ITUD20120079A1 - Metodo per l'analisi del processo di formazione di aggregati in un fluido biologico e relativa apparecchiatura di analisi - Google Patents

Description

“METODO PER L’ANALISI DEL PROCESSO DI FORMAZIONE DI AGGREGATI IN UN FLUIDO BIOLOGICO E RELATIVA APPARECCHIATURA DI ANALISIâ€

CAMPO DI APPLICAZIONE

Il presente trovato si riferisce ad un metodo per l’analisi del processo di formazione di aggregati, quali aggregati piastrinici o di globuli rossi o altro, in un fluido biologico, quale sangue od altri fluidi ematici, siano essi animali o umani, e miscele di detto fluido con sostanze additive.

In particolare, il presente trovato prevede lo studio “in vitro†, del fenomeno di accrescimento nel tempo degli aggregati in condizioni di flusso controllato del fluido, al fine di valutare ad esempio l’insorgenza di patologie cardiovascolari, come potenziali rischi trombotici in soggetti “silenti†, e potenziali rischi emorragici in soggetti con disordini della emostasi congeniti ed acquisiti. Inoltre, il metodo secondo il presente trovato consente il monitoraggio dell’efficacia di farmaci antitrombotici o altri farmaci. È pure oggetto del presente trovato un’apparecchiatura di analisi del processo di aggregazione nel fluido biologico.

STATO DELLA TECNICA

Il processo coagulativo à ̈ il meccanismo fisiologico che porta all’arresto della perdita di sangue dai vasi sanguigni danneggiati, ed à ̈ essenziale per garantire l’integrità di un individuo in caso di emorragie.

La trombosi à ̈ una formazione indesiderata di un tappo emostatico o di un trombo all’interno di un vaso sanguigno o del sistema cardiovascolare.

Com’à ̈ noto, la capacità adesiva ed aggregativa delle piastrine e la formazione di fibrina controllano normalmente la riparazione dei danni tessutali. L’attivazione delle piastrine porta alla formazione di una massa di piastrine aggregate che formano un tappo per l’arresto di eventi emorragici.

A volte, le piastrine possono esasperare il processo di riparazione, essendo attivate in maniera inappropriata se c’à ̈ un cambiamento patologico nel processo emostatico, ad esempio l’arteriosclerosi che può dare seguito ad un evento drammatico che porta all’occlusione del vaso ematico: la trombosi.

Un evento emostatico patologico, sia esso trombotico-ischemico, dovuto ad improvvisa mancanza di flusso ematico in un vaso sanguigno, come nel caso delle coronarie nell’infarto del miocardio, od emorragico, rappresenta un severo problema a carico del sistema cardiovascolare. Questi problemi derivano da alterazioni cardiovascolari acquisite nel tempo, come manifestazioni arteriosclerotiche, aneurismi, “shunts†atero-venosi, vasculiti, anomalie delle valvole cardiache, fibrillazioni atriali e malattie di conduzione, trombosi venose e arteriose o altro.

Inoltre, queste manifestazioni patologiche sono difficilmente diagnosticabili in quanto presenti anche in soggetti che nella normale vita di relazione non hanno mai evidenziato eventi patologici e che, ad esempio, in occasione di interventi chirurgici, possono incorrere in gravi manifestazioni emorragiche o trombotiche - ischemiche. A tale scopo risulta di fondamentale importanza dotarsi, in ambito clinico, di un test funzionale “ex vivo†che permetta di identificare potenziali rischi trombotici ed emorragici in soggetti “silenti†per manifestazioni patologiche cardiovascolari.

A tal fine à ̈ nota la domanda di brevetto europeo 06819957.9 che si riferisce ad un’apparecchiatura per la diagnosi, prognosi e monitoraggio farmacologico della patologia trombotico-ischemica ed emorragica a carico dell’apparato cardio-vascolare. In particolare, l’apparecchiatura nota di cui sopra comprende una camera, anche chiamata camera di perfusione, di passaggio o flusso di liquidi ematici.

La camera di perfusione à ̈ provvista di microcanali nei quali, mediante mezzi di pompaggio ed aspirazione, viene fatto fluire il sangue precedentemente prelevato dal paziente in una provetta, ed opportunamente trattato con anticoagulanti come ad esempio eparina, citrato o simili, e con sonde fluorescenti che fungono da marcatori ottici, come ad esempio quinacrina, ficoeritrina, o simili.

Mezzi di acquisizione ottica coordinati con detti marcatori per analisi di fluorescenza acquisiscono immagini relative all’avanzamento dei processi emostatici che portano alla formazione di trombi all’interno dei microcanali.

Un’unità di elaborazione elabora le immagini acquisite e fornisce indicazioni relative al comportamento dell’emostasi del paziente.

I mezzi di acquisizione ottica noti possono essere ad esempio microscopi ottici confocali, o microscopi ottici invertiti.

Utilizzando un microscopio invertito la quantificazione della formazione del trombo à ̈ realizzata attraverso un’immagine digitale bidimensionale. Mediante questo approccio la ricostruzione tridimensionale della formazione del trombo può solo venire estrapolata in modo indiretto da quella bidimensionale e potrebbe non riflettere la sua reale dimensione.

Questo problema può essere risolto attraverso il microscopio confocale, ed a tal riguardo si vedano le pubblicazioni di M. Mazzucato, M.R. Cozzi, P. Pradella, D. Perissinotto, A. Malmstrom, M. Morgelin, P. Spessotto, A. Colombatti, L. De Marco, R. Perris, Vascular, "PG-MZver sicari variants promote platelet adhesion at low shear rates and cooperate with collagens to induce aggregation" FASEB J. 16 (2002), 1903-1916; di M. Mazzucato, P. Pradella, M.R. Cozzi, L. De Marco, Z.M. Ruggeri, "Sequential cytoplasmìc calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by thà ̈ glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor" , Blood 100 (2002) 2793-2800; di M. Mazzucato, M.R. Cozzi, P. Pradella, Z.M. Ruggeri, L. De Marco, "Distinct roles of ADP receptors in von Willebrand factormediated platelet signaling and activation under high flow†, Blood 104 (2004), 3221-3227; di A. Casonato, L. De Marco, L. Gallinaro, M. Sztukowska, M. Mazzuccato, M. Battiston, A. Pagnan, Z.M. Ruggeri, “Altered von Willebrand factor subunit proteolysis and multimer processing associated with thà ̈ Cys2362Phe mutation in thà ̈ B2 domain ", Thrombosis and Haemostasis 97 (2007) 527-533; di M. Mazzucato, M.R. Cozzi, M. Battiston, M. Jandrot-Perrus, M. Mongiat, P. Marchese, T.J. Kunicki, Z.M. Ruggeri, L. De Marco, “ Distinct spatiotemporal Ca2+ signaling elicited by integrin alpha2fil and glycoprotein VI under flow ", Blood 114 (2009), 2793-280.

