ITUD20090048A1 - Procedimento per l'indagine batteriologica su un campione biologico e relativo dispositivo - Google Patents

Procedimento per l'indagine batteriologica su un campione biologico e relativo dispositivo

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ITUD20090048A1
ITUD20090048A1 IT000048A ITUD20090048A ITUD20090048A1 IT UD20090048 A1 ITUD20090048 A1 IT UD20090048A1 IT 000048 A IT000048 A IT 000048A IT UD20090048 A ITUD20090048 A IT UD20090048A IT UD20090048 A1 ITUD20090048 A1 IT UD20090048A1
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Description

"PROCEDIMENTO PER L'INDAGINE BATTERIOLOGICA SU UN CAMPIONE BIOLOGICO E RELATIVO DISPOSITIVO"
CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente trovato si riferisce ad un procedimento, ed al relativo dispositivo, per l'indagine batteriologica su un campione biologico volta ad individuare una carica batterica nel campione e selezionare l'antibiotico maggiormente efficace per il suo trattamento terapeutico. Il campione da analizzare può essere, ad esempio, urina, bronco aspirato, sangue, sangue diluito od altro ancora.
STATO DELLA TECNICA
E' noto che un test di sensibilità in vitro agli antibiotici (antibiogramma) prevede, in base alle linee guida internazionali vigenti, l'allestimento di una sospensione batterica standardizzata da testare contro concentrazioni ottimizzate (breakpoints) o diluizioni scalari di antibiotici (MIC).
Il numero di batteri analizzato deve essere standardizzato a prescindere dalla sensibilità del metodo adottato per il test.
La preparazione di un inoculo à ̈ uno dei passaggi più critici in ogni test di sensibilità o antibiogramma. L'inoculo può influenzare in modo significativo le dimensioni dell'area di inibizione.
A seconda dell'inoculo, si possono avere risultati falsamente sensibili se vengono analizzati troppo pochi batteri, mentre si potrebbero ottenere risultati falsamente resistenti analizzando batteri in numero troppo elevato.
Per la maggior parte dei microorganismi, l'inoculo utilizzato dovrebbe sviluppare, dopo incubazione "overnight", colonie semi-confluenti. Un inoculo non corretto (colonie a crescita confluente o separata) può essere facilmente riconosciuto e queste prove devono, pertanto, essere ripetute.
La preparazione di un inoculo adeguato non à ̈ critica fino a quando si ottiene una crescita semiconfluente.
Gli inoculi sono generalmente preparati aggiungendo ad un brodo di coltura cellule da quattro o cinque colonie isolate di colonie di simile morfologia e successivamente consentendone la crescita alla fase logaritmica.
La selezione da quattro a cinque colonie, invece che da una singola colonia, à ̈ effettuata per minimizzare la possibilità di analizzare una colonia che potrebbe essere derivata da un mutantesensibile.
Gli inoculi possono essere preparati anche direttamente sospendendo colonie cresciute "overnight" su una piastra di agar, direttamente in brodocoltura o soluzione salina. Questa tecnica di preparazione diretta dell'inoculo con sospensione à ̈ preferita per batteri che crescono in maniera non prevedibile nel brodo, ad esempio batteri esigenti ("fastidious bacteria").
A causa della non affidabilità della crescita in un inoculo in brodo, l'uso di colonne fresche (da 16 a 24 ore) à ̈ obbligatorio.
La scelta del metodo di inoculo à ̈ principalmente condizionata da considerazioni pratiche, ma i risultati sono migliori se si adottano alcune modalità di standardizzazione, quali la comparazione della densità della sospensione dei microorganismi ad un determinato standard di torbidità o ad un lattice equivalente, oppure eseguendo misurazioni fotometriche.
In particolare, il metodo di standardizzazione più diffusamente impiegato per la standardizzazione dell'inoculo prevede standard di torbidità McFarland, tipicamente impiegati in microbiologia come riferimento per regolare la torbidità di sospensioni batteriche in modo da avere il numero di batteri in un certo intervallo.
Gli standard McFarland (0,5, 1, 2, 3, 4) possono essere preparati mediante l'aggiunta di volumi specifici di acido solforico e cloruro di bario diidrato per ottenere una soluzione di solfato di bario con una specifica densità ottica.
Lo standard più comunemente usato à ̈ lo standard McFarland 0,5, il quale viene preparato da 99,5 mL di acido solforico 1% aggiunti a 0,5 mL di cloruro di bario di idrato 1,175%, in agitazione continua. Questa soluzione viene dispensata all'interno di provette simili a quelle impiegate per la preparazione dell'inoculo, le quali sono chiuse con tappo a vite e riposte al buio a temperatura ambiente. Lo standard McFarland 0,5 fornisce uno standard confrontabile visivamente con quello di una sospensione batterica, in soluzione salina sterile oppure brodo di crescita, contenente approssimativamente 1,5*IO<8>CFU/ml.
