JP2000004886A

JP2000004886A - ヒアルロン酸合成酵素改変タンパク質

Info

Publication number: JP2000004886A
Application number: JP10193788A
Authority: JP
Inventors: Naoki Itano; 直樹板野; Mamoru Yoshida; 衛吉田; Hiroharu Kimata; 弘治木全
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 2000-01-11
Anticipated expiration: 2018-06-24
Also published as: JP4173219B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒアルロン酸合成機構の解明およびヒアルロ
ン酸合成を制御するために有用な改変タンパク質を提供
する。【解決手段】連続する３つの領域（Ｎ末端領域、内部
領域およびＣ末端領域）からなり、配列番号２、配列番
号４及び配列番号６に示すアミノ酸配列を有する３種の
ヒアルロン酸合成酵素タンパク質から選ばれる１種のタ
ンパク質の前記３つの領域のうち１つ又は２つの領域
を、残りの１種又は２種のヒアルロン酸合成酵素タンパ
ク質の前記１つ又は２つの領域に相当する領域で置換さ
れたタンパク質であり、好ましくはヒアルロン酸合成活
性が低下又は増加したタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、活性の変化したキ
メラ又は変異型のヒアルロン酸合成酵素に関する。該タ
ンパク質は、生化学的研究又は医薬開発の研究試薬とし
て有用である。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」ともい
う）は、高分子量のグリコサミノグリカンであり、関節
軟骨などの細胞外マトリクスの主要構成分子である。Ｈ
Ａは、グルクロン酸がＮ−アセチルグルコサミンにβ−
１，３結合した二糖単位（GlcUAβ1-3GlcNAc：GlcUAは
グルクロン酸を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミンを
それぞれ表す）のβ−１，４結合による繰り返しから構
成され、ヒアルロン酸合成酵素（以下、「ＨＡＳ」とも
いう）により合成される。

【０００３】ＨＡは、ＨＡ結合タンパク質とともに細胞
表面受容体との相互作用により、細胞の接着、遊走、分
化等のような多くの細胞の挙動を調節している。さら
に、ＨＡは、形態形成、再生、創傷治癒、腫瘍浸潤、お
よびガン転移等の多くの現象に関与している。これらの
機能は、ＨＡの濃度や鎖長のような多くの要因に依存し
ている。例えば、高分子量のＨＡは高濃度で、内皮細胞
の成長を抑制する一方、低分子量のＨＡは細胞成長を刺
激し、血管形成を誘導することが示されている。同様
に、高分子量のＨＡは高濃度で、滑膜細胞及びある種の
線維芽細胞の成長を抑制するが、低分子量のＨＡは低濃
度でこれらの細胞の成長を刺激する。

【０００４】ＨＡの細胞制御機構を解明するのに有力な
手段は、ＨＡ合成機構を解明し、ＨＡの合成制御法を開
発することであると考えられる。しかし、哺乳動物にお
けるＨＡ合成機構の解明するために多くの研究がなされ
てきたが、ＨＡ合成に関与する活性型の酵素の単離が困
難であったために、未だ明らかにされていない。

【０００５】近年、高度に保存された構造を有する哺乳
動物のＨＡＳ遺伝子、ＨＡＳ１（マウス：特開平９−２
２４６７４号、ヒト：WO97/38113号国際公開パンフレッ
ト）、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３（Spicer, A.P., August
ine, M.L., and Mcdonald, J.A. (1996)J. Biol. Chem.
271, 23400-23406; Spicer, A.P., Olson, J.S. andMc
donald, J.A.(1997) J. Biol. Chem. 272, 8957-8961;
WO98/00551）が、相次いでクローニングされている。異
なる酵素の存在により、ＨＡの合成機構および生物学的
意義に関し、さらなる疑問が持ち上がっている。

【０００６】ＨＡＳ２またはＨＡＳ３のｃＤＮＡをＣＯ
Ｓ−１細胞にトランスフェクトすると、粒子排除アッセ
イ（particle exclusion assay）によりＨＡコート（HA
-coat）のデ・ノボ産生が検出され、これら２つの遺伝
子産物はアイソザイムであることが示唆された。しか
し、ＨＡＳ１と他の２種の機能の関係は不明である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記３種のＨＡＳ遺伝
子産物は、構造的に類似しており、Ｎ末端疎水性領域、
内部細胞内領域、およびＣ末端疎水性領域の３つの領域
を有している。Ｎ末端及びＣ末端領域は、ＨＡＳタンパ
ク質ファミリー間で相同性は低いが、高い相同性が内部
細胞内領域で認められる。細胞内領域は、β−１，４−
結合によるオリゴ糖の合成を触媒することが示唆される
アミノ酸モチーフ（Asp Asp Gln Arg Trp（配列番号
７））を含んでおり、ＨＡ合成の触媒領域に関与してい
る可能性がある。哺乳動物のＨＡＳ遺伝子がクローニン
グされてはいるが、ＨＡ生合成の調節機構、および酵素
活性やＨＡの鎖長の決定に重要であるタンパク質ドメイ
ンの解明に有用な情報は得られていない。

【０００８】本発明は、上記観点から、ＨＡ合成機構の
解明およびＨＡ合成を制御することを目的としてなされ
たものであり、そのために有用なＨＡＳ改変タンパク質
を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、ＨＡＳ１、ＨＡ
Ｓ２およびＨＡＳ３のいずれかを、他の少なくとも１種
又は２種の一部と置換して得られるキメラタンパク質、
および特定の位置にアミノ酸を置換する変異を有する変
異型ＨＡＳは、野生型ＨＡＳよりもＨＡ合成活性が低下
又は増加することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

【００１０】すなわち本発明は、連続する３つの領域
（Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域）からなり、
配列番号２、配列番号４及び配列番号６に示すアミノ酸
配列を有する３種のヒアルロン酸合成酵素タンパク質か
ら選ばれる１種のタンパク質の前記３つの領域のうち１
つ又は２つの領域を、残りの１種又は２種のヒアルロン
酸合成酵素タンパク質の前記１つ又は２つの領域に相当
する領域で置換した組換えタンパク質であり、好ましく
はヒアルロン酸合成活性が低下又は増加したタンパク質
である。

【００１１】また本発明は、前記タンパク質をコードす
るＤＮＡを提供する。さらに本発明は、活性が低下又は
増加した変異型ヒアルロン酸合成酵素を提供する。本発
明はまた、ヒアルロン酸合成酵素タンパク質の研究用キ
ットであって、上記タンパク質を含むキットを提供す
る。

【００１２】本発明において「ヒアルロン酸合成活性」
とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンを基質
として、ヒアルロン酸を合成する活性をいい、具体的に
は、一定の酵素濃度、基質濃度及び酵素反応条件におけ
る単位時間あたりのヒアルロン酸合成量として表すこと
ができる。なお、ヒアルロン酸合成活性の低下、又は増
加は、改変していないＨＡＳ（野生型ＨＡＳ）のヒアル
ロン酸合成活性に対する改変したＨＡＳ（ＨＡＳ改変タ
ンパク質）のヒアルロン酸合成活性の低下又は増加を調
べることにより、判定することができる。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第１のＨＡＳ改変タンパク質は、ＨＡＳ１、Ｈ
ＡＳ２およびＨＡＳ３のいずれかにおいて、Ｎ末端領
域、内部領域およびＣ末端領域のうち１つ又は２つの領
域を、残りの１種又は２種のヒアルロン酸合成酵素タン
パク質の前記１つ又は２つの領域に相当する領域で置換
したタンパク質である。本発明のタンパク質は、ＨＡＳ
１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３よりも低下又は増加したＨ
ＡＳ活性を有する。

【００１４】ここで、Ｎ末端領域（以下、「Ａ」の記号
で表すことがある）とは、ＨＡＳタンパク質のＮ末端に
存在する疎水性領域であり、細胞膜を貫通する２つのト
ランスメンブレンドメインを有している。内部領域（以
下、「Ｂ」の記号で表すことがある）は、ＨＡＳタンパ
ク質の内部に存在し、ＨＡＳ酵素活性を有する活性ドメ
インを含み、細胞内ループを形成する。Ｃ末端領域（以
下、「Ｃ」の記号で表すことがある）は、ＨＡＳタンパ
ク質のＣ末端に存在する疎水性領域であり、細胞膜を貫
通する複数のトランスメンブレンドメインを有している
（以上、図１参照）。本発明において、Ｎ末端領域、内
部領域およびＣ末端領域とは、便宜的に、概ね上記の構
造によって分けられるものであり、厳密な境界を有する
ものではないが、例えば、ＨＡＳ１ではＡとＢとの境界
はＮ末端から２２７番目〜２２８番目付近、ＢとＣの境
界はＮ末端から４０９番目〜４２０番目付近に存在す
る。

【００１５】本発明のＨＡＳ改変タンパク質として具体
的には、以下に示すタンパク質が挙げられる。これらの
中では、活性が低下している点では、（８）を除くもの
が好ましい。

【００１６】（１）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜７１で示さ
れるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号５２〜３７９で
示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。

【００１７】（２）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜７１で示さ
れるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号５１〜３８３で
示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。

【００１８】（３）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜５１で示さ
れるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号７１〜４０９で
示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００１９】（４）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜５１で示さ
れるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号５１〜３８３で
示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００２０】（５）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号１９８〜３７９
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。

【００２１】（６）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２０１〜３８３
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。

【００２２】（７）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号２２８〜４０９
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００２３】（８）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２０１〜３８３
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００２４】（９）Ｎ末端領域および内部領域、並びに
Ｃ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示される
アミノ酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０９で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００２５】（１０）Ｎ末端領域、並びに内部領域およ
びＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示され
るアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号２２８〜５８３
で示されるアミノ酸配列。

【００２６】（１１）Ｎ末端領域および内部領域、並び
にＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示され
るアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜３７９で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。

【００２７】（１２）Ｎ末端領域、並びに内部領域およ
びＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示され
るアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号１９８〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００２８】（１３）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末
端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜２７５で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２８０〜３８３
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００２９】（１４）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末
端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９６で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２０１〜２７９
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号２７６〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００３０】（１５）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末
端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜３１８で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号３２３〜３８３
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００３１】（１６）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末
端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜２７５で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２８０〜３２２
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３１９〜５５２
で示されるアミノ酸配列。