Tuttavia, le dimensioni di un microscopio confocale e soprattutto il suo costo, limitano la sua diffusione a sofisticati laboratori di ricerca.

Inoltre, trattandosi di una ricostruzione in tempo reale la sorgente laser monocromatica utilizzata per illuminare gli aggregati piastrinici durante il processo di emostasi, interagisce pesantemente con il processo stesso trasferendo energia così da alterarne o comprometterne la dinamica. Sono anche diffusi dispositivi più semplici economici ma meno accurati per il monitoraggio di cellule in condizioni di flusso che integrano canali fluidici posti direttamente su chip CMOS senza lenti funzionanti anche in condizioni di fluorescenza con campi visivi superiori al cm<^>2 e risoluzione fino a qualche micron, a tale scopo si veda ad esempio U. Gurkan, S. Moon, H. Gecki, F. Xu, S. Wang, T. J. Lu and U. Demirci, " Miniaturized lensless imaging systems for celi and microorganism visualization in point-of-care testing", Biotechnol. J. 2011, 6, pp. 138 — 149.

Sono anche noti metodi di analisi dell’aggregazione piastrinica nel sangue intero mediante misurazione della resistenza elettrica fra due elettrodi immersi nel sangue intero ad esempio descritti in D.C. Cardinal, R.J. Flower, “ The electronic aggregometer: A novel device for assessing platelet behavior in blood †, J. Pharmacol. Methods, 1980, 3, 135-158.

Sono pure noti metodi di analisi in vivo dei fenomeni di stasi sanguigna (si veda T. Dai, A. Adler, "In vivo blood characterization from bioimpedance spectroscopy of blood pooling", IEEE Trans. Instr. Meas., 2009, 58, 3831-3838) e per monitorare la viscosità del sangue durante gli interventi cardiochirurgici mediante tecniche di spettroscopia di impedenza (si veda G.A.M. Pop, T.L.M. de Backer, M. de Jong, P.C. Struijk, L. Moraru, Z. Chang, H. G. Goovaerts, C. J. Slager, A.J.J.C. Bogers, "On-line electrical impedance measurement for monitoring blood viscosity during on-pump heartsurgery", Eur. Surgical Res., 2004, 36, 259-265).

I parametri Cole-Cole di polarizzazione indotta spettrale rilevati mediante la spettroscopia di impedenza possono essere posti in correlazione con l’ematocrito (si veda: Y. Ulgen, M. Sezdi, " Physiological quality assessment of stored whole blood by means of electric measurements" , Med. Bio. Eng. Comput., 2007, 45, 653-660), con la qualità del sangue (si veda: Y. Ulgen, M. Sezdi, "Hematocrit dependence of thà ̈ Cole-Cole parameters of human blood", IEEE Proc. 2nd Int. Biomed. Eng. Days, 1998, 71 -74), e con la viscosità.

In particolare, si osserva un aumento logaritmico (esponenziale) della capacità associata alla membrana cellulare al crescere del fibrinogeno (rispettivamente, dell’ematocrito). A causa della membrana isolante dei globuli rossi, che si presenta non conduttiva sotto i 200kHz, la resistenza elettrica del sangue intero alle basse frequenze dipende fortemente dall’ematocrito come descritto in T. Yamagata, H. Fujisaki, "Investigation of electrical resistivity changes of human blood during dynamic exercise", Trans. Electrical and Electronic Engineering, IEEJ 2008, 3, 79-83. Sopra 10 MHz la membrana si comporta come un corto circuito e la conduttanza misurata à ̈ una media pesata delle conducibilità associate al plasma ed al fluido intracellulare.

Un modello quantitativo della conducibilità del sangue in condizioni di flusso laminare stazionario all’interno di tubi rigidi cilindrici, viene descritto in A. E. Hoetink, T. J. C. Faes, K. R. Visser, R. M. Heethaar, "On thà ̈ flow dependency of thà ̈ electrical conductivity of blood", IEEE Trans. Biomed. Eng. 2004, 51, 1251-1261, ovvero un modello basato su un’estensione della teoria di Maxwell-Fricke che tiene conto dell'effetto di orientamento e della deformazione delle particelle ellissoidali che vengono indotti dallo sforzo di taglio; Un’estensione di tale analisi per tenere conto anche di un flusso pulsante viene descritto in R. L. Gaw, B. H. Cornish, B. J. Thomas, “The Electrical Impedance of Pulsatile Blood Flowing Through Rigid Tubes: A Theoretical Investigation IEEE Trans. Biomed. Eng. 2008, 55, 721-727.

In K. Asami, K. Sekine, “ Dielectric modelling of erythrocyte aggregation in blood" J. Phys. D: Appi. Phys. 2007, 40, 21972204 viene simulato il comportamento dielettrico del sangue intero utilizzando un modello degli eritrociti che consiste in un disco ricoperto da una membrana, ed il modello di un aggregato di eritrociti à ̈ costituito da una pila di dischi a spaziatura regolare.

Inoltre, in O. Baskurt, M. Uyuklu, S. Ozdem e H. J. Meiselman, “ Measurement of red blood celi aggregation in disposable capìllary tubes †, Clinical Hemorheology and Microcirculation 47, pp. 295-305, 2011, ed in O. Baskurt, M. Uyuklu and H. J. Meiselman, “ Simultaneous monitoring of electrical conductance and Ught transmittance during red blood celi aggregation †, Biorheology 46, pp. 239-249, 2009, si sono sperimentate tecniche nelle quali si misurano e si correlano tra loro la conduttanza elettrica (mediante 2 elettrodi posizionati all’inizio e fine del canale) e la trasmittanza della luce trasversale rispetto al canale fluidico dove avviene l’aggregazione di eritrociti per share rate di 500 l/s per 75 sec.

In O. Kwon, J. K. Seo, E. J. Woo and J-R. Yoon, "Electrical Impedance Imaging for Searching anomalies", Comm. Korean Math. Soc. 16 (2001), No. 3, pp. 459-485 si valuta dal punto di vista dei problemi inversi, la ricostruzione in un disco bidimensionale, della geometria (posizione e dimensioni) di un numero limitato di difetti 2D, con conducibilità diversa rispetto a quella del disco, a partire dalla misura dei potenziali in un numero di punti elevato (> 30) distribuiti uniformemente lungo l’intero bordo del dominio stesso. Negli stessi punti à ̈ applicata anche una distribuzione di corrente prescritta mediante condizioni al contorno di Neumann (cioà ̈ sulla derivata normale al bordo del potenziale) in modo da garantire somma nulla e densità uniforme nel disco. Anche i potenziali vengono normalizzati in modo da garantire media nulla.