La provetta da analizzare con il brodo inoculato o la sospensione diretta con i microorganismi viene posta in agitazione.
In seguito, mediante adeguata illuminazione, la provetta à ̈ posta a fianco dello standard a 0,5 McFarland su uno sfondo bianco con linee di contrasto nere e le loro torbidità sono confrontate osservando le linee nere attraverso la sospensione. Se la sospensione à ̈ troppo densa, sarà più difficoltoso osservare le linee nere che attraverso lo standard McFarland 0,5. In questo caso, l'inoculo viene diluito con brodo sterile addizionale o soluzione salina.
Alternativamente, se la sospensione da testare à ̈ troppo "leggera", vengono aggiunti più microorganismi, oppure la sospensione viene incubata nuovamente (a seconda del protocollo di preparazione dell 'inoculo) fino a che la torbidità raggiunge quella dello standard Mac Farland.
Una volta standardizzata, la sospensione dell'inoculo dovrebbe essere usata entro 15 minuti della preparazione.
Recentemente, sono state usate sospensioni di particelle di lattice come alternative più semplici e maggiormente stabili al solfato di bario per ot tenere una torbidità comparabile a quella dello standard McFarland.
In alternativa, si effettua una standardizzazione con spettrofotometro o nefelometro, più conveniente e precisa rispetto alla regolazione visiva per la corrispondenza con lo standard McFarland.
In questo caso le colonie vengono sospese in acqua distillata in una provetta di vetro per avere una sospensione a torbidità visibile.
Lo spettrofotometro viene azzerato a 500 nm con acqua o brodo sterile (usato anche per la sospensione).
In seguito, si misura 1'assorbenza della sospensione batterica e, da una tabella di riferimento, si seleziona il volume da trasferire in 5 mi di acqua distillata sterile, tramite idonea micropipetta a volume fisso.
Tale metodo dipende dal tipo di spettrofotometro adottato che può variare, così come dipende anche dalla scelta del tipo di provette o cuvette di dimensioni differenti.
Pertanto, per ottenere una crescita confluente, Ã ̈ necessario adattare, di volta in volta, le diluizioni alla dotazione strumentale di ciascun laboratorio.
Come detto, può essere usato anche un nefelometro, tuttavia à ̈ richiesta la calibrazione dello strumento per i diversi gruppi di microorganismi. Di conseguenza, le note tecniche di predisposizione dell 'inoculo e confronto con uno standard McFarland 0,5 comportano una notevole mole di lavoro che non à ̈ esente da imprecisioni e lentezza nell 'ottenere il voluto dato finale.
Da quanto sopra à ̈ evidente come, nel caso di un paziente la cui cura con antibiotico debba essere avviata celermente, le soluzioni note nella tecnica non sono efficaci nel fornire un dato preciso in tempi rapidi.
Ciò si traduce nella scarsa tempestività con la quale, a volte, viene avviata un'efficace terapia in un paziente, con il rischio di pericoli, anche gravi, per la sua salute.
È, quindi, uso comune della classe medica somministrare preventivamente al paziente, senza il supporto di test diagnostici ed unicamente in base al sospetto clinico, un antibiotico a largo spettro per consentire l'inizio immediato della terapia. L'indiscriminato utilizzo di tali antibiotici induce i cosiddetti fenomeni di farmaco-resistenza. Uno scopo del presente trovato à ̈ quello di mette re a punto un procedimento per l'indagine batteriologica e realizzare un relativo dispositivo, che consenta di ridurre i tempi con i quali si può procedere all'avvio dell'operazione di antibiogramma, in modo da velocizzare l'avvio dell'intervento terapeutico sul paziente, senza per questo determinare rischi di insorgere di farmaco-resistenza.
Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questo ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO
Il presente trovato à ̈ espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti.
Le relative rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell'idea di soluzione principale.
In accordo con il suddetto scopo, un procedimento per l'indagine batteriologica su un campione biologico secondo il presente trovato prevede l'esecuzione di una lettura in light scattering per la determinazione della torbidità secondo lo standard McFarland di una sospensione di un mezzo di coltura liquido, o brodo eugonico, in cui viene inoculato il campione biologico ed in cui la torbidità viene misurata in continuo direttamente dalla sospensione del campione in analisi durante la fase di crescita dei batteri, fino al raggiungimento di una determinata soglia di torbidità espressa secondo lo standard McFarland.
