciclo viene controllato su base quotidiana. Tuttavia, in pochi individui, forse 20% della popolazione, la concentrazione di picco di LH effettiva non viene osservata fino al giorno seguente la crescita principale di concentrazione. Agli scopi del trovato, preferiamo l'uso della crescita osservabile come parametro critico.

Alternativamente, o in più, si può dichiarare la fine della fase fertile sulla base della conoscenza della concentrazione dell'estradiolo (o un relativo metabolita), durante il ciclo corrente. In modo conveniente, questa può .essere dichiarata in un giorno scelto che segue un. valore della concentrazione di picco. Poiché la concentrazione di picco dell'E3G urinario, per esempio, sembra essere un evento meno facilmente rilevabile dell'aumento del LH, si può definire il "picco" di E3G per riferimento al valore di soglia, determinato per esempio dalla relazione

assumendo che il "picco" si presenta il giorno in cui per la prima volta questa relazione viene soddisfatta durante il regime di prova adottato durante il ciclo attuale. Si applicherà la relazione inversa se il segnale di E3G è inversamente proporzionale alla- concentrazione effettiva. In alcuni casi questo può avvenire nel giorno stesso della rilevazione della crescita significativa di E3G indicativa dell'ovulazione imminente. Quando si è rilevato il "picco" di E3G, si può assumere che la fase fertile sia terminata il sesto, o con maggiore sicurezza il settimo o l'ottavo giorno successivo. In questa forma di attuazione, il trovato fornisce l'opzione di un procedimento per il monitoraggio della fertilità durante il ciclo attuale basata unicamente sui dati derivati dai saggi su estradiolo/metaboliti . Per una procedura a prova di errore, basata sulla conoscenza del giorno di ovulazione durante i cicli precedenti, si può utilizzare il picco di E3G, poiché questo si presenta tipicamente circa 1 giorno prima dell'ovulazione effettiva.

Un altro procedimento per prevedere la fine del periodo fertile (sebbene non con -la stessa accuratezza del giorno dell'ovulazione) è quello di misurare i livelli dell'ormone urinario P3G . P3G presenta un livello relativamente basso nell'urina fino alla partenza della fase luteale, nel quale momento il suo livello cresce abbastanza ripidamente. Perciò, una volta che si è rilevato un livello abbastanza elevato di P3G, si può indicare all'utente che è iniziata la fase luteale del ciclo - cioè il periodo sterile terminale Si può basare un livello elevato di P3G urinario su dati rilevati durante il ciclo attuale e/o uno o più dei cicli precedenti. Si può registrare un livello di P3G "elevato", per esempio , o quando il livello di P3G rilevato è maggiore della somma dei quattro livelli rilevati precedenti del P3G durante lo stesso ciclo mestruale, o maggiore di 3500 ng/ml, qualsiasi di queste due soglie sia la più bassa e sia raggiunta per prima. Una volta registrato il livello di P3G "elevato"·, si può avvertire il soggetto del fatto che sarà sterile per il resto di quel ciclo.

Se lo si desidera, si può utilizzare la rilevazione del LH o del P3G come segnale di monitoraggio per indicare che il soggetto non è più fertile fino alla fine del ciclo, con un ormone che agisce come "rincalzo" per l'altro. Tuttavia, si preferisce utilizzare la rilevazione di LH come indicatore primario del fatto che l'ovulazione stia per avvenire, poiché la rilevazione stessa di LH si offre a una determinazione più accurata del giorno esatto dell'ovulazione rispetto all'uso di P3G.

Procedimenti per la rilevazione di analiti di fluidi del corpo, quali metaboliti degli ormoni urinari, adatti allo scopo di questo procedimento, sono ben noti a coloro che sono esperti nella tecnica. In una forma di attuazione preferita, si rileva l'analito per mezzo di procedimenti di saggio e dispositivi come descritti nel brevetto britannico GB 2204398 e la richiesta di brevetto europeo EP-A-383619.

Nel caso in cui il procedimento del trovato si basa sulla misurazione di un componente dell'urina, questa dev'essere effettuata su un campione di urina, è disponibile una moltitudine di tecniche di immunosaggi che permettono la misurazione di componenti dell'urina. Nella letteratura è stata descritta un'ampia varietà di dispositivi di prova in fase solida quali aste di livello e strisce cromatografiche, e possono facilmente essere adattate all'uso nella determinazione di analiti urinari. Il dispositivo dovrebbe poter almeno indicare livelli relativi dell'analito, per esempio E3G, in bande di soglia. Esempi di semplici tecnologie di saggio che possono facilmente essere adattate all'uso domestico vengono descritti, per esempio, in EP-A-225054, EP-A-183442, EP-A-186799 e EP-A-291194. Si possono utilizzare strisce di saggio a perdere quali quelle descritte in EP-A-291194 che richiedono semplicemente di essere poste a contatto con l'urina e che forniscono un risultato del saggio in forma·semi-qualitativa, per esempio per mezzo di una serie di zone di prova della striscia che sono progressivamente positive in corrispondenza di livelli superiori dell'analito urinario. Si possono utilizzare strisce multiple che rispondono a soglie di analito differenti, piuttosto che una singola striscia. Alternativamente, si può basare un saggio quantitativo leggibile a vista su una progressione di una regione o "fronte" visibile, per esempio colorata, su una superficie ‘(per esempio diffusione radiale), utilizzando per esempio un saggio marcato con enzimi.

In una forma di attuazione più sofisticata del trovato, si fornisce un dispositivo di registrazione che incorpora mezzi per la lettura del risultato del saggio dell'urina, per esempio misurando l'assorbanza di per mezzo di o la fluorescenza da una striscia di saggio. Questo può permettere di fornire un'indicazione numerica più precisa del livello dell'analito, e inoltre migliorare l'accuratezza del procedimento.

In una forma di attuazione in cui si misurano simultaneamente due o più analiti, è possibile realizzare tale misurazione se lo si desidera utilizzando un unico dispositivo di prova di un fluido del corpo, per esempio un dispositivo che incorpora strisce di saggio multiple, o un'unica striscia che può rilevare in modo indipendente il livello degli analiti differenti.

DESCRIZIONE GENERALE DI UN FORMATO DI SAGGIO PREFERITO

In una forma di attuazione, questo aspetto del trovato si riferisce in particolare ai saggi in forma di striscia- per la determinazione degli analiti monovalenti quali gli apteni.

In un'altra forma di attuazione, il trovato si riferisce in particolare a saggi migliorati in cui determinano simultaneamente due o più analiti nello stesso campione.

Quando un saggio è destinato alla rilevazione della presenza e/o quantità di un solo analito in un liquido campione, è relativamente facile configurare le condizioni di seggio per ottenere questo risultato e eliminare l'effetto di altri componenti che possono essere presenti nel campione. Tuttavia, quando si desidera utilizzare un unico dispositivo di saggio per determinare più di un analito differente nello stesso liquido campione lo "scopo" di bilanciare le condizioni per assicurare che le reazioni di saggio separate procedano in modo efficiente ed efficace è molto più difficile, specialmente in saggi in forma di striscia.

In un'altra forma di attuazione, il trovato fornisce un saggio in forma di striscia per un analito monovalente (aptene) che utilizza un'etichetta diretta in particelle per la rilevazione del risultato del saggio, nel quale saggio le etichette in particelle trasportano un anticorpo specifico per l'analito monovalente e la zona di rilevazione della striscia contiene un analito immobilizzato o un analogo relativo. Ciascuna particella dell'etichetta trasporta una molteplicità di identiche etichette dell'anticorpo. Come reagente, è possibile standardizzare le particelle che trasportano l'anticorpo durante la fabbricazione (cioè durante l'applicazione di anticorpi alle particelle) per assicurare che in un gruppo'di lavorazione un dato carico di anticorpi attivi sia costante. La concentrazione dell'analito o dell'analogo dell'analito dovrebbe superare la concentrazione effettiva (concentrazione molare) di anticorpi sulle particelle.

Non è essenziale avere un carico di anticorpi costante su ciascuna particella, poiché è possibile variare il numero di particelle. La quantità di anticorpo marcato in particelle nel saggio dovrebbe essere superiore, rispetto alla concentrazione anticipata dell'analito nel campione. Questi livelli possono essere regolati per mezzo di sperimentazione in modo tale che la presenza di analito libero nel liquido campione conduce a un livello significativo di legame dell'analito libero sugli anticorpi sulle particelle e perciò inibisca significativamente il legame possibile dell'etichetta in particelle con 1'analito/analogo immobilizzato nella zona di rilevazione. Il principio sottostante al saggio è il fatto che sulla particella media esiste un numero sufficiente di molecole di anticorpo attive per assicurare il legame delle particelle nella zona di rilevazione, ma che ciononostante la presenza di analito sul campione presenta un effetto di limitazione di questo legame. Il punto fino al quale le particelle si legano sulla zona di rilevazione è perciò inversamente proporzionale alla concentrazione di analito nel liquido campione. In un saggio in forma di striscia, si posiziona l'anticorpo marcato in particelle a monte rispetto alla zona di rilevazione in modo tale che il campione di liquido marcato incontra il materiale marcato in particelle e lo trasporta verso la zona di rilevazione. In questa configurazione di saggio è necessario assicurare che la razione potenziale tra l'analito libero e l'anticorpo marcato in particelle sia almeno sostanzialmente completa prima che questi reagenti raggiungano la zona di rilevazione. Il punto al quale le particelle si legano all'analito/analogo immobilizzato nella zona di rilevazione dipende perciò dall'anticorpo non complessato che rimane sulle particelle. È necessario assicurare che la concentrazione di analito/analogo immobilizzato nella zona di rilevazione sia alta, così da promuovere una cattura efficiente delle particelle mentre attraversano questa zona. Per migliorare l'efficienza del legame precedente dell'anticorpo marcato in particelle all'analito libero nel liquido campione, è molto desiderabile che l'anticorpo sulle particelle abbia un'affinità molto alta per l'anelito. Questa affinità è preferibilmente almeno pari a circa 10<9>, e più preferibilmente almeno circa 10<10>, litri/mole. L'uso di tali anticorpi ad alta affinità assicura una cattura efficiente dell'anelito libero per mezzo delle particelle, e inoltre assicura che nelle condizioni di. saggio, una volta che le molecole dell'analito si sono legate a un anticorpo della particella, è molto improbabile che vengano rilasciate o scambiate con una molecola di analito/analogo mentre la particella attraversa la zona di rilevazione.

I principi generali del trovato descritti in precedenza si applicano anche a saggi che sono destinati a determinare due o più analiti, almeno uno di essi essendo monovalente.

In una forma di attuazione, il trovato fornisce un procedimento per determinare la presenza e/o la concentrazione di due o più analiti in un unico liquido campione, quale un campione di urina, almeno uno di detti analiti potendo essere determinato per mezzo di una reazione di legame in forma di sandwich che implica due reagenti di legame specifici per differenti epitopi su detto analito e almeno un altro di detti analiti essendo un aptene (e. perciò non facilmente determinabile per mezzo di una reazione di legame in formato di sandwich), il quale procedimento comprende i passi di:

a) fornire un dispositivo che comprende una striscia di materiale poroso lungo il quale può migrare detto liquido campione, la striscia avendo due o più zone di rilevazione spazialmente distinte (almeno una per analito da determinare) posizionate a valle rispetto al punto di somministrazione del liquido campione a detta striscia, delle quali zone:

i) almeno una zona contiene un agente di cattura immobilizzato che è un agente di legame specifico di detto primo analito o un agente di legame specifico che può catturare un complesso in forma di sandwich che include detto primo analito, e

ii) almeno un'altra zona contiene un agente di cattura immobilizzato che è o l'aptene· o un relativo analogo;

b) fornire due-o più popolazioni di particelle che possono migrare attraverso detta striscia con detto liquido campione, delle quali popolazioni:

i) almeno una prima popolazione porta un agente legante specifico di detto primo analito, o specifico per un altro agente legante specifico che può partecipare a una reazione in forma di sandwich con detto primo analito, e ii) almeno una popolazione differente porta un agente legante specifico di detto aptene; e

c) far sì che dette popolazioni di particelle rimangano in sospensione in detto liquido campione e migrino con detto liquido campione attraverso detta striscia; la presenza di detto liquido analito in detto liquido campione portando al legame di dette particelle in detta almeno una zona di rilevazione in quantità direttamente proporzionale alla concentrazione di detto primo analito in detto liquido campione, e la presenza di detto aptene in detto liquido campione comportando una riduzione del legame di dette particelle di detta almeno una altra popolazione in detta altra zone di rilevazione .in quantità direttamente proporzionale alla concentrazione di detto aptene in detto liquido campione, la zona di rilevazione contenendo l'aptene immobilizzato o l'analogo dell'aptene immobilizzato che viene posto preferibilmente a valle rispetto alla zona di rilevazione associata al primo analito.

Un esempio del primo analito è l'ormone luteìnìzzante (LH). Un esempio di secondo analito è l'estradiolo o un relativo metabolita, quale estrone-3-glucuronide (E3G).

Preferibilmente le particelle sono particelle di lattice, che possono essere colorate.

Più preferibilmente, l'affinità dell'agente legante antiaptene specifico è di circa 10<9>, preferibilmente circa 10<10>, litri/mole.

Preferibilmente il punto di legame delle particelle in dette zone di rilevazione è determinato dalla misurazione dell'estinzione della radiazione elettromagnetica, quale luce, quando trasmessa attraverso lo spessore di detta striscia.