In tempi recenti notevoli sforzi ed una crescente attenzione sono stati dedicati alla progettazione di dispositivi microfluidici dotati di geometrie diverse, ad esempio personalizzabili su richiesta dell’utente, sia di canali con dimensioni minime di qualche micron, che di elettrodi con dimensioni minime di 10 di micron, come contatori di cellule del sangue (si veda al proposito N. Piacentini, D. Demarchi, P. Civera, M. Knaflitz, “ Blood Celi Counting by Means of Impedance Measurements in a MicroSystem Device †, Proc. 30th Int. IEEE EMBS Conf. 2008, 4824-4827) o separatori dì cellule (si veda al proposito Y. Nakashima, S. Hata, T. Yasuda, “Blood plasma separation and extraction from a minute amount of blood using dielectrophoretic and capillary forces ", Sens. Actuators B 2010, 145, 561-569), cosicché diversi fornitori, hanno sviluppato le microtecnologie che ne consentono la fabbricazione.

Tali tecnologie realizzative dei canali e degli elettrodi in esso integrati consentono facilmente la visione al microscopio ottico o a fluorescenza convenzionale, invertito o confocale e la misura del comportamento elettrico di tipo impedenzometrico mediante strumentazione per la misura dell’ impedenza di tipo commerciale (LCR Meter Agilent HP4284A con classe <0.5%) o sviluppata ad hoc.

È anche nota una metodologia automatica per monitorare il comportamento cellulare consentendo di osservare ad esempio la proliferazione cellulare, l’adesione cellulare e la diffusione dell’adesione, la mobilità, porazìone delle membrane cellulari. Tale metodologia consiste di un insieme di elettrodi stampati su di un film d’oro, alimentati da tensioni, correnti alternate a frequenza ed ampiezza variabili; tra coppie di elettrodi (di forma circolare del diametro di 250 micron) si misura sia il modulo Z dell’impedenza, che in altre metodologie il modulo e la fase dell’impedenza stessa. Dato che le membrane cellulari alle frequenze di utilizzo (<200 kHz) risultano praticamente isolanti, cambiamenti morfologici della disposizione cellulare modificano i cammini delle correnti elettriche provocando una conseguente variazione dell’impedenza misurata alle coppie di elettrodi.

Esistono diverse matrici di elettrodi ciascuno del diametro di 250 micron sia per colture cellulari stazionarie che in condizioni di perfusione anche ad elevato share rate con un canale di dimensioni 50 mm di lunghezza, 5 mm di larghezza, e 0.4 mm di altezza.

Sono anche noti kit completi con un totale di 10 uscite fluidiche ed elettriche complessivamente personalizzabili studiati per la microscopia sia a fluorescenza che tradizionale con canali chiusi di lunghezza variabile, di altezze variabili da decine di micron e larghezze dell’ordine di 100 micron.

Sono pure note soluzioni in cui al canale microfluidico di passaggio del sangue sono associate fibre ottiche per illuminare e ricevere focalizzata la luce emessa.

In merito a rilevazioni di grandezze elettriche per l’analisi di processi interessanti il sangue sono anche noti il documento KR2008015212 in cui si utilizzano due elettrodi in contatto con il sangue fermo in un contenitore cilindrico e si misura ed acquisisce l’impedenza, il documento SU1278697 in cui si individua la formazione di strutture di coagulazione spaziali del sangue mediante confronto di misure di conduttività in continua ed in frequenza e la prevalenza della conducibilità in continua rispetto a quella in frequenza indica l’evento, ed il documento US-B2-6797150 in cui si valuta con misure di capacità e resistenza nel dominio del tempo ed in frequenza la concentrazione di glucosio, l’ematocrito ecc. di un volume di campione biologico, ad esempio sangue, che occupa tutto il volume tra due elettrodi di una cella elettrochimica caratterizzata da una coppia di elettrodi piani affacciati e distanti 1; indicando con S la l’area conduttrice di contatto con gli elettrodi del campione cellulare, la capacità C dipende da S (nell’ipotesi che la capacità in serie del doppio strato di ioni all’interfaccia tra elettrodi e cellule sia costante) la resistenza R da 1/S, il loro rapporto C/R à ̈ proporzionale al quadrato di S. Da tale rapporto si deduce l’area coperta dal campione e di conseguenza il volume S 1.

Il documento US-A1-20080297169 prevede la misurazione di una frazione di particelle in fluidi biologici (ad esempio ematocrito nel sangue, velocità di coagulazione, tempo di protrombina PT, tempo di attivazione parziale di protrombina APPT, activated clotting time ACT, trombine clotting time TCT) e non; inoltre consente di determinare la concentrazione di un analita in un campione di sangue plasma siero urine ecc.. I fluidi sono fermi. Il dispositivo contiene i reagenti necessari. La tecnica à ̈ basata sulla misura di impedenza in AC o resistenza in DC tra coppie di elettrodi. Un sistema termostatico standard mantiene la temperatura ad esempio a 35°C. Le alimentazioni elettriche sono standard come pure il sistema di acquisizione dei segnali elettrici di tensione e corrente per il calcolo di resistenza o impedenza.

Il documento WO-A1-2005114140 descrive un dispositivo per la misura della coagulazione del sangue intero o il tempo di protrombina nel siero. Si studia il moto di una particella in materiale ferromagnetico azionata da forze magnetiche all’interno della camera contenente il campione di fluido biologico in esame.

Infine, il documento WO-A1-2011073481 descrive un sistema multi elettrodo dove si misura il cambiamento di impedenza dovuto alla presenza di un particolare componente in una soluzione di natura diversa (biologica o meno). Il cambiamento di impedenza à ̈ legato al particolare componente presente.

I documenti sopra citati relativi a misure impedenziometriche non sono in grado di determinare con ragionevole certezza l’evoluzione di accrescimento di un aggregato piastrinico in condizioni di flusso del fluido emostatico, ma unicamente in condizioni stazionarie del fluido emostatico ad esempio in una provetta.

Tale analisi del processo di emostasi potrebbe essere realizzabile con tecniche ottiche ma le attrezzature richieste risultano particolarmente complesse da gestire ed utilizzare, nonché particolarmente costose e tali da non giustificare una loro applicazione in ambito ambulatoriale.