【００３２】本発明の改変タンパク質をコードするＤＮ
Ａ又はこれらのＤＮＡを発現させるための発現ベクター
は、ＨＡＳ１（配列番号１）、ＨＡＳ２（配列番号３）
およびＨＡＳ３（配列番号５）のｃＤＮＡを用いて、通
常の組換えＤＮＡ手法により容易に作製することができ
る。

【００３３】なお、ここで用いることができるｃＤＮＡ
は、配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列をコ
ードしている限りにおいて特に限定されず、例えば配列
番号１、３又は５が例示されるが、遺伝暗号の縮重によ
る異なった塩基配列を有するｃＤＮＡであってもよい。
本発明の改変タンパク質をコードするＤＮＡには、当該
ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さら
に本発明の改変タンパク質をコードするＤＮＡは、本発
明の改変タンパク質をコードするコード鎖のみの一本鎖
であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な塩基
配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖からなる二本鎖で
あってもよい。

【００３４】発現ベクターとしては、通常用いられる発
現用の細胞、特に動物細胞で発現可能なものであれば特
に制限されないが、例えばｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベク
ター（イーストマン・コダック社）、ｐｃＤＮＡ３．
１、ｐＲＣ／ＣＭＶ２（インビトロジェン社）等が挙げ
られる。またＨＡＳ発現ベクターを導入する細胞として
は、ＣＯＳ−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞等が挙げ
られる。

【００３５】本発明の第２のＨＡＳ改変タンパク質は、
特定の位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたＨＡ
Ｓ１タンパク質、ＨＡＳ２タンパク質又はＨＡＳ３タン
パク質である。ＨＡＳ１タンパク質に導入する変異は、
２４２位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３
３７位のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換する変異、３３
８位のＨｉｓ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、３４４
位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３８０位
のＧｌｎ残基をＡｓｎ残基に置換する変異、３８３位の
Ａｒｇ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、３８４位のＴ
ｒｐ残基をＴｙｒ残基に置換する変異、または３１２位
にＧｌｙ残基をＰｒｏ残基に置換する変異から選ばれ
る。

【００３６】これらの変異の中で顕著にＨＡ合成活性が
低下するものとしては、２４２位のＡｓｐ残基をＧｌｕ
残基に置換する変異、３４４位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残
基に置換する変異、３８０位のＧｌｎ残基をＡｓｎ残基
に置換する変異、３８３位のＡｒｇ残基をＬｙｓ残基に
置換する変異、３８４位のＴｒｐ残基をＴｙｒ残基に置
換する変異が挙げられ、かつ好ましい。

【００３７】これらの変異の中で特に顕著にＨＡ合成活
性が低下するものとしては、２４２位のＡｓｐ残基をＧ
ｌｕ残基に置換する変異、３４４位のＡｓｐ残基をＧｌ
ｕ残基へ置換する変異、または３８４位のＴｒｐ残基を
Ｔｙｒ残基へ置換する変異が挙げられ、かつ特に好まし
い。

【００３８】また、上記の変異の中でＨＡ合成活性が増
加するものとしては、３３７位のＴｈｒ残基をＳｅｒ
残基に置換する変異、並びに３３７位のＴｈｒ残基を
Ｓｅｒ残基に置換する変異及び３３８位のＨｉｓ残基を
Ｌｙｓ残基に置換する変異が挙げられ、かつ好ましい。
これらの変異の中でも、特に顕著にＨＡ合成活性が増加
するものとしては、３３７位のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基
に置換する変異及び３３８位のＨｉｓ残基をＬｙｓ残基
に置換する変異が挙げられ、かつ特に好ましい。

【００３９】また、ＨＡＳ３タンパク質に導入する変異
は、２９７位のＧｌｎ残基をＨｉｓ残基に置換する変
異、２９８位のＧｌｎ残基をＧｌｕ残基に置換する変
異、３００位のＬｅｕ残基をＶａｌ残基に置換する変
異、３０５位のＨｉｓ残基をＡｓｎ残基に置換する変
異、３０７位のＬｙｓ残基をＧｌｕ残基に置換する変
異、３０９位のＬｅｕ残基をＭｅｔ残基に置換する変
異、３１１位のＳｅｒ残基をＡｓｎ残基に置換する変
異、または３１２位のＬｙｓ残基をＧｌｎ残基に置換す
る変異から選ばれる。

【００４０】上記変異の中で顕著にＨＡ合成活性が低下
するものとしては、２９７位のＧｌｎ残基をＨｉｓ残基
に置換する変異、２９８位のＧｌｎ残基をＧｌｕ残基に
置換する変異、３０７位のＬｙｓ残基をＧｌｕ残基へ置
換する変異、または３１２位のＬｙｓ残基をＧｌｎ残基
へ置換する変異が挙げられ、かつ好ましい。これらの変
異の中で特に顕著にＨＡ合成活性が低下するものとして
は、２９７位のＧｌｎ残基をＨｉｓ残基に置換する変異
が挙げられ、かつ特に好ましい。

【００４１】また、ＨＡＳ２タンパク質に導入する変異
は、２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変
異、及び２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する
変異、２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する
変異、２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変
異、及び３０３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ残基に置換する
変異、２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する
変異、２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変
異、３０３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ残基に置換する変
異、３０７位のＡｓｎ残基をＳｅｒ残基に置換する変
異、及び３０８位のＧｌｎ残基をＬｙｓ残基に置換する
変異、から選ばれる。

【００４２】これらの変異の中で顕著にＨＡ合成活性が
増加するものとしては、２９３位のＨｉｓ残基をＧｌ
ｎ残基に置換する変異、２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ
残基に置換する変異及び３０３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ
残基に置換する変異、並びに２９３位のＨｉｓ残基を
Ｇｌｎ残基に置換する変異、２９４位のＧｌｕ残基をＧ
ｌｎ残基に置換する変異、３０３位のＧｌｕ残基をＬｙ
ｓ残基に置換する変異、３０７位のＡｓｎ残基をＳｅｒ
残基に置換する変異、及び３０８位のＧｌｎ残基をＬｙ
ｓ残基に置換する変異が挙げられ、かつ好ましい。

【００４３】上記変異を有するＨＡＳタンパク質は、Ｈ
ＡＳタンパク質をコードするＤＮＡに、所望の変異が生
じるように部位特異的変異を導入し、ＣＯＳ−１細胞等
の細胞で発現させることによって容易に取得することが
できる。

【００４４】前記の第１及び第２の改変タンパク質によ
り、ＨＡＳタンパク質研究用のキットを構成することが
できる。本発明の改変タンパク質は、ＨＡＳ活性が低下
又は増加している。本発明の改変タンパク質または、こ
れらのタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに各種改変
タンパク質、またはこれらのタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含むキットは、ＨＡの生合成機構の解明などの研
究に有用である。また、ガン細胞の増殖、転移にはＨＡ
が関与していることから、活性の低下したＨＡＳは、ガ
ン細胞の増殖、転移を抑制することが期待される。

【００４５】また、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３によ
り合成されるＨＡの平均分子量は、それぞれ２０００ｋ
Ｄａ、１４００ｋＤａ及び１００〜３００ｋＤａである
ことが明らかにされた。これら本発明により、ＨＡの合
成量、合成ＨＡの長さを制御する事が可能となり、特定
の分子量を持つＨＡを効率的に生産する有用なツールと
なり得る。更に、それら分子量の異なるＨＡ標品の生理
機能、例えば、形態形成作用、器官再生効果や、細胞増
殖の抑制あるいは促進作用、細胞浸潤促進あるいは抑制
作用などから、腫瘍浸潤抑制作用、癌転移抑制作用、抗
潰瘍作用、創傷治癒、関節炎治療、感染防止等の医薬品
開発が期待される。また、本発明の改変タンパク質をコ
ードするＤＮＡを生物体に取り込むことで、ＨＡ合成機
能の促進、抑制、攪乱を行うことが可能となり、ＨＡ生
合成に係わる疾患（例えば関節炎、炎症、繊維化、角質
化、癌等）に対する遺伝子治療の可能性も期待される。

【００４６】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【００４７】＜１＞タグ標識ＨＡＳ発現ベクターの構築
及びＣＯＳ−１細胞への導入（１）マウスＨＡＳ１ｃＤＮＡ発現ベクターの構築マウスＨＡＳ１ｃＤＮＡは、マウス１７日齢の胚ｃＤ
ＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TMｃＤＮＡ、クロ
ンテック社）からSpicer, A.P. et al. (1996)J. Biol.
Chem., 271, 23400-23406に記載の方法に従ってクロー
ン化した。

【００４８】マウスＨＡＳ１ｃＤＮＡ断片を、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）および
配列番号８及び９に示す塩基配列を有するプライマーを
用いた２０サイクルのＰＣＲ反応により増幅した。配列
番号８に示す塩基配列は、ＢｇｌII部位及びＨＡＳ１の
配列番号１０に示すアミノ酸配列（２〜９位）に相当す
る配列を含んでいる。また、配列番号９に示す塩基配列
は、ＨＡＳＩの配列番号１１に示すアミノ酸配列（２０
４〜３１１位）に相当する配列を含んでいる。

【００４９】得られたＰＣＲ断片をＢｇｌIIおよびＢｓ
ｐＨＩで切断して電気泳動により製し、ＢｓｐＨＩを含
む断片を取り出した。同様に、３’末端側の断片は、Ｈ
ＡＳ１全長ｃＤＮＡからＢｓｐＨＩおよびＢｇｌIIで切
断して電気泳動により精製することにより取り出した。
これらのＨＡＳ１の２つの断片は、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ
−２ベクター（イーストマン・コダック）のＢｇｌII部
位にサプクローン化し、ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１を構築し
た。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターは、ＣＭＶプロモ
ーター及び８アミノ酸からなるＦＬＡＧペプチドをコー
ドする配列を含んでおり、クローン化断片がコードする
ペプチドは、ＦＬＡＧとの融合蛋白として該ベクターが
導入された細胞内に分泌される。

【００５０】（２）マウスＨＡＳ２ｃＤＮＡ発現ベク
ターの構築マウスＨＡＳ２ｃＤＮＡは、マウス１７日齢の胚ｃＤ
ＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TMｃＤＮＡ、クロ
ンテック社）からSpicer, A.P. et al. (1996)J. Biol.
Chem., 271, 23400-23406に記載の方法に従ってクロー
ン化した。