Il trovato fornisce anche un dispositivo di saggio per l'uso nella determinazione di due o più analiti in un unico liquido campione, almeno uno di detti analiti essendo determinabile per mezzo di una reazione di legame in formato di sandwich che implica due reagenti di legame specifici per differenti epitopi su detto analito e almeno un altro di detti analiti essendo un aptene (e perciò non determinabile facilmente per mezzo di una reazione di legame in forma di sandwich), il. dispositivo comprendendo in un involucro protettivo:

a) una striscia di materiale poroso lungo la quale può migrare un liquido campione;

b) due o più zone di rilevazione (almeno una per analito da determinare) su detta striscia, posizionate a valle rispetto al punto di somministrazione di detto liquido campione a detta striscia, delle quali zone:

i) almeno una zona contiene un agente di cattura immobilizzato che è un agente di legame specifico di detto primo analito o un agente di legame specifico che può catturare un complesso in forma di sandwich che include detto primo analito, e

ii) almeno un'altra zona contiene un agente di cattura immobilizzato che è o l'aptene o un relativo analogo;

c) due o più popolazioni di particelle, posizionate a monte rispetto a dette zone di rilevazione, che possono migrare attraverso detta striscia con detto liquido campione, delle quali popolazioni:

i) almeno una prima popolazione porta un agente legante specifico di detto primo analito, o specifico per un altro agente legante specifico anch'esso presente nel dispositivo e che può partecipare a una reazione in forma di sandwich con detto primo analito, e

ii) almeno un'altra popolazione porta un agente legante specifico di detto aptene; e

la presenza di detto primo analito in detto liquido campione portando al legame di particelle in detta almeno una zona di rilevazione in quantità direttamente proporzionale alla concentrazione di detto primo analito in detto liquido campione, e la presenza di detto aptene in detto liquido campione comportando una riduzione nel legame delle particelle di detta almeno un'altra popolazione in detta altra zone di rilevazione in quantità direttamente proporzionale alla concentrazione di detto aptene in detto liquido campione, la zona di rilevazione contenendo l' aptene o l'analogo •dell'aptene immobilizzato essendo preferibilmente posizionata a valle rispetto alla zona di rilevazione associata la primo analito.

Preferibilmente il materiale della striscia è almeno traslucido nel suo spessore. Un materiale della striscia ideale è la nitrocellulosa .

Poiché il saggio dell'aptene non è una reazione in competizione in cui esiste la possibilità di un libero interscambio tra l'analito nel campione e l'analito fornito come reagente nel saggio (in questo caso l'analito/analogo immobilizzato sulla striscia) è essenziale che nel corso del saggio si forniscano opportunità sufficienti al "legame dell'analito con le particelle che trasportano anticorpi prima che queste particelle incontrino la zona di rilevazione rilevante sulla striscia. Per assicurare ciò è desiderabile avere a disposizione un tempo di contatto comparativamente lungo tra il reagente in particelle il campione. Di conseguenza nei lìmiti di una geometria accettabile del dispositivo di saggio la zona di rilevazione che contiene l'analito analogo dovrebbe essere il più distante dalla sorgente del reagente marcato in particelle possibile. In particolare, nel caso in cui il dispositivo di saggio sia destinato a determinare due o più analiti nello stesso liquido campione e si determina almeno uno degli altri analiti per mezzo della reazione dal formato a sandwich, la zona di rilevazione dell'aptene dovrebbe idealmente trovarsi a valle della zona o delle zone di rilevazione richieste sui saggi in formato di sandwich.

Una forma di attuazione particolare del trovato è perciò un saggio in formato di striscia a doppio analito per determinare LH e E3G in un campione di urina applicato in cui si rilevano i risultati dei due saggi in zone di rilevazione specialmente distinte della striscia e la zona dell'E3G si trova a valle rispetto alla zona di. rilevazione del LH rispetto al punto di somministrazione del liquido campione.

Dispositivi di saggio che comprendono

«una striscia di materiale poroso lungo la quale può migrare un liquido quale un campione di saggio per diffusione o per capillarità così da portare uno o più reagenti di saggio in una piccola zona di rilevazione della, striscia, vengono ora ampiamente utilizzati per l'analisi qualitativa e semi quantitativa degli analiti che possono essere rilevati per mezzo di saggi a sandwich in fase solida. Quando si utilizzano etichette dirette, quali soluzioni colloidali di oro e particelle di lattice colorate, tali saggi possono rilevare il risultato in forma facilmente leggibile all'occhio umano. Il risultato viene conseguito concentrando il materiale rilevabile nella regione relativamente piccola del materiale di supporto poroso.

In una forma di attuazione, Il trovato fornisce un saggio quantitativo in forma di striscia in cui il risultato del saggio viene rilevato per mezzo di legame in una zona di rilevazione di un reagente marcato che possiede punti di legame attivi multipli specifici dell'analito in prova. L'etichetta è una microparticella rilevabile, quale una particella di lattice (colorata), una soluzione colloidale metallica (per esempio di oro), una soluzione colloidale di colorante, o particelle di un elemento non metallico (per esempio carbonio, selenio), dalle dimensioni sufficientemente piccole da permettere la migrazione attraverso il materiale della striscia poroso ma sufficientemente grandi da permettere la formazione di un risultato finale rilevabile quando il materiale marcato rimane concentrato nella zona di rilevazione. Sono ideali etichette in particelle dei tipi già utilizzati nei saggi a sandwich in formato di striscia.

In un saggio tipico secondo il trovato, si forniscono i molteplici punti di legame specifici attivi nel reagente marcato utilizzando una molteplicità di anticorpi identici, preferibilmente anticorpi specifici (per esempio monoclonali), attaccati a ciascuna particella dell'etichetta.

Contrariamente a quanto ci attenderebbe, abbiamo scoperto che specialmente in un saggio all'aptene l'uso di etichette in particelle che possiedono molteplici punti di legame specifici dell'anelito attivi identici comporta una crescita della sensibilità molto accentuata. Riteniamo che i punti di legame in eccesso sulle particelle dell'etichetta permetta un legame effettivo della particella nella zona di rilevazione che trasporta l'aptene. Tuttavia, forse a causa della geometria del sistema, che può essere visualizzata come superficie della zona di rilevazione piana e particelle dell'etichetta più o meno sferiche, il precedente legame di una relativamente piccola quantità di analito di aptene da un campione sulla superficie incurvata della particella dell'etichetta genera un certo grado di inibizione del legame delle particelle dell'etichetta nella zona di rilevazione sufficiente a influenzare il legame e generare un effetto rilevabile.

Crediamo che sia altamente desiderabile il fatto che una volta che la molecola dell'analito si è legata in modo specifico alla particella dell'etichetta, rimanga legata in questo modo per tutto il resto Sei protocollo di saggio fino alla formazione del risultato del saggio rilevabile nella zona di rilevazione. Un modo per raggiungere questo scopo è attraverso l'uso di uno specifico agente legante nel reagente marcato che presenti un'affinità molto elevata per l'analito. È ora convenzionale l'uso di anticorpi monoclonali aventi affinità all'analito di 10<8>. Abbiamo scoperto che è vantaggioso l'uso, nel contesto dì un saggio con aptene in forma di striscia, di agenti di legame specifici marcati aventi affinità con l'analito pari almeno a circa 10<9 >e più preferibilmente almeno circa 10<10>, litri/mole . Un buon procedimento per la misurazione dell'affinità in soluzione viene descritto in Friguet et al, J. Immunological Methods, voi 77 (1985) pp. 305-319. Si possono coltivare anticorpi monoclonali aventi tali affinità elevate in modo convenzionale e identificati da procedure di selezione normali. Sebbene sia desiderabile l'uso di anticorpi che presentano alta affinità in soluzione, questo non è il solo modo per conseguire questo aspetto del trovato. Si è osservato occasionalmente che è possibile trasformare un anticorpo che presenta un affinità relativamente bassa in soluzione nelle sue proprietà effettive quando immobilizzato in fase solida.

Una forma di attuazione importante del trovato è costituita da saggio in forma di striscia quantitativo per analiti di fluidi del corpo umano, specialmente aptene. Un esempio particolare è costituito da un tale saggio per estradiolo o un relativo metabolita quale estrone-3-glucuronide (E3G). Una forma di attuazione specialmente importante del trovato è un saggio in forma di striscia per E3G urinario che può determinare in modo quantitativo l'E3G in un campo di concentrazione di 5-60 ng/ml di urina; Tale saggio è particolarmente adatto all'uso in procedure destinate a fornire un utente di conoscenza dello stato di fertilità di un ciclo di ovulazione, la concentrazione nel fluido del corpo dell'estradiolo o del relativo metabolita essendo riconosciuta come indicatore utile di tale stato.

Se lo si desidera, un dispositivo di saggio secondo il trovato, come descritto in precedenza, può inoltre includere la possibilità di determinare altri analiti nello stesso campione, se, appropriato utilizzando tecnologia del saggio a sandwich. Per esempio, una forma di attuazione del trovato è un dispositivo di saggio in formato a striscia _ che può fornire una determinazione quantitativa dell'E3G urinario, come descritto in precedenza, e simultaneamente una determinazione quantitativa dell'ormone luteinizzante urinario (LH) per mezzo di· una procedura di, saggio a sandwich, i risultati di E3G e LH essendo rilevati in due zone di rilevazione differenti. In modo conveniente, in tale saggio combinato, l'etichetta può essere la stessa per ciascun saggio, sebbene il lettore esperto apprezzerà naturalmente il fatto che si richiderebbero normalmente due popolazioni di particelle di etichetta, una sostenente punti di legame molteplici dell'E3G e l'altra sostenente un materiale di legame specifico del LH. La zona di rilevazione dell'E3G conterrà E3G immobilizzato o un relativo analogo, e la zona di rilevazione di LH conterrà materiale legante specifico immobilizzato, quale un anticorpo anti-LH.

DESCRIZIONE GENERALE DI UN SISTEMA DI LETTURA DEI RISULTATI DEL SAGGIO

Questo aspetto dell'invenzione si riferisce a dispositivi per la lettura dei risultati di saggi, e dispositivi di saggio-per l'uso insieme a dispositivi di lettura-I dispositivi di saggio per uso domestico quali prove di gravidanza sono relativamente ben noti. Nel caso di prove di gravidanza, che deve fornire all'utilizzatore un risultato "si/no", la tecnologia ora disponibile permette la lettura del risultato del saggio facilmente a occhio nudo senza necessità di alcuna apparecchiatura di supporto.

I saggi per uso domestico hanno lo scopo di rilevare cambiamenti fisiologici nel corpo umano, con lo scopo di far migliorare le condizioni di salute, una generale buona condizione o stile di vita dell'individuo. I consumatori stanno diventando sempre più consapevoli della salute, e l'abilità del consumatore nel monitoraggio del proprio o delle proprie funzioni corporali viene ora incoraggiata. In alcuni casi questo può facilitare l'interazione tra il singolo consumatore e la professione medica (GP).

Esistono molti saggi indicativi dì cambiamenti fisiologici nel corpo umano che al momento attuale possono essere svolti solamente utilizzando tecniche di laboratorio sofisticate. Per fornire informazioni utili che riguardano l'individuo in prova, e generalmente necessario che tali saggi forniscano un risultato in termini numerici precisi, per esempio la concentrazione di un analito specifico in un fluido corporeo.

Di conseguenza esiste la necessità di un sistema di saggio, applicabile specialmente alla prova di campioni di fluidi di corpo in casa, che combini la convenienza della prova di campioni insieme a determinazione numerica semplice ed efficace in quanto a costo dei risultati del saggio.

Nella letteratura tecnica vengono descritti molti dispositivi di saggio con suggerimenti i base ai quali il risultato del saggio può essere letto utilizzando apparecchiature ottiche. Si suggerisce spesso l'uso di emissione fluorescente, o riflettanza luminosa. Tali tecniche sono più appropriate per l'uso in laboratori sofisticati. In EP-A-212599 che descrive elementi analitici multizonali aventi una zona di concentrazione del segnale rilevabile, si suggerisce il fatto che un segnale rilevabìle indicativo del risultato del saggio nella zona può essere misurato per mezzo di radiazione elettromagnetica, quale luce, trasmessa attraverso quella zona. EP-A-212599 indica che l'elemento può essere realizzato con materiali fibrosi porosi, quali carta e nitrocellulosa. Tuttavia, non si forniscono dettagli pratici per indicare come si può realizzare una misurazione accurata utilizzando la luce trasmessa.

Abbiamo scoperto che si può derivare informazione quantitativa dalla lettura per trasmissione di una striscia di saggio o simili se la radiazione elettromagnetica incidente è uniforme su una regione della striscia di prova che comprende e si estende oltre la zona di prova.

In una forma di attuazione, il trovato fornisce un procedimento di "lettura" dei risultati di un saggio realizzato concentrando un materiale rilevabile in una zona relativamente piccola di un supporto sotto forma di striscia, foglio o strato attraverso lo spessore del quale può essere trasmessa radiazione elettromagnetica, quale luce, in cui viene esposta almeno una porzione di una superficie di detto supporto a radiazione elettromagnetica incidente che è sostanzialmente uniforme sull'intera porzione, detta porzione includendo detta zona, e la radiazione elettromagnetica che emerge dalla superfìcie opposta di detto supporto viene misurata per determinare detto risultato del saggio.

