ITUD20130111A1 - Metodo per la rilevazione dell'aggregazione proteica e relativo apparato di rilevazione - Google Patents

Description

Descrizione del trovato avente per titolo:

"METODO PER LA RILEVAZIONE DELL’AGGREGAZIONE PROTEICA E RELATIVO APPARATO DI RILEVAZIONE"

CAMPO DI APPLICAZIONE

II presente trovato si riferisce ad un metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica, in particolare della fibrillazione proteica, ed al relativo apparato di rilevazione.

In particolare, il presente trovato si riferisce ad una metodologia per la rilevazione della formazione di aggregati di fibrille proteiche responsabili di gravi patologie dell’uomo, quali il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la Sclerosi Laterale Amiotrofica, il morbo di Huntington.

STATO DELLA TECNICA

È noto che l’aggregazione proteica porta alla fibrillazione amiloide che è responsabile di gravi malattie. Ad esempio, l’Alzheimer, il Parkinson, il morbo di Huntington, la Sclerosi Laterale Amiotrofica sono alcune delle malattie neurodegenerative correlate alla presenza di depositi di aggregati di proteine amiloidi.

I depositi di proteine amiliodi, anche detti aggregati amiloidi, comprendono fibre contenenti proteine ripiegate con conformazione beta-sheet, disposte in una cosiddetta struttura cross-beta. Le complessità e le dinamiche delle proteine ripiegate sono attualmente oggetto di studio per chiarire il meccanismo molecolare che coinvolge l’aggregazione proteica e per permettere di comprendere l’efficacia degli inibitori amiloidi.

In ambito biofarmaceutico e clinico/patologico sono in corso continui studi volti ad identificare un processo di controllo dell’aggregazione delle proteine amiloidi.

È stato dimostrato recentemente che una delle proteine analizzabili per la valutazione del processo aggregativo delle proteine è la K-caseina carbossimetilato la quale può essere utilizzata come primo test per composti schermo con inibitori convenzionali e per attività di inibizione dell’aggregazione [Carver, J. A., Duggan, P. J., Ecroyd, H., Liu, Y., Meyer, A. G. & Tranberg, C. E. “Carboxymethylated-k-casein: A convenient tool for thè Identification of polyphenolic inhibitors of amyloid fibril formation”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 18 (1), 2010, 222-228].

Attualmente, la K-caseina è probabilmente la proteina del latte che è stata meglio caratterizzata e che costituisce più del 70%-80% del totale delle proteine del latte bovino.

La K-caseina carbossimetilato è una proteina amiloidogenica che subisce facilmente la nucleazione di aggregazione dipendente e che forma fibrilla amiloide allo stesso modo di peptidi amiloidogenici che sono causa delle malattie sopra identificate, ad esempio dell’ amiloide β (Αβ) che è causa del morbo di Alzheimer [Ecroyd, H., Koudelka, T., Thom, D. C., Williams, D. M., Devlin, G., Hoffmann, P. & Carver, J. A. “Dissociation from thè oligomeric state is thè ratelimiting step in amyloid fibril formation by k-casein.”, J. Biol. Chem. 283, 2008, 9012-9022].

Attualmente, la rilevazione dell’aggregazione fibrillare della K-caseina carbossimetilato viene effettuata mediante tecniche di fluorescenza ottica. Le tecniche di fluorescenza ottica prevedono l’utilizzo di un saggio legante, o fluoroforo, che può essere a base di tioflavina-T fluorescente.

Quando la tioflavina-T si lega agli aggregati di amiloide, se eccitata con una lunghezza d’onda di 440nm, riemette fluorescenza a 485nm. Mediante monitoraggio nel tempo della fluorescenza della tioflavina-T si può valutare la cinetica di formazione della fibrilla [H. LeVine III, “Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease-amyloid peptides: Detection of amyloid aggregation in solution”, Protein Science 2 (3), 1993, 404-410].

Le suddette prove possono prevedere anche l’introduzione di farmaci, per valutare la loro azione inibitrice della formazione di fibrilla amiloide.

Il processo di monitoraggio dell’ amiloide viene tipicamente effettuato con prove di elevata durata temporale, anche diversi giorni, durante la quale la tioflavina-T, in soluzione, si intercala alla formazione della fibrilla, permettendo di misurare le dimensioni, i tempi di formazione e le cinetiche delle fibrille proteiche.