【００５１】マウスＨＡＳ２ｃＤＮＡ断片を、配列番
号１２及び１３に示す塩基配列を有するプライマーを用
いて、上記と同様にしてＰＣＲにより増幅した。配列番
号１２に示す塩基配列は、ＢｇｌII部位及びＨＡＳ２の
配列番号１４に示すアミノ酸配列（２〜９位）に相当す
る配列を含んでいる。また、配列番号１３に示す塩基配
列は、ＳｍａＩ部位及びＨＡＳ２の配列番号１５に示す
アミノ酸配列（５４５〜５５２位）に相当する配列を含
んでいる。

【００５２】得られたＰＣＲ断片を電気泳動により精製
し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターのＢｇｌII及びＳ
ｍａＩ部位にサプクローン化し、ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ２
を構築した。

【００５３】（３）マウスＨＡＳ３ｃＤＮＡ発現ベク
ターの構築マウスＨＡＳ３ｃＤＮＡは、マウス１７日齢の胚ｃＤ
ＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TMｃＤＮＡ、クロ
ンテック社）からSpicer, A.P. et al. (1996)J. Biol.
Chem., 271, 23400-23406に記載の方法に従ってクロー
ン化した。

【００５４】マウスＨＡＳ３ｃＤＮＡ断片を、配列番
号１６及び１７に示す塩基配列を有するプライマーを用
いて、上記と同様にしてＰＣＲにより増幅した。配列番
号１６に示す塩基配列は、ＥｃｏＲＩ部位及びＨＡＳ３
の配列番号１８に示すアミノ酸配列（２〜９位）に相当
する配列を含んでいる。また、配列番号１７に示す塩基
配列は、ＥｃｏＲＩ部位及びＨＡＳ３の配列番号１９に
示すアミノ酸配列（５４９〜５５４位）に相当する配列
を含んでいる。

【００５５】得られたＰＣＲ断片を電気泳動により精製
し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターのＥｃｏＲＩ部位
にサプクローン化し、ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ３を構築し
た。

【００５６】＜２＞ＨＡＳキメラｃＤＮＡの構築ＨＡＳキメラｃＤＮＡを構築するために、各マウスＨＡ
ＳｃＤＮＡを含むプラスミドｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１、ｐ
ＦＬＡＧ−ＨＡＳ２、およびｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ３を鋳
型とするＰＣＲを行った。先ず、ＨＡＳ１及びＨＡＳ２
のＣ末端領域を、５’側プライマーとして配列番号２５
（F1-4）または配列番号３２（F2-4）に示す塩基配列を
有するプライマーを、３’側プライマーとして配列番号
３６に示すプライマー（C-CMV-24）を用いて、それぞれ
増幅した。また、他の領域を、表１に示すプライマーを
用いてそれぞれ増幅した。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（パーキン−エルマー
社）を用いて、９４℃４５秒、６０℃４５秒、および７
２℃４分の反応を２５サイクル行った。

【００５７】表１中の記号Ａ、Ａ_S、Ｂ、Ｂ_L等は、以下
のとおりである。また、以下の記載において、各領域を
表す記号の後に付された数字１、２、３は、ＨＡＳ１、
ＨＡＳ２またはＨＡＳ３の領域であることを示す。例え
ば、Ｃ１は、ＨＡＳ１のＣ末端領域を表す。

【００５８】Ａ：Ｎ末端領域Ａ_S：Ｎ末端〜２番目のＮ末端トランスメンブレンドメ
インまでの領域Ｂ：内部領域Ｂ_L：酵素活性を有する細胞内ループドメイン

【００５９】キメラ（Chim番号）１７〜２０において
は、図３に記載されているように、内部領域を更に細分
化しており、そのＢ領域に相当する部分は以下のように
なる。Ｂａとは、ＨＡＳ２のアミノ酸配列（配列番号
４）１９８番から２７５番と、ＨＡＳ３のアミノ酸配列
（配列番号６）２８０番から３８３番より成る部分と、
Ｂｂとは、ＨＡＳ３のアミノ酸配列（配列番号６）２０
１番から２７９番と、ＨＡＳ２のアミノ酸配列（配列番
号４）２７６番から３７９番より成る部分と、Ｂｃと
は、ＨＡＳ２のアミノ酸配列（配列番号４）１９８番か
ら３１８番と、ＨＡＳ３のアミノ酸配列（配列番号６）
３２３番から３８３番より成る部分と、Ｂｄとは、ＨＡ
Ｓ２のアミノ酸配列（配列番号４）１９８番から２７５
番と、ＨＡＳ３のアミノ酸配列（配列番号６）２８０番
から３２２番と、ＨＡＳ２のアミノ酸配列（配列番号
４）３１９番から３７９番、より成る部分を表してい
る。

【００６０】

【表１】表１ ─────────────────────────────────── 増幅する領域５’プライマー３’プライマー ───────────────────────────── Ａ_S F1-1(配列番号 8) R1-1(配列番号20) ＨＡＳ１Ａ F1-1 R1-2(配列番号21) Ｂ_L F1-2(配列番号22) R1-3(配列番号23) Ｂ F1-3(配列番号24) R1-3 Ｃ F1-4(配列番号25) Ａ_S F2-1(配列番号26) R2-1(配列番号27) ＨＡＳ２Ａ F2-1 R2-2(配列番号28) Ｂ_L F2-2(配列番号29) R2-3(配列番号30) Ｂ F2-3(配列番号31) R2-3 Ｃ F2-4(配列番号32) ＨＡＳ３Ｂ_L F3-1(配列番号33) R3-1(配列番号34) Ｂ F3-2(配列番号35) R3-1 ＨＡＳ２，３キメラＢa F2-3 R3-1 ＨＡＳ２，３キメラＢb F3-2 R2-3 ＨＡＳ２，３キメラＢc F2-3 R3-1 ＨＡＳ２，３キメラＢd F2-3 R2-3 ───────────────────────────────────

【００６１】Ｃ１断片をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌIIで消
化し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターにサブクローン
化し、ｐＦＬＡＧ−Ｃ１を構築した。また、Ｃ２断片を
ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭ
Ｖ−２ベクターにサブクローン化し、ｐＦＬＡＧ−Ｃ２
を構築した。さらに、Ａ１、Ａ_S１、Ａ２、Ａ_S２の各断
片をＨｉｎｄIIIで消化し、ｐＦＬＡＧ−Ｃ１またはｐ
ＦＬＡＧ−Ｃ２のＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏ４７III部位
にサブクローン化し、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ１、ｐＦＬＡ
Ｇ−Ａ１Ｃ２、ｐＦＬＡＧ−Ａ２Ｃ１、ｐＦＬＡＧ−Ａ
２Ｃ２、ｐＦＬＡＧ−Ａ_S１Ｃ１、およびｐＦＬＡＧ−
Ａ_S２Ｃ２を構築した。

【００６２】各断片を連結後、新たなＥｃｏ４７III部
位が、Ａ断片及びＣ断片の間に生成された。Ｂ１断片
を、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ１、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ２、ｐ
ＦＬＡＧ−Ａ２Ｃ１、ｐＦＬＡＧ−Ａ２Ｃ２のＥｃｏ４
７III部位にサブクローン化した。また、Ｂ２断片およ
びＢ３断片を、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ１およびｐＦＬＡＧ
−Ａ２Ｃ２のＥｃｏ４７III部位にサブクローン化し
た。さらに、Ｂ_L１、Ｂ_L２、およびＢ_L３断片を、ｐＦ
ＬＡＧ−Ａ_S１Ｃ１およびｐＦＬＡＧ−Ａ_S２Ｃ２のＥｃ
ｏ４７III部位にサブクローン化した。

【００６３】ＨＡＳキメラｃＤＮＡは、さらに２段階Ｐ
ＣＲにより、重複する２つの分離したＰＣＲ産物を連結
してより長い産物を得た。第一段階ＰＣＲでは、表１に
示すプライマーおよびｐｆｕＤＮＡポリメラーゼを用
い、Ｂドメインの５’断片および３’断片を得た。第二
段階ＰＣＲでは、ゲル電気泳動で精製した重複する２つ
の断片を等量用い、プライマーを用いずに５サイクル反
応を行った。反応後、Ｂドメインの両側に設定されたプ
ライマーのセットを加え、ＰＣＲ反応を２０サイクル行
った。プライマーは、Ｂ１断片にはＦ１−３及びＲ１−
３を、Ｂ２断片にはＦ２−３及びＲ２−３を、Ｂ３断片
にはＦ３−３及びＲ３−３を、それぞれ用いた。得られ
たキメラＢ断片を、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ１およびｐＦＬ
ＡＧ−Ａ２Ｃ２のＥｃｏ４７III部位にサブクローン化
した。

【００６４】上記で得られた全ての発現ベクターの構造
は、塩基配列決定により確認した。これらの発現ベクタ
ーがコードするＨＡＳキメラタンパク質の構造を、図２
および図３に模式的に示す。また、上記手順と図示した
キメラ蛋白質との関係を表２に示す。尚、これらのタン
パク質のうちＣｈｉｍ１およびＣｈｉｍ７は、ＨＡＳ１
と同一の構造を有する。また、Ｃｈｉｍ５とＣｈｉｍ１
１はＨＡＳ２と同一の構造を有する。

【００６５】

【表２】

【００６６】＜３＞部位特異的変異ＨＡＳ発現ベクター
の構築Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ^TM 部位特異的変異キットを
用い、ＨＡＳ１（ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１）に、２４２位
のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異（Ａｓｐ２４
２Ｇｌｕ）、３４４位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換
する変異（Ａｓｐ３４４Ｇｌｕ）、３８０位のＧｌｎ残
基をＡｓｎ残基に置換する変異（Ｇｌｎ３８０ＡＳ
ｎ）、３８３位のＡｒｇ残基をＬｙｓ残基に置換する変
異（Ａｒｇ３８３Ｌｙｓ）、３８４位のＴｒｐ残基をＴ
ｙｒ残基に置換する変異（Ｔｒｐ３８４Ｔｙｒ）、また
は３１２位にＧｌｙ残基をＰｒｏ残基に置換する変異
（Ｇｌｙ３１２Ｐｒｏ）を導入した。ＨＡＳタンパク質
中における各変異の位置を、図４に示す。さらに、ＨＡ
Ｓ１（ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１）に、３３７位のＴｈｒ残
基をＳｅｒ残基に置換する変異（Ｔ３３７Ｓ）、及び同
変異に加えて３３８位のＨｉｓ残基をＬｙｓ残基に置換
する変異（Ｔ３３７Ｓ，Ｈ３３８Ｋ）を導入した。

