ITTO960178A1 - Procedimento per la preparazione di materiale biologico per impianto - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Procedimento per la preparazione di materiale biologico per impianto?

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la preparazione di materiale biologico da impianto, in cui il materiale da impianto ? fissato con un aldeide e l?eccesso di aldeide ? legato mediante trattamento con un acido amminocarbossilico.

L?uso di tessuti biologici di varia origine nella preparazione di dispositivi protesici si ? ormai affermato in diversi campi della medicina. Il materiale utilizzato a tale scopo pu? avere diversa provenienza sia per tipologia di tessuto (valvole cardiache, pericardio, tendini, legamenti, dura madre, cute, vene, ecc.), sia per specie animale (tessuto autologo, omologo o eterologo).

Nell?allestimento di questi dispositivi, si deve ricorrere a trattamenti chimici al fine di ridurre in modo permanente l'antigenicit? di questi tessuti, quindi l'eventualit? di una reazione di rigetto, e migliorarne le propriet? meccaniche.

Tra le sostanze pi? largamente impiegate nella fissazione dei materiali biologici, vi sono le aldeidi. Particolarmente utilizzate sono la glutaraldeide, la formaldeide, i gliossali ed altre aldeidi. Tali composti sono in grado di creare reti di legami che stabilizzano il tessuto e, in particolare, glutaraldeide e formaldeide sono note per l'effetto sterilizzante che esercitano.

A questi composti ed ai derivati che essi generano durante la fissazione, vengono per? ascritti anche effetti negativi, quale la citotossicit?, l?induzione della mineralizzazione, lo sviluppo di reazioni infiammatorie, ecc.. Numerosi autori descrivono infatti la presenza di residui aldeidici come una delle principali concause della calcificazione del tessuto, fenomeno che, per esempio nelle protesi biologiche di valvole cardiache, determina la maggior parte delle complicazioni imputabili direttamente alla protesi.

La formazione di depositi di calcio pu? provocare, infatti, una riduzione di flessibilit? dei lembi valvolari e pu? portare al laceramento del tessuto, determinando una riduzione di funzionalit? parziale o totale della valvola.

E' noto che la glutaraldeide, come altre aldeidi, ? in grado di reagire con i residui amminici degli amminoacidi. La natura chimica di questi prodotti, nel caso delle proteine, ? per? complessa e non completamente compresa. La reazione pi? semplice conosciuta tra un gruppo aldeidico della glutaraldeide ed i residui amminici della lisina porta alla formazione di immine.Tuttavia, anche i prodotti oligomerici e polimerici, che la glutaraldeide genera in ambiente neutro o alcalino, sono in grado di legarsi ai gruppi amminici liberi delle proteine.

Quest?ampia reattivit? porta alla formazione, oltre che di semplici legami imminici, generalmente considerati reversibili a pH acido, anche alle pi? stabili immine ?-coniugate ed a strutture cicliche di tipo piridinico cariche positivamente.

Per la detossificazione di materiali biologici trattati con glutaraldeide, in passato ? stato proposto di bloccare i gruppi aldeidici ancora liberi con diversi tipi di molecole. In particolare, il brevetto statunitense n.5.188.834 descrive a tal fine l?impiego di amminoacidi bicarbossilici in ambiente acido.

Il trattamento deve avvenire ad un pH acido. Infatti, gli oligomeri ed i polimeri di glutaraldeide tendono a tornare nella forma monomerica e ad essere cos? allontanati; inoltre, si ritiene che le specie chimiche che si generano nel corso del trattamento siano immine ?-insature, favorite dal pH leggermente acido.

Per meglio controllare il pH, la reazione viene portata a termine in tamponi fissati intorno a pH 3.0, quali citrato di 3odio/HCl, idrogeno ftalato di potassio/HCl , acido citrico/fosfato, citrato-fosfato-borato/HCl ; d?altra parte, l?effetto tamponante degli stessi amminoacidi pu? essere sfruttato per mantenersi nell?intervallo di pH desiderato.

La presente invenzione ha per oggetto un procedimento del tipo citato nel preambolo introduttivo della presente descrizione, caratterizzato dal fatto che per legare l'eccesso di aldeide si impiega un composto di formula generale:

in cui n ? 1 o 2 e X ? un gruppo sulf o o fosfono (-PO3H) e miscele di tali composti.

I composti utilizzati secondo l?invenzione, avendo una solubilit? superiore rispetto agli amminoacidi bicarbossilici,utilizzati secondo la tecnica nota, determinano una semplificazione radicale nella preparazione e nella manipolazione delle soluzioni durante il processo; ? infatti possibile effettuarne la dissoluzione in tempi brevi ed a temperatura ambiente e si ha inoltre una drastica riduzione dei volumi impiegati per unit? di tessuto trattato, assicurando ampio eccesso di reattivo.

Tra i composti citati, sono preferiti l?acido 2-ammino-3-sulf opropionico (acidocisteico) , l ' acido 2-ammino-4-sulf obutirrico (acido omocisteico), l'acido 2-ammino-3-fosfonopropionico e l'acido 2-ammino-4-fosfonobutirrico; tra questi, particolarmente preferito ? l?acido omocisteico.

Trattandosi di composti provvisti di un centro chirale, nell'ambito dell?invenzione i composti potranno essere utilizzati nella forma racema (D,L) o nella forma (L) o (D).