Secondo una forma esecutiva del presente trovato, la rilevazione del raggiungimento della soglia di torbidità McFarland avviene per calcolo differenziale dall'avvio della fase di crescita, o incubazione, dei batteri.
Secondo una forma di esecuzione preferita, il procedimento secondo il trovato comprende una prima fase nella quale si determina la crescita batterica nella sospensione del campione biologico, inoculato in un mezzo di coltura liquido, contenuta in un elemento di contenimento almeno in parte trasparente alle radiazioni elettromagnetiche.
Contemporaneamente alla crescita batterica viene fatto incidere sull'elemento di contenimento un fascio di luce coerente e collimato (laser) e viene effettuata una rilevazione nel tempo della quantità di luce rifratta, o diffusa, (light scattering) da parte della sospensione.
La rilevazione à ̈ effettuata in corrispondenza di una prima e di una seconda posizione angolare, distinte fra loro, rispetto a detto elemento di contenimento, in modo da determinare una prima ed una seconda curva, rispettivamente associate alla prima ed alla seconda posizione angolare, dell'andamento nel tempo della torbidità della sospensione batterica.
Il procedimento secondo il presente trovato comprende, inoltre, una seconda fase in cui si determinano due curve differenziali date dalla differenza, rispettivamente, tra detta prima curva ed il valore di torbidità puntuale all'inizio della prima fase rilevato in corrispondenza della prima posizione angolare e tra detta seconda curva ed il valore di torbidità puntuale all'inizio della seconda fase rilevato in corrispondenza della seconda posizione angolare.
Il procedimento prevede, quindi, una terza fase in cui, dall'andamento delle due curve differenziali confrontato con primi dati di classificazione, si ricava la tipologia di batterio presente nel campione dove avviene la crescita batterica o la sua famiglia, o ceppo o specie di appartenenza.
E' prevista, inoltre, una quarta fase in cui le due curve differenziali sono correlate ad una corrispondente variazione dei valori di torbidità riferiti allo standard McFarland che definisce detta soglia di torbidità, in funzione di pre-memorizzati secondi dati di dipendenza tra l'andamento delle due curve differenziali e la corrispondente variazione dei valori di torbidità secondo lo standard McFarland. I secondi dati di dipendenza sono definiti e suddivisi per ciascuna famiglia, o ceppo o specie di appartenenza dei batteri.
Una forma di realizzazione del presente trovato adotta un particolare gruppo di lettura basato su emissione di luce coerente, o laser, attraverso un campione e ricezione della relativa luce diffusa per la determinazione della presenza e classificazione di batteri.
Vantaggiosamente, il gruppo di lettura à ̈ atto ad effettuare una segnalazione, ad esempio acustica, oppure grafica o visiva, dell'avvenuto raggiungimento della soglia di torbidità McFarland.
La metodologia secondo il presente trovato può essere applicata alla rilevazione della torbidità McFarland su qualunque contenitore di vetro o plastica, tipo provetta, o su micropozzetti.
Il presente trovato può essere automatizzato in integrazione ad analizzatori che impiegano un sisterna di lettura laser light scattering.
Aspetto vantaggioso del presente trovato prevede il controllo della corretta misura effettuata dal gruppo di lettura tramite determinazione automatica dell'avvenuta misura di torbidità McFarland impiegando sospensioni di particelle di lattice a concentrazione nota.
Con il presente trovato si riducono i tempi con i quali si può procedere all'avvio dell'operazione di antibiogramma, in modo da velocizzare l'intervento terapeutico sul paziente, senza per questo determinare rischi di insorgere di farmaco-resistenza.
In questo modo, le fasi fino ad ora descritte si chiudono con la disponibilità di campioni positivi a torbidità idonea per iniziare 1'antibiogramma clinico, cioà ̈ le prove di funzionalità verso gli antibiotici direttamente dal brodo di crescita. Questo vantaggio consente di fornire al clinico il risultato funzionale del primo antibiotico testato (resistente o sensibile) al fine di curare correttamente il paziente per l'antibiotico somministrato se risultasse sensibile, oppure di cambiare antibiotico nel caso la prova fornisse risultati di resistenza.
Il trovato, quindi, consente l'esecuzione di un antibiogramma di tipo clinico, ovvero un antibio gramma diretto effettuato sul brodo di crescita inoculato con il campione biologico in esame risultato positivo alla crescita batterica.
Inoltre, il raggiungimento del voluto valore Mac Farland, ad esempio standard 0,5, secondo il trovato à ̈ molto più preciso rispetto alla procedura di diluizione del campione concentrato eseguita nella tecnica nota. Il raggiungimento di un preciso valore di torbidità à ̈, infatti, più affidabile partendo da valori bassi ed operando durante la crescita batterica.