Uno scopo del presente trovato à ̈ quello di mettere a punto un metodo per Tanalisi del processo di formazione di aggregati in un fluido biologico, quale sangue, in condizioni di flusso per stimare l’andamento, nel tempo, di accrescimento dell’aggregato, ovvero del suo volume.

Un ulteriore scopo del presente trovato à ̈ quello di mettere a punto un metodo di analisi che sia affidabile e preciso e che permetta di acquisire sostanzialmente in tempo reale ed analizzare il processo aggregativo nella sua globalità e complessità con un elevato grado di affidabilità e precisione.

Un ulteriore scopo del presente trovato à ̈ quello di realizzare un’apparecchiatura per l’analisi del processo di aggregazione in un fluido biologico che sia economica, facilmente trasportabile ed adatta ad essere utilizzata anche in strutture di tipo ambulatoriale.

Un ulteriore scopo del presente trovato à ̈ quello di realizzare un’apparecchiatura che sia affidabile precisa, e permetta di monitorare, acquisire in tempo reale, ed analizzare in modalità dinamica la formazione di aggregati.

Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato à ̈ espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti. Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell’idea di soluzione principale.

In accordo con i suddetti scopi, un metodo per l’analisi del processo di formazione di aggregati, quali aggregati piastrinici o di globuli rossi, o simili, in un fluido biologico, quale sangue, fluidi ematici o altri fluidi, viene utilizzato per lo studio “in vitro†del fenomeno di accrescimento nel tempo di aggregati.

Il metodo comprende almeno una fase in cui il fluido biologico viene fatto scorrere attraverso almeno un microcanale di una camera di perfusione, ed una fase di acquisizione ottica, mediante un dispositivo di acquisizione ottica, durante la quale, in almeno un’area di indagine del microcanale, vengono acquisite immagini relative alla formazione di aggregati. Nel microcanale à ̈ presente un substrato reattivo, quale un substrato citoadesivo, per stimolare nel fluido biologico il processo di aggregazione.

Secondo un aspetto del presente trovato il metodo comprende, inoltre, una fase di misura impedenziometrica, associata alla fase di acquisizione ottica, durante la quale, mediante mezzi di rilevazione impedenziometrici disposti in corrispondenza dell’area di indagine del microcanale, viene eseguita una rilevazione nel tempo dell’impedenza del fluido biologico. L’impedenza rilevata à ̈ correlata alla formazione di aggregati. II metodo comprende anche una fase di elaborazione, mediante un’unità di elaborazione, durante la quale viene determinato il volume di aggregati che si stanno formando nell’area di indagine, correlando, nel tempo, informazioni relative alle immagini acquisite nella fase di acquisizione ottica con dati dell’impedenza del fluido biologico acquisiti nella fase di misura impedenziometrica.

In questo modo, mediante integrazione delle misure ottiche e delle misure impedenziometriche relative agli aggregati che si vanno via via definendo durante il processo di aggregazione à ̈ possibile ottenere un’indicazione del volume di sviluppo degli aggregati per valutare ad esempio l’insorgenza di patologie cardiovascolari, o studiare l’effetto di particolari farmaci. La misura del volume à ̈ ottenuta senza sapere a priori dove si formerà l’aggregato, o trombo, rispetto alla disposizione dei mezzi di rilevazione impedenziometrici.

Secondo un ulteriore aspetto del presente trovato, durante la fase di elaborazione, dalle immagini acquisite viene stimata un’area di base degli aggregati che si formano nell’area di indagine.

In accordo con un ulteriore aspetto del trovato, la suddetta area di base degli aggregati viene determinata in funzione dell’intensità luminosa rilevata dall’immagine. In forme di realizzazione del presente trovato, nella fase di elaborazione viene determinata una funzione di forma che à ̈ direttamente proporzionale all’intensità luminosa rilevata dall’immagine.

Secondo un’ulteriore forma di realizzazione risulta vantaggioso prevedere che la suddetta funzione di forma venga elaborata, in funzione della suddetta area di base degli aggregati, per approssimarla all’andamento delle misure di impedenza acquisite nella fase di misura impedenziometrica, e per determinare il volume dell’aggregato. In altre parole viene individuata una funzione di forma che meglio riproduce le misure di impedenza che sono state acquisite.

In ulteriori forme di realizzazione, durante la fase di elaborazione, i dati dell’impedenza sono correlati ad un’altezza media degli aggregati che si formano nell’area di indagine.

Il presente trovato à ̈ relativo anche all’apparecchiatura per l’analisi del processo di aggregazione che implementa un metodo come sopra descritto.

Forme di realizzazione del presente trovato prevedono che i mezzi di rilevazione impedenziometrici comprendano elettrodi alimentati da dispositivi di alimentazione elettrica ed ai quali sono associati dispositivi di misura per la rilevazione di suddetti dati di impedenza.

Si può prevedere, infatti, che da coppie dei suddetti elettrodi vengano rilevate le tensioni elettriche e venga rilevata la corrente transitante per la successiva valutazione dell’impedenza. In una forma di realizzazione del presente trovato, i mezzi di rilevazione impedenziometrici comprendono almeno un primo elettrodo ed un secondo elettrodo aventi sviluppo oblungo e disposti, paralleli fra loro, trasversalmente allo sviluppo longitudinale del microcanale. L’area di indagine à ̈ compresa fra il primo elettrodo ed il secondo elettrodo ed ha dimensioni, a solo titolo esemplificativo dell’ordine micrometrico.

In altre forme realizzative si può prevedere, infatti, l’utilizzo di due o più coppie di elettrodi utilizzati per l’esecuzione di misure distinte di tensione e di corrente.

In accordo con una variante i mezzi di rilevazione impedenziometrici comprendono una pluralità di celle elementari di rilevazione angolarmente sfalsate una rispetto all’altra e ciascuna provvista di almeno una coppia dei suddetti elettrodi.

In questo modo à ̈ possibile prevede che ciascuna cella elementare di rilevazione rilevi un valore impedenziometrico di una porzione dell’area di indagine. Successivamente, per la determinazione del volume dell’aggregato viene eseguita una media pesata delle informazioni rilevate.

In accordo con una forma realizzativa ciascuna di dette celle elementari di rilevazione comprende un primo elettrodo, centrale, circondato da un secondo elettrodo, conformato sostanzialmente ad “U†.

ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI

Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di una forma di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:

- la fig. 1 à ̈ una rappresentazione schematica di un’apparecchiatura per l’analisi del processo di formazione di aggregati secondo il presente trovato;

- la fig. 2 Ã ̈ una vista in pianta di un particolare di fig. 1;

- la fig. 3 Ã ̈ una vista prospettica di un componente del particolare di fig. 2,

- la fig. 4 Ã ̈ una vista di un particolare di fig. 2;

- la fig. 5 Ã ̈ una variante di fig. 4;

- la fig. 6 à ̈ un’immagine del fenomeno di aggregazione;

- la fig. 7 à ̈ una vista di una funzione di forma ottenuta dall’elaborazione deH’immagine di fig. 6;

- la fig. 8 à ̈ un grafico riportante l’andamento del modulo di impedenza in funzione della frequenza di alimentazione del sangue senza aggregazione, e con aggregazione; - la fig. 9 à ̈ un grafico che riporta l’andamento nel tempo del modulo dell’impedenza del sangue con o senza aggregazione indotta, per una frequenza di alimentazione di 150kHz.

- le figg. 10, IOa-d, 11, l la-d, 12, 12a-d, 13 e 13a-d sono rappresentazioni del fenomeno di aggregazione indotta rilevate durante il processo di aggregazione indotta.

Per facilitare la comprensione, numeri di riferimento identici sono stati utilizzati, ove possibile, per identificare elementi comuni identici nelle figure. Va inteso che elementi e caratteristiche di una forma di realizzazione possono essere convenientemente incorporati in altre forme di realizzazione senza ulteriori precisazioni.

DESCRIZIONE DI ALCUNE FORME DI REALIZZAZIONE

Con riferimento a fig. 1, un’attrezzatura per l’analisi del processo di formazione di aggregati, in un fluido biologico, secondo il presente trovato viene indicata nel suo complesso con il numero di riferimento 10, e comprende almeno una camera di perfusione 11 nella quale viene fatto scorrere un fluido biologico, nel caso di specie sangue, ed un dispositivo di acquisizione ottica 12 predisposto per acquisire immagini relativamente alla condizioni di scorrimento del sangue nella camera di perfusione 11. Nel seguito della descrizione si farà riferimento al caso specifico di formazione di aggregati piastrinici, anche se à ̈ di tutta evidenza che un’analoga trattazione può essere fornita anche per altri aggregati come aggregati di globuli rossi, o simili.

Il fluido da analizzare, infatti, può essere fluido biologico, sangue, fluidi ematici siano essi animali o umani, e miscele di detto fluido con sostanze additive.

La camera di perfusione 11 (figg. 1, 2, e 3) comprende un corpo di base 13 provvisto di almeno una miscroscanalatura 14 ricavata su una prima superficie 15 del corpo di base 13, avente uno sviluppo prevalentemente longitudinale ed una sezione rettangolare a solo titolo esemplificativo di dimensioni 0.4 mm di larghezza e 0.2 mm di altezza.

In corrispondenza di ciascuna delle estremità terminali della microscanalatura 14, ed ortogonalmente allo spessore del corpo di base 13, à ̈ ricavato un canale di ingresso 18, e rispettivamente un canale di uscita 19 del sangue che viene fatto fluire attraverso la microscanalatura 14.

II canale di ingresso 18 e di uscita 19 presentano un’estremità di collegamento 21 (fig. 1) ricavata in corrispondenza di una seconda superficie 23 del corpo di base 13, che à ̈ contrapposta alla prima superficie 15, ed un’estremità svasata 24 che si apre verso la microscanalatura 14.

In corrispondenza dell’estremità di collegamento 21 del canale di ingresso 18 à ̈ collegato un condotto di ingresso 25 del sangue, mentre in corrispondenza del canale di uscita 19 à ̈ collegato un condotto di uscita 26 del sangue.

Al condotto di ingresso 25 à ̈ associato un elemento di contenimento 28 del sangue mentre al condotto di uscita 26 à ̈ associato un dispositivo di pompaggio, nella fattispecie una pompa a siringa 27, che provvede ad aspirare il sangue dal condotto di ingresso, facendolo passare attraverso la microscanalatura 14 con una portata costante ed un gradiente di velocità, ovvero uno “sheare rate†non inferiore a 3000 s<^>-l.

La prima superficie 15 (fìgg. 2 e 3) à ̈ definita da una sede di alloggiamento 29 sagomata e ricavata rientrante nello spessore complessivo del corpo di base 13.

La sede di alloggiamento 29 à ̈ configurata per permettere il posizionamento stabile e l’alloggiamento con precisione di un elemento di copertura, nella fattispecie un ve trino 30 (fìg. 1), il quale viene posto a contatto con una sua superficie di appoggio 31 contro la prima superficie 15 del corpo di base 13 e provvede a chiudere la microscanaltura 14 per definire un microcanale 33 di passaggio del sangue.

La prima superficie 15 del corpo di base 13, e la superficie di appoggio 31 del vetrino 30 hanno tolleranze geometriche e dimensionali molto ristrette per garantire la corretta planarità reciproca fra loro e garantire la chiusura ermetica del microcanale 33.

La pompa a siringa 27 genera nel microcanale 33 una depressione che, oltre ad aspirare il sangue dall’elemento di contenimento 28 provvede a mantenere aderenti fra loro il corpo di base 13 ed il vetrino 30.

Sulla superficie di appoggio 31 del vetrino 30, prima dell’analisi viene distribuita uniformemente una sostanza citoadesiva, quale un collagene, per favorire l’aggregazione piastrinica del sangue.

Mezzi di fissaggio di tipo noto e non rappresentati nelle figure sono previsti per fissare reciprocamente fra loro il corpo di base 13 ed il vetrino 30.

La camera di perfusione 11 à ̈ tipicamente realizzata in materiale trasparente per permettere l’acquisizione delle immagini da parte dei mezzi di acquisizione ottica. La sua geometria deve essere adatta a simulare le condizioni fluidodinamiche desiderate come ad esempio il grado di scorrimento, o “sheare rate†, e il flusso laminare.

In particolare, la camera di perfusione 11 deve garantire un’elevata tenuta idraulica, al fine di conservare le condizioni fluido-dinamiche volute e non inficiare l’attendibilità dell’analisi.

Il materiale utilizzato per la realizzazione della camera di perfusione 11, ovvero per il coipo di base 13 e per il vetrino 30, Ã ̈ scelto in un gruppo comprendente vetro, COC (copolimeri ciclici a base olefinica), COP (polimeri ciclici a base olefinica), policarbonato ad elevato grado ottico, silicone da colata, ovvero in polidimetilsilossano anche noto come PDMS, o simili.

Sulla superficie di appoggio 31 del vetrino 30 ed in zone di indagine 34, nella fattispecie due zone di indagine 34, della stessa superficie di appoggio 31 che à ̈ disposta in corrispondenza del microcanale 33, sono presenti mezzi di rilevazione impedenziometrici 35 (fig. 4), che provvedono ad effettuare una misura impedenziometrica dell’aggregato piastrinico.