【００６７】同様に、ＨＡＳ３（ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ
３）に、２９７位のＧｌｎ残基をＨｉｓ残基に置換する
変異（Ｑ２９７Ｈ）、２９８位のＧｌｎ残基をＧｌｕ残
基に置換する変異（Ｑ２９８Ｅ）、３００位のＬｅｕ残
基をＶａｌ残基に置換する変異（Ｌ３００Ｖ）、３０５
位のＨｉｓ残基をＡｓｎ残基に置換する変異（Ｈ３０５
Ｎ）、３０７位のＬｙｓ残基をＧｌｕ残基に置換する変
異（Ｋ３０７Ｅ）、３０９位のＬｅｕ残基をＭｅｔ残基
に置換する変異（Ｌ３０９Ｍ）、３１１位のＳｅｒ残基
をＡｓｎ残基に置換する変異（Ｓ３１１Ｎ）、または３
１２位のＬｙｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異（Ｋ３
１２Ｑ）を導入した。また、ＨＡＳ２（ｐＦＬＡＧ−Ｈ
ＡＳ２）に、２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置
換する変異、及び２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に
置換する変異（Ｈ２９３Ｑ，Ｅ２９４Ｑ）、２９３位
のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、及び２９４
位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、及び３０
３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ残基に置換する変異（Ｈ２９
３Ｑ，Ｅ２９４Ｑ，Ｅ３０３Ｋ）、２９３位のＨｉｓ
残基をＧｌｎ残基に置換する変異、及び２９４位のＧｌ
ｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、３０３位のＧｌｕ
残基をＬｙｓ残基に置換する変異、３０７位のＡｓｎ残
基をＳｅｒ残基に置換する変異、及び３０８位のＧｌｎ
残基をＬｙｓ残基に置換する変異（Ｈ２９３Ｑ，Ｅ２９
４Ｑ，Ｅ３０３Ｋ，Ｎ３０７Ｓ，Ｑ３０８Ｋ）、をそれ
ぞれ導入した。

【００６８】目的どおりの変異が導入されたことは、塩
基配列決定により確認した。

【００６９】＜４＞ＨＡ合成アッセイ（１）ＦＬＡＧ−タグ標識ＨＡＳ発現ベクターのＣＯＳ
−１細胞への導入上記のようにして構築されたＦＬＡＧ−タグ標識ベクタ
ーを、ＣＯＳ−１細胞にエレクトロポレーションにより
トランスフェクトした。コントロールとして、ｐＦＬＡ
Ｇ−ＣＭＶ−２ベクターをＣＯＳ−１細胞にトランスフ
ェクトした。エレクトロポレーションは、市販の装置
（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ、バイオラッド社）を用い、
装置のマニュアルに従って行った。トランスフェクトさ
れた細胞は、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭＬ−グ
ルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地で３７℃で
３日間培養した。

【００７０】（２）ＨＡ合成量の測定培養した細胞から粗膜画分を調製し、０．２ｍｌの２５
ｍＭＨｐｅｐｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．１）、５ｍＭジ
チオスライトール、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＮＡｃ（シグマ社）、０．１ｍＭＵＤＰ−
ＧｌｃＡ（ＮａｋａｒａｉＴｅｓｑｕｅ）、および
２．５μＣｉＵＤＰ−［¹⁴Ｃ］ＧｌｃＡ（２８．５ｍ
Ｃｉ／ｍｍｏｌ、デュポンＮＥＮ社）に懸濁させた。タ
ンパク質量は、ＢＩＯ−ＲＡＤプロテインアッセイキッ
ト（バイオラッド社）を用いて定量した。ＨＡＳ活性
は、 Ng, K.F. and Schwartzm, N.B. (1989) J. Biol.
Chem.,264, 11776-11783に記載の方法を改変して測定
した。すなわち、上記懸濁液を３７℃で１時間保温後、
１ＴＲＵのストレプトマイセスヒアルロニダーゼ（生化
学工業（株））を添加し、あるいは添加しないで、３７
℃で１時間さらにインキュベートした。その後、１％
（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを添加して煮沸した。

【００７１】放射活性を有するＨＡを、ＨｉＬｏａｄ
１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇ（ファルマシア
バイオテック社）を用いたクロマトグラフィーにより分
離した。溶出は、０．２Ｍ酢酸アンモニウムを用いて行
い、１ｍｌづつ分画し、放射活性を測定した。ＨＡに取
り込まれた放射活性を、ストレプトマイセスヒアルロニ
ダーゼ感受性のカウントを計算することにより測定し
た。このＨＡに取り込まれた放射活性から、ＨＡＳ活性
（ピコモル／分／μｇタンパク質）を算出した。Ｃｈｉ
ｍ１〜Ｃｈｉｍ１６についての結果を図５に示す。ま
た、Ｃｈｉｍ１７〜Ｃｈｉｍ２０、変異型ＨＡＳ２タン
パク質、変異型ＨＡＳ３タンパク質、および、変異型Ｈ
ＡＳ１タンパク質のうちＨＡＳ１（Ｔ３３７Ｓ）及びＨ
ＡＳ１（Ｔ３３７Ｓ，Ｈ３３８Ｋ）についての結果を図
６に示す。さらに、残りの変異型ＨＡＳ１タンパク質に
ついての結果を表３に示す。

【００７２】

【表３】表３ ─────────────────────── 変異体相対活性 ─────────────────────── 野生型ＨＡＳ１１００％Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ＜１％Ａｓｐ３４４Ｇｌｕ＜１％Ｇｌｎ３８０ＡＳｎ１０〜２０％Ａｒｇ３８３Ｌｙｓ１０〜２０％Ｔｒｐ３８４Ｔｙｒ＜１％Ｇｌｙ３１２Ｐｒｏ１００〜１１０％ ───────────────────────細胞
質ループ上にあるアミノ酸を別のアミノ酸に置換した変
異型ＨＡＳタンパク質を用いた結果（表３、図６）にお
いて、変異型ＨＡＳタンパク質の野生型ＨＡＳタンパク
質に対する相対活性が極端に低下していることにより、
ＨＡＳの活性部位は、細胞質ループ上にあることが示さ
れた。

【００７３】（３）ＨＡのアガロースゲル電気泳動変異型ＨＡＳ１発現ベクターでトランスフェクトした細
胞の溶解物を用いて合成された放射性標識ＨＡを、上記
と同様にしてＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅ
ｘ３０ｐｇで分離した。放射活性ＨＡは、１ＴＲＵの
ストレプトマイセスヒアルロニダーゼ（生化学工業
（株））を添加し、あるいは添加しないで、３７℃で１
時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動で分画
した。ＫｉｌｏＢａｓｅ^TM ＤＮＡマーカー（ファルマ
シアバイオテック社）を分子量マーカーに用いた。ゲル
を乾燥させた後、放射活性ＨＡを、ＢＡＳ２０００II
（富士フィルム社）で２日間露光後に検出した。結果を
図７に示す。キメラＨＡＳタンパク質及び変異型ＨＡＳ
タンパク質を用いて合成したＨＡを、上記と同様にして
電気泳動し、分子量を測定した。その結果、ＨＡの分子
量は、改変又は変異による合成活性の変化とは独立し
て、大きく異なっていた。

【００７４】また、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２又はＨＡＳ３を
用いて合成したＨＡを上記と同様にして電気泳動し、分
子量を測定した。その結果、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡ
Ｓ３により合成されるＨＡの平均分子量は、それぞれ２
０００ｋＤａ、１４００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ
であった。