Preferibilmente, la radiazione elettromagnetica incidente ha intensità sostanzialmente uniforme.

Questa uniformità può essere ottenuta, per esempio, fornendo una sorgente collimata di radiazione elettromagnetica, utilizzando mezzi di focalizzazione convenzionali quali lenti e guide di luce per fornire una radiazione elettromagnetica incidente parallela che ricada essenzialmente normalmente sulla intera porzione esposta del supporto.

Tuttavia, in una forma di attuazione preferita del trovato, la radiazione elettromagnetica incidente viene diffusa e inonda la porzione esposta in modo uniforma in modo diffuso casualmente.

In un'altra forma di attuazione, il trovato fornisce un dispositivo di saggio comprendente una striscia o foglio di supporto porosa permeabile ai liquidi o foglio attraverso lo spessore dei quali si può trasmettere radiazione elettromagnetica in modo diffuso, detto supporto trovandosi in un involucro, detto supporto includendo almeno una zona di rilevazione in cui si rileva un risultato di un saggio per mezzo di un legame specifico di un materiale rilevabile direttamente o indirettamente con un agente legante immobilizzato in una zona di<' >rilevazione, la rilevazione di detto materiale essendo realizzata come risposta a " detta radiazione elettromagnetica, e detto involucro avendo regioni di trasmissione della radiazione elettromagnetica che permettono la trasmissione di energia elettromagnetica da una sorgente esterna attraverso detto dispositivo, detta zona di rilevazione trovandosi nel percorso della radiazione elettromagnetica t-ra dette regioni di trasmissione della radiazione elettromagnetica.

Preferibilmente, la striscia o foglio di supporto porosi- comprendono carta, nitrocellulosa o simili, con uno spessore che preferibilmente non supera 1 mm.

Ancora in un'altra forma di attuazione, il trovato, fornisce una combinazione di un dispositivo di saggio e un dispositivo di lettura dei risultati del saggio, in cui:

a) detto dispositivo comprende una strìscia o foglio di supporto permeabile ai liquidi porosa attraverso lo spessore della quale si può diffusamente trasmettere radiazione elettromagnetica, detto supporto trovandosi preferibilmente in un involucro o copertura, detto supporto includendo almeno una zona di rilevazione in cui si rileva un risultato del saggio per mezzo di un legame specifico di un materiale rilevabile direttamente o indirettamente a un agente legante immobilizzato rispetto a detta zona di rilevazione;

b) detto involucro o copertura, se presente, ha regioni di trasmissione della radiazione elettromagnetica che permettono la trasmissione di radiazione elettromagnetica da una sorgente esterna attraverso detto dispositivo, detta zona di rilevazione trovandosi in un percorso compreso tra dette regioni di trasmissione;

c) detto dispositivo di lettura dei risultati del saggio presenta mezzi di ricezione per ricevere almeno una porzione di detto dispositivo, detta porzione includendo detta zona di rilevazione per presentare detta zona di rilevazione ai mezzi di lettura, detti mezzi di lettura incorporando una sorgente di radiazione elettromagnetica uniforme e uno o più sensori posiziona.ti in modo tale che all'inserimento di detto dispositivo in detti mezzi di ricezione, si può far passare radiazione elettromagnetica attraverso detto dispositivo e l'intensità della radiazione elettromagnetica che fuoriesce da detto dispositivo può essere rilevata da detto sensore (sensori).

Preferibilmente, detti mezzi di ricezione incorporano mezzi di interblocco che possono essere impegnati da mezzi di interblocco corrispondenti su detto dispositivo per assicurare che al momento della ricezione di detto dispositivo da parte di detto lettore detta zona (zone) di rilevazione è posizionata e mantenuta in disposizione spaziale predeterminata rispetto a detti mezzi di lettura,

Preferibilmente, detti mezzi riceventi includono mezzi di azionamento azionati dal ricevimento di detto dispositivo, detti mezzi di azionamento facendo iniziare la lettura di detta zona (zone) di rilevazione.

Se il dispositivo di saggio è fornito di un involucro, è vantaggioso se detto involucro del dispositivo include mezzi di registrazione interna che impegnano mezzi di registrazione corrispondenti associati a detto supporto in modo tale che detta zona di rilevazione di detto involucro del dispositivo è posizionata in relazione spaziale predeterminata rispetto a detti mezzi di registrazione su detto involucro del dispositivo. Preferibilmente, detti mezzi di registrazione interna comprendono un piedino o simili, che possono essere impegnati da un foro, un'indentazione o simili su detto supporto, detta zona di rilevazione trovandosi in corrispondenza di una posizione predeterminata su detto supporto rispetto a detto foro o indentazione.

Durante la fabbricazione di detto dispositivo di saggio, si possono utilizzare detti mezzi di registrazione corrispondenti per facilitare o controllare una formazione accurata, per esempio per mezzo di tecniche di stampa a reagenti, di detta zona di rilevazione su detto supporto. Inoltre, o alternativamente, si può facilitare un posizionamento accurato di detto supporto in detto involucro del dispositivo o può essere controllato per mezzo di detta registrazione .

In un'ulteriore forma di attuazione, il trovato fornisce un dispositivo di lettura dei risultati del saggio, per l'uso con un dispositivo di saggio che comprende una striscia o foglio di supporto permeabile ai liquidi porosa o foglio attraverso lo spessore della quale si può trasmettere radiazione elettromagnetica, detto supporto includendo una zona di rilevazione in cui si rileva un risultato del saggio per mezzo di legame specifico dì un materiale rilevabile direttamente o indirettamente su un agente legante immobilizzato rispetto a detta zona dì rilevazione, la rilevazione di detto materiale essendo realizzata come risposta a detta radiazione elettromagnetica, detto dispositivo di lettura dei risultati del saggio comprendendo:

a) mezzi di ricezione per ricevere almeno una porzione di detto dispositivo di saggio, detta porzione includendo detta zona di rilevazione;

b) mezzi di lettura associati a detti mezzi di ricezione, detti mezzi di ricezione comprendendo:

i) almeno una sorgente di radiazione uniforme diffusa (preferibilmente elettromagnetica; e

ii) uno o più sensori che possono rilevare l'intensità di detta radiazione elettromagnetica;

detta sorgente e detto sensore (sensori) essendo posizionati in modo tale che quando detta porzione di detto dispositivo di saggio è ricevuta entro detti mezzi riceventi, detta zona di rilevazione è disposta su un percorso tra detta sorgente e detto sensore (sensori).

La combinazione di lettore/dispositivo di saggio può essere fornita al consumatore come un unico corredo di prova. In generale, tuttavia, mentre il lettore costituirà un'unità relativamente permanente che il consumatore può utilizzare più volte (e che può essere fornito di una possibilità di elaborazione dei dati/memoria elettronica che permette la valutazione dei risultati di molteplici saggi sequenziali) i dispositivi di prova saranno destinati ad essere utilizzati una sola volta e quindi buttati<’ >via. Di conseguenza, i dispositivi di prova possono essere forniti al consumatore separatamente rispetto al lettore, per esempio in confezioni multiple.

Assicurando un interblocco preciso tra il dispositivo di'prova e il lettore, e inoltre assicurando una precisa registrazione della posizione della zona di rilevazione nel dispositivo di prova stesso, la zona di prova sarà presentata al lettore in posizione predeterminata costante ogni volta che un dispositivo di prova viene inserito nel lettore. La realizzazione del sistema ottico nel lettore (sorgente luminosa e sensori) può quindi essere mantenuta nel modo più semplice possibile, poiché non è essenziale che i sensori includano alcuna possibilità di scansione, per esempio, che verrebbe altrimenti richiesta se non fosse nota la posizione esatta della zona di rilevazione. Eliminando la necessità di un sistema di lettura ottico sofisticato, si può ridurre il costo del lettore/dispositivo di monitoraggio. La semplificazione del sistema di lettura ottico può anche permettere al lettore/dispositivo di monitoraggio di avere dimensioni ridotte che favoriranno un uso conveniente e che non crea disagio in casa. Naturalmente, si può includere una possibilità di scansione nel lettore se lo si desidera.

Un beneficio aggiuntivo del fornire un sistema di registrazione interna che assicuri un posizionamento preciso della zona di rilevazione nel dispositivo di prova, è il fatto che si può facilitare una fabbricazione automatizzata e il monitoraggio di qualità dei dispositivi di prova. Poiché si prospetta, per esempio, nel caso di un dispositivo di monitoraggio di un ciclo di ovulazione, che il consumatore avrà bisogno di utilizzare diversi dispositivi di prova ogni mese, può essere necessario fabbricare i dispositivi di prova in grandi quantità a basso costo. La registrazione interna può facilitare una fabbricazione automatizzata e un'alta disponibilità .

In principio, si può utilizzare qualsiasi radiazione elettromagnetica per realizzare la misurazione per trasmissione nel trovato. La radiazione elettromagnetica dovrebbe preferibilmente poter essere resa diffusa. Preferibilmente la radiazione elettromagnetica è costituita da luce nel campo visibile o quasi visibile. Questo include luce infrarossa e luce ultravioletta. Si prospetta generalmente che il materiale rilevabile utilizzato come etichetta nel saggio è uno che interagirà con la luce nel campo visibile o praticamente visibile, per esempio per assorbimento. La lunghezza d'onda della radiazione elettromagnetica scelta è preferibilmente prossima o corrispondente a una lunghezza d'onda che viene fortemente influenzata, per esempio assorbita, dall'etichetta. Per esempio, se l'etichetta è una sostanza che è fortemente colorata, cioè visibile all'Occhio umano nudo quando il materiale .è concentrato, la radiazione elettromagnetica ideale è una luce di lunghezza d'onda complementare.

Etichette dirette in particelle, per esempio, soluzioni colloidali metalliche (per esempio oro), soluzioni colloidali di elementi non metallici (per esempio selenio, carbonio), soluzioni colloidali di coloranti e particelle di lattici colorati (polistirene) sono esempi ideali. Per esempio, nel caso di particelle di lattice colorate di blu, la radiazione elettromagnetica ideale è la luce rossa visibile che verrà fortemente assorbita dalle particelle blu.

In una forma di attuazione preferita del trovato, la radiazione elettromagnetica trasmessa che raggiunge il sensore (sensori) dovrebbe essere diffusa. La diffusione può verificarsi come conseguenza della trasmissione della radiazione elettromagnetica attraverso al striscia o il foglio di supporto, ma piu preferibilmente ha un contributo della sorgente della radiazione elettromagnetica che emette l'energia in forma fortemente diffusa. In una forma di attuazione preferita del trovato la sorgente produce radiazione fortemente diffusa e la striscia di supporto o foglio di supporto attraverso cui la radiazione viene,in seguito trasmessa è in termini comparativi un diffusore molto più debole.

Un vantaggio principale nell'uso di luce diffusa o altra radiazione nel contesto del trovato è il fatto che la lettura del saggio risulta molto meno probabilmente influenzata in modo avverso da materiali di contaminazione o macchie sul dispositivo di saggio. Per esempio, polvere o graffi sul dispositivo di saggio della regione attraverso cui la radiazione deve essere trasmessa potrebbero interferire fortemente con l'accuratezza del risultato determinato se si utilizza luce focalizzata piuttosto che diffusa. Per mezzo dell'uso di una sorgente di luce diffusa secondo il trovato, è possibile fornire un dispositivo di lettura del saggio che può interpretare accuratamente il risultato di un saggio condotto anche in un dispositivo di saggio essenzialmente trasparente senza che il risultato del saggio venga influenzato in modo avverso da contaminazione o danni minori {per esempio graffi superficiali) sul dispositivo di saggio.

In una forma di attuazione preferita del trovato, la radiazione elettromagnetica dalla sorgente viene pulsata. Sincronizzando i rilevatori (sensori) cosicché funzionino solamente in fase con la sorgente,di radiazione pulsata, è possibile eliminare qualsiasi interferenza di fondo che potrebbe essere generata da radiazione esterna, per esempio luce ambientale. Si suggerisce che i saggi vengano principalmente condotti in circostanze di luce naturale o, anche più spesso, luce artificiale. La luce artificiale è generalmente di natura pulsata (tipicamente 50-100 Hertz) a causa della natura alternante delle alimentazioni elettriche. Adottando una sorgente di radiazione pulsata per l'illuminazione del dispositivo di saggio nel lettore, si può ignorare l'intrusione di luce naturale. Selezionando la frequenza di impulsamento in modo tale che sia sufficientemente diversa dalla luce artificiale prevalente, si può anche evitare qualsiasi interferenza dovuta a luce artificiale. Preferibilmente, la frequenza di· impulso della <‘>luce dovrebbe essere di almeno 1 kHz. Una frequenza di impulsamento ideale è pari a circa 16 kHz. L'elettronica necessaria per ottenere rilevazione pulsata sincrona è familiare a coloro che sono esperti nella tecnica.

L'uso di luce pulsata è molto vantaggioso poiché non rende necessario che il dispositivo di monitoraggio sia "impermeabile alla luce". Non solo questo semplifica la realizzazione del dispositivo di monitoraggio ma la lettura del risultato del saggio può essere svolta mentre il dispositivo di monitoraggio è "aperto", così semplificando il funzionamento per 1'utilizzatore.