A solo titolo esemplificativo ciascuna zona di indagine 34 ha una dimensione di circa 0.2 mm di larghezza e 0.2 mm di lunghezza.

In una prima forma di realizzazione (fig. 4), i mezzi di rilevazione impedenziometrici 35 comprendo un primo elettrodo 36 ed un secondo elettrodo 37 aventi sviluppo oblungo e disposti, paralleli fra loro, trasversalmente allo sviluppo longitudinale del microcanale 33.

A solo titolo esemplificativo il primo elettrodo 36 ed il secondo elettrodo 37 lunghi circa 250 pm sono disposti paralleli fra loro e distanziati reciprocamente di circa 200 pm.

In una seconda forma di realizzazione (fig. 5), i mezzi di rilevazione impedenziometrici 35 comprendono quattro celle elementari di rilevazione 138 ciascuna ruotata di 90° rispetto alle due celle elementari di rilevazione 138 adiacenti.

Ciascuna zona di indagine 34 viene pertanto suddivisa in una pluralità di porzioni di indagine a ciascuna delle quali, a sua volta, fa capo una cella elementare di rilevazione 138.

Ciascuna cella elementare di rilevazione 138 comprende un primo elettrodo 136, centrale, circondato da un secondo elettrodo 137, conformato ad “U†, ovvero presentante tre tratti rettilinei collegati reciprocamente fra loro alle rispettive estremità e disposti angolati fra loro secondo un angolo di 90°.

A solo titolo esemplificativo il primo elettrodo 136 Ã ̈ lungo circa 80 pm e largo 20 pm, mentre il secondo elettrodo 137 Ã ̈ largo circa 10 pm.

In entrambe le forme di realizzazione descritte con riferimento a fig. 4 e fig. 5, i primi elettrodi 36, 136 ed i secondi elettrodi 37, 137 sono realizzati in materiale conduttivo scelto fra almeno oro, platino, ed ossido di indio-stagno, ovvero ossido di indio drogato con stagno anche noto con l’ acronimo ITO.

I primi elettrodi 36, 136 ed i secondi elettrodi 37, 137 sono realizzati per stampaggio sulla superficie di appoggio 31, ad esempio mediante tecniche di deposizione per evaporazione di materiale (PVD), tecniche sputtering, od altre tecniche simili o assimilabili.

I primi elettrodi 36, 136 ed i secondi elettrodi 37, 137 comprendono un parte sensibile attiva che, durante l’uso, à ̈ a diretto contatto con il sangue, e la rimanente parte dell’elettrodo che à ̈ isolata, ad esempio mediante tecniche di passivazione.

Durante le rilevazioni ciascuna coppia di primo 36, 136 e secondo elettrodo 37, 137 vengono sottoposti, indipendentemente uno dal altro ad una differenza di potenziale e viene rilevata la corrente transitante.

In particolare, i primi elettrodi 36, 136 ed i secondi elettrodi 37, 137 sono associati, indipendentemente l’uno dall’altro, a dispositivi di alimentazione elettrica 40 di tipo noto, ed a dispositivi di misura 41 delle grandezze elettriche.

Il dispositivo di acquisizione ottica 12 comprende un modulo ottico 42 per l’analisi di epifluorescenza al fine di evidenziare le piastrine che vengono marcate con un’opportuna sonda fluorescente per aderire al substrato citoadesivo.

Il modulo ottico 42 può essere del tipo a fluorescenza con o senza lenti di tipo bidimensionale.

I dispositivi di alimentazione elettrica 40, i dispositivi di misura 41 ed i dispositivi di acquisizione ottico sono associati ad una unità di elaborazione 43 prevista per controllare, per comandare, acquisire dati, elaborare dati forniti da questi ultimi.

L’apparecchiatura 10 del presente trovato può comprendere vantaggiosamente mezzi di termostatazione per mantenere la camera di perfusione 11 ad una voluta temperatura vantaggiosamente alla temperatura fisiologica che nel caso del corpo umano à ̈ di circa 37 °C.

II procedimento per l’analisi del processo di aggregazione piastrinica utilizzante un’apparecchiatura 10 come sopra decritta viene di seguito descritto.

II procedimento comprende almeno una fase in cui un campione di fluido ematico viene prelevato da un paziente ed opportunamente preparato secondo modalità che variano in funzione delle prove che si vogliono ottenere.

Nello specifico à ̈ richiesto almeno un prelievo di sangue venoso, la conservazione temporanea del sangue in una provetta contenente sostanze anticoagulanti come ad esempio eparina, citrato o simili, e l’aggiunta di sostanze fluorescenti ad esempio Quinacrina e anticorpo antifibrina ficoeritrinato.

È prevista poi la deposizione sulla superficie di appoggio 31 del vetrino 30 della sostanza citoadesiva, e il successivo posizionamento del vetrino 30 sul corpo di base 13.

Successivamente viene avviata la circolazione del sangue attraverso il microcanale 33 mediante azionamento della pompa a siringa 27, per dar corso al fenomeno di aggregazione piastrinica che, a solo titolo esemplificativo, può avere una durata di circa 6 minuti.

A questo punto viene avviata una fase di analisi del processo di aggregazione piastrina che prevede almeno una sottofase di misurazione ottica, una sottofase di misura zione impedenziometrica, ed una sottofase di elaborazione durante la quale vengono correlate fra loro le informazioni acquisite nelle precedenti due sottofasi.

La sottofase di misurazione ottica permette la stima nel tempo, e mediante il dispositivo di acquisizione ottica 12 della distribuzione spaziale sul piano del vetrino 30, e nella zona di indagine 34, di un aggregato piastrinico. In particolare, durante la suddetta sottofase di misurazione ottica vengono acquisite immagini nel tempo, una delle quali rappresentate in fig. 6, e viene stimata un’area di base, ovvero la superficie in pianta valutata dal dispositivo di acquisizione ottica 12 posto al di sopra delle zone di indagine 34, di un aggregato piastrinico che aderisce all’interno di ciascuna zona di indagine 34 all’istante considerato.

La sottofase di misurazione impedeziometrica permette la determinazione nel tempo, dell’evoluzione dell’altezza media dell’aggregato piastrinico all’interno di ciascuna delle zone di indagine 34.