Il tempo d'analisi con il presente trovato à ̈ notevolmente ridotto rispetto ai metodi della tecnica nota. Tale velocità di rilevazione à ̈ possibile grazie alla misura basata su light scattering, molto più rapida e sensibile nello stabilire in breve tempo la presenza/assenza di crescite batteriche nel campione grazie ad una rilevazione diretta della torbidità e quindi della concentrazione degli organismi.
Il presente trovato permette, così, di fornire risultati precisi ed affidabili con notevole risparmio di tempo rispetto ai metodi noti, ed à ̈ realizzabile anche con macchinari e strumenti preesistenti.
In altre parole, il procedimento consente di individuare tutti i positivi entro un tempo significativamente ridotto rispetto ai metodi classici per emocoltura.
Questo riduce significativamente il tempo medio di refertazione dell'antibiogramma, con evidenti benefici terapeutici e di gestione del paziente.
Il procedimento secondo il trovato à ̈ automatizzabile, richiede una manualità operativa ridotta, grazie all'automazione delle fasi di lettura, elaborazione dei dati, esposizione dei risultati od altro.
ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI
Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di una forma preferenziale di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:
- la fig. 1 Ã ̈ una rappresentazione schematica di un dispositivo secondo il presente trovato;
- la fig. 2 à ̈ un grafico dell'andamento nel tempo (t) della quantità di luce diffusa Vi(t), V2(t) che viene rilevata da due sensori SI, S2;
la fig. 3 à ̈ un grafico dell'andamento nel tempo (t) della variazione Al(t), A2(t) della quantità di luce diffusa Vl(t), V2(t) che viene rilevata da due sensori SI, S2, rispetto ad un valore iniziale V1(0), V2(0);
la fig. 4 à ̈ una rappresentazione schematica del metodo di rilevazione della torbidità McFarland ó(t) a partire dalla curve Δ1(t), Δ2(t) di fig. 3.
DESCRIZIONE DI UNA FORMA PREFERENZIALE DI
REALIZZAZIONE
Con riferimento alle figure allegate, un procedimento secondo il presente trovato à ̈ impiegato per predisporre, mediante tecnologia laser light scattering, un campione biologico in sospensione in brodo di coltura liquido, o brodo eugonico, a torbidità McFarland definita, nella fattispecie 0,5.
Il procedimento si avvale di un dispositivo 10 (fig. 1) che prevede l'uso di un elemento di contenimento, o provetta, 16 trasparente alle radiazioni elettromagnetiche al cui interno à ̈ prevista la crescita batterica di una sospensione del campione biologico inoculato nel brodo eugonico.
II dispositivo 10 comprende un gruppo di lettura 11 mediante il quale rilevare la luce diffusa dalla sospensione contenuta nella provetta 16 e mezzi di elaborazione 26, tipo un computer, mediante i quali elaborare i segnali ricevuti dal gruppo di lettura 11 ai fini dell'analisi.
Con il presente trovato, il campione viene sottoposto ad un test colturale per verificarne la positività ad un determinato ceppo batterico e, se positivo, una volta preparato alla voluta torbidità, viene impiegato direttamente nelle successive fasi di un test di antibiogramma clinico per valutare la sensibilità in vitro agli antibiotici.
La misurazione della torbidità McFarland del campione in provetta mediante il gruppo di lettura 11 di fig. 1 si basa su emissione di luce laser e lettura in light scattering, direttamente in fase di analisi, cioà ̈ contestualmente alla crescita batterica durante il test coltura per la determinazione della carica batterica nel campione in analisi.
In particolare, il gruppo di lettura 11 Ã ̈ provvisto di mezzi emettitori 12 mediante i quali, sulla provetta 16, viene fatto incidere un fascio 14 di luce coerente, o polarizzato (laser) e collimato. Inoltre, il gruppo di lettura comprende mezzi sensori, primi 18 e secondi 20, mediante i quali viene effettuata una rilevazione nel tempo di raggi 22, 24 di luce diffusa, o rifratta, da parte della sospensione.
I primi 18 e secondi 20 mezzi sensori sono atti a generare corrispondenti segnali SI, S2 che vengono trasmessi ai mezzi di elaborazione 26.
I primi 18 e secondi 20 mezzi sensori sono collocati in corrispondenza di una prima Pi e di una seconda P2 posizione angolare (fig. 1), distinte fra loro, rispetto alla provetta 16, in modo da determinare una prima Vl(t) ed una seconda V2(t) curva, rispettivamente associate alla prima PI ed alla seconda P2 posizione angolare, dell'andamento nel tempo della torbidità della sospensione batterica. Nella fattispecie, i primi 18 e secondi 20 mezzi sensori sono posizionati a due angolazioni prestabilite a e β rispetto alla direzione del fascio 14, rispettivamente a 30° e 90° (fig. 1).