La sorgente di luce o altra radiazione elettromagnetica può comprendere componenti completamente convenzionali. Esempi ideali sono LED disponibili in commercio, preferibilmente scelti per fornire una lunghezza d'onda adatta alla luce che venga fortemente assorbita dal materiale rilevabile concentrato nella zona (zone) di prova. La luce proveniente dai LED dovrebbe essere fatta passare attraverso un forte diffusore prima di raggiungere il dispositivo di saggio. Se desiderato, si può utilizzare un gruppo di LED che vengono alimentati uno per volta.

Elementi di diffusone adatti possono essere realizzati, per esempio, con materiali plastici, e sono disponibili in commercio. Se necessario, le proprietà di diffusione della luce del materiale di diffusione possono essere migliorate includendo materiali in particelle quali ossidi di titanio e solfato di bario. Un materiale di diffusione ideale comprende poliestere o policarbonato, contenente biossido di titanio. Un buon livello di inclusione del materiale in particelle è di almeno 1% in peso, preferibilmente circa 2%. Per mezzo dell'uso di un diffusore, si possono rilevare tutte le regioni rilevanti di una striscia di saggio simultaneamente, e le differenze dell'emissione luminosa dalla sorgente vengono eliminate.

Il sensore (sensori) per rilevare la luce emergente possono essere componenti convenzionali quali fotodiodi, per esempio fotodiodi al silicio.

Preferibilmente, viene posizionato un secondo diffusore, che può essere realizzato con lo stesso materiale del diffusore primario, di fronte al sensore (sensori). Questo assicura che la vista rilevata dal sensore non venga influenzata dalla presenza o assenza di una strìscia di prova nella testa di lettura. Di conseguenza, il dispositivo di monitoraggio può essere calibrato in assenza di una striscia di prova, e quindi migliorare un risultato di saggio in presenza di una striscia di saggio.

Utilizzando una sorgente di luce uniforme secondo il trovato, è possibile fornire un sistema di lettura per strisce di prova e simili che sia relativamente tollerante rispetto alle variazioni nel posizionamento della zona (zone) di prova da una striscia all'altra, in assenza di un sensore di scansione. Si ottengono ulteriori benefici se viene controllato il posizionamento della zona di prova, come qui descritto.

Allo scopo di migliorare la probabilità della concezione, sono già stati commercializzati dispositivi di saggio che permettono all'utilizzatore di controllare la concentrazione urinaria di ormone luteinizzante (LH) che presenta un netto picco approssimativamente un giorno prima dell'ovulazione. Si conduce una prova quotidiana della concentrazione di LH, per esempio utilizzando una tecnologia a "asta di livello" il risultato essendo fornito da una punta terminale colorata, l'intensità del colore essendo proporzionale alla concentrazione di LH. Fornendo al consumatore un grafico dei colori che permette la comparazione del risultato quotidiano con uno standard, si può rilevare semplicemente a occhio 1' "aumento del LH". Sfortunatamente, il monitoraggio della concentrazione di LH è un esempio molto raro di saggio che si fonda su dati semi-quantitativi che può essere condotto con tale semplice tecnologia, essendo possibile solamente perchè in termini di concentrazione relativa l'aumento del LH è un tale evento drammatico. Per la maggior parte di altri saggi potenzialmente utili i cambiamenti nella concentrazione dell'analito nei fluidi del corpo sono molto più sottili rilevabili solamente accuratamente con mezzi strumentali.

Esiste perciò la necessità di estendere la tecnologia di prova per uso domestico qualitativa attualmente disponibile nell'area di prove quantitativamente precise. Un esempio conveniente, che costituisce un'estensione logica dell'interesse del consumatore attuale nella prova di gravidanza domestica e la prova di predizione ,dell'ovulazione, è l'estensione del monitoraggio accurato del ciclo di ovulazione, non solamente per controllare la probabilità di concentrazione ma anche per fornire informazioni affidabili a scopo di contraccezione. Sono state avanzate proposte di analizzare fluidi del corpo tenendo questo scopo presente. Un tema comune è quello di controllare fluttuazioni periodiche in vari livelli di metaboliti dell'ormone nell'urina.

Il trovato può essere utilizzato per determinare qualsiasi analito in un fluido del corpo, specialmente nel monitoraggio del ciclo di ovulazione umana determinando uno o più ormoni o metaboliti relativi in un fluido del corpo, quale l'urina, per esempio o LH e/o estrone-3-glucuronide (E3G).

Nel contesto preferito del presente trovato si sottolinea il fatto che un dispositivo di prova di un liquido campione per uso domestico includerà un materiale di supporto poroso, quale una striscia, attraverso il quale un liquido campione quale urina può permeare e in cui il risultato del saggio si presente per mezzo di legame specifico di un materiale rilevabile in una regione definita con precisione (zone di rilevazione) del supporto, quale una stretta striscia o un piccolo punto, contenente un reagente legante specifico immobilizzato. Il trovato riguarda perciò i modi in cui è possibile determinare la posizione di un materiale rilevabile in tale, zona di rilevazione in modo accurato in modo semplice e efficace dal punto di vista del costo. Dispositivi per uso domestico per le analisi delle urine, per esempio in test di gravidanza e test di predizione dell'ovulazione, sono ora ampiamente disponibili in commercio. Molti di tali dispositivi sono basati sui principi dell'immunocromatografia, e tipicamente comprendono un involucro cavo realizzato in materiale plastico che contiene una striscia di saggio porosa che sostiene reagenti predosati. I reagenti nel dispositivo possono includere uno o più reagenti marcati con un etichetta diretta, quale una soluzione colloidale di un colorante, una soluzione colloidale metallica (per esempio oro) o microparticelle di lattice colorate, (per esempio polistirene), che siano visibili all'occhio quando concentrate in un'area di prova relativamente piccola della striscia. L'utilizzatore deve solamente applicare un campione di urina a una parte dell'involucro per iniziare il saggio. Il risultato del saggio diviene visibile a occhio nudo in pochi minuti senza ulteriore azione da parte dell'utilizzatore. Esempi di tali dispositivi sono descritti in EP-A-291194 e EP-A-383619. La raccolta del campione viene realizzata in modo conveniente per mezzo di un elemento assorbente che forma parte del dispositivo e che può facilmente assorbire liquido campione, per esempio da un flusso di urina. Opzionalmente l'elemento assorbente p.uò sporgere dall'involucro del dispositivo per facilitare l'applicazione del campione.

Un'ulteriore forma di attuazione dell'invenzione è costituita da un dispositivo elettronico per il controllo dello stato di fertilità del ciclo di ovulazione umano e che fornisce a un utilizzatore di detto dispositivo indicazioni relative a detto stato di fertilità comprendente:

a) mezzi di lettura per le lettura di un di<'>spoitivo di saggio a doppio analito come qui descritto;

b) mezzi di elaborazione delle informazioni per determinare da detta lettura di detto dispositivo di saggio, valori di concentrazione nel campione di fluido del corpo di detti almeno due analiti;

c) mezzi per l'elaborazione di informazioni e mezzi di memorizzazione per derivare da determinati valori di concentrazione un'indicazionne dello stato di fertilità attuale di un soggetto uano in prova; e

d) mezzi di comunicazione per trasmettere detto stato di fertilità attuale a detto utente di detto dispositivo elettronico. Preferibilmente, il dispositivo inoltre comprende mezzi di ricezione per ricevere detto dispositivo di saggio, detti mezzi di lettura essendo posizionati in detti mezzi di ricezione. La lettura viene conseguita in modo milgiore per mezzo di trasmissione ottica attraverso detto dispositivo di saggio ricevuto da detti mezzi di ricezione. Preferiblmente i mezzi di visualizzazione comprendono una o più sorgenti di luce che forniscono un segnale in colori a detto utente, una variazione in detto stato di fertilità essendo indicata da un cambiamento di colore.

Altre forme di attuazione del trovato, che risulteranno chiare dalla seguente descrizione dettagliata, includono dispositivi di saggio per l'uso come parte della combinazione di lettore/dispositivo di saggio, procedimenti di fabbricazione di tali dispositivi di saggio, e procedimenti di uso di tali dispositivi di saggio e lettori.

BREVE DESCRIZIONE DELLE ILLUSTRAZIONI

Solamente a titolo di esempio, verranno ora descritti dispositivi di saggio e lettori secondo il trovato con riferimento alle illustrazioni allegate, di cui:

la figura 1 mostra una vista generale di un foglio di materiale poroso, per esempio carta, durante il deposito di reagente sul foglio e la suddivisione del foglio in strisce di saggio.

La figura 2 mostra una vista "in esploso" di un dispositivo di saggio del trovato che incorpora una striscia di saggio realizzata come mostrato in figura 1.

La figura 3 mostra in sezione trasversale schematica un dispositivo di saggio di figura 2 posizionato nella testa di lettura di un dispositivo di monitoraggio secondo il trovato, che lavora per mezzo di trasmissione della luce attraverso la striscia di saggio. L'asse y è distorto per mostrare la composizione dei componenti.

Le figura 4a, 4be 4c mostrano in forma parzialmente "esplosa" le<' >prestazioni principali di un dispositivo di monitoraggio completo secondo il trovato, precisamente:

figura 4a: il coperchio e la metà superiore dell'involucro;

figura 4b: una piastra di un circuito elettronico che incorpora una testa di lettura;

figura 4c: la metà inferiore dell'involucro e il contenitore delle batterie associato.

Figura 5: mostra la testa di lettura vista in figura 4b in scala ingrandita.

Figura 6: mostra una vista direttamente verso il basso nella fenditura ricevente del dispositivo di prova della testa di lettura di figura 5.

Figura 7; è una sezione trasversale di un'estremità di un dispositivo di prova progettato per l'inserimento nella fenditura di ricezione della testa di lettura.

La figura 8 mostra, in forma schematica, le funzioni di base che possono essere richieste in un dispositivo di monitoraggio elettronico per l'uso secondo il trovato, come applicato al ciclo di ovulazione umano.

La figura 9a mostra una striscia di prova a analito doppio.

La figura 9b mostra in sezione trasversale longitudinale un dispositivo di saggio che include la striscia di prova di figura 9a.

Le figure 9a e 9b vengono descritte nell'esempio 5 nel seguito.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DI UNA COMBINAZIONE DI DISPOSITIVO DI SAGGIO/MONITOR Con riferimento alla figura 1, il foglio 100 di materiale poroso, per esempio nitrocellulosa, deve essere diviso in una moltitudine di strisce di saggio identiche 101 tagliando lungo l'asse centrale A-A e gli assi laterali B-B.

Vengono posizionate linee parallele (102-107) di reagenti di saggio sul foglio 100 prima della suddivisione. Solamente a scopo di esempio, si suppone che i reagenti siano un primo anticorpo immobilizzato lungo linee 102 e 107, e un secondo anticorpo differente immobilizzato lungo le linee 103 e 106. La 'deposizione di reagente può avvenire per mezzo di una "penna" 108 o simili azionata su un meccanismo di tracciamento controllato con un calcolatore "x-y" (non mostrato) e alimentato con una soluzione reagente tamponata appropriata attraverso un tubo flessibile misurato 109. Se il materiale del foglio 100 è nitrocellulosa, si possono immobilizzare reagenti quali anticorpi e antigeni per semplice applicazione diretta sulla nitrocellulosa, seguita dal blocco del materiale del foglio, per esempio con albume o polivinilalcool . In seguito al deposito di reagente e il blocco, si possono depositare due linee di reagente marcato mobile 104 e 105, quale un antigene (per esempio E3G) o un altro anticorpo (per esempio anti LH) marcato per esempio con un'etichetta diretta in particelle quale un lattice colorato. Questo deposito può avvenire per esempio per mezzo di un'altra penna (non mostrato) . Alternativamente, il reagente (reagenti) marcato può essere trattenuto su un cuscino poroso separato o simili, piuttosto che essere applicato direttamente al materiale della striscia di prova.

Per ottenere un posizionamento preciso delle linee che contengono reagente, ciascuna periferia longitudinale 110, 111 del foglio 100 viene perforata con una moltitudine di piccoli fori identici 112 ciascuno dei quali è situato <'>all'interno della larghezza della striscia designata 113. I fori 112 vengono realizzati sul foglio 100 prima che il foglio venga posizionato su un telaio (non mostrato) o simile superficie di utilizzo per mezzo di una sbarra 114 spinta verso il basso su ciascuna periferia laterale del foglio. Viene mostrata solamente una di queste sbarre (parzialmente). Ciascuna sbarra presenta una moltitudine di piedini che si sporgono verso il basso 115, ciascuno dei quali si posiziona precisamente in una dei fori 112. Il tracciato della penna che deposita il reagente 108 viene registrato con precisione con la posizione delle barre che trattengono il foglio, e di conseguenza il deposito del reagente viene svolto lungo una linea precisa predeterminata rispetto alle perforazioni del foglio.

In seguito a tutti i depositi dei reagenti necessari e altri trattamenti del foglio, il foglio viene suddiviso per mezzo di mezzi di taglio (non mostrato) in strisce identiche,singole 101. Ciascuna striscia singola perciò contiene un foro di posizionamento 112 con due linee che contengono il reagente o zone di reazione (per esempio 102 o 103) posizionate rispetto al foro 112 in posizioni predeterminate precise che si estendono sulla larghezza di ciascuna striscia. In corrispondenza di una posizione distante dal foro 112 si trova una regione (per esempio 104) della striscia che supporta il reagente marcato mobile. La posizione esatta del reagente marcato rispetto al foro non è necessariamente critica quanto la posizione delle zone di reazione.