I vantaggi pratici dei composti utilizzati secondo l'invenzione,derivanti dalla maggiore solubilit?, sono accompagnati da propriet? detossificanti non inferiori a quelle dei composti utilizzati secondo la tecnica convenzionale. L'efficacia del processo ? stata verificata sia con colture cellulari in vitro, sia in prove 3u animale (impianto sotto cute ed intramuscolo in ratto; impianto in pecora in carotide e sostituzione valvolare, sempre su pecora); la riduzione nella calcificazione sembra migliorare, mentre paragonabile ? l?istotossicit?. Inoltre, con particolare riferimento ai composti preferiti di acido cisteico ed acido omocisteico, si pu? preconizzare una minore trombogenicit?.

Il trattamento con i composti secondo l'invenzione viene effettuato con soluzioni acquose preferibilmente ad un pH nell'intervallo da 2,5 a 5,5 e pi? particolarmente tra 3 e 5; il mezzo di reazione ? costituito preferibilmente da un mezzo tamponato appartenente preferibilmente al gruppo di citrato di sodio/HCl, idrogeno ftalato di potassio/HCl, acido citrico/fosfato, citrato-fosfato-borato/HCl .La concentrazione di soluzioni di acido ? generalmente compresa nell'intervallo da 10 mM fino alla soluzione satura, particolarmente nel caso di acido omocisteico da 10 mM fino a 273 mM (50 g/l).

Dopo il trattamento, il materiale per l'impianto viene conservato in una soluzione di sterilizzazione biologicamente compatibile, per la quale ? particolarmente preferita una soluzione di Paraben (0,02% n-propil-p-idrossibenzoato e 0,18% metil-pidrossibenzoato ).

Esempio

Pericardio bovino ottenuto dal macello locale ? stato posto in soluzione fisiologica e ghiaccio. Entro un?ora ? stato trasferito in laboratorio per essere scrupolosamente liberato da residui di grasso o tessuto connettivo, sempre lavorando in soluzione salina 0,9% e ghiaccio. Il pericardio ? stato quindi posto in soluzione di glutaraldeide allo 0,5% (pH 7.4) a 4?C per 48 ore. Di questo pericardio, una parte ? stata avviata alla normale lavorazione in soluzione di formaldeide 4% e quindi conservato in glutaraldeide allo 0,5%; un secondo lotto ? stato invece lavato per tre volte per 20 minuti in soluzione fisiologica, quindi trattato due volte per 24 ore in una soluzione di acido omocisteico 59 mM, preparata con un tampone sodio-citrato/HCl 50 mM circa, pH 3.3. Trascorse le 48 ore, sono stati ripetuti i lavaggi con fisiologica ed il prodotto ? stato stoccato in una soluzione di Paraben.

Dalle pezze di pericardio trattate sono stati ricavati diversi campioni per i test di impianto sotto cute e intramuscolo in ratto, ossia in sede non ortotopica secondo un modello animale pi? volte utilizzato nell'induzione della calcificazione distrofica dei tessuti eterologhi e nello studio della reattivit? tessutale.

A tale scopo sono stati scelti ratti Sprague-Dawley di 180-220 g, impiantando per animale quattro dischetti di 12 mm di diametro, di cui due (uno trattato ed uno di controllo) in sede sottocutanea e due (uno trattato ed uno di controllo) in sede intramuscolare .

Gli animali sono stati sacrificati secondo tre diversi tempi di impianto: 2,4 e 8 settimane. I campioni espiantati sono stati processati per essere sottoposti alla determinazione quantitativa del calcio (assorbimento atomico) e ad osservazione istologica e microscopica.

In tabella vengono riassunti i valori di Ca ug/mg di tessuto dei diversi campioni.

Dalle analisi istologiche, inoltre, non si ? evidenziata macro o microscopicamente alcuna particolare reattivit? tessutale.

Claims (7)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la preparazione di materiale biologico per impianto, fissato per mezzo di aldeidi, in cui l?eccesso di aldeide ? legato mediante trattamento con un acido amminocarbossilico, caratterizzato dal fatto che detto acido ? scelto tra composti di formula generale:

   in cui n ? 1 o 2 e X ? un gruppo sulfo o fosfono(-P03H) e miscele di tali composti.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detto composto ? scelto dal gruppo che consiste di acido-2-ammino-4-sulfobutirrico, acido 2-ammino-4-fosfonobutirr ico,acido2-ammino-3-sulf opropionico e acido 2-ammino-3-fosfonoproprionico.
3. 3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui il trattamento ? effettuato a pH acido nell?intervallo da 2,5 a 5,5, preferibilmente tra 3 e 5.
4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui il mezzo di reazione ? costituito da un mezzo tamponato scelto tra citrato di sodio/HCl, idrogeno ftalato di potassio/HCl, acido citrico/fosfato, citrato-fosfato-borato/HCl .
5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui il mezzo di reazione ? una soluzione acquosa contenente il suddetto composto o loro miscele.
6. 6. Procedimento secondo una qualsiasidelle rivendicazioni 1 a 5, in cui il suddetto composto ? acido omocisteico in soluzione acquosa in concentrazione da 10 mM a 273 mM.
7. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui il materiale per l'impianto viene conservato dopo il trattamento in una soluzione di sterilizzazione biologicamente compatibile.