Le rilevazione dell’aggregazione proteica viene effettuata con apparecchiature fluorimetriche che risultano particolarmente costose e complicate da utilizzare.

Inoltre, come sopra descritto, per effettuare le prove è necessario l’utilizzo di sostanze fluorofore le quali devono essere inserite in soluzione con la dovuta accuratezza assieme alle proteine da analizzare. Ciò richiede particolare perizia da parte dell’operatore per ottenere risultati accurati.

Le sostanze fluorofore inserite in soluzione, inoltre, possono in alcuni casi falsare la bontà delle rilevazioni, in quanto queste si possono legare anche con altre strutture non direttamente correlate ad aggregati amiloidi.

Nel caso in cui le prove vengano eseguite con lo scopo di valutare l’azione inibitrice di farmaci, le sostanze fluorofore presenti possono, in alcuni casi, intervenire sull’azione del farmaco non permettendo di valutare l’efficacia dello stesso.

Inoltre, nel caso in cui sia necessario valutare il tempo di risposta da parte di un farmaco, l’utilizzo di sostanze fluorofore, come rilevatore dell’aggregazione proteica, non permette di individuare con accuratezza gli istanti di intervento del farmaco.

Uno scopo del presente trovato è quello di mettere a punto un metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica che sia semplice e non richieda l’impiego di apparati complessi e costosi.

Un ulteriore scopo del presente trovato è quello di mettere a punto un metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica i cui dati rilevati non siano falsati dall’introduzione di sostanze funzionali.

È anche scopo del presente trovato mettere a punto un processo di analisi di farmaci al fine di valutare con accuratezza l’efficacia di inibizione all’aggregazione proteica di un farmaco.

È anche uno scopo del presente trovato quello di realizzare un apparato per la rilevazione dell’aggregazione proteica che sia semplice, poco costoso, e di facile realizzazione.

Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato è espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti. Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell’idea di soluzione principale.

In accordo con i suddetti scopi, forme di realizzazione del presente trovato sono relative ad un metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica che prevede di effettuare una analisi che include misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica di un campione di una soluzione tamponata di proteine e correlare segnali elettrici rilevati con una dinamica di formazione di aggregati di fibrille proteiche.

In accordo con la presente descrizione, il metodo del presente trovato non prevede l’utilizzo di misurazioni ottiche, né in particolare di sostanze fluorofore da mescolare con la soluzione proteica da analizzare.

Con il presente trovato è possibile effettuare un monitoraggio nel tempo dell’aggregazione delle proteine nelle fibrille basato su tecniche di spettroscopia ad impedenza elettrica le quali permettono di valutare l’andamento nel tempo del processo di aggregazione proteica che è causa di gravi patologie.

Il presente trovato si riferisce anche ad un apparato per la rilevazione dell’aggregazione proteica che comprende:

- un dispositivo di misura comprendente almeno un corpo di contenimento provvisto di un serbatoio nel quale è inseribile almeno un campione di una soluzione proteica tamponata ed elettrodi interdigitati previsti almeno in corrispondenza di una parete interna del serbatoio, per effettuare rilevazioni di impedenza elettrica del campione contenuto nel serbatoio,

un rilevatore di impedenza collegato agli elettrodi interdigitati per riceverne relativi segnali elettrici ed effettuare misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica,

- un’unità di controllo ed elaborazione elettronica collegata al rilevatore di impedenza e configurata per correlare segnali elettrici rilevati con una dinamica di formazione di aggregati di fibrille proteiche.

Con l’apparato del presente trovato, poiché le proteine sono disciolte in una soluzione tampone le cui proprietà elettriche sono normalmente di carattere conduttivo, quando le fibrille delle proteine si formano in soluzione e ricadono sulla superfìcie dell’elettrodo, c’è una variazione locale della carica che modifica la risposta spettroscopica di impedenza elettrica e permette di ottenere informazioni relative al processo aggregativo delle proteine.

Il metodo e l’apparato di rilevazione dell’aggregazione proteica permettono una valutazione del processo senza la presenza di molecole fluorofore, quali la tioflavina-T, come marcatore.