I suddetti mezzi di elaborazione 26 sono atti ad elaborare i segnali SI, S2 prodotti dai primi 18 e secondi 20 mezzi sensori in modo da determinare, dalle due curve Vl(t) e V2(t), due curve differenziali Al(t) e A2(t) (fig. 3).
Tali due curve differenziali Al(t) e A2(t) sono date dalla differenza rispettivamente tra la prima curva Vl(t) ed un primo valore Vl(0) di torbidità puntuale all'inizio della rilevazione, rilevato in corrispondenza della prima posizione Pi e tra la seconda curva V2(t) ed un secondo valore V2(0) di torbidità puntuale all'inizio della rilevazione, rilevato in corrispondenza della seconda posizione P2
I mezzi di elaborazione 26 comprendono mezzi di memorizzazione 28 a banca dati in cui sono memorizzati primi dati Di di classificazione mediante i quali, dall'andamento delle due curve differenziali Al(t) e A2(t), si ricava la tipologia di batterio presente nel campione dove avviene la crescita batterica o la sua famiglia di appartenenza.
I campioni biologici, con presenza di batteri in duplicazione, emettono segnali di luce diffusa che il gruppo di lettura 11 rileva ed i mezzi di elaborazione 26 elaborano per fornire specifiche curve che esprimono l'andamento della crescita batterica nel tempo.
La prima curva derivata dal segnale ottenuto dal primo sensore 18 con angolazione di 30° Ã ̈ relativa alla presenza di batteri e conseguente misurazione della carica batterica nel tempo.
La seconda curva derivata dal segnale ottenuto dal secondo sensore 20 con angolazione di 90° Ã ̈, invece, maggiormente caratterizzata dalla morfologia dei batteri.
Dalle curve Vl(t), V2(t) di crescita dell'eventuale batterio ottenute da segnali SI, S2 forniti dai due sensori 18 e 20 vengono computate le due curve differenziali Al(t) e A2(t), le quali sono date dalla differenza rispettivamente tra la prima curva Vl(t) ed un primo valore Vl(0) di torbidità puntuale all'inizio della rilevazione, rilevato in corrispondenza della prima posizione PI e tra la seconda curva V2(t) ed un secondo valore V2(0) di torbidità puntuale all'inizio della rilevazione, rilevato in corrispondenza della seconda posizione P2.
A partire da tali curve differenziali Al(t) e A2(t) vengono estrapolati specifici parametri matematici per ciascuna curva, basati su modelli di regressione non lineare. Inoltre à ̈ possibile combinare i parametri omologhi delle due curve (ad esempio calcolando dei rapporti, o delle differenze, o delle somme) per ottenere degli ulteriori parametri derivati.
L'insieme di questi parametri ("set") fornisce una descrizione sintetica delle caratteristiche delle curve del batterio presente nel campione in esame .
Un esempio di una equazione di regressione applicabile alle curve à ̈ l'equazione del tipo
Δ ( t ) = a b * e
che può essere efficacemente utilizzata per descrivere l'andamento di crescita esponenziale di una colonia batterica.
Tale equazione può essere applicata ad entrambe le curve differenziali Al ( t ) e A2 (t ) :
Δ1 ( t ) = al bl * e ici * ti
Δ2 (t ) = a2 b2 * e (c2 * t) Da tali relazione à ̈ possibile quindi estrapolare i parametri al, bl, cl, a2, b2 e c2.
Successivamente, i mezzi di elaborazione 26 confrontano i primi dati Di con i parametri estrapolati dalle curve differenziali Al(t) e A2(t). Nella fattispecie, i primi dati Di consistono nella raccolta dei valori tipici di detti "set" di parametri (compresi degli intervalli di validità degli stessi) per varie tipologie di batteri, ovvero per batteri di tipo "cocco" o "bacillo", ovvero per diverse famiglie di batteri, ovvero per diverse specie batteriche o ancora per diversi ceppi batterici.
In particolare, i mezzi di elaborazione 26 confrontano il "set" di parametri del batterio oggetto di studio con i vari "set" di parametri presenti nei dati Di determinando, con l'ausilio di opportune tecniche statistiche, quale tipo o famiglia o specie o ceppo sia con maggiore probabilità quella di appartenenza del batterio in oggetto.
Nei mezzi di memorizzazione 26 sono, inoltre, pre-memorizzati secondi dati D2 di dipendenza tra l'andamento delle due curve differenziali Al(t) e A2(t) e valori di torbidità secondo lo standard McFarland.