Con riferimento alla figura 2, un dispositivo di saggio <' >del trovato comprende un involucro di plastica avente una metà superiore e una inferiore 200 e 201 disposte per contenere la striscia di. saggio 101 e inoltre un elemento ricevente il campione assorbente 202 che può estendersi fuori da un'estremità 203 dell'involucro montato. Nel dispositivo montato l'elemento ricevente assorbente 202 si sovrappone all'estremità 204 della striscia di saggio adiacente al reagente marcato depositato. La metà superiore 200 dell'involucro include una finestra o apertura 205 attraverso la quale si possono osservare entrambe le zone di rilevazione 102 e 103 dall'esterno dell'involucro. La metà superiore dell'involucro contiene sulla sua superficie esterna 206 una depressione circolare 207 sull'accesso longitudinale centrale dell'involucro a una piccola distanza oltre la finestra di osservazione rispetto all'estremità 203 dell'involucro che accoglie l'elemento ricevente il campione. Sull'interno della metà superiore dell'involucro si trova un piedino o caviglia che si estende verso il basso 208 posizionato direttamente al disotto della depressione 207. Il diametro del piedino o caviglia che si estende verso il basso 208 si adatta a quello del foro 112 sulla striscia di saggio 101, cosicché si può posizionare la striscia in modo positivo nel dispositivo montato sulla caviglia.

La metà inferiore 201 dell'involucro include inoltre una finestra o apertura di trasmissione della luce 209 che, nel dispositivo montato si trova direttamente opposta alla finestra risultante 205 sulla metà superiore dell'involucro. La metà inferiore dell'involucro contiene anche una depressione- 210 che può accogliere l'estremità -di fondo del piedino o caviglia 208 quando le due metà dell'involucro vengono posizionate insieme per formare un involucro .

Nel dispositivo montato, l'atto di racchiudere la striscia e l'elemento assorbente tra la metà superiore e inferiore dell'involucro fa sì che le porzioni sovrapposte 204 e 211 della striscia e l'elemento assorbente vengano bloccate insieme così da fornire una buona giunzione che conduce l'umidità.

Si prospetta generalmente il fatto che il materiale dell'involucro sarà opaco, per esempio materiale plastico o colorato, ma l'involucro può anche essere traslucido o anche trasparente se desiderato.

Con riferimento alla figura 3, vi si vede il dispositivo di saggio 300 posizionato in una fenditura 301 in un dispositivo di monitoraggio 302. Questa regione del dispositivo di saggio include le due finestre opposte 205 e 209.

L'involucro del dispositivo di monitoraggio presenta fenditure per ricevere la porzione del dispositivo di saggio che incorpora le finestre dei risultati.·Sui lati opposti della fenditura si trova una sorgente luminosa 303 e una testa di lettura 304.

La fenditura incorpora un pulsante o sporgenza 305 che può inserirsi nella depressione 207 sulla superficie esterna dell'involucro del dispositivo di saggio. Si ottiene perciò un posizionamento positivo preciso dell'involucro nella fenditura. Poiché la depressione si trova in una posizione fissa rispetto al piedino o caviglia interna 208 nel dispositivo di saggio, e quindi il foro di registrazione 112 nella striscia 101, le due zone di rilevazione 102 e 103 sulla striscia sono posizionate in una posizione precisa rispetto alla testa di lettura. Il foro nella striscia di saggio perciò agisce come riferimento positivo nel complesso della fabbricazione del dispositivo di saggio e assicura che dopo che il dispositivo di saggio è stato utilizzato e presentato al dispositivo di monitoraggio le zone di rilevazione sulla striscia si troveranno nella stessa posizione relativa rispetto alla testa di lettura ogni volta. Di conseguenza non si ha la necessità che la testa di lettura incorpori la possibilità di scansione per posizionare le zone di rilevazione di ciascun dispositivo presentato.

La sorgente di luce o illuminatore 303 incorpora una moltitudine di LED per la generazione di luce 306, e questa illumina la striscia di saggio attraverso un diffusore 307 e la finestra di osservazione 209 sulla metà inferiore dell'involucro del dispositivo di saggio·. La luce attraversa la striscia di nitrocellulosa sottile 101 ed esce dal dispositivo di saggio attraverso la finestra del risultato 205 nella metà superiore dell'involucro. Immediatamente al di fuori della finestra 205 si trova un secondo diffusore 308. Dopo il passaggio attraverso il secondo diffusore 308,. la luce incontra una piastra 309 avente una moltitudine di aperture 310-314. Vi sono in totale cinque aperture, due delle quali (311, 313) sono adiacenti alla zona di rilevazione e le altre (310, 312, e 314) si trovano in posizioni su entrambi i lati di queste aperture della zona di rilevazione. Le aperture hanno la forma di fenditura corrispondente alle linee di rilevazione sulla striscia. L'ampiezza di ciascuna delle due aperture 311 e 313 che corrisponde alle zone di rilevazione stesse è pari al doppio della larghezza di ciascuna delle altre tre aperture, che servono come controlli.

La luce che passa attraverso queste aperture si sposta verso una fenditura corrispondente <' >315 - 319 su una piastra a diaframma 320. In corrispondenza dell'estremità distante di ciascuna fenditura si trova un rilevatore della luce 321. I rilevatori 321 hanno dimensioni e caratteristiche identiche. In corrispondenza della superficie frontale 322 della piastra a diaframma 320, ciascuna fenditura ha dimensioni uguali a quelle dell'apertura corrispondente. In corrispondenza della superficie posteriore del diaframma adiacente ai rilevatori di luce ciascuna fenditura ha le stesse dimensioni della superficie del rilevatore luminoso adiacente ad essa. Di conseguenza, le due fenditure (316, 318) associate alle aperture della zona di rilevazione hanno lati paralleli. Le tre fenditure (315, 317, e 319) associate alle aperture di monitoraggio crescono in dimensioni mentre si spostano verso il rilevatore della luce.

La fenditura sul dispositivo di monitoraggio può anche accogliere mezzi di richiamo o per la presa quali una o più piastre caricate a molla o piedini (non mostrato) per migliorare ulteriormente il posizionamento positivo del dispositivo di saggio nella fenditura.

Idealmente, si deriva lo stesso segnale ottico da ciascuna apertura indipendentemente dalla posizione in linea precisa opposta alle aperture. Le<' >aperture possono avere dimensioni differenti per promuovere questo scopo. Le dimensioni della zona di riferimento dovrebbero essere scelte in modo da corrispondere il più possibile all'area effettiva della zona di rilevazione sulla striscia.

Per ridurre la possibilità di scambio dei dati tra le aperture, la striscia di saggio dovrebbe essere trattenuta il più vicino possibile alle aperture quando il dispositivo di saggio viene posizionato nella fenditura nel dispositivo di monitoraggio.

Come descritto in precedenza, vi sono cinque canali di misurazione ottica nel dispositivo di lettura. Inoltre, si può avere un sesto canale di riferimento elettronico che fornisce la calibrazione dei guadagni elettronici nel circuito rilevatore.

Una tipica striscia dì prova può presentare un gradiente di concentrazione dell'etichetta rilevabile lungo la sua estensione, in funzione del quale si deve misurare l'etichetta rilevabile in corrispondenza di una zona di reazione. Per sistemare ciò le misurazioni vengono idealmente svolte su entrambi.! lati della zona di reazione sulla striscia di prova. Il segnale dalla zona di reazione può essere espresso come rapporto del segnale totale e registrato da due aree di riferimento adiacenti sulla striscia.

I cinque canali di misurazione vengono divisi in due zone di reazione e tre zone di riferimento. Una zona di riferimento, posizionata tra le due zone di reazione fornisce una misurazione ottica di riferimento a entrambe le misurazioni della zona ottica di reazione.

Un sistema · di misurazione della riflettanza dev'essere completamente montato su un lato della striscia di prova. Per ottenere lo stesso<" >livello di compattezza per un dispositivo di lettura a cinque canali si implicarebbe l'uso di componenti adatti (relativamente) costosi. Un progetto per la trasmissione può essere realizzato interamente con componenti disponibili in commercio, optoelettronici dall'alto volume, che facilitano la produzione di un dispositivo di monitoraggio compatto e relativamente economico.

Si montano i cinque rilevatori 321 sulla superficie posteriore di una piastra a diaframma. Ciascun rilevatore vede la striscia di prova attraverso un'apertura nel diaframma. Il diaframma evita che la luce vista attraverso un'apertura ricada sui rilevatori adiacenti, e inoltre fornisce la sistemazione per la tolleranza di posizionamento della linea. La posizione della zona di prova nel campo di vista del rilevatore può variare da un bordo dell'apertura all'altro lungo l'asse x. Qualsiasi variazione nel segnale che deriva da questo effetto è una funzione dello spostamento angolare rispetto al centro del rilevatore di misurazione. La profondità del diaframma può essere scelta in modo da controllare il possibile spostamento angolare della zona di prova rispetto al rilevatore, e mantenere l'accuratezza della lettura.

La sporgenza 305 viene mantenuta in una posizione precisa rispetto alle aperture. Il piedino di riferimento si posiziona nella depressione 207 nell'involucro del dispositivo di prova. Questa depressione viene inoltre posizionata in modo preciso rispetto al piedino interno 208 modellato nel dispositivo di prova, sul quale la striscia di prova è posizionata per mezzo del suo foro di posizionamento perforato attraverso la striscia. Le zone di reazione sono posizionate con precisione rispetto al foro di posizionamento. In questo modo, a meno di tolleranze di fabbricazione, le zone di reazione sono posizionate con precisione rispetto al foro di posizionamento. In questo modo, a meno di tolleranze di fabbricazione, le zone di reazione vengono trattenute in posizioni precise rispetto - alle aperture attraverso cui i rilevatori vedono la striscia di prova.

L'illuminatore può consistere di una serie di LEO racchiusi o posizionati dietro un mezzo di diffusione che fornisce un'illuminazione uniforme e diffusa della striscia di prova che copre la zona di riferimento e del segnale.

L'incorporare un diffusore tra le aperture e la striscia di prova produce un benefici per lo scopo della calibrazione. Per calibrare ciascuno dei canali ottici in assenza della striscia di prova è altamente desiderabile che ciascun rilevatore accolga <' >la luce dalle stesse aree dell'illuminatore come nel caso in cui è presente il dispositivo di prova. Il diffusore può essere scelto in modo da essere un diffusore dominante lungo il percorso ottico cosicché l'introduzione della striscia di prova non contribuisce significativamente a cambiamenti significativi nella distribuzione dell'illuminazione osservata dai rilevatori.

Inoltre, l'elemento diffusore può permettere al gruppo ottico di incorporare una superficie "ripulita per strofinamento" desiderabile per le prestazioni ripetute sul lungo termine del gruppo ottico. Modulando l'intensità dell'illuminatore è possibile calibrare i canali ottici, senza aiuto di parti mobili, "in modo invisibile" all'utilizzatore prima dell'inserimento di un dispositivo di prova.

La striscia di prova può consistere di uno strato diffuso otticamente di nitrocellulosa o simili, preferibilmente racchiuso tra due strati di pellicola trasparente otticamente, per esempio un poliestere quale "Mylar". La pellicola trasparente protegge la nitrocellulosa in cui avvengono le reazioni di saggio. La realizzazione di misure di riflettanza attraverso queste pellicole sottili trasparenti è particolarmente difficile a causa dei problemi che sorgono da riflessioni speculari. Le misure di trasmissione permettono la realizzazione ortogonale di ottiche rispetto alla superficie di misurazione e minimizzano gli effetti avversi della riflessione.

Il trovato è applicabile in particolare modo alla lettura di strisce di prova realizzate con nitrocellulosa e membrane diffuse simili che preferibilmente non superano in spessore 1 min.

Rivolgendoci alla figura 4a, il dispositivo di monitoraggio comprende un involucro modellato, per esempio in materiale plastico, avente una forma generalmente arrotondata ovale. L'involucro comprende principalmente una metà superiore 400 e una metà inferiore, delle quali si vede in figura 4 solamente la metà superiore. Verso il lato di destra dell'involucro 400 si trova una rientranza 401 avente una superficie posteriore inclinata all'indietro 402. La superficie posteriore 402 incorpora un'apertura 403 per un pulsante (non mostrato), una finestra 404 per far apparire un pannello di visualizzazione (non mostrato) e due finestre 405 e 406 per far apparire luci colorate o altri indicatori (nuovamente non mostrati) per trasportare informazioni all'utente. Dalla estremità sinistra dello scomparto 401 si estende una lunga fenditura 407 per fornire accesso a una testa di lettura (non mostrato). Lo scomparto 401 e la fenditura 407 possono essere racchiusi per mezzo di un coperchio 408 che viene attaccato alla parte posteriore dell'involucro per mezzo di due punti a cerniera 409 e 410. La superficie superiore 411 dell'involucro 400 rientra leggermente così da accogliere il coperchio quando richiuso, cosicché la parte esterna del dispositivo richiuso presenta una superficie continua relativamente uniforma all'utilizzatore. Il coperchio può essere fatto ruotare verso l'alto per rilevare le prestazioni accessibili all'utilizzatore del dispositivo di monitoraggio. Il coperchio può essere richiuso per mezzo di una graffa a molla {non vista in figura 4a), che si estende verso l'alto attraverso un orifizio 412 sul bordo frontale 413 dell'involucro. Il bordo frontale 413 dell'orifizio incorpora un ulteriore orifizio 414 attraverso il quale si può rilevare un'ulteriore luce indicatrice (non mostrato).