Rientra nel presente trovato anche un metodo per la valutazione dell’ efficacia di un farmaco inibitore dell’aggregazione proteica che prevede di aggiungere all’anzidetta soluzione proteica tamponata, un quantitativo di farmaco e, in base alla dinamica di formazione di aggregati proteici che viene rilevata in presenza del farmaco, derivare l’efficacia del farmaco.

Fa parte del presente trovato anche un kit per l’analisi dell’efficacia di inibizione dell’aggregazione proteica da parte di un farmaco inibitore comprendente un apparato come sopra espresso ed una soluzione tampone da miscelare con una quantità di proteina da analizzare e con un farmaco inibitore dell’ aggregazione proteica.

ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI

Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di forme di realizzazione, fornite a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:

- la fig. 1 è una rappresentazione schematica di un apparato per la rilevazione dell’aggregazione proteica in accordo con una prima forma di realizzazione del presente trovato;

- la fig. 2 è una vista prospettica in esploso di alcuni componenti dell’apparato di fig. 1;

- la fig. 3 è un particolare in gradito di fig. 2 in accordo con una possibile forma di realizzazione;

- la fig. 4 è una rappresentazione schematica del processo di aggregazione proteica;

- la fig. 5 è una rappresentazione di un equivalente elettrico del processo di aggregazione proteico ;

- le figg. 6a e 6b sono grafici rispettivamente del modulo e della fase dell’impedenza rilevate in frequenza durante prove sperimentali di validazione della rilevazione del processo di aggregazione proteica;

- la fig. 7 è un grafico che riporta dati rilevati durante prove sperimentali per la valutazione del processo di aggregazione proteica con e senza l’aggiunta di un farmaco inibitore.

Per facilitare la comprensione, numeri di riferimento identici sono stati utilizzati, ove possibile, per identificare elementi comuni identici nelle figure. Va inteso che elementi e caratteristiche di una forma di realizzazione possono essere convenientemente incorporati in altre forme di realizzazione senza ulteriori precisazioni.

DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE

Con riferimento alla fig. 1 viene descritta una possibile forma di realizzazione di un apparato di rilevazione 10 secondo il presente trovato, che può essere combinata con ulteriori forme di realizzazione qui descritte.

L’apparato di rilevazione 10, che può essere vantaggiosamente miniaturizzato e compatto, comprende un dispositivo di misura provvisto di corpo di contenimento 11 provvisto, a sua volta, di un serbatoio 12 nel quale è inseribile almeno una soluzione di analisi.

In possibili soluzioni realizzative del presente trovato, il serbatoio 12 presenta una forma sostanzialmente cilindrica anche se non si esclude che, in altre forme di realizzazione, il serbatoio 12 possa avere una forma diversa, ad esempio prismatica.

Una possibile implementazione realizzativa del presente trovato prevede che il serbatoio 12 abbia una capacità volumetrica compresa fra 50μ1 e 70μ1, preferibilmente di circa 60μ1.

A solo titolo esemplificativo, nel caso in cui il serbatoio 12 abbia forma sostanzialmente cilindrica, quest’ultimo presenta un diametro di circa 3mm, ed un’altezza di circa 8mm.

II dispositivo di misura prevede, ad esempio su almeno una delle pareti interne del serbatoio 12, elettrodi 13 selettivamente aumentabili elettricamente con le modalità sotto descritte per la rilevazione di grandezze elettriche.

In accordo con una possibile implementazione realizzativa del presente trovato, una delle quali ad esempio rappresentata nelle figg. 2 e 3, gli elettrodi 13 possono presentare una configurazione interdigitata ovvero aventi struttura dove la lunghezza della regione tra due elettrodi 13 è aumentata foggiando gli elettrodi, o le metallizzazioni che li realizzano, a strisce parallele, o estensioni, come le dita di una mano.

Possibili soluzioni realizzative del presente trovato possono prevedere che gli elettrodi 13 comprendano una pluralità di coppie di estensioni 22, a solo titolo esemplificativo si può prevedere che gli elettrodi 13 comprendano da 50 a 70 coppie di estensioni 22, preferibilmente da 55 a 65 coppie di estensioni 22. A solo titolo esemplificativo e non limitativo del presente trovato ciascuna estensione 22 può avere una larghezza di ΙΟμηι ed una lunghezza di 2mm. In possibili soluzioni realizzative del presente trovato, le estensioni 22 sono disposte parallele fra loro e distanziate reciprocamente di circa 5μηι.