I suddetti secondi dati D2 di dipendenza sono definiti e suddivisi per ciascuna famiglia di appartenenza dei batteri.
I suddetti mezzi di elaborazione 26 sono atti a correlare le due curve differenziali Al(t) e A2(t) ad un definito valore di torbidità secondo lo standard McFarland, vantaggiosamente al riferimento 0,5 McFarland.
II valore di lettura rilevato dal gruppo di lettura 11 all'inizio dell'analisi (t=0) viene memorizzato e ad esso viene assegnato convenzionalmente un livello di torbidità McFarland di riferimento, nella fattispecie pari a zero (0). Sperimentalmente à ̈ stata determinata una relazione di dipendenza tra l'aumento del valore rilevato dal gruppo di lettura 11 (espresso come differenza o delta Δ rispetto al valore inizialmente memorizzato) e la relativa variazione di torbidità espressa in unità McFarland.
I valori rilevati dai due sensori 18, 20 ad inizio analisi, cioà ̈ a tempo zero (t=0), sono indicati convenzionalmente come V1(0) e V2(0) e vengono inviati ai mezzi di elaborazione 26 dove sono memorizzati nei mezzi di memorizzazione 28.
Nel corso dell'analisi, i primi 18 e secondi 20 mezzi sensori rilevano la quantità di luce rifratta sui due angoli a e β in cui si trovano rispetto alla provetta 16. Detto t un generico istante temporale durante l'analisi, i valori letti dai primi 18 e secondi 20 mezzi sensori al tempo t sono convenzionalmente indicati come Vl(t) e V2(t), indicando con ciò l'andamento, o funzione, della luce diffusa rispetto al tempo t.
In fig. 2 viene riportato il tipico andamento temporale esponenziale della curva associata alle funzioni Vl(t) e V2(t) dei valori rilevati dai primi 18 e secondi 20 mezzi sensori durante l'analisi di un campione biologico contenente batteri in crescita in brodo eugonico.
Secondo il presente trovato, al tempo t viene calcolata, per ogni sensore, la differenza tra il valore attuale V(t) ed il valore all'istante t=0, cioà ̈ per il primo sensore 18 vale la relazione:
Δ1(t)= Vl(t) - V1(0);
mentre per il secondo sensore 20 vale la relazione
Δ2(t)= V2(t) - V2(0).
E' pertanto possibile ottenere le due curve àl(t) e A2(t) (riportate in fig. 3) che rappresentano la variazione di scattering rilevata dai due sensori nel tempo.
La Richiedente ha individuato una relazione di dipendenza tra la variazione di torbidità misurata con la tecnica light-scattering mediante il gruppo di lettura 11 (indicata con il simbolo Δ) e la stessa variazione di torbidità espressa in unità McFarland (indicata con Î ́, mentre il relativo andamento nel tempo, o funzione del tempo, à ̈ indicato con Î ́(t)). Tale dipendenza non à ̈ fissa, bensì dipende da vari fattori, tra i quali vi sono la forma e la dimensione del batterio in esame.
La Richiedente ha esaminato sperimentalmente la crescita di diverse famiglie di batteri, rilevata come descritto con riferimento alla fig. 1. In particolare, sono stati esaminati gli andamenti della variazione di scattering Al(t) e A2(t), confrontandoli con l'aumento del valore di torbidità espresso in McFarland (Î ́) rilevato tramite un fotometro di riferimento.
Da tali prove sono state estrapolate le dipendenze che sussistono, per ciascuna famiglia batterica esaminata, tra l'aumento del valore di scattering rilevato sui due sensori 18, 20, Al(t) e A2(t), ed il relativo aumento di torbidità espressa in unità McFarland (Î ́). Le informazioni sulle dipendenze, secondi dati D2, sono state memorizzate nei mezzi di memorizzazione 28.
A titolo di esempio, i secondi dati D2 possono avere una struttura tipo la seguente tabella:
Tabella
Famiglia del batterio Relazione di dipendenza
Famiglia 1 Î ́ = al*A2 bl*A cl
Famiglia 2 Î ́ = a2*A2 b2*A c2
Famiglia 3 Î ́ = a3*A2 b3*A c3
Nella tabella, ad ogni famiglia di batteri à ̈ associata una relazione di dipendenza che lega la variazione di torbidità espressa in unità McFarland (Î ́) e la relativa variazione di torbidità misurata secondo la tecnica light-scattering (Δ).
Pertanto, nota la famiglia di appartenenza del batterio oggetto dello studio (es: Famiglia 1), e nota la variazione di torbidità misurata secondo la tecnica light-scattering a partire dall'istante iniziale t=0 (Δ), la corrispondente variazione di torbidità espressa in unità McFarland (Î ́) risulta essere:
Î ́ = al*A2 bl*A cl
dove al, bl e cl sono opportuni parametri specifici della famiglia identificata.