Rivolgendoci alla figura 4b, la piastra del circuito 430 presenta una forma rettangolare arrotondata per l'adattamento alla forma interna dell'involucro, e sostiene tute le prestazioni operazionali del dispositivo di monitoraggio. Queste includono un pulsante 431 che l' utilizzatore può premere per far partire il monitoraggio di un ciclo di ovulazione. Quando la piastra del circuito è montata sull'involucro e coperta per mezzo della relativa metà superiore, il pulsante è accessibile attraverso l'apertura 403. Alla destra del pulsante si trova un pannello di visualizzazione 432 quale un visualizzatore a cristalli liquidi che è visibile all'utilizzatore attraverso la finestra 404. Alla destra del pannello di visualizzazione si trovano due guide della luce 433 e 434 che trasferiscono, per esempio, luce colorata (come rossa e verde) da due LED o lampade simili (non mostrato). Sulla piastra del circuito vengono montati appropriati "microcircuiti integrati" e circuiti di memoria 435 e 436. Un'ulteriore guida della luce 437 montata in corrispondenza del bordo fornitale 438 della piastra del circuito può trasportare luce da un altro LED (non mostrato) all'apertura 414. Questa luce può indicare, per esempio, all'utilizzatore che si richiede un saggio. Questa luce può avere un colore differente rispetto a quello delle luci associate al pannello di visualizzazione, per esempio giallo Un connettore delle batterie 439 pende dalla parte inferiore della piastra del circuito per la; connessione alle batterie trattenute nell'involucro inferiore (vedere la figura 4c).

Sempre in corrispondenza della parte frontale della piastra del circuito si trova un commutatore 440 che può essere azionato per mezzo del blocco a molla del coperchio 408.

In corrispondenza dell'estremità di sinistra della piastra del circuito viene montata la testa di lettura 441 che comprende una fenditura di ricezione centrale 442 per accogliere un'estremità di un dispositivo di saggio (non mostrato). Sulla parte frontale della fenditura ricevente 442 si trova un illuminatore 443 e immediatamente opposto in corrispondenza della parte posteriore della fenditura si trova un sistema di rilevazione ottico 444 cosicché la luce può essere trasmessa attraverso la fenditura (e attraverso un dispositivo di prova quando inserito) e valutata per mezzo del sensore.

Rivolgendoci alla figura 4c, la metà inferiore dell'involucro 460 ha una forma complessiva ovale per l'adattamento alla metà superiore 400 e fornisce una sistemazione alla piastra del circuito 430. Il bordo frontale 461 dell'involucro 460 accoglie un dispositivo di blocco caricato a molla 462 per fissare il coperchio 408 quando richiuso. Il dispositivo di blocco 462 viene rilasciato dalla pressione sulla superficie frontale 463 per esempio applicata per mezzo della punta di un dito. Il fondo dell'involucro 464 include una camera per la batterie (al di sotto), e viene fornito di un piccolo foro di accesso 465 verso l'estremità di destra dell'involucro attraverso il quale si può passare il connettore a batteria 439 e connesso alle batterie 466. Le batterie vengono trattenute per mezzo di una copertura 467 che può essere bloccata rispetto al fondo 468 dell'involucro.

Le parti costituenti dell'involucro possono essere modellate in materiali a forte impatto o materiali plastici simili quali polistirene o policarbonato e trattenute insieme per mezzo di graffe "a inserimento a pressione" o viti filettate o qualsiasi altro procedimento appropriato.

Rivolgendosi all'illustrazione ingrandita della testa di lettura, come si vede in figura 5, la fenditura 442 per ricevere un dispositivo di saggio ha forma laterale parallela, ma la sua grandezza è ingrandita in corrispondenza dell'estremità di destra 500 a gradini così da fornire una coppia di spalle o appoggi 501, 502 contro cui si può appoggiare una porzione ingrandita in modo corrispondente di un dispositivo di saggio. Questo può facilitare un inserimento effettivo di un dispositivo di saggio nella testa di lettura. Nella parte di lavoro più stretta 503 della fenditura si trova un pulsante 504 montato sulla parete superiore 505 della fenditura, che deve essere completamente abbassato per-attivare il meccanismo di lettura. Un inserimento appropriato di un dispositivo di prova causa un abbassamento adeguato di questo pulsante.

Sempre sulla parete posteriore 505 della fenditura si trova un piedino di posizionamento fisso 506 che deve impegnare un foro corrispondente in un dispositivo di saggio inserito. Sempre sulla parete posteriore 505 si trova un pannello di trasmissione della luce 507 che copre i sensori ottici. Il pannello 507 si estende verso l'esterno oltre il pano della prete posteriore 505 della fenditura e presenta bori inclinati 508, 509 per dargli un profilo distintivo. In corrispondenza di estremità opposte della parete frontale 510 della fenditura si trovano due piedini (non visti in figura 5) che vengono richiamati verso l'esterno nella fenditura/ per esempio per mezzo di meccanismi a molla contenuti nei due involucri 511, 512.

Queste stesse prestazioni sono illustrate in figura 6 che costituisce una vista direttamente verso il basso nella fenditura ricevente. Vi si vedono i due piedini richiamati 600, 601. Lo scopo di questi piedini è quello di fornire mezzi di richiamo per spingere un dispositivo di saggio inserito contro la parete posteriore 505 della fenditura. Se la porzione ricevibile di un dispositivo di saggio presenta fori nella forma appropriata o depressioni per accogliere il piedino di posizionamento fisso 506 e il pannello sporgente 507, il pannello di saggio può essere spinto sufficientemente in prossimità della parete posteriore della fenditura così da spingere il pulsante 504 e iniziare la procedura di rilevazione ottica.

La figura 7, in sezione trasversale, mostra parte di un dispositivo di saggio 700 avente un profilo che può cooperare con le prestazioni viste in figura 6..1.1 dispositivo di saggio può essere inserito nella fenditura con la porzione centrale più ampia 701 che si appoggia contro spalle 501, 502. L'estremità di attacco 702 del dispositivo di saggio presenta un bordo lievemente squadrato 703 per facilitare l'inserimento nella fenditura oltre il piedino 600. Il dispositivo di saggio comprende un involucro cavo che contiene una striscia di saggio porosa 704 compresa tra due fogli 705, 706 di materiale trasparente. Come descritto in precedenza, la striscia 704 è posizionata con precisione nell'involucro del dispositivo di saggio per mezzo di un piedino 707 che si estende attraverso un foro 708 nella striscia. Sulla parte esterna del dispositivo di saggio in corrispondenza di un punto corrispondente al centro del piedino di posizionamento 707 si trova un foro conico 709 che può accogliere il piedino di posizionamento fisso 506 nella fenditura del dispositivo di lettura. Ciascuna lato dell'involucro del dispositivo di saggio presenta un'apertura 710, 711 che, quando il dispositivo di saggio viene inserito nella fenditura in modo corretto, sarà adiacente alla sorgente di luce 443 e i sensori di luce 444 rispettivamente. I profili di queste due aperture sono differenti e in particolare il profilo dell'apertura 711 sulla stessa superficie del saggio del foro conico 709 è modellata per adattarsi al profilo del panello sporgente 507 che ricopre i sensori della luce. Questo assicura che la testa di lettura funzionerà solamente quando il dispositivo di saggio viene inserito con l'orientazione corretta così da assicurare che il pulsante 504 venga abbassato.

Si apprezzerà che disposizione complessiva e la forma generale del dispositivo di monitoraggio possono essere sottoposti a variazioni molto considerevoli rispetto a quelle descritte in precedenza senza allontanarsi dallo scopo del trovato. La forma generale e lo schema della testa di lettura sono dettati dalla necessità di cooperare con efficacia con il dispositivo di saggio ma questa forma può variare in modo considerevole. La disposizione e la natura dei controlli accessibili all'utente e le prestazioni di visualizzazione dell'informazione possono essere similmente sottoposti a considerevoli variazioni e sono dettai in gran parte da considerazioni estetiche.

L'elettronica dettagliata di un dispositivo di monitoraggio che può assimilare, memorizzare e trattare dati su concentrazioni di analiti, così come fornire le prestazioni elettroniche preferite del dispositivo qui discusso, e nei casi appropriati predire eventi futuri, quali lo stato di fertilità di un ciclo di ovulazione sulla base di tali dati, possono essere facilmente forniti da coloro che sono esperti nella tecnica dell'elettronica una volta che sì siano resi conto dei fattori che tale dispositivo deve considerare, e l'informazione che il dispositivo deve fornire all'utente. Solamente a titolo di esempio, le funzioni di base che si possono implicare in tale dispositivo vengono delineate in figura 8 dalle illustrazioni allegate e descritte brevemente nel seguito. Le singole prestazioni possono essere completamente convenzionali, e coloro che sono familiari con la tecnica dell'elettronica apprezzeranno il fatto che si possono utilizzare altre combinazioni e disposizioni di tali prestazioni per ottenere gli scopi del trovato. Per esempio si possono utilizzare cosiddetti sistemi "cablati" e "reti neuronali", al posto di convenzionali microprocessori basati su tecnologia ,a "microcircuiti integrati".

Come illustrato in figura 8, la combinazione comprende essenzialmente un'unità di lettura 800 per derivare informazioni da un dispositivo di saggio, l'unità di lettura comprendendo un illuminatore 801 e un lettore 802 (qui rappresentati come fotodiodi). L'unità di lettura alimenta in un'unità dì conversione 803 per la conversione il segnale ottico in forma utilizzabile da parte di un microprocessore. Come prestazione opzionale, viene fornito un sistema di calibrazione 805 per la conversione del segnale derivato dell'unità di lettura nei dati corrispondenti, per esempio, ad un valore di concentrazione assoluto.

Si può richiedere un temporizzatore, quale un orologio 806, per la regolazione delle misurazioni in un ciclo. Il microprocessore 804 elabora, memorizza e interpreta risultati alla luce di eventi precedenti, in particolare modo registrati dai cicli precedenti. L'interfaccia dell'utente comprenderà generalmente almeno mezzi, quali un pulsante, che l'utente può azionare al momento dell'inizio di un ciclo per far partire il funzionamento del dispositivo nel complesso. L'alimentazione 808 dovrebbe includere mezzi, quali un condensatore di recupero di memoria 809 per evitare la perdita di dati storici quando si rende necessario sostituire le batterie.

Si possono inviare informazioni all'utente per mezzo di un visualizzatore a cristalli liquido a LED, per esempio. Se lo si desidera, si possono inviare informazioni relative allo stato di fertilità per mezzo di semplici informazioni visive, per esempio una combinazione di colori che mostra, per esempio, verde per sterilità e rosso per fertilità. Specialmente nel caso in cui il dispositivo è destinato in primo luogo all'aiuto per la contraccezione, dovrebbe essere "a prova di errori" mostrando un segnale "fertile".

Come descritto in precedenza,· le prestazioni 803 e 806 insieme corrispondono alla prestazione 435 (figura 4b), e la prestazione 804 corrisponde alle prestazione 436 (figura 4b).

La spettrofotometria di trasmissione è una tecnica ampiamente utilizzata per la quantificazione di concentrazioni di coloranti in soluzioni liquide trasparenti. Gli spettrofotometri disponibili in commercio richiedono generalmente modifiche sostanziali per la realizzazione di misurazioni su soluzioni diffuse (di diffusione). Generalmente non si pensa che la spettrofotometria per trasmissione sia un procedimento appropriato alla misurazione di campioni fortemente diffusi, così viene generalmente adottata solamente quando non si può utilizzare un approccio alternativo. Agli scopi del trovato, la misurazione per trasmissione offre benefici positivi oltre l'approccio di riflettanza più utilizzato in precedenza su strisce di prova.

Alcuni saggi su strisce convenzionali utilizzano misurazioni di riflettanza per stabilire la concentrazione di colorante sulla superficie della striscia (per esempio dispositivi per il monitoraggio - del glucosio) La chimica di questi saggi si verifica su uno strato molto sottile della superficie di una striscia di prova. In contrasto, la chimica dei dispositivi a striscia preferiti del trovato avviene nello spessore complessivo della strìscia di prova. A causa delle variazioni del deposito del reagente e del flusso, la concentrazione di etichetta rilevabile catturata in una zona di reazione può differire secondo la profondità.

Curvatura materiali di superficie, rifinitura e effetti del solvente possono variare il rapporto di riflettanza speculare rispetto a quella per diffusione. Per misurazioni di riflessione è la luce riflessa per diffusione dalla superficie della striscia che porta l'informazione sul segnale (cioè quella luce che avrà interagito con l'etichetta rilevabile), mentre la luce riflessa specularmente non conterrà alcuna informazione (poiché questa luce è la componente che è appena rimbalzata sulla superficie senza interagire con l'etichetta rilevabile sulla striscia diffusa) . Senza ritornare a sistemi relativamente ingombranti e costosi, è difficile progettare un sistema di misurazione di riflessione che minimizzi la riflessione speculare per quanto possibile con la misurazione di trasmissione, specialmente utilizzando una luce diffusa come avviene secondo il trovato.

I sistemi di riflettanza richiedono l'uso di una superficie di prova che possa essere rimossa dal percorso ottico a scopo di calibrazione. Questa superficie di riferimento non deve deteriorarsi se deve far parte del gruppo ottico. Inoltre, si richiede uno spostamento meccanico per il posizionamento del materiale di riferimento quando è necessario misurare strisce di saggio. Tali problemi vengono evitati per mezzo del trovato.