Implementazioni realizzative del presente trovato possono prevedere che gli elettrodi 13 siano depositati, su almeno una delle pareti interne del serbatoio 12, con tecniche di deposizione chimica o fìsica di vapore anche note come tecniche di “Chemical Vapour Deposition” o “CVD”, tecniche di “Phisical Vapour Deposition” o “PVD”, o tecniche “Plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition” o PECVD.

Alcune soluzioni realizzative del presente trovato possono prevedere che gli elettrodi 13 siano realizzati con una delle tecniche PVD, nota come deposizione a polimerizzazione catodica, o deposizione sputtering.

Possibili implementazioni realizzative del presente trovato prevedono che gli elettrodi 13 siano realizzati in oro anche se non si esclude che, in altre soluzioni realizzative siano realizzati in platino o in ossido di indio-stagno anche noto con Γ acronimo ITO.

Una possibile forma realizzativa del presente trovato, ad esempio rappresentata nelle figg. 1 e 2 prevede che il corpo di contenimento 11 comprenda un primo componente 14 ed un secondo componente 16.

Il primo componente 14 è configurato a piastrina ed è provvisto di una prima superficie 15 sulla quale sono ricavati gli elettrodi 13.

II primo componente 14 può essere realizzato in vetro o in materiali polimerici.

Una prima forma di realizzazione del trovato prevede che il primo componente 14 sia realizzato con vetro al quarzo. Altre possibili forme di realizzazione prevedono che il primo componente 14 sia realizzato in policarbonato.

Il secondo componente 16 è provvisto di una sede di contenimento 17 aperta verso l’esterno almeno da un lato e nella quale, in uso, viene posto un campione di una soluzione proteica tamponata da analizzare. Il primo componente 14 è posizionabile con la sua prima superficie 15 a chiusura della sede di contenimento 17 del secondo componente 16 per definire il serbatoio 12.

In accordo con possibili soluzioni realizzative del presente trovato, il secondo componente 16 comprende un primo strato 18 provvisto di un’apertura passante 19 ed un secondo strato 20 configurato a piastrina e posizionabile a chiusura di un lato dell’ apertura passante 19 per definire la sede di contenimento 17. In particolare, si prevede che l’apertura passante 19 del primo strato 18 venga chiusa ermeticamente da un lato e dall’altro mediante rispettivamente il primo componente 14 ed il secondo strato 20.

Possibili soluzioni realizzative del presente trovato possono prevedere che il secondo componente 16 sia realizzato con un materiale polimerico o vetro.

Una possibile implementazione realizzativa prevede che il secondo componente 16 sia realizzato in polidimetilsilossano.

In accordo con possibili implementazioni realizzative il primo componente 14 ed il secondo componente 16 possono essere mantenuti collegati reciprocamente mediante organi di fissaggio 21 per chiudere ermeticamente il serbatoio 12.

In accordo con possibili soluzioni realizzative, gli organi di fissaggio 21 possono comprendere una pinza, un morsetto, viti, elementi magnetici, o elementi simili ed assimilabili idonei allo scopo.

L’apparato di rilevazione 10 comprende un rilevatore di impedenza 23 controllato automaticamente da un’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24.

Il rilevatore di impedenza 23 è collegabile agli elettrodi 13 mediante organi di collegamento elettrico 26, quali cablaggio elettrici, fili conduttori, o loro possibili combinazioni.

Il rilevatore di impedenza 23, o rilevatore LCR, è configurato per rilevare nella soluzione di analisi, ed attraverso gli elettrodi 13 l’induttanza, la capacità e la resistenza ovvero, più in generale, modulo e fase dell’impedenza elettrica. Un esempio di rilevatore di impedenza 23 utilizzabile è quello prodotto dalla Agilent Technology, con il codice di riferimento Agilent E4980A LCR. L’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24, del tipo completamente programmabile, è stata sviluppata per acquisire automaticamente i dati di impedenza dal rilevatore di impedenza 23, ed estrapolare da essi delle informazioni relative alla formazione di aggregati amiloidi.

In possibili soluzioni realizzative, l’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 è configurata per implementare un programma idoneo ad interpolare i dati rilevati dal rilevatore di impedenza 23 ed a fornire indicazioni sul processo di aggregazione.