【００７５】

【発明の効果】本発明により、活性の低下又は増加した
ＨＡＳ改変タンパク質が得られる。

【００７６】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：2102 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：胚配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：49..1800 特徴を決定した方法：P 配列 CTAAAGAGAA CAAGACGGAG AAGAGAGAAT CCAGGAGGAC CCACAGCC ATG AGA CAG 57 Met Arg Gln 1 GAC ATG CCA AAG CCC TCA GAG GCA GCG CGT TGC TGC TCT GGC CTG GCC 105 Asp Met Pro Lys Pro Ser Glu Ala Ala Arg Cys Cys Ser Gly Leu Ala 5 10 15 AGG CGA GCA CTC ACG ATC ATC TTT GCC CTG CTC ATC CTG GGC CTC ATG 153 Arg Arg Ala Leu Thr Ile Ile Phe Ala Leu Leu Ile Leu Gly Leu Met 20 25 30 35 ACC TGG GCC TAC GCC GCA GGC GTT CCT CTG GCT TCA GAT CGC TAT GGA 201 Thr Trp Ala Tyr Ala Ala Gly Val Pro Leu Ala Ser Asp Arg Tyr Gly 40 45 50 CTC CTG GCC TTT GGC CTC TAT GGG GCA TTC CTC AGC GCA CAC CTA GTG 249 Leu Leu Ala Phe Gly Leu Tyr Gly Ala Phe Leu Ser Ala His Leu Val 55 60 65 GCA CAG AGC CTC TTC GCT TAC CTG GAG CAC CGA AGG GTG GCA GCG GCT 297 Ala Gln Ser Leu Phe Ala Tyr Leu Glu His Arg Arg Val Ala Ala Ala 70 75 80 GCG CGG CGC TCC TTG GCG AAG GGG CCC CTG GAT GCG GCC ACT GCA CGC 345 Ala Arg Arg Ser Leu Ala Lys Gly Pro Leu Asp Ala Ala Thr Ala Arg 85 90 95 AGC GTG GCA CTC ACC ATC TCA GCC TAC CAA GAG GAT CCC GCT TAC CTG 393 Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Tyr Gln Glu Asp Pro Ala Tyr Leu 100 105 110 115 CGC CAG TGC TTG ACC TCC GCG CGC GCC TTG CTG TAC CCG CAC ACG AGG 441 Arg Gln Cys Leu Thr Ser Ala Arg Ala Leu Leu Tyr Pro His Thr Arg 120 125 130 TTA CGC GTG CTC ATG GTG GTG GAC GGC AAC CGC GCT GAG GAT CTG TAC 489 Leu Arg Val Leu Met Val Val Asp Gly Asn Arg Ala Glu Asp Leu Tyr 135 140 145 ATG GTG GAC ATG TTC CGA GAA GTC TTC GCC GAT GAG GAC CCC GCC ACT 537 Met Val Asp Met Phe Arg Glu Val Phe Ala Asp Glu Asp Pro Ala Thr 150 155 160 TAT GTG TGG GAT GGC AAC TAC CAT CAG CCC TGG GAA CCA GCG GAG GCT 585 Tyr Val Trp Asp Gly Asn Tyr His Gln Pro Trp Glu Pro Ala Glu Ala 165 170 175 ACG GGC GCT GTC GGT GAA GGT GCC TAC CGG GAG GTG GAG GCG GAG GAC 633 Thr Gly Ala Val Gly Glu Gly Ala Tyr Arg Glu Val Glu Ala Glu Asp 180 185 190 195 CCC GGG CGG TTG GCG GTG GAG GCG CTG GTG AGA ACA CGC AGG TGC GTG 681 Pro Gly Arg Leu Ala Val Glu Ala Leu Val Arg Thr Arg Arg Cys Val 200 205 210 TGC GTG GCT CAG CGT TGG GGC GGC AAA CGT GAG GTC ATG TAC ACA GCT 729 Cys Val Ala Gln Arg Trp Gly Gly Lys Arg Glu Val Met Tyr Thr Ala 215 220 225 TTC AAG GCA CTG GGC GAC TCC GTG GAC TAC GTG CAG GTC TGT GAC TCA 777 Phe Lys Ala Leu Gly Asp Ser Val Asp Tyr Val Gln Val Cys Asp Ser 230 235 240 GAC ACA AGA CTA GAC CCC ATG GCA CTG CTG GAG CTT GTG CGA GTG TTG 825 Asp Thr Arg Leu Asp Pro Met Ala Leu Leu Glu Leu Val Arg Val Leu 245 250 255 GAT GAA GAC CCC CGG GTA GGG GCT GTT GGA GGG GAT GTG AGG ATC CTT 873 Asp Glu Asp Pro Arg Val Gly Ala Val Gly Gly Asp Val Arg Ile Leu 260 265 270 275 AAC CCT CTG GAC TCC TGG GTC AGC TTC TTG AGC AGT CTT CGA TAC TGG 921 Asn Pro Leu Asp Ser Trp Val Ser Phe Leu Ser Ser Leu Arg Tyr Trp 280 285 290 GTA GCC TTC AAT GTG GAA CGA GCT TGT CAG AGC TAC TTC CAC TGT GTG 969 Val Ala Phe Asn Val Glu Arg Ala Cys Gln Ser Tyr Phe His Cys Val 295 300 305 TCC TGC ATC AGT GGT CCT CTG GGT CTA TAC AGA AAC AAT CTC CTG CAG 1017 Ser Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Arg Asn Asn Leu Leu Gln 310 315 320 CAG TTC TTG GAG GCC TGG TAC AAC CAA AAG TTC CTG GGC ACC CAC TGC 1065 Gln Phe Leu Glu Ala Trp Tyr Asn Gln Lys Phe Leu Gly Thr His Cys 325 330 335 ACA TTT GGG GAT GAC AGG CAC CTC ACC AAC CGA ATG CTT AGC ATG GGC 1113 Thr Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg Met Leu Ser Met Gly 340 345 350 355 TAT GCT ACC AAG TAT ACC TCG CGC TCC AGA TGC TAC TCG GAG ACG CCC 1161 Tyr Ala Thr Lys Tyr Thr Ser Arg Ser Arg Cys Tyr Ser Glu Thr Pro 360 365 370 TCC TCC TTC CTT CGT TGG TTG AGC CAA CAG ACC CGC TGG TCC AAA TCT 1209 Ser Ser Phe Leu Arg Trp Leu Ser Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser 375 380 385 TAC TTC CGA GAG TGG CTA TAC AAT GCT CTG TGG TGG CAT CGC CAC CAC 1257 Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Leu Trp Trp His Arg His His 390 395 400 GCA TGG ATG ACC TAT GAA GCG GTG GTC TCG GGC CTC TTC CCT TTC TTC 1305 Ala Trp Met Thr Tyr Glu Ala Val Val Ser Gly Leu Phe Pro Phe Phe 405 410 415 GTG GCT GCC ACG GTG TTG AGG CTC TTC TAT GCA GGG CGC CCG TGG GCT 1353 Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Leu Phe Tyr Ala Gly Arg Pro Trp Ala 420 425 430 435 CTG CTC TGG GTG CTG CTC TGT GTG CAG GGC GTA GCA CTG GCA AAG GCA 1401 Leu Leu Trp Val Leu Leu Cys Val Gln Gly Val Ala Leu Ala Lys Ala 440 445 450 GCC TTT GCA GCC TGG CTG CGT GGC TGC GTG CGC ATG GTG CTG CTG TCA 1449 Ala Phe Ala Ala Trp Leu Arg Gly Cys Val Arg Met Val Leu Leu Ser 455 460 465 CTC TAT GCA CCA CTC TAC ATG TGC GGC CTC CTG CCT GCC AAA TTC CTA 1497 Leu Tyr Ala Pro Leu Tyr Met Cys Gly Leu Leu Pro Ala Lys Phe Leu 470 475 480 GCG TTG GTT ACC ATG AAT CAA AGT GGT TGG GGT ACC TCG GGC CGG AAG 1545 Ala Leu Val Thr Met Asn Gln Ser Gly Trp Gly Thr Ser Gly Arg Lys 485 490 495 AAA CTG GCT GCT AAC TAT GTC CCC GTG TTG CCC CTG GCA CTC TGG GCT 1593 Lys Leu Ala Ala Asn Tyr Val Pro Val Leu Pro Leu Ala Leu Trp Ala 500 505 510 515 CTA CTG CTG CTT GGA GGC CTG GCC CGC AGT GTG GCC CAG GAG GCC AGA 1641 Leu Leu Leu Leu Gly Gly Leu Ala Arg Ser Val Ala Gln Glu Ala Arg 520 525 530 GCT GAC TGG AGT GGC CCA TCC CGA GCA GCT GAA GCC TAC CAC CTT GCT 1689 Ala Asp Trp Ser Gly Pro Ser Arg Ala Ala Glu Ala Tyr His Leu Ala 535 540 545 GCT GGG GCT GGT GCC TAT GTG GCC TAC TGG GTG GTA ATG TTA ACT ATC 1737 Ala Gly Ala Gly Ala Tyr Val Ala Tyr Trp Val Val Met Leu Thr Ile 550 555 560 TAC TGG GTA GGT GTG AGG AGG CTG TGC AGA CGT CGG AGC GGT GGT TAC 1785 Tyr Trp Val Gly Val Arg Arg Leu Cys Arg Arg Arg Ser Gly Gly Tyr 565 570 575 CGT GTC CAA GTA TGAGTCCGGG CATGAAGATG CAGCTGAGGG CTCTTAAAGG 1837 Arg Val Gln Val 580 AGGAGTCCTT GTGAGGCACC CCCTGGAGTC ATGGCTTTCT GGGGACTCAG TTTACCTTCT 1897 CTTTGAAATG AGGGAGTTAT TTAAGATTCT TCAATATGGA CTGTATTGGA ACTCAGATCT 1957 AGGTCTCTGG GGAGGGGTAA TTTATTGATC AGGGAGTGGG ATTGTAGGAC CAGGGCCAGA 2017 ACGTCTCCAT TTTCTCCCTG TTGCTATTTA ATGTTTGTAC TGTAAGATTA TATAATAAAT 2077 TTTTTATTTA TTTTCTTCTT TAGAG 2102

【００７７】配列番号：２配列の長さ：583 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Arg Gln Asp Met Pro Lys Pro Ser Glu Ala Ala Arg Cys Cys Ser 1 5 10 15 Gly Leu Ala Arg Arg Ala Leu Thr Ile Ile Phe Ala Leu Leu Ile Leu 20 25 30 Gly Leu Met Thr Trp Ala Tyr Ala Ala Gly Val Pro Leu Ala Ser Asp 35 40 45 Arg Tyr Gly Leu Leu Ala Phe Gly Leu Tyr Gly Ala Phe Leu Ser Ala 50 55 60 His Leu Val Ala Gln Ser Leu Phe Ala Tyr Leu Glu His Arg Arg Val 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Arg Arg Ser Leu Ala Lys Gly Pro Leu Asp Ala Ala 85 90 95 Thr Ala Arg Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Tyr Gln Glu Asp Pro 100 105 110 Ala Tyr Leu Arg Gln Cys Leu Thr Ser Ala Arg Ala Leu Leu Tyr Pro 115 120 125 His Thr Arg Leu Arg Val Leu Met Val Val Asp Gly Asn Arg Ala Glu 130 135 140 Asp Leu Tyr Met Val Asp Met Phe Arg Glu Val Phe Ala Asp Glu Asp 145 150 155 160 Pro Ala Thr Tyr Val Trp Asp Gly Asn Tyr His Gln Pro Trp Glu Pro 165 170 175 Ala Glu Ala Thr Gly Ala Val Gly Glu Gly Ala Tyr Arg Glu Val Glu 180 185 190 Ala Glu Asp Pro Gly Arg Leu Ala Val Glu Ala Leu Val Arg Thr Arg 195 200 205 Arg Cys Val Cys Val Ala Gln Arg Trp Gly Gly Lys Arg Glu Val Met 210 215 220 Tyr Thr Ala Phe Lys Ala Leu Gly Asp Ser Val Asp Tyr Val Gln Val 225 230 235 240 Cys Asp Ser Asp Thr Arg Leu Asp Pro Met Ala Leu Leu Glu Leu Val 245 250 255 Arg Val Leu Asp Glu Asp Pro Arg Val Gly Ala Val Gly Gly Asp Val 260 265 270 Arg Ile Leu Asn Pro Leu Asp Ser Trp Val Ser Phe Leu Ser Ser Leu 275 280 285 Arg Tyr Trp Val Ala Phe Asn Val Glu Arg Ala Cys Gln Ser Tyr Phe 290 295 300 His Cys Val Ser Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Arg Asn Asn 305 310 315 320 Leu Leu Gln Gln Phe Leu Glu Ala Trp Tyr Asn Gln Lys Phe Leu Gly 325 330 335 Thr His Cys Thr Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg Met Leu 340 345 350 Ser Met Gly Tyr Ala Thr Lys Tyr Thr Ser Arg Ser Arg Cys Tyr Ser 355 360 365 Glu Thr Pro Ser Ser Phe Leu Arg Trp Leu Ser Gln Gln Thr Arg Trp 370 375 380 Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Leu Trp Trp His 385 390 395 400 Arg His His Ala Trp Met Thr Tyr Glu Ala Val Val Ser Gly Leu Phe 405 410 415 Pro Phe Phe Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Leu Phe Tyr Ala Gly Arg 420 425 430 Pro Trp Ala Leu Leu Trp Val Leu Leu Cys Val Gln Gly Val Ala Leu 435 440 445 Ala Lys Ala Ala Phe Ala Ala Trp Leu Arg Gly Cys Val Arg Met Val 450 455 460 Leu Leu Ser Leu Tyr Ala Pro Leu Tyr Met Cys Gly Leu Leu Pro Ala 465 470 475 480 Lys Phe Leu Ala Leu Val Thr Met Asn Gln Ser Gly Trp Gly Thr Ser 485 490 495 Gly Arg Lys Lys Leu Ala Ala Asn Tyr Val Pro Val Leu Pro Leu Ala 500 505 510 Leu Trp Ala Leu Leu Leu Leu Gly Gly Leu Ala Arg Ser Val Ala Gln 515 520 525 Glu Ala Arg Ala Asp Trp Ser Gly Pro Ser Arg Ala Ala Glu Ala Tyr 530 535 540 His Leu Ala Ala Gly Ala Gly Ala Tyr Val Ala Tyr Trp Val Val Met 545 550 555 560 Leu Thr Ile Tyr Trp Val Gly Val Arg Arg Leu Cys Arg Arg Arg Ser 565 570 575 Gly Gly Tyr Arg Val Gln Val 580