Oltre agli esempi specifici di materiali rilevabili già qui citati, il trovato può utilizzare come materiali di etichetta che bloccano o riflettono la radiazione magnetica, piuttosto che assorbirla, per esempio particelle "bianche" quali particelle di lattice nel loro stato naturale non colorato. Alternativamente, l'etichetta può essere un reagente o un catalizzatore che partecipa alla generazione di un materiale che assorbe radiazione o che blocca radiazione, per esempio un enzima che reagisca con un substrato per la produzione di un materiale rilevabile, quale un materiale colorato, nella zona di rilevazione.

ESEMPI

Nei seguenti esempi.· si illustrano aspetti del trovato. Questi si riferiscono al monitoraggio del ciclo.di ovulazione umano.

ESEMPIO 1

Questo esempio descrive un algoritmo conveniente sul quale si può basare un procedimento di monitoraggio secondo il trovato. Il corredo fornito all'utente comprende una moltitudine di dispositivi di prova dell'urina a perdere a doppio analito, che possono saggiare E3G dell'urina e LH dell'urina in forma leggibile per mezzo di un monitor anch'esso fornito. I dispositivi di prova a perdere e il monitor sono come descritti in precedenza. Il monitor può ricevere qualsiasi dispositivo di prova utilizzato e determinare la concentrazione urinaria di ciascun analito. Questa informazione viene memorizzata nel monitor e comparata con dati simili ottenuti in giorni successivi nello stesso ciclo. Il monitor presenta un pulsante delle mestruazioni che l'utente deve premere all'inizio del ciclo, e un pannello di visualizzazione o simili per convogliare informazioni relative allo stato del ciclo, e per indicare all'utente quando si dovrebbe svolgere la prova.

a) Struttura delle regole dell'algoritmo

Gli scopi sono:

i) Identificare la posizione dell'aumento del LH in un singolo ciclo;

ii) identificare una crescita significativa nella concentrazione dell'E3G in un singolo ciclo rispetto alla concentrazione dell'E3G nel giorno 6 di quel ciclo;

iii) preferibilmente, includere una procedura a prova di errore nel caso di mancata identificazione della crescita della concentrazione di E3G in un intervallo atteso.

Il numero di prove disponibili in ciascun mese della routine è limitato a otto, e si adotta una strategia della prova che renderà massime le possibilità di raggiungere i) e ii). b) Cicli di partenza

Per stabilire una base di dati adeguata, durante il primo ciclo di utilizzo il monitor richiede sedici prove. Questo serve a stabilire dati della linea di base per l'individuo. L'utente preme il tasto delle mestruazioni sul monitor il mattino dopo l'inizio delle mestruazioni. Questo giorno viene registrato come giorno 1 dal monitor. Le prove iniziano il giorno 8 e continuano quotidianamente fino al giorno 23. Queste prove sono destinate a rendere massime le possibilità di osservare l'aumento del LH.

All'inizio del ciclo 2 e la partenza di tutti i cicli successivi, si preme il pulsante delle mestruazioni come in precedenza. Dal ciclo 2 in avanti, si utilizzano solamente 8 prove per ciascun ciclo. Tutte e otto le prove devono provenire dallo stesso gruppo di lavorazione e devono essere complete. In tutti i cicli dal ciclo 2 in avanti, le prove cominciano il giorno 6. Per i cicli 2 e 3, le prove due a otto vengono svolte in giorni consecutivi a partire dal tipico giorno di aumento del LH meno quattro giorni. Dal ciclo 4 in avanti, trattato come il primo ciclo della routine, le prove due a otto vengono svolte in sequenza dalla tipica aumento del LH meno cinque giorni. Il tipico giorno dell'aumento del LH è definito come il giorno medio dell'aumento del LH per i prossimi sei mesi,

c) Partenza della fase fertile

Durante il ciclo 1, il monitor dichiara la donna fertile dal giorno 6 in avanti, poiché non si sono raccolte informazioni riguardanti le caratteristiche del ciclo. Nei cicli 2 e 3, il monitor può utilizzare la tipica posizione dell'aumento del LH dal ciclo(i) precedente per determinare la partenza della fase fertile.

Tuttavia, a causa della limitata quantità di dati relativi al ciclo disponibile, il monitor dichiarerà una donna fertile durante i cicli 2 e 3 nel giorno 6 o al tipico aumento del LH meno 7 giorni, qualsiasi dei due sia il più tardo.

Nei cicli di routine successivi, si determina l'inizio della fase fertile rilevando un cambiamento significativo nel segnale di E3G rispetto al giorno 6. Quando il rapporto del segnale del giorno attuale di E3G (Si) e il segnale del giorno 6 (S6) raggiunge una soglia scelta come descritto in precedenza, la donna viene dichiarata fertile. Come protezione dagli errori, il monitor dichiara la donna fertile alla tipica aumento del LH meno 2 giorni, in assenza di un significativo cambiamento rilevato prima nel segnale di E3G.

d) Termine della fase fertile

Durante il normale funzionamento, la fine della fase fertile è definita come il quarto mattino dopo la rilevazione dell'aumento del LH. In assenza di una aumento del LH rilevabile durante la sequenza di prova, il sistema dichiara la fine della fase fertile uguale a sei giorni dopo l'ultima prova. La ragione di questo calcolo è la seguente. Il regime di prova è quello di coprire le posizioni tipiche dell'aumento del LH più un giorno. I dati di studi pubblicati WHO hanno mostrato una variabilità tra donne della posizione dell'aumento del LH pari a 1,8 giorni. L'aggiunta di cinque giorni al periodo fertile dichiarato dopo il completamento della prova permette una confidenza pari a due volte la deviazione standard relativa al fatto che si. presenterà una aumento del LH entro il periodo fertile.

In funzionamento non normale (ciclo 1), ne caso in cui non vi siano informazioni relative alla tipica posizione dell'aumento del LH, se non si rileva questo parametro, si dichiara la fine della fase fertile su un ciclo di 28 giorni.

ESEMPIO 2

Questo esempio utilizza profili di E3G rappresentativi di due donne - delle quali si sa che una presenta bassi livelli di E3G urinario e l'altra livelli relativamente alti. Nelle prime due colonne di ciascuna tabella, vengono descritti 30 giorni di ciascun ciclo in termini della loro fertilità. La prima fase viene chiamata sterile e consìste di quella porzione della fase follicolare durante la quale ci si aspetta che rapporti non protetti non sfocino in una gravidanza, seguita da una fase di transizione durante la quale si verificano cambiamenti che conducono a uno stato fertile e durante i quali si richiede un segnale positivo per indicare l'inizio della fase fertile. La fase fertile è quella fase prima e dopo l'ovulazione durante la quale è molto probabile che un rapporto non protetto comporti una gravidanza. La sua durata prima dell'ovulazione dipende completamente dalla vita effettiva dello sperma, e questo, è a sua volta influenzato da fattori controllati dagli ormoni femminili, specialmente il muco. La fase luteale, post fertile, è quel periodo di tempo dopo che l'uovo ha lasciato l'utero e la concezione nel ciclo attuale non è più possibile.

I valori di E3G vengono 'forniti nella terza colonna. Questi sono stati derivati da immunosaggì in campioni di urina prelevati nel primo mattino raccolti ogni giorno. L'immunosaggio era un saggio competitivo a antigene-marcato-con-enzima convenzionale. I valori sono espressi in ng/ml.

L'ovulazione effettiva è assunta come 24 ore dopo l'aumento del LH. Questi valori del LH sono stati determinati per mezzo di immunosaggi a sandwich marcati con enzimi convenzionali sugli stessi campioni, ma i valori non vengono inclusi nella tabella poiché la data dell'ovulazione è il risultato essenziale.

L'algoritmo dell'esempio 1 è stato applicato a ciascun ciclo, scegliendo il segnale di attivazione di E3G come:

ESEMPIO 3

Questo esempio illustra un sistema contraccettivo umano semplice ma molto conveniente, che si affida solamente per ogni ciclo su un numero limitato di saggi dell'analito urinario E3G.

L'utente viene fornito di un gruppo di lavorazione "mensile" di 8 dispositivi di saggio a perdere, ciascuno comprendente una striscia di saggio sulla quale si può applicare urina, la striscia comprendendo tutti i reagenti necessari per permettere di fornire un segnale indicativo della concentrazione di E3G, per esempio per mezzo di una reazione in competizione che implica un reagente di legame specifico marcato che rimane legato in una zona di rilevazione sulla striscia in quantità direttamente o inversamente proporzionale alla concentrazione del E3G nel campione dì urina. Si fornisce anche un lettore elettronico ottico, che converte informazioni sul segnale dalla striscia utilizzata<' >in dati numerici e elabora questi dati per fornire all'utente informazioni appropriate riguardanti lo stato del ciclo.

Il giorno 6 si compie un saggio dell'urina iniziale (il giorno 1 essendo il giorno durante il quale per la prima volta si osservano le <' >mestruazioni), per stabilire un riferimento di base della concentrazione di E3G in questo ciclo.

Il giorno 9 si compie un secondo saggio dell'urina, e. cosi ciascun giorno dopo questo, fino all'uso di tutte le prove, o fino al momento in cui si ottiene un'indicazione di una concentrazione di E3G elevata indicativa di un'ovulazione imminente. Si dichiara una concentrazione di E3G sufficientemente elevata quando il rapporto tra la concentrazione di riferimento [r] e la concentrazione della prova [i] soddisfa per la prima volta il criterio:

nel caso di proporzionalità diretta tra il segnale della prova e la concentrazione di E3G, o

nel caso di proporzionalità inversa.

Nel giorno in cui si rileva una concentrazione di E3G sufficientemente elevata si evitano rapporti non protetti, e così per i 12 giorni immediatamente successivi.

Se non si rileva una concentrazione di E3G sufficientemente elevata prima dell'uso di tutte le prove, si evitano rapporti non protetti per i 15 giorni immediatamente successivi dopo l'ultimo giorno di prova.

Come ulteriore protezione contro errori, si utilizza il picco di E3G (come definito in precedenza) per la registrazione del giorno di ovulazione durante i cicli precedenti, e si avverte l'utente dell'inizio della fase fertile se non si è rilevata una concentrazione dell'E3G sufficientemente elevata prima di 3 giorni prima del giorno di ovulazione medio.

Non si verifica concenzione.

Questo esempio fornisce all'utente il beneficio che si richiede un piccolo numero di prove per mese. Si fornisce anche semplicità di fabbricazione, poiché si saggia un solo analito (E3G).

Se lo si desidera, si può rendere il saggio più sofisticato, per esempio permettendo la rilevazione dell'evento dell'ovulazione includendo dati relativi alla concentrazione del LH urinario, e raggruppando dati relativi a cicli precedenti, in modo tale da poter ridurre ulteriormente il periodo di astinenza senza accrescere la probabilità di concezione, come descritto in generale in precedenza.

ESEMPIO 5

Questo esempio illustra un saggio combinato di LH/E3G secondo il trovato. In EP-A-291194 e EP-A-383619 si descrivono in dettaglio la realizzazione fisica e i procedimenti di fabbricazione di dispositivi appropriati, includenti la fabbricazione di reagenti.

Il lattice dì E3G viene preparato combinando particelle di lattice colorate in blu (diametro medio 380 nm) con un anticorpo monoclonale anti E3G di affinità in soluzione pari a circa 10<10 >litri/mole. L'anticorpo (170pg/ml) viene miscelato con particelle di lattice (0,5% solido) in un tampone di borato di<' >sodio dal pH 8,5. Si bloccano i punti dì legame vacanti sulla superficie del lattice con BSA [25 mg/l] . Si lava quindi il lattice per rimuovere i materiali non assorbiti.

Si prepara il lattice di LH con antìcorpo monoclonale anti beta LH assorbito su particelle di lattice di colore blu (380 nm). Questo processo viene svolto con un rapporto tra anticorpo e lattice pari a ΙΟΟμιη/ml allo 0,5% solido in tampone di borato di sodio (pH 8,5) contenente etanolo (rapporto 6 a 1 v/v), seguito da bloccaggio dei punti di legame vacanti con BSA (25 mg/ml). Si lava quindi il lattice per rimuovere i materiali non assorbiti.

Si satura un foglio (spesso 1,4 mm) di polietilene macroporoso, pretrattato con detergente, disopnibile in commercio, avente dimensioni dei pori pari a circa 100 micron con una sospensione acquosa di quantità uguali di entrambe le popolazioni delle particelle di lattice preparate in precedenza, 0,008% solido totale, ih un tampone Tris a pH 8,5 contenente il 3% di BSA e 1% di zucchero. Il foglio viene asciugato a freddo e tagliato in porzioni ciascuna di 6 x 12 mm, avente una capacità di liquido pari a circa 12 μL,.

La striscia in fase solida sulla quale si rilevano i livelli di E3G e LH è nitrocellulosa, avente dimensioni .dei <' >pori nominali pari a 8μm, legata a un foglio di appoggio di poliestere. Si tracciano in lìnee E3G-proteina coniugato (albume di uovo), e un anticorpo anti alfa LH, separatamente sulla nitrocellulosa (vedere figura 9) utilizzando soluzioni contenenti 2 mg /ml del rispettivo reagente in tampone fosfato a pH 7,4. Si blocca la nitrocellulosa con PVA prima del suo taglio in strisce.