Una possibile soluzione realizzativa prevede che l’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 sia configurata per implementare un modello ad elementi concentrati o “lumped element model” il cui andamento nel tempo degli elementi fornisce indicazioni sull’ aggregazione.

In accordo con possibili forme di realizzazione, si può prevedere che l’apparato di rilevazione 10 comprenda una camera termostatica 25 nella quale inserire almeno il corpo di contenimento 11.

La camera termostatica 25 può essere configurata per mantenere almeno la soluzione di analisi ad una temperatura compresa fra 34°C e 39°C, preferibilmente a circa 37°C.

Il metodo di rilevazione dell’aggregazione, secondo il presente trovato prevede di preparare o mettere a disposizione una soluzione proteica tamponata miscelando opportunamente un voluto quantitativo delle proteine, o di una soluzione proteica, da analizzare con una soluzione tampone e l’introduzione nel serbatoio 12 di un campione dell’anzidetta soluzione proteica tamponata. In accordo con soluzioni realizzative del presente trovato, la soluzione tampone utilizzata per preparare la soluzione proteica tamponata presenta proprietà di conducibilità elettrica al fine di permettere rilevazioni impedenziometriche .

Una possibile forma di realizzazione del presente trovato prevede che la soluzione tampone comprenda una soluzione di fosfato di sodio. Altre forme realizzative del presente trovato possono prevedere che la soluzione tampone sia scelta in un gruppo costituito da un tampone fosfato PBS, agenti denaturanti e loro possibili combinazioni.

La soluzione tampone fosfato PBS salino comprende una soluzione salina acquosa contenente cloruro di sodio, fosfato di sodio e, in alcune formulazioni, cloruro di potassio.

Possibili implementazioni realizzative prevedono che la soluzione tampone fosfato PBS presenti un titolo lx.

Gli agenti denaturanti possono comprendere guanidinio cloruro e/o urea. In accordo con possibili soluzioni realizzative del presente trovato relative ad un metodo di valutazione deH’efficacia di inibizione dell’aggregazione proteica da parte di un farmaco, si può prevedere che alla soluzione proteica tamponata venga aggiunto anche un farmaco inibitore dell’aggregazione proteica, ciò al fine di valutarne l’azione inibitrice.

Il metodo di analisi dell’aggregazione proteica prevede poi la rilevazione di grandezze impedenziometriche nella soluzione di analisi comprendente almeno la soluzione tampone, la soluzione proteica ed eventualmente il farmaco da valutare.

La rilevazione delle grandezze impedenziometriche può essere effettuata nel tempo ad intervalli regolari per un determinato tempo di prova.

A titolo d’esempio, il tempo di prova può essere variabile fra 10 e 30 ore e le rilevazioni possono essere effettuate con una cadenza di 1-10 minuti, preferibilmente ogni 5 minuti.

Possibili forme di realizzazione possono prevedere che le misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica vengano effettuate valutando un intervallo di frequenze per un tempo ciclo, o cadenza, compreso tra 4 e 6 minuti, ripetendo la valutazione dell’intervallo di frequenze per un tempo prova complessivo compreso tra 16 ore e 20 ore.

Il metodo può comprendere una fase di elaborazione delle grandezze impedenziometriche durante la quale l’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 estrapola informazioni relative all’andamento del processo aggregativo proteico nel tempo.

In accordo con possibili implementazioni del metodo secondo il presente trovato, si prevede che almeno la soluzione di analisi venga mantenuta, per l’intera durata della prova, o per almeno parte di essa, ad una temperatura controllata. A solo titolo esemplificativo, la soluzione di analisi può essere mantenuta ad una temperatura costante nel tempo.

Prove sperimentali

La Richiedente ha effettuato prove sulle soluzioni di analisi ottenendo risultati soddisfacenti sulla K-caseina, una proteina del latte. Le prove sono state eseguite con o senza l’aggiunta di un farmaco inibitore dell’aggregazione proteica.

Come farmaco inibitore dell’aggregazione proteica è stata utilizzata la doxiciclina.

Un primo test è stato effettuato con una soluzione proteica di K-caseina carbossimetilato dissolta in una soluzione tampone di fosfato di sodio 50mM con pH 7.2 e una quantità di ΙΟμΜ di tioflavina-T. La tioflavina-T è stata aggiunta alla soluzione tampone unicamente per una validazione anche ottica tradizionale dell’effettiva cinetica di aggregazione proteica. La sua aggiunta risulta tuttavia opzionale, in quanto non necessaria la presenza di sostanze fluorofore al fine della rilevazione del processo aggregativo delle proteine.