【００７８】配列番号：３配列の長さ：2938 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：胚配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：508..2166 特徴を決定した方法：P 配列 ACATGTAAGA AGAAGGAGAA GTCAAGGCGT CTGGAAAGAA TTACCCAGTC CTGGCTTCGA 60 GCAGCCCATT GAACGGGGGA CTTGAACCAG CCAAAGACTT CTTCATTCTG CTCTTGCTAG 120 ACTCTGCTGA GTCTTGACCC GGCTTGTAGG TTGATGTGAA AAGAGATTTT GTGTCGTCGG 180 AGGGAAGGGG ATTGGAGCAA ATAGCAAAAC AGGGGGAAAA GTTAATTTAT CTTTAAAGCA 240 GATATAACAA AGAATTAGAA GACTTAAGTG CAGCGGAAAT ATAAAGAGAA TATTAGTGAA 300 ATTTCTTCTC AAAGAGGGGA GAACCAAGCA TTTAAGGCTC CCCCATCTTT TTTTTTAAAT 360 GTTGTTTTTA AATTTCTTAT TTTTTTTGGC CGGTCGTCTC AAATTCATCT GATTTCTTAT 420 TACCTCAATT TTGGAAACTT CCTTCCACGA CCCTCCGGGA CCACACAGAC AGGCGGAGGA 480 CGAGTCTATG AGCAGGAGCT GAACAAG ATG CAT TGT GAG AGG TTT CTA TGT 531 Met His Cys Glu Arg Phe Leu Cys 1 5 GTC CTG AGA ATA ATT GGA ACT ACA CTT TTT GGA GTG TCT CTC CTC CTC 579 Val Leu Arg Ile Ile Gly Thr Thr Leu Phe Gly Val Ser Leu Leu Leu 10 15 20 GGA ATC ACA GCT GCT TAT ATT GTT GGC TAC CAG TTT ATC CAA ACA GAT 627 Gly Ile Thr Ala Ala Tyr Ile Val Gly Tyr Gln Phe Ile Gln Thr Asp 25 30 35 40 Asn Tyr Tyr Phe Ser Phe Gly Leu Tyr Gly Ala Phe Leu Ala Ser His 45 50 55 CTC ATC ATC CAA AGC CTC TTT GCC TTT TTG GAA CAC CGG AAA ATG AAG 723 Leu Ile Ile Gln Ser Leu Phe Ala Phe Leu Glu His Arg Lys Met Lys 60 65 70 AAG TCC CTT GAA ACC CCG ATT AAA TTG AAC AAA ACG GTA GCA CTC TGC 771 Lys Ser Leu Glu Thr Pro Ile Lys Leu Asn Lys Thr Val Ala Leu Cys 75 80 85 ATC GCT GCG TAC CAA GAG GAC CCT GAC TAC TTA CGG AAA TGT TTG CAA 819 Ile Ala Ala Tyr Gln Glu Asp Pro Asp Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Gln 90 95 100 TCT GTG AAA AGG CTG ACC TAC CCT GGG ATT AAA GTC GTG ATG GTC ATC 867 Ser Val Lys Arg Leu Thr Tyr Pro Gly Ile Lys Val Val Met Val Ile 105 110 115 120 GAT GGG AAC TCA GAC GAC GAC CTT TAC ATG ATG GAC ATA TTC AGC GAA 915 Asp Gly Asn Ser Asp Asp Asp Leu Tyr Met Met Asp Ile Phe Ser Glu 125 130 135 GTT ATG GGC AGG GAC AAA TCG GCC ACG TAC ATC TGG AAG AAC AAC TTT 963 Val Met Gly Arg Asp Lys Ser Ala Thr Tyr Ile Trp Lys Asn Asn Phe 140 145 150 CAT GAA AAG GGA CCT GGT GAG ACA GAA GAG TCC CAT AAA GAA AGT TCA 1011 His Glu Lys Gly Pro Gly Glu Thr Glu Glu Ser His Lys Glu Ser Ser 155 160 165 CAA CAT GTC ACC CAA TTG GTC TTG TCT AAC AAA AGT ATT TGC ATC ATG 1059 Gln His Val Thr Gln Leu Val Leu Ser Asn Lys Ser Ile Cys Ile Met 170 175 180 CAA AAA TGG GGT GGA AAG AGA GAA GTC ATG TAC ACA GCC TTC AGA GCA 1107 Gln Lys Trp Gly Gly Lys Arg Glu Val Met Tyr Thr Ala Phe Arg Ala 185 190 195 200 CTG GGG CGA AGC GTG GAT TAT GTA CAG GTG TGT GAC TCA GAT ACT ATG 1155 Leu Gly Arg Ser Val Asp Tyr Val Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Met 205 210 215 CTT GAC CCT GCC TCA TCT GTG GAG ATG GTG AAG GTC TTA GAG GAA GAC 1203 Leu Asp Pro Ala Ser Ser Val Glu Met Val Lys Val Leu Glu Glu Asp 220 225 230 CCT ATG GTT GGA GGT GTT GGA GGA GAT GTC CAG ATT TTA AAC AAG TAT 1251 Pro Met Val Gly Gly Val Gly Gly Asp Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr 235 240 245 GAT TCC TGG ATC TCC TTC CTC AGC AGC GTG AGA TAC TGG ATG GCT TTT 1299 Asp Ser Trp Ile Ser Phe Leu Ser Ser Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe 250 255 260 AAT ATA GAA AGG GCC TGC CAG TCT TAT TTT GGC TGT GTC CAG TGC ATA 1347 Asn Ile Glu Arg Ala Cys Gln Ser Tyr Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile 265 270 275 280 AGC GGT CCT CTG GGA ATG TAC AGA AAC TCC TTG CTG CAT GAA TTT GTG 1395 Ser Gly Pro Leu Gly Met Tyr Arg Asn Ser Leu Leu His Glu Phe Val 285 290 295 GAA GAC TGG TAC AAT CAG GAA TTC ATG GGT AAC CAA TGC AGT TTT GGT 1443 Glu Asp Trp Tyr Asn Gln Glu Phe Met Gly Asn Gln Cys Ser Phe Gly 300 305 310 GAC GAC AGG CAC CTT ACC AAC AGG GTG TTG AGT CTG GGC TAT GCA ACT 1491 Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg Val Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Thr 315 320 325 AAA TAC ACG GCT CGG TCC AAG TGC CTT ACT GAA ACT CCC ATA GAA TAT 1539 Lys Tyr Thr Ala Arg Ser Lys Cys Leu Thr Glu Thr Pro Ile Glu Tyr 330 335 340 CTG AGA TGG CTG AAC CAG CAG ACC CGT TGG AGC AAG TCC TAC TTC CGA 1587 Leu Arg Trp Leu Asn Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg 345 350 355 360 GAG TGG CTG TAC AAT GCC ATG TGG TTT CAC AAG CAT CAC CTG TGG ATG 1635 Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Met Trp Phe His Lys His His Leu Trp Met 365 370 375 ACC TAT GAA GCT GTT ATC ACT GGA TTC TTT CCT TTC TTT CTC ATT GCC 1683 Thr Tyr Glu Ala Val Ile Thr Gly Phe Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala 380 385 390 ACA GTC ATC CAG CTC TTC TAC AGG GGT AAA ATC TGG AAC ATC CTC CTC 1731 Thr Val Ile Gln Leu Phe Tyr Arg Gly Lys Ile Trp Asn Ile Leu Leu 395 400 405 TTC CTG TTA ACT GTC CAG CTA GTG GGT CTC ATC AAG TCA TCT TTT GCC 1779 Phe Leu Leu Thr Val Gln Leu Val Gly Leu Ile Lys Ser Ser Phe Ala 410 415 420 AGC TGC CTT AGA GGA AAT ATC GTC ATG GTA TTC ATG TCT CTG TAT TCA 1827 Ser Cys Leu Arg Gly Asn Ile Val Met Val Phe Met Ser Leu Tyr Ser 425 430 435 440 GTG TTA TAC ATG TCA AGT CTA CTT CCT GCC AAG ATG TTT GCA ATT GCA 1875 Val Leu Tyr Met Ser Ser Leu Leu Pro Ala Lys Met Phe Ala Ile Ala 445 450 455 ACC ATA AAC AAA GCT GGG TGG GGC ACA TCT GGA AGG AAG ACC ATT GTT 1923 Thr Ile Asn Lys Ala Gly Trp Gly Thr Ser Gly Arg Lys Thr Ile Val 460 465 470 GTT AAT TTC ATA GGA CTT ATT CCA GTG TCC GTG TGG TTT ACA ATC CTT 1971 Val Asn Phe Ile Gly Leu Ile Pro Val Ser Val Trp Phe Thr Ile Leu 475 480 485 CTA GGT GGT GTA ATT TTC ACC ATT TAT AAG GAA TCT AAA AAG CCA TTT 2019 Leu Gly Gly Val Ile Phe Thr Ile Tyr Lys Glu Ser Lys Lys Pro Phe 490 495 500 TCC GAA TCC AAA CAG ACT GTT CTC ATC GTG GGA ACT TTG ATC TAT GCA 2067 Ser Glu Ser Lys Gln Thr Val Leu Ile Val Gly Thr Leu Ile Tyr Ala 505 510 515 520 TGC TAC TGG GTC ATG CTT TTG ACT CTC TAT GTG GTT CTC ATC AAT AAG 2115 Cys Tyr Trp Val Met Leu Leu Thr Leu Tyr Val Val Leu Ile Asn Lys 525 530 535 TGT GGC AGG CGG AAG AAG GGA CAA CAG TAT GAC ATG GTG CTT GAT GTA 2163 Cys Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Met Val Leu Asp Val 540 545 550 TGATGATGTT TGTAGTCACA CCTGGAGACA CACACACACA CACATCACAC ACACACACAC 2223 CTTAGCTCCT CAAGGGGCTA TACAGTATTG TGGCACCGCA CCCTGCCACC ACAGGAGACA 2283 TATCACTGCT GCTGGGACTT GAACAAAGAC ATTCAATGGG GGTTGGTTTC TTTTTTATTC 2343 TGCCAAAGCA AATTGATACA TCAGTGAGAA GAAAGTCCGA TTAAATCTGA CAGTTTTAGG 2403 ACGGTGGGAT GATGTCTTGG CTTATGCACT TTTCCCTTAC TGTGCATCTG CCTGACAGTG 2463 TTTGTTCTAA ATACCTCACT TGCCATGCTT TGTGTGGGTG ATCATGGAAG AAAAGGATTC 2523 TGAAAACTCA AGGGAACGTT CTTTCAACCT ACACATCCTA ACTTATGGAC TCTTTTGATA 2583 GCTGATGATT TTCTTTCTAT TTTTTGTTTT TAAGGAAAAT TGTTCATCTT TACCAAATGA 2643 AATGCCAAAG GAAAGTTGGA AAGCCACTGG CTATGCTGTA TTTTGATATA ATAATTGTAC 2703 TGTGTTTTAA ATTTTGTATC CGGATTTTTA AAAACAAAAT TTCACACCAT AGTCTATATT 2763 TTACTTCTCT GGCAAAATAC ACTTTTGTTC TTTTATATAT ATATATATAT ATATATAATA 2823 AAATAGGTTC TAAAAAAATC CATACTATAA AAAAAAATTA ACCTGCCCAA AATGTGAAAC 2883 GTGGTTGACT GATGTTCATG AAAGAATAAA ATGTTTCTCT CTTTCTCTAC ATTTT 2938