Si utilizzano i reagenti precedenti nel montaggio di un dispositivo di saggio come generalmente descritto e illustrato nella forma di attuazione 1 di EP-A-383619.

Le figure 9a e 9b delle illustrazioni allegate illustrano il dispositivo.

La figura 9a mostra la striscia 901 di nitrocellulosa su una striscia di appoggio di poliestere trasparente. La striscia presenta una lunghezza di 40mm e 6 mm. La linea 903 rappresenta la posizione dell'anticorpo anti LH immobilizzato sulla striscia. La linea è approssimativamente larga 1 mm ed è centrata a 10 mm dall'estremità di sinistra 904 della striscia 1. La linea 905 rappresenta la posizione dell'E3G immobilizzato. Questa è anche una linea larga circa 1 mm ed è centrata a 16 mm dall'estremità di sinistra della striscia.

La figura 9b mostra il dispositivo montato in sezione trasversale. Il dispositivo comprende un involucro avente una metà superiore 910 e una metà inferiore 911. Un elemento di ricezione del campione assorbente (stoppino) 912 si sporge dall'estremità di sinistra 913 dell'involucro. Il corpo macroporoso 914 che contiene le due popolazioni di particelle di lattice si trova in contatto con lo stoppino nell'involucro. L'involucro contiene anche la striscia 901 e il suo foglio di appoggio associato 902. Un liquido campione applicato al collettore del campione 912 può migrare attraverso un corpo macroporoso 914 nella striscia 901. L'involucro presenta una apertura superiore o finestra 914 e un'apertura inferiore o finestra 916 disposte l'una opposta all'altra in modo tale che la luce può attraversare l'involucro da un lato all'altro e così facendo attraverserà una porzione della striscia. Questa porzione contiene entrambe le linee di reagente 903 e 905. La porzione terminale 917 dell'involucro può contenere un pozzo o un elemento essiccante, se lo si desidera.

Quando si applica un campione di urina che contiene LH e E3G sul dispositivo esso migra attraverso il corpo 914 e sulla striscia. Le due popolazioni di particelle di lattice vengono rilasciate e trasportate con il campione. In funzione delle concentrazioni dei due analiti nel campione, le particelle di lattice che trasportano il materiale di legame appropriato si attaccano alla striscia lungo le linee 903 e 905. Si può determinare il grado di legame delle particelle lungo queste linee per mezzo di trasmissione di luce attraverso la striscia, come descritto nei dettagli in precedenza.

Il relativo posizionamento delle linee dì E3G e LH, come descritto in precedenza, migliora considerevolmente l'efficienza con la quale si possono determinare le rispettive concentrazioni dei due analiti.

Claims (25)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un corredo di prova per l'uso nel monitoraggio del ciclo di ovulazione di un mammifero umano, in modo speciale un umano, che comprende una moltitudine di dispositivi di prova a perdere per il campionamento e la prova di fluidi del corpo, quali urina, e fornire segnali leggibili indicativi delle concentrazioni di almeno due analiti nel fluido del corpo, detti analiti essendo significativi rispetto allo stato di fertilità del ciclo di ovulazione, insieme a un lettore/monitor elettronico per la lettura e l'interpretazione di detti segnali leggibili per fornire all'utente indicazioni relative a detto stato di fertilità, in cui: a) detti segnali leggibili vengono letti mentre uno tra detti dispositivi di prova è posizionato' in mezzi di <' >ricezione di detto lettore/monitor; b) detti segnali leggibili vengono creati concentrando un primo materiale rilevabile, preferibilmente un reagente marcato, in una prima zona di rilevazione di un supporto poroso, quale una striscia di prova, in detto dispositivo di prova e concentrando un secondo materiale rilevabile, preferibilmente un reagente marcato, in una seconda zona di rilevazione di detto suppòrto poroso, mentre detto fluido del corpo campionato sta scorrendo, per esempio per capillarità, attraverso detto supporto poroso, e detta seconda zona di rilevazione preferìbilmente trovandosi a valle rispetto a detta prima zona di rilevazione rispetto a una porzione di ricezione di detto dispositivo di prova che entra in contatto con detto fluido del corpo per iniziare la prova; c) detto primo segnale della zona di rilevazione è indicativo della concentrazione nel fluido del corpo di un primo analito, preferibilmente ormone luteinizzante (LH), che presenta un cambiamento di concentrazione significativo strettamente associato al tempo di ovulazione effettivo; e d) detto secondo segnale della zona di rilevazione è significativo della concentrazione in un fluido del corpo di un secondo analito, preferìbilmente estradiolo o un relativo metabolita quale estrone-3-glucuronide (E3G), che presenta un cambiamento significativo nella concentrazione prima dell'inizio della fase fertile di detto ciclo di ovulazione.
2. 2. Un corredo di prova secondo la rivendicazione 1, in cui detta seconda zona di rilevazione si trova a valle di detta prima zona di rilevazione.
3. 3. Un corredo di prova secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui detta prima zona di rilevazione contiene un anticorpo anti-LH immobilizzato e detta seconda zona contiene E3G immobilizzato o un analogo immobilizzato di E3G.
4. 4. Un corredo di prova secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui detti segnali leggibili vengono letti per mezzo di trasmissione ottica attraverso detto dispositivo di prova.
5. 5. Un corredo di prova secondo la rivendicazione 4 in cui il lettore/monitor comprende: a) una sorgente di luce diffusa avente una lunghezza d'onda che venga fortemente assorbita da detti materiali rilevabili; b) mezzi di rilevazione per la rilevazione di luce incidente da detta sorgente; c) mezzi per ricevere e trattenere detto dispositivo di prova con-ciascuna di dette zone di rilevazione immersa in un percorso luminoso tra detta sorgente e detto sensore; e d) mezzi elettronici connessi a detti mezzi di rilevazione, detti mezzi elettronici essendo programmati per derivare dalla luce incidente rilevata una misura del punto fino al quale il materiale staccabile si è concentrato in ciascuna di dette zone di rilevazione.
6. 6. Un corredo di prova secondo la rivendicazione 5, in cui detta luce diffusa è pulsata, e detti mezzi elettronici sono programmati per controllare detti mezzi di rilevazione in modo tale che detti mezzi di rilevazione rilevano solamente luce incidente in fase con detta luce pulsata, detta luce avendo preferibilmente una frequenza di impulsi di almeno circa 1 kHz. 1 .
7. Un corredo di prova come rivendicato in rivendicazione 5, in cui detti mezzi di ricezione incorporano mezzi di interblocco che possono essere impegnati con corrispondenti mezzi di interblocco su detto dispositivo di prova per assicurare al ricevimento di detto dispositivo di prova per mezzo di detto lettore/monitor dette zone di rilevazione sono posizionate e mantenute in disposizione spaziale predeterminata rispetto a detti mezzi di rilevazione.
8. 8. Un corredo di prova come rivendicato in rivendicazione 7, in cui detti mezzi di ricezione includono mezzi di attivazione attivati dalla ricezione di detto dispositivo di prova, detti mezzi di attivazione causando l'inizio di detta lettura di dette zone dì rilevazione.
9. 9. Un corredo di prova come rivendicato in rivendicazione 7 o in rivendicazione 8, in cui detto dispositivo di prova presenta un involucro o una copertura che include mezzi di registrazione interna che impegnano mezzi di registrazione corrispondenti associati con detto supporto poroso in modo tale che dette zone di rilevazione in detto· involucro o copertura del dispositivo di prova sono posizionate in relazione spaziale predeterminata rispetto a detti mezzi di interblocco su detto involucro o copertura del dispositivo di prova.
10. 10. Un corredo dì prova secondo la rivendicazione 8, in cui detti mezzi di registrazione interna comprendono un piedino o simili, impegnabili con un foro o indentazione su detto supporto poroso, dette zone di rilevazione trovandosi in corrispondenza di posizioni predeterminate su detto supporto poroso rispetto a detto foro o indentazione.
11. 11. Un corredo di prova secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detti segnali leggibili vengono creati per mezzo di concentrazione di reagenti marcati in particelle nelle rispettive zone di rilevazione.
12. 12. Un corredo di prova secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, contenente una moltitudine sufficiente di dispositivi di prova a perdere da permettere a un utente di svolgere prove su base quotidiana per un massimo di 16 giorni in un qualsiasi ciclo di ovulazione .
13. 13. Un pacchetto di rifornimento, contenente una moltitudine, preferibilmente non più di 12, idealmente circa 7 a 10, dispositivi dì prova a perdere per rifornire uh corredo di prova secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, preferibilmente più istruzioni per l'utente per utilizzare tutti i detti dispositivi di prova durante il corso di un ciclo di ovulazione.
14. 14. Un dispositivo di saggio per l'uso nella determinazione di due o più analiti in un unico liquido campione, almeno uno di detti analiti essendo determinabile per mezzo di una reazione di legame in formato di sandwich che implica due reagenti di legame specifici per differenti epitopi su detto analito e almeno un altro di detti analiti essendo un aptene (e perciò non determinabile facilmente per mezzo di una reazione di legame in forma di sandwich), il dispositivo comprendendo in un involucro protettivo : a) una striscia di materiale poroso lungo la quale può migrare un .liquido campione; b) due o più zone di rilevazione (almeno una per analito da determinare) su detta striscia, posizionate a valle rispetto al punto di somministrazione di detto liquido campione a detta striscia, delle quali zone: i) almeno una zona contiene un agente di cattura -immobilizzato che è un agente di legame specifico di detto primo analito o un agente di legame specifico che può catturare un complesso in forma di sandwich che include detto primo analito, e ii) almeno un'altra zona contiene un agente di cattura immobilizzato che è o l'aptene o un relativo analogo; c) due o più popolazioni di particelle, posizionate a monte rispetto a. dette zone di rilevazione, che possono migrare attraverso detta striscia con detto liquido campione, delle quali popolazioni: i) almeno una prima popolazione porta un agente legante specifico di detto primo analito, o specifico per un altro agente legante specifico anch'esso presente nel dispositivo e che può partecipare a una reazione in forma' di sandwich con detto primo analito, e ii) almeno un'altra popolazione porta un agente legante specifico di detto aptene; e la presenza di detto primo analito in detto liquido campione portando al legame di particelle in detta almeno una zona di rilevazione in quantità direttamente proporzionale alla concentrazione di detto primo analito in detto liquido campione, e la presenza di detto aptene in detto liquido campione comportando .una riduzione nel legame delle particelle di detta almeno un'altra popolazione in detta altra zone di rilevazione in quantità direttamente proporzionale alla concentrazione di detto aptene in detto liquido campione, la zona di rilevazione contenendo 1'aptene o l'analogo dell'aptene immobilizzato essendo preferibilmente posizionata a valle rispetto alla zona di rilevazione associata la primo analito.
15. 15. Un dispositivo secondo la rivendicazione 14, in cui detta seconda zona di rilevazione si trova a valle rispetto a detta prima zona di rilevazione.
16. 16. Un dispositivo secondo la rivendicazione 14 o la rivendicazione 15, in cui detto primo analito è un ormone luteinizzante (LH).
17. 17. Un dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 14 a 16, in cui detto secondo .analito è estradiolo o un relativo metabolita, quale E3G.
18. 18. Un dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 14 a 17, in cui il liquido è urina.
19. 19. Un dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 14 a 18, 'in cui le particelle sono particelle di lattice, preferibilmente colorate.
20. 20. Un dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 14 a 19 in cui l'affinità dell'agente legante specifico anti-aptene è pari a circa 10<9>, preferibilmente circa 10<10>, moli/litro.
21. 21. Un dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 14 a 20 in cui il materiale della striscia è almeno traslucido attraverso il suo spessore.
22. 22. Un dispositivo elettronico per il monitoraggio dello stato di fertilità del ciclo di ovulazione umano e che fornisce all'utilizzatore del dispositivo indicazioni relative allo stato di fertilità comprendente: a) mezzi di lettura per lettura di un dispositivo di saggio secondo la rivendicazione 14, in cui il fluido del corpo è urina, il primo analito è LH, il secondo analìto è estradiolo o un suo metabolita , specialmente E3G, e la seconda zona di rilevazione si trova a valle rispetto alla prima zona di rilevazione; b) mezzi di elaborazione delle informazioni per determinare da detta lettura di detto dispositivo di saggio valori di concentrazione nell'urina di detti due analiti; c) mezzi per l'elaborazione di informazioni e mezzi di memorizzazione per derivare da detti valori di concentrazione determinati e da valori di concentrazione derivati in precedenza un'indicazione dello stato attuale di fertilità di un soggetto umano in prova; e d) mezzi di visualizzazione per comunicare detto stato di fertilità all'utente.
23. 23. Un dispositivo elettronico secondo la rivendicazione 22, che inoltre comprende mezzi di ricezione per ricevere detto dispositivo di saggio, detti mezzi di lettura essendo posizionati in detti mezzi di ricezione.
24. 24. Un dispositivo elettronico secondo la rivendicazione 23, in cui si consegue la lettura per mezzo di trasmissione ottica attraverso detto dispositivo quando ricevuto da detti mezzi di ricezione.
25. 25. Un dispositivo elettronico secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni 22 a 24, in cui detti mezzi di visualizzazione comprendono una o più sorgenti di luce che forniscono un segnale colorato all'utente, una variazione nello stato di fertilità essendo indicata da un cambiamento di colore.