La soluzione proteica era ad una concentrazione finale di 0.5 mg/ml (27μΜ).

La soluzione proteica e la soluzione tampone sono state miscelate fra loro per ottenere una soluzione di analisi introdotta poi nel serbatoio 12.

In generale, secondo forme di realizzazione qui descritte, per ciascuna analisi di spettroscopia ad impedenza elettrica, si prevede di utilizzare una quantità di proteina in soluzione tamponata compresa tra 0,025 mg e 0,035 mg.

La Richiedente ha riscontrato che la quantità di campione di proteina presente nella soluzione tamponata e necessaria per effettuare le misurazioni con spettroscopia impedenziometrica sia molto più ridotta rispetto a quella necessaria per le analisi in fluorescenza.

Forme di realizzazione del presente trovato prevedono che gli elettrodi 13 vengano alimentati in tensione con una frequenza variabile da 20Hz a 2 IO<6>Hz spaziata logaritmicamente.

Implementazioni realizzative prevedono che l’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 ed il rilevatore di impedenza 23 siano state impostate per realizzare misure di impedenza con una tensione di alimentazione di lOOmV (per evitare le reazioni di ossidoriduzione) con 24 punti di frequenza nel campo da 20Hz a 2 IO<6>Hz equispaziate logaritmicamente. Le rilevazioni sono state realizzate ogni 5 minuti, per una durata totale di circa 18 ore.

L’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24, che implementa il lumped element model, ha estrapolato dai dati rilevati informazioni relative all’aggregazione.

La fig. 4 viene utilizzata per rappresentare schematicamente una possibile forma di precipitazione delle fibrille proteiche sugli elettrodi 13.

La fig. 5 viene utilizzata per fornire una rappresentazione equivalente elettrica del processo aggregativo per valutare la deposizione di fibrilla in funzione delle grandezze impedenziometriche rilevate.

In particolare, con riferimento alla fig. 5 gli elementi C0e L0sono rispettivamente una capacità ed un’induttanza legate alla non idealità dei cavi di connessione. Tali grandezze vengono neutralizzate realizzando le compensazioni “circuito aperto” e “cortocircuito” prima delle misurazioni sulle proprietà del campione.

L’elemento CPE, o elemento a fase costante tiene conto dell’effetto di doppio strato che si viene a creare fra le fibrille depositate e le estensioni 20 degli elettrodi 13.

Il doppio strato si forma ogniqualvolta una soluzione ionica salina, a contatto con elettrodi metallici, si trova a scambiare con essi una quantità di carica.

L’impedenza dell’elemento a fase costante è esprimibile dalla formula:

1

<Zc>'‘~u<»rc DL

Essendo CDLla capacità del doppio strato e a è lo scostamento di fase che è compreso fra 0 e 1.

Lo spessore del doppio strato, tipicamente dell’ordine di qualche nanometro, è legato alla lunghezza di Debye e dipende quindi dalla concentrazione dei sali in soluzione. In questo sottilissimo strato, il passaggio di carica non avviene né per via capacitiva, caso in cui a = 1, né per via resistiva, caso in cui a = 0, bensì in modo intermedio; all’aumentare della concentrazione di sali in soluzione la lunghezza di Debye diminuisce e anche a diminuisce.

La quantità CDL è la capacità a facce piane e parallele calcolata all’interno di questo strato, avente quindi superficie pari alla superficie dell’elettrodo e distanza fra le armature pari alla lunghezza di Debye.

Le grandezze RSOL e CSOL rappresentano il comportamento dell’ impedenza della soluzione.

La rilevazione effettuata, che tiene conto della precipitazione della fibrilla sugli elettrodi, è rappresentata dall’evoluzione nel tempo della capacità CFIB-Risultati ottenuti

Le fìgg. 6a e 6b, sono una rappresentazione grafica, rispettivamente, del valore assoluto e della fase dell’impedenza misurata (dopo la compensazione circuito aperto e cortocircuito) nel corso delle 18 ore di prova per la saggiatura sperimentale della precipitazione di fibrilla sugli elettrodi. L’accuratezza dei dati dell’impedenza acquisita dopo compensazione aperta e di corto è del 0.1%. In prima battuta è chiaro che il doppio strato, identificato dal parametro CPE riveste un ruolo significativo e maschera fortemente le variazioni dell’impedenza nel tempo, ciò si può osservare in fig. 6a, alle basse frequenze, laddove il valore dell’ impedenza misurata è di gran lunga superiore alla sua variabilità.