【００７９】配列番号：４配列の長さ：552 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met His Cys Glu Arg Phe Leu Cys Val Leu Arg Ile Ile Gly Thr Thr 1 5 10 15 Leu Phe Gly Val Ser Leu Leu Leu Gly Ile Thr Ala Ala Tyr Ile Val 20 25 30 Gly Tyr Gln Phe Ile Gln Thr Asp Asn Tyr Tyr Phe Ser Phe Gly Leu 35 40 45 Tyr Gly Ala Phe Leu Ala Ser His Leu Ile Ile Gln Ser Leu Phe Ala 50 55 60 Phe Leu Glu His Arg Lys Met Lys Lys Ser Leu Glu Thr Pro Ile Lys 65 70 75 80 Leu Asn Lys Thr Val Ala Leu Cys Ile Ala Ala Tyr Gln Glu Asp Pro 85 90 95 Asp Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Gln Ser Val Lys Arg Leu Thr Tyr Pro 100 105 110 Gly Ile Lys Val Val Met Val Ile Asp Gly Asn Ser Asp Asp Asp Leu 115 120 125 Tyr Met Met Asp Ile Phe Ser Glu Val Met Gly Arg Asp Lys Ser Ala 130 135 140 Thr Tyr Ile Trp Lys Asn Asn Phe His Glu Lys Gly Pro Gly Glu Thr 145 150 155 160 Glu Glu Ser His Lys Glu Ser Ser Gln His Val Thr Gln Leu Val Leu 165 170 175 Ser Asn Lys Ser Ile Cys Ile Met Gln Lys Trp Gly Gly Lys Arg Glu 180 185 190 Val Met Tyr Thr Ala Phe Arg Ala Leu Gly Arg Ser Val Asp Tyr Val 195 200 205 Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Met Leu Asp Pro Ala Ser Ser Val Glu 210 215 220 Met Val Lys Val Leu Glu Glu Asp Pro Met Val Gly Gly Val Gly Gly 225 230 235 240 Asp Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr Asp Ser Trp Ile Ser Phe Leu Ser 245 250 255 Ser Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe Asn Ile Glu Arg Ala Cys Gln Ser 260 265 270 Tyr Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Met Tyr Arg 275 280 285 Asn Ser Leu Leu His Glu Phe Val Glu Asp Trp Tyr Asn Gln Glu Phe 290 295 300 Met Gly Asn Gln Cys Ser Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg 305 310 315 320 Val Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Thr Lys Tyr Thr Ala Arg Ser Lys Cys 325 330 335 Leu Thr Glu Thr Pro Ile Glu Tyr Leu Arg Trp Leu Asn Gln Gln Thr 340 345 350 Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Met Trp 355 360 365 Phe His Lys His His Leu Trp Met Thr Tyr Glu Ala Val Ile Thr Gly 370 375 380 Phe Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Thr Val Ile Gln Leu Phe Tyr Arg 385 390 395 400 Gly Lys Ile Trp Asn Ile Leu Leu Phe Leu Leu Thr Val Gln Leu Val 405 410 415 Gly Leu Ile Lys Ser Ser Phe Ala Ser Cys Leu Arg Gly Asn Ile Val 420 425 430 Met Val Phe Met Ser Leu Tyr Ser Val Leu Tyr Met Ser Ser Leu Leu 435 440 445 Pro Ala Lys Met Phe Ala Ile Ala Thr Ile Asn Lys Ala Gly Trp Gly 450 455 460 Thr Ser Gly Arg Lys Thr Ile Val Val Asn Phe Ile Gly Leu Ile Pro 465 470 475 480 Val Ser Val Trp Phe Thr Ile Leu Leu Gly Gly Val Ile Phe Thr Ile 485 490 495 Tyr Lys Glu Ser Lys Lys Pro Phe Ser Glu Ser Lys Gln Thr Val Leu 500 505 510 Ile Val Gly Thr Leu Ile Tyr Ala Cys Tyr Trp Val Met Leu Leu Thr 515 520 525 Leu Tyr Val Val Leu Ile Asn Lys Cys Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gln 530 535 540 Gln Tyr Asp Met Val Leu Asp Val 545 550