Per l’esecuzione delle misurazioni impedenziometriche à ̈ stato necessario caratterizzare il comportamento elettrico del plasma, del sangue e dell’aggregato piastrinico. Il sangue à ̈ formato principalmente da plasma, globuli rossi, globuli bianchi e piastrine. Il plasma dal punto di vista elettrico si comporta come una soluzione salina e quindi principalmente come un conduttore (sigma 1 S/m); il contenuto cellulare invece à ̈ formato da una membrana lipidica (un dielettrico) contenente un fluido intracellulare detto citoplasma. Esiste un intervallo di frequenze ottimale in cui effettuare le suddette misure impedenziometriche; a basse frequenze si misura principalmente il fenomeno del “doublé layer†dovuto alla reazione agli elettrodi dei sali disciolti nel plasma (la misura del doublé layer non porta informazioni se non legate all’interfaccia elettrodo -plasma), mentre ad alte frequenze la membrana delle cellule si comporta non più come dielettrico e all’atto pratico si effettua una misura sul citoplasma.

In fig. 8 sono mostrate due famiglie di curve relative alla spettroscopia di impedenza su sangue senza induzione di trombo e con induzione di trombo. Come si può notare in entrambe le famiglie di curve la parte a sinistra del grafico (bassa frequenza) ha un comportamento decrescente in frequenza e ciò à ̈ dovuto al fenomeno di interfaccia del doublé layer; a frequenze superiori invece il fenomeno diventa resistivo e quindi la misura va effettuata a frequenze comprese tra 100 kHz e 1 MHz.

Si può, inoltre, osservare che mentre in assenza di aggregato piastrinico (curve tratteggiate) le curve sono tutte sovrapposte (nessun cambio di impedenza), in presenza di aggregato (curve continue) la famiglia di curve evolve in modo monotono aumentando il valore di impedenza letto. In fig. 9 à ̈ mostrata l’evoluzione temporale dell’impedenza valutata alla frequenza di 150 kHz.

Si può osservare che senza indurre l’aggregato piastrinico il valore di impedenza si mantiene costante nel tempo, mentre inducendo la formazione trombotica si ha un sensibile incremento della misura, nel caso di specie dopo i 50 secondi.

Un ulteriore fattore da considerare per la misura del fenomeno di aggregazione riguarda l’ampiezza dei segnali elettrici in gioco in relazione con i materiali scelti per la realizzazione degli elettrodi; con elettrodi in oro l’ampiezza del segnale iniettato à ̈ inferiore a 1 Volt per non compromettere la linearità del fenomeno.

Con riferimento alle rilevazioni effettuate nelle forme di realizzazione successive il segnale iniettato à ̈ stato scelto di ampiezza 0.1 Volt.

Durante la sottofase di elaborazione viene stimato il volume dell’aggregato piastrinico nel tempo in ciascuna delle zone di indagine 34. In particolare, dalla misura del l’impedenza, dall’area di base determinabile per via ottica e della luminanza emessa dal trombo piastrinico à ̈ possibile effettuare l’inversione e risalire al volume complessivo del trombo formatosi all’interno dell’area di indagine 34.

Il volume dell’aggregato piastrinico per ciascuna area di indagine 34 viene determinato correlando fra loro l’area di base “S†dell’aggregato piastrinico, e l’altezza dell’aggregato piastrinico entrambi valutati in funzione del tempo “t†.

L’area di base S viene valutata in funzione delle immagini acquisite durante la sottofase di misurazione ottica.

L’altezza dell’aggregato , viene valutata in funzione delle misurazioni impedenziometriche effettuate.

L’acquisizione delle immagini, infatti, permette la costruzione di una funzione di forma, ad esempio del tipo rappresentato in fig. 7, la cui proiezione su un piano cartesiano (x, y) del vetrino 30, coincide con l’immagine ottica bidimensionale acquisita nel dato istante temporale. Dall’immagine à ̈ possibile determinare per ciascun suo punto, o pixel dell’immagine, un valore di intensità luminosa, o luminanza. La funzione di forma presenta pertanto una terza dimensione “z†funzione del tempo, e del punto considerato che à ̈ direttamente proporzionale all’intensità luminosa rilevata dall’immagine per quel dato punto.

La terza dimensione “z†della funzione di forma à ̈ esprimibile dalla formula: z(x, y, t)=k(t) I(x, y, t)

ovvero, la coordinata z(x, y, t) del punto (x, y) (o pixel del immagine acquisita) à ̈ proporzionale all’intensità luminosa I(x, y, t) del punto, o pixel, considerato (x, y), dove k(t) à ̈ una costante di proporzionalità incognita in un dato istante temporale t.

La costante di proporzionalità k(t) viene determinata sfruttando una simulazione 3D di tipo elettroquasistatico sulla medesima geometria della cella elementare mediante l’Approccio Geometrico Discreto su griglia cubica, tetraedrica o poliedrica, in modo da riprodurre con minima discrepanza il valore di impedenza misurato ai morsetti degli elettrodi ad una frequenza f<200 kHz.

Durante la suddetta simulazione viene utilizzata una tecnica di inversione che prevede di modulare il valore del parametro k(t) fino a trovare la funzione z(x, y, t) che meglio approssima l’andamento delle misure di impedenza. Da tale funzione à ̈ immediato calcolare il volume V(t) equivalente dell’aggregato, mediante integrazione della funzione z(x, y, t) opportunamente scalata.

Con riferimento alla forma di realizzazione descritta con riferimento a fig. 5, la cella elementare di rilevazione 138 ha comportamento elettrico di tipo anisotropo dato che la densità di corrente à ̈ principalmente orientata in direzione perpendicolare all’elettrodo centrale.

Pertanto, l’impedenza misurata dipende da tale direzione ed à ̈ sensibile alla crescita in altezza z(x, y, t) dell’aggregato piastrinico lungo i punti (x, y) di tale direzione all’istante t. Per ciascuna cella elementare di rilevazione 138 si determina una funzione di forma z(x, y, t) da cui à ̈ possibile individuare un’altezza media che à ̈ associata a tale cella ed à ̈ relativa ad una direzione.

In tale modo dalle quattro altezze medie ottenute per ciascuna cella elementare di rilevazione 138, à ̈ possibile determinare l’altezza media h della zona di indagine 34 cui appartengono le quattro celle elementari di rilevazione 138.

La particolare disposizione delle celle elementari di rilevazione 138 all’interno della zona di indagine 34 permette di sondare la crescita in altezza della funzione di forma z(x, y, t) secondo direzioni ortogonali fra loro.

Nella fig. 10 à ̈ rappresentato l’andamento dell’impedenza rilevata durante la suddetta sottofase di misura impedenziometrica in una prima fase iniziale, in cui si ha una lenta crescita del trombo, comparato con le acquisizioni di immagini effettuate nella sottofase di misura ottica (figg. 10a, 10b, 10c, lOd).