Nella fig. 4 à ̈ schematizzato il principio di rilevazione della torbidità McFarland 6(t) a partire dalle curve Al(t) e A2(t). Dall'analisi comparata, basata sui primi dati DI, delle curve Al(t) e A2(t) à ̈ possibile risalire alla tipologia di batterio in esame o almeno alla sua famiglia di appartenenza.
In base alla famiglia di appartenenza à ̈ possibile definire la relazione di dipendenza tra Δ e Î ́, partendo dal database delle sperimentazioni di laboratorio.
A questo punto, nota la relazione di dipendenza, à ̈ possibile calcolare il valore attuale di torbidità McFarland Î ́ del campione in analisi, applicando tale relazione alle due curve Al(t) e A2(t).
Preferibilmente, sono inoltre previsti lattici a concentrazione nota, quale ulteriore convalida della misura effettuata.
L'applicazione pratica di tale tecnica consente la rilevazione del raggiungimento di un determinato livello di torbidità McFarland (nel caso di specie 0,5 unità), necessario come concentrazione standardizzata per l'inoculo del test antibiogramma durante la fase di crescita del campione positivo sottoposto ad analisi colturale.
Il monitoraggio continuo della torbidità del campione durante la crescita determina vantaggi operativi che consentono di velocizzare le procedure di inoculo per il test antibiogramma clinico o standard.
Infatti, le procedure standard prevedono, com'à ̈ noto, lo stemperamento, o diluizione, di colonie precedentemente isolate in piastra in soluzioni fisiologiche/saline fino all'ottenimento di sospensioni a torbidità standardizzata. Pertanto, la metodologia nota può incorrere in errori di diluizione, di manipolazione o di scelta delle colonie utilizzate. Tali preparazioni normalmente si ottengono ad avvenuta crescita di detti batteri nelle normali piastre di Petri che richiedono comunque un'incubazione minima "overnight".
Con la nuova tecnica qui descritta vengono quindi evitate tutte le operazioni manuali relative alla preparazione della sospensione batterica, riducendo i possibili fattori di errore e rendendo possibile una maggiore automazione del test.
Il tempo di raggiungimento di un prestabilito livello di torbidità McFarland, ad esempio 0,5, del campione in fase di crescita dipende dalla carica batterica iniziale del campione, laddove, maggiore à ̈ il valore di conta, più rapido sarà il raggiungimento della soglia McFarland prestabilita.
Vantaggiosamente, il gruppo di lettura 11 ed il relativo dispositivo 10 per la predisposizione del campione al voluto livello di torbidità descritti possono essere integrati in un'unica strumentazione automatica.
È chiaro che al procedimento per l'indagine batteriologica su un campione biologico e relativo dispositivo 10 fin qui descritti possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti e/o fasi, senza per questo uscire dall'ambito del presente trovato .

Claims (6)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per l'indagine batteriologica su un campione biologico caratterizzato dal fatto che prevede l'esecuzione di una lettura in light scattering per la determinazione della torbidità secondo lo standard McFarland di una sospensione formata da un mezzo di coltura liquido, o brodo eugonico, in cui viene inoculato il campione biologico ed in cui la torbidità viene misurata in continuo direttamente dalla sospensione del campione in analisi durante la fase di crescita dei batteri, fino al raggiungimento di una determinata soglia di torbidità espressa secondo lo standard McFarland.
  2. 2. Procedimento come nella rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la rilevazione del raggiungimento della soglia di torbidità McFarland avviene per calcolo differenziale dall'avvio della fase di crescita dei batteri .