È anche possibile apprezzare che la grandezza CSOL è troppo piccola e non interviene nel campo di frequenze di indagine in quanto, se CSOL intervenisse, si osserverebbe in fig. 6a, alle alte frequenze un andamento di nuovo decrescente del modulo di impedenza e in fig. 6b un ritorno della fase a valori prossimi a -90°.

Allo scopo di meglio distinguere i parametri del modello che sono variabili nel tempo, i dati dell’impedenza rilevata con spettroscopia impedenziometrica sono stati interpolati dall’unità di controllo ed elaborazione elettronica 24 mediante l’ implementazione di un programma iterativo.

I dati interpolati forniscono come risultato RSOL»10Q, CDi®70nF, a«0.9 e la loro accuratezza è di circa 5%.

La quantità CFIB non può essere stimata direttamente dal programma dato che nel modello equivalente di fig. 5 il parametro CFIB è posto in serie al CPE il quale presenta un elevato valore di fase a. Per questa ragione sono state eseguite le misurazioni di impedenza della sola soluzione tampone, senza l’aggiunta di soluzione proteica, alle stesse condizioni, con dati acquisiti ogni 5 minuti e per 18 ore.

II valore del parametro CFIB può essere stimato con la relazione sotto riportata, valutando l’evoluzione del doppio strato, ovvero del parametro CPE, nel tempo delle proteine rispetto all’evoluzione del doppio strato nella soluzione tampone:

1

Nella relazione si valuta Γ impedenza del doppio strato per le proteine come la somma del contributo del doppio strato CPE e del contributo CFIB a cui è sottratto il contributo del solo doppio strato CPE nella soluzione tampone. Per la verifica dei dati ottenuti sono state ripetute tre volte le prove alle stesse condizioni.

Allo scopo di validare l’approccio utilizzato e studiare il comportamento aggregativo anche con l’aggiunta di farmaci inibitori, alla soluzione tampone pura ed alla soluzione di proteine è stato aggiunto il farmaco dossiciclina con una concentrazione di 81μΜ. Questa concentrazione di doxiciclina è noto inibisca la formazione di fibrilla Αβ.

Analogamente alla relazione sopra riportata è stata valutata la quantità:

Le prove con e senza l’aggiunta del farmaco sono state ripetute tre volte alle stesse condizioni.

La fig. 7 è una rappresentazione grafica del parametro CFIB con soluzione proteica in fibrillazione (linea continua indicata dalla freccia A) e con soluzione proteica a cui è stato aggiunto il farmaco inibitore, nel caso di specie la dossicilina (linea continua indicata dalla freccia B). Le linee continue indicate dalle frecce A e B rappresentano il valor medio sulle tre prove effettuate, i punti circostanti le linee A e B rappresentano invece la deviazione standard valutata sulle tre prove.

Dalla fig. 5 è possibile comprendere come i comportamenti delle proteine con o senza l’aggiunta di farmaci siano piuttosto differenti, in particolare nelle prime otto ore delle prove, in cui gli intervalli di confidenza sono fra loro lontani.

È chiaro che al metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica e relativo apparato di rilevazione 10 fin qui descritto possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti, senza per questo uscire dall’ambito del presente trovato.