Dopo questa fase iniziale, un aggregato piastrinico, formatosi al di fuori del campo visivo per effetto del flusso, viene trasportato dentro alla zona di analisi per pochi secondi e poi spazzato via di nuovo (figg. 11, I la, 11 b, I le, 11 d) .

Vi à ̈ poi una terza fase in cui si ha una rapida crescita di volume dell’aggregato piastrinico all 'interno dell’area di analisi (figg. 12, 12a, 12b, 12c, 12d).

Vi à ̈ infine un’ultima fase in cui il trombo, di volume considerevole, viene spazzato via dal flusso sanguigno e a quel punto si riformano nuovamente aggregati (figg. 13, 13a, 13 b, 13c, 13d).

È chiaro che al metodo per l’analisi del processo di formazione di aggregati in un fluido biologico ed alla relativa apparecchiatura di analisi fin qui descritte possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti, senza per questo uscire dall’ambito del presente trovato.

È anche chiaro che, sebbene il presente trovato sia stato descritto con riferimento ad alcuni esempi specifici, una persona esperta del ramo potrà senz’altro realizzare molte altre forme equivalenti del metodo per l’analisi del processo di formazione di aggregati in un fluido biologico e della relativa apparecchiatura di analisi, aventi le caratteristiche espresse nelle rivendicazioni e quindi tutte rientranti nell’ambito di protezione da esse definito.

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per l’analisi del processo di formazione di aggregati in un fluido biologico, quale sangue o fluidi ematici, comprendente almeno una fase in cui detto fluido biologico viene fatto scorrere attraverso almeno un microcanale (33) di una camera di perfusione (11), in detto microcanale (33) essendo presente un substrato reattivo, quale un substrato citoadesivo, per stimolare in detto fluido biologico un processo di aggregazione, ed una fase di acquisizione ottica, mediante un dispositivo di acquisizione ottica (12), durante la quale, in almeno un’area di indagine (34) di detto microcanale (33), vengono acquisite immagini relative alla formazione di aggregati, caratterizzato dal fatto che comprende una fase di misura impedenziometrica, associata a detta fase di acquisizione ottica, durante la quale, mediante mezzi di rilevazione impedenziometrici (35) disposti in corrispondenza di detta area di indagine (34) di detto microcanale (33), viene eseguita una rilevazione nel tempo dell’impedenza di detto fluido biologico, detta impedenza essendo correlata alla formazione di aggregati, ed una fase di elaborazione durante la quale viene determinato il volume di aggregati che si stanno formando in detta area di indagine (34) correlando, nel tempo, informazioni relative a dette immagini acquisite in detta fase di acquisizione ottica con dati dell’impedenza di detto fluido biologico acquisiti in detta fase di misura impedenziometrica.
2. 2. Metodo come nella rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che in detta fase di elaborazione, da dette immagini viene stimata un’area di base (S) degli aggregati che si formano in detta area di indagine (34).
3. 3. Metodo come nella rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detta area di base (S) degli aggregati viene determinata in funzione dell’intensità luminosa rilevata da dette immagini.
4. 4. Metodo come nella rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che in detta fase di elaborazione viene determinata una funzione di forma che à ̈ direttamente proporzionale a detta intensità luminosa rilevata da detta immagine.
5. 5. Metodo come nella rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detta funzione di forma viene elaborata, in funzione di detta area di base (S), per approssimarla all’andamento delle misure di impedenza acquisite in detta fase di misura impedenziometrica, e per determinare il volume di detto aggregato.
6. 6. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che in detta fase di elaborazione, detti dati dell’impedenza sono correlati ad un’altezza media degli aggregati che si formano in detta area di indagine (34).
7. 7. Apparecchiatura per l’analisi del processo di formazione di aggregati in un fluido biologico, quale sangue o fluidi ematici, comprendente una camera di perfusione (11) provvista di almeno un microcanale (33) attraverso il quale scorre detto fluido biologico, ed in cui à ̈ presente almeno un substrato reattivo, quale un substrato citoadesivo, per stimolare nel fluido biologico il processo di aggregazione, ed un dispositivo di acquisizione ottica (12) adatto ad acquisire immagini relative alla formazione di aggregati in almeno un’area di indagine (34) di detto microcanale (33), caratterizzato dal fatta che comprende mezzi di rilevazione impedenziometrici (35) associati a detto microcanale (33), in corrispondenza di detta area di indagine (34) e disposti, durante l’uso, a contatto con il flusso di fluido biologico transitante, per rilevare dati di impedenza di detto fluido biologico correlati alla formazione di aggregati, ed un’unità di elaborazione (43) idonea a determinare il volume di aggregati che si stanno formando in detto microcanale (33), mediante correlazione, nel tempo, di dette immagini acquisite da detto dispositivo di acquisizione ottica (12) e di detti dati di impedenza rilevati da detti mezzi di rilevazione impedenziometrici (35).
8. 8. Apparecchiatura come nella rivendicazione 7, caratterizzata dal fatto che detti mezzi di rilevazione impedenziometrici (35) comprendono elettrodi (36, 37; 136, 137) ai quali sono associati dispositivi di misura (41) per la rilevazione di detti dati di impedenza.
9. 9. Apparecchiatura come nella rivendicazione 8, caratterizzata dal fatto che detti elettrodi (36, 37; 136, 137) sono realizzati in materiale conduttivo scelto in un gruppo comprendente almeno oro, platino, ossido di indio-stagno.
10. 10. Apparecchiatura come nella rivendicazione 8 o 9, caratterizzata dal fatto che detti mezzi di rilevazione impedenziometrici (35) comprendono almeno un primo elettrodo (36) ed un secondo elettrodo (37) aventi sviluppo oblungo e disposti, paralleli fra loro, trasversalmente allo sviluppo longitudinale del microcanale (33), detta area di indagine (34) essendo compresa fra detto primo elettrodo (36) e detto secondo elettrodo (37).
11. 11. Apparecchiatura come nella rivendicazione 8 o 9, caratterizzata dal fatto che detti mezzi di rilevazione impedenziomentrici (35) comprendono una pluralità di celle elementari di rilevazione (138) angolarmente sfalsate una rispetto all’altra e ciascuna provvista di almeno una coppia di detti elettrodi (136, 137).
12. 12. Apparecchiatura come nella rivendicazione 11, caratterizzata dal fatto che ciascuna di dette celle elementari di rilevazione (138) comprende un primo elettrodo (136), centrale, circondato da un secondo elettrodo (137), conformato ad “U†.
13. 13. Apparecchiatura come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 12, caratterizzato dal fatto che detto dispositivo di acquisizione ottica (12) comprende un modulo ottico (42) del tipo a fluorescenza con o senza lenti di tipo bidimensionale,