  3. 3. Procedimento come nella rivendicazione 1 o 2, comprendente: - una prima fase nella quale si effettua la crescita batterica nella sospensione del campione biologico inoculato nel mezzo di coltura liquido contenuto in un elemento di contenimento (16) almeno in parte trasparente alle radiazioni elettromagnetiche, sul quale elemen to di contenimento (16), contemporaneamente alla crescita batterica, viene fatto incidere un fascio (14) di luce coerente e collimato e viene effettuata una rilevazione nel tempo della quantità di luce rifratta, o diffusa, da parte della sospensione, detta rilevazione venendo effettuata in corrispondenza di una prima (Pi) e di una seconda (P2) posizione angolare, distinte fra loro, rispetto a detto elemento di contenimento (16), in modo da determinare una prima Vl(t) ed una seconda V2(t) curva, rispettivamente associate alla prima (Pi) ed alla seconda (P2) posizione angolare, dell'andamento nel tempo della torbidità della sospensione batterica; caratterizzato dal fatto che comprende: - una seconda fase in cui si determinano due curve differenziali Al(t) e A2(t) date dalla differenza rispettivamente tra detta prima curva Vl(t) ed un primo valore Vi(0) di torbidità puntuale all'inizio della prima fase, rilevato in corrispondenza della prima (PI) posizione angolare e tra detta seconda curva V2(t) ed un secondo valore V2(0) di torbidità puntuale all'inizio della prima fase, rilevato in corrispondenza della seconda (P2) posizione angolare; - una terza fase in cui, dall'andamento delle due curve differenziali Al(t) e A2(t) confrontato con primi dati (DI) di classificazione, si ricava la tipologia di bat- lUa3⁄4ndatario STEFANO LJ er sé eoervlri iis, 6/2 - 33100 UDINE terio presente nel campione o la sua famiglia, o ceppo o specie, di appartenenza; - una quarta fase in cui le due curve differenziali Al(t) e A2(t) sono correlate ad una corrispondente variazione Î ́ dei valori di torbidità riferiti allo standard McFarland Î ́(t) che definisce detta soglia di torbidità, in funzione di pre-memorizzati secondi dati (D2) di dipendenza tra l'andamento delle due curve differenziali Al(t) e A2(t) e valori di torbidità secondo lo standard McFarland 6(t), detti secondi dati (D2) essendo definiti e suddivisi per ciascuna famiglia, o ceppo o specie di appartenenza dei batteri.
  4. 4. Procedimento come nella rivendicazione 1, 2 o 3, caratterizzato dal fatto che la variazione Î ́ della quarta fase corrisponde allo standard McFarland 0,5.
  5. 5. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che prevede una fase di controllo della corretta misura di torbidità McFarland tramite confronto con sospensioni di particelle di lattice a concentrazione nota.
  6. 6. Dispositivo per l'indagine batteriologica su un campione biologico, caratterizzato dal fatto che comprende: - un elemento di contenimento (16) almeno in parte trasparente alle radiazioni elettromagnetiche, al cui interno à ̈ prevista la crescita batterica di una sospensione del campione biologico inoculato in un mezzo di coltura liquido, o brodo eugonico, - un gruppo di lettura (11) provvisto di mezzi emettitori (12) mediante i quali, su detto elemento di contenimento (16), viene fatto incidere un fascio (14) di luce coerente e collimato e di primi (18) e secondi (20) mezzi sensori mediante i quali viene effettuata una rilevazione nel tempo di raggi (22, 24) di luce diffusa, o rifratta, da parte della sospensione, detti primi (18) e secondi (20) mezzi sensori essendo collocati in corrispondenza di una prima (Pi) e di una seconda (P2) posizione angolare, distinte fra loro, rispetto a detto elemento di contenimento (16), in modo da determinare una prima Vl(t) ed una seconda V2(t) curva, rispettivamente associate alla prima (Pi) ed alla seconda (P2) posizione angolare, dell'andamento nel tempo della torbidità della sospensione batterica; - mezzi di elaborazione (26) atti ad elaborare segnali prodotti dai primi (18) e secondi (20) mezzi sensori in modo da determinare due curve differenziali Al(t) e A2(t) date dalla differenza rispettivamente tra detta prima curva Vl(t) ed un primo valore Vl(0) di torbidità puntuale all'inizio della rilevazione, rilevato in corrispondenza della prima (PI) posizione angolare e tra detta seconda curva V2(t) ed un secondo valore V2(0) di torbidità puntuale all'inizio della rilevazione, rilevato in corrispondenza della seconda (P2) posizione angolare, detti mezzi di elaborazione (26) comprendendo mezzi di memorizzazione (28) a banca dati in cui sono memorizzati primi dati (Di) di classificazione mediante i quali, dall'andamento delle due curve differenziali Al(t) e A2(t) si ricava la tipologia di batterio presente nel campione o la sua famiglia, o ceppo o specie di appartenenza, in detti mezzi di memorizzazione (28) essendo, inoltre, pre-memorizzati secondi dati (D2) di dipendenza tra l'andamento delle due curve differenziali Al(t) e A2(t) ed una corrispondente variazione Î ́ dei valori di torbidità secondo lo standard McFarland 6(t) che definisce una voluta soglia di torbidità, detti secondi dati (D2) di dipendenza essendo definiti e suddivisi per ciascuna famiglia, o ceppo o specie di appartenenza dei batteri, detti mezzi di elaborazione (26) essendo atti a correlare le due curve differenziali Al(t) e A2(t) alla corrispondente variazione Î ́ di detti valori di torbidità secondo lo standard McFarland.
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