È anche chiaro che, sebbene il presente trovato sia stato descritto con riferimento ad alcuni esempi specifici, una persona esperta del ramo potrà senz’altro realizzare molte altre forme equivalenti di metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica e relativo apparato di rilevazione 10, aventi le caratteristiche espresse nelle rivendicazioni e quindi tutte rientranti nell’ambito di protezione da esse definito.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la rilevazione dell’aggregazione proteica, in particolare della formazione di fibrille proteiche, caratterizzato dal fatto che prevede di effettuare misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica di un campione di una soluzione tamponata di proteine e correlare segnali elettrici rilevati con una dinamica di formazione di aggregati di fibrille proteiche.
2. 2. Metodo come nella rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta soluzione tamponata è scelta in un gruppo costituito da soluzione di fosfato di sodio, tampone fosfato PBS, agenti denaturanti e loro possibili combinazioni.
3. 3. Metodo come nella rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che le misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica vengono effettuate valutando un intervallo di frequenze per un tempo ciclo compreso tra 4 e 6 minuti, ripetendo la valutazione dell’ intervallo di frequenze per un tempo prova complessivo compreso tra 16 ore e 20 ore.
4. 4. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la misura di spettroscopia ad impedenza elettrica viene effettuata in condizioni termostatate di detto campione.
5. 5. Metodo come nella rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che una temperatura di termostatazione è compresa fra 34°C e 39°C, in particolare tra circa 36°C e 38°C.
6. 6. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni prevedenti, caratterizzato dal fatto che dette misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica vengono effettuate mediante elettrodi (13) posti a contatto con detta soluzione proteica tamponata.
7. 7. Metodo come nella rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detti elettrodi (13) vengono alimentati in tensione con una frequenza variabile da 20Hz a 2 IO<6>Hz spaziata logaritmicamente.
8. 8. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che per ciascuna prova di spettroscopia ad impedenza elettrica, prevede di utilizzare una quantità di proteina in soluzione tamponata compresa tra 0,025 mg e 0,035 mg.
9. 9. Apparato per la rilevazione dell’aggregazione proteica, in particolare della formazione di fibrille proteiche, caratterizzato dal fatto che comprende: - un dispositivo di misura comprendente almeno un corpo di contenimento (11) provvisto di un serbatoio (12) nel quale è inseribile almeno un campione di una soluzione proteica tamponata ed elettrodi (13) interdigitati previsti almeno in corrispondenza di una parete interna del serbatoio (12), per effettuare rilevazioni di impedenza elettrica del campione contenuto nel serbatoio (12), - un rilevatore di impedenza (23) collegato agli elettrodi (13) interdigitati per riceverne relativi segnali elettrici ed effettuare misurazioni di spettroscopia ad impedenza elettrica, - un’unità di controllo ed elaborazione elettronica (24) collegata al rilevatore di impedenza (23) e configurata per correlare segnali elettrici rilevati con una dinamica di formazione di aggregati di fibrille proteiche.
10. 10. Apparato come nella rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che comprende una camera termostatica (25) nella quale inserire almeno detto corpo di contenimento (11) e configurata per mantenere detta soluzione di analisi ad una temperatura compresa fra 34°C e 39°C, preferibilmente a circa 37°C.
11. 11. Apparato come nella rivendicazione 9 o 10, caratterizzato dal fatto che detto corpo di contenimento (11) comprende un primo componente (14) configurato a piastrina e provvisto di una prima superficie (15) sulla quale sono ricavati detti elettrodi (13) ed un secondo componente (16) provvisto di una sede di contenimento (17), detto primo componente (14) essendo posizionabile con la sua prima superficie (15) a chiusura della sede di contenimento (17) per definire detto serbatoio (12).
12. 12. Apparato come nella rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che detto secondo componente (16) comprende un primo strato (18) provvisto di un’apertura passante (19) ed un secondo strato (20) configurato a piastrina e posizionabile a chiusura di un lato dell’apertura passante (19) per definire detta sede di contenimento (17).
13. 13. Apparato come nella rivendicazione 11 o 12, caratterizzato dal fatto che detto primo componente (14) e detto secondo componente (16) sono collegati reciprocamente mediante organi di fissaggio (21) per chiudere ermeticamente detto serbatoio (12).
14. 14. Metodo per la valutazione dell’efficacia di inibizione dell’aggregazione proteica in particolare della formazione di fibrille proteiche, da parte di un farmaco, che prevede di effettuare l’analisi dell’aggregazione proteica secondo un metodo come ad una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui alla soluzione proteica tamponata viene aggiunto detto farmaco ed in cui, in base alla dinamica dell’aggregazione proteica in presenza del farmaco, è prevista una valutazione dell’ efficacia di detto farmaco.
15. 15. Kit per l’analisi dell’efficacia di inibizione dell’aggregazione proteica, in particolare della formazione di fibrille proteiche, da parte di un farmaco inibitore comprendente un apparato come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 13 ed una soluzione tampone da miscelare con una quantità di proteina da analizzare e con un farmaco inibitore dell’ aggregazione proteica,