【００８０】配列番号：５配列の長さ：1665 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：マウス組織の種類：胚配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1665 特徴を決定した方法：P 配列 ATG CCG GTG CAG CTG ACT ACA GCC CTG CGT GTG GTG GGC ACC AGT CTG 48 Met Pro Val Gln Leu Thr Thr Ala Leu Arg Val Val Gly Thr Ser Leu 1 5 10 15 TTT GCC CTG GTA GTG CTG GGA GGC ATC CTG GCG GCC TAT GTG ACA GGC 96 Phe Ala Leu Val Val Leu Gly Gly Ile Leu Ala Ala Tyr Val Thr Gly 20 25 30 TAC CAG TTT ATC CAC ACA GAA AAG CAC TAC CTG TCC TTT GGC CTC TAC 144 Tyr Gln Phe Ile His Thr Glu Lys His Tyr Leu Ser Phe Gly Leu Tyr 35 40 45 GGT GCC ATC CTG GGT CTA CAT CTG CTC ATC CAG AGC CTG TTT GCC TTC 192 Gly Ala Ile Leu Gly Leu His Leu Leu Ile Gln Ser Leu Phe Ala Phe 50 55 60 CTG GAG CAC CGT CGA ATG CGC AGG GCA GGG CGC CCC CTC AAG CTG CAC 240 Leu Glu His Arg Arg Met Arg Arg Ala Gly Arg Pro Leu Lys Leu His 65 70 75 80 TGC TCC CAG AGG TCG CGT TCA GTG GCA CTC TGC ATT GCT GCC TAC CAA 288 Cys Ser Gln Arg Ser Arg Ser Val Ala Leu Cys Ile Ala Ala Tyr Gln 85 90 95 GAG GAC CCC GAA TAC CTG CGC AAG TGC CTT CGC TCA GCT CAG CGC ATT 336 Glu Asp Pro Glu Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Arg Ser Ala Gln Arg Ile 100 105 110 GCC TTT CCA AAC CTC AAG GTG GTC ATG GTA GTG GAT GGC AAT CGC CAG 384 Ala Phe Pro Asn Leu Lys Val Val Met Val Val Asp Gly Asn Arg Gln 115 120 125 GAA GAT ACC TAC ATG TTG GAC ATC TTC CAT GAG GTG CTG GGT GGC ACT 432 Glu Asp Thr Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val Leu Gly Gly Thr 130 135 140 GAG CAA GCT GGC TTC TTT GTG TGG CGT AGC AAT TTC CAT GAG GCG GGT 480 Glu Gln Ala Gly Phe Phe Val Trp Arg Ser Asn Phe His Glu Ala Gly 145 150 155 160 GAA GGA GAG ACA GAG GCC AGC CTG CAG GAA GGC ATG GAG CGT GTG CGA 528 Glu Gly Glu Thr Glu Ala Ser Leu Gln Glu Gly Met Glu Arg Val Arg 165 170 175 GCT GTG GTG TGG GCC AGC ACC TTC TCA TGC ATC ATG CAG AAG TGG GGG 576 Ala Val Val Trp Ala Ser Thr Phe Ser Cys Ile Met Gln Lys Trp Gly 180 185 190 GGC AAG CGT GAG GTC ATG TAC ACT GCC TTC AAG GCC CTT GGC AAC TCA 624 Gly Lys Arg Glu Val Met Tyr Thr Ala Phe Lys Ala Leu Gly Asn Ser 195 200 205 GTG GAC TAC ATC CAG GTG TGT GAC TCT GAC ACT GTG CTG GAC CCA GCC 672 Val Asp Tyr Ile Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Val Leu Asp Pro Ala 210 215 220 TGC ACC ATT GAG ATG CTT CGA GTC TTG GAA GAA GAT CCC CAA GTA GGA 720 Cys Thr Ile Glu Met Leu Arg Val Leu Glu Glu Asp Pro Gln Val Gly 225 230 235 240 GGT GTT GGA GGA GAT GTC CAA ATC CTC AAC AAG TAT GAT TCA TGG ATC 768 Gly Val Gly Gly Asp Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr Asp Ser Trp Ile 245 250 255 TCC TTC CTG AGC AGT GTG AGG TAC TGG ATG GCT TTC AAC GTG GAG CGG 816 Ser Phe Leu Ser Ser Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe Asn Val Glu Arg 260 265 270 GCC TGC CAG TCC TAC TTT GGC TGT GTG CAA TGT ATT AGT GGG CCT TTG 864 Ala Cys Gln Ser Tyr Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile Ser Gly Pro Leu 275 280 285 GGC ATG TAC CGC AAC AGC CTC CTT CAG CAG TTC CTG GAG GAT TGG TAC 912 Gly Met Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Gln Gln Phe Leu Glu Asp Trp Tyr 290 295 300 CAT CAG AAG TTC CTA GGC AGC AAG TGC AGC TTT GGG GAT GAT CGG CAC 960 His Gln Lys Phe Leu Gly Ser Lys Cys Ser Phe Gly Asp Asp Arg His 305 310 315 320 CTT ACC AAC CGA GTC CTG AGT CTT GGC TAC CGG ACT AAG TAT ACA GCA 1008 Leu Thr Asn Arg Val Leu Ser Leu Gly Tyr Arg Thr Lys Tyr Thr Ala 325 330 335 CGC TCT AAG TGC CTC ACA GAG ACC CCC ACT AGG TAC CTT CGA TGG CTC 1056 Arg Ser Lys Cys Leu Thr Glu Thr Pro Thr Arg Tyr Leu Arg Trp Leu 340 345 350 AAT CAG CAA ACC CGC TGG AGC AAG TCT TAC TTT CGG GAA TGG CTC TAC 1104 Asn Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr 355 360 365 AAT TCT CTG TGG TTC CAT AAG CAC CAC CTC TGG ATG ACC TAT GAA TCA 1152 Asn Ser Leu Trp Phe His Lys His His Leu Trp Met Thr Tyr Glu Ser 370 375 380 GTG GTC ACA GGT TTC TTC CCA TTC TTC CTC ATT GCT ACA GTC ATA CAA 1200 Val Val Thr Gly Phe Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Thr Val Ile Gln 385 390 395 400 CTT TTC TAC CGT GGC CGC ATC TGG AAC ATT CTC CTC TTC CTG CTA ACA 1248 Leu Phe Tyr Arg Gly Arg Ile Trp Asn Ile Leu Leu Phe Leu Leu Thr 405 410 415 GTG CAG CTG GTG GGC ATT ATC AAG GCT ACC TAT GCC TGC TTC CTT CGA 1296 Val Gln Leu Val Gly Ile Ile Lys Ala Thr Tyr Ala Cys Phe Leu Arg 420 425 430 GGC AAT GCA GAG ATG ATC TTC ATG TCC CTC TAC TCC CTT CTC TAT ATG 1344 Gly Asn Ala Glu Met Ile Phe Met Ser Leu Tyr Ser Leu Leu Tyr Met 435 440 445 TCC AGC CTC TTG CCA GCC AAG ATC TTT GCT ATT GCT ACC ATC AAC AAG 1392 Ser Ser Leu Leu Pro Ala Lys Ile Phe Ala Ile Ala Thr Ile Asn Lys 450 455 460 TCT GGC TGG GGC ACT TCT GGC AGG AAA ACC ATT GTC GTG AAC TTC ATT 1440 Ser Gly Trp Gly Thr Ser Gly Arg Lys Thr Ile Val Val Asn Phe Ile 465 470 475 480 GGC CTA ATC CCC GTG TCC ATC TGG GTG GCA GTT CTT CTA GGG GGG TTA 1488 Gly Leu Ile Pro Val Ser Ile Trp Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Leu 485 490 495 GCC TAC ACA GCT TAT TGC CAG GAC CTG TTC AGT GAG ACC GAG CTA GCC 1536 Ala Tyr Thr Ala Tyr Cys Gln Asp Leu Phe Ser Glu Thr Glu Leu Ala 500 505 510 TTC CTA GTC TCT GGG GCC ATC CTG TAT GGC TGC TAC TGG GTG GCC CTC 1584 Phe Leu Val Ser Gly Ala Ile Leu Tyr Gly Cys Tyr Trp Val Ala Leu 515 520 525 CTC ATG CTG TAT CTG GCC ATT ATT GCC CGG AGG TGT GGG AAG AAG CCA 1632 Leu Met Leu Tyr Leu Ala Ile Ile Ala Arg Arg Cys Gly Lys Lys Pro 530 535 540 GAA CAG TAT AGC CTG GCT TTT GCG GAG GTG TGA 1665 Glu Gln Tyr Ser Leu Ala Phe Ala Glu Val 545 550

【００８１】配列番号：６配列の長さ：554 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Pro Val Gln Leu Thr Thr Ala Leu Arg Val Val Gly Thr Ser Leu 1 5 10 15 Phe Ala Leu Val Val Leu Gly Gly Ile Leu Ala Ala Tyr Val Thr Gly 20 25 30 Tyr Gln Phe Ile His Thr Glu Lys His Tyr Leu Ser Phe Gly Leu Tyr 35 40 45 Gly Ala Ile Leu Gly Leu His Leu Leu Ile Gln Ser Leu Phe Ala Phe 50 55 60 Leu Glu His Arg Arg Met Arg Arg Ala Gly Arg Pro Leu Lys Leu His 65 70 75 80 Cys Ser Gln Arg Ser Arg Ser Val Ala Leu Cys Ile Ala Ala Tyr Gln 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Arg Ser Ala Gln Arg Ile 100 105 110 Ala Phe Pro Asn Leu Lys Val Val Met Val Val Asp Gly Asn Arg Gln 115 120 125 Glu Asp Thr Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val Leu Gly Gly Thr 130 135 140 Glu Gln Ala Gly Phe Phe Val Trp Arg Ser Asn Phe His Glu Ala Gly 145 150 155 160 Glu Gly Glu Thr Glu Ala Ser Leu Gln Glu Gly Met Glu Arg Val Arg 165 170 175 Ala Val Val Trp Ala Ser Thr Phe Ser Cys Ile Met Gln Lys Trp Gly 180 185 190 Gly Lys Arg Glu Val Met Tyr Thr Ala Phe Lys Ala Leu Gly Asn Ser 195 200 205 Val Asp Tyr Ile Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Val Leu Asp Pro Ala 210 215 220 Cys Thr Ile Glu Met Leu Arg Val Leu Glu Glu Asp Pro Gln Val Gly 225 230 235 240 Gly Val Gly Gly Asp Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr Asp Ser Trp Ile 245 250 255 Ser Phe Leu Ser Ser Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe Asn Val Glu Arg 260 265 270 Ala Cys Gln Ser Tyr Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile Ser Gly Pro Leu 275 280 285 Gly Met Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Gln Gln Phe Leu Glu Asp Trp Tyr 290 295 300 His Gln Lys Phe Leu Gly Ser Lys Cys Ser Phe Gly Asp Asp Arg His 305 310 315 320 Leu Thr Asn Arg Val Leu Ser Leu Gly Tyr Arg Thr Lys Tyr Thr Ala 325 330 335 Arg Ser Lys Cys Leu Thr Glu Thr Pro Thr Arg Tyr Leu Arg Trp Leu 340 345 350 Asn Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr 355 360 365 Asn Ser Leu Trp Phe His Lys His His Leu Trp Met Thr Tyr Glu Ser 370 375 380 Val Val Thr Gly Phe Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Thr Val Ile Gln 385 390 395 400 Leu Phe Tyr Arg Gly Arg Ile Trp Asn Ile Leu Leu Phe Leu Leu Thr 405 410 415 Val Gln Leu Val Gly Ile Ile Lys Ala Thr Tyr Ala Cys Phe Leu Arg 420 425 430 Gly Asn Ala Glu Met Ile Phe Met Ser Leu Tyr Ser Leu Leu Tyr Met 435 440 445 Ser Ser Leu Leu Pro Ala Lys Ile Phe Ala Ile Ala Thr Ile Asn Lys 450 455 460 Ser Gly Trp Gly Thr Ser Gly Arg Lys Thr Ile Val Val Asn Phe Ile 465 470 475 480 Gly Leu Ile Pro Val Ser Ile Trp Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Leu 485 490 495 Ala Tyr Thr Ala Tyr Cys Gln Asp Leu Phe Ser Glu Thr Glu Leu Ala 500 505 510 Phe Leu Val Ser Gly Ala Ile Leu Tyr Gly Cys Tyr Trp Val Ala Leu 515 520 525 Leu Met Leu Tyr Leu Ala Ile Ile Ala Arg Arg Cys Gly Lys Lys Pro 530 535 540 Glu Gln Tyr Ser Leu Ala Phe Ala Glu Val 545 550

【００８２】配列番号：７配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asp Asp Gln Arg Trp 1 5

【００８３】配列番号：８配列の長さ：34 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GATAGATCTG AGACAGGACA TGCCAAAGCC CTCA 34

【００８４】配列番号：９配列の長さ：24 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CACGCACCTG CGTGTTCTCA CCAG 24

【００８５】配列番号：１０配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Gln Asp Met Pro Lys Pro Ser 1 5

【００８６】配列番号：１１配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Leu Val Arg Thr Arg Arg Cys Val 1 5

【００８７】配列番号：１２配列の長さ：34 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GATAGATCTG CATTGTGAGA GGTTTCTATG TGTC 34

【００８８】配列番号：１３配列の長さ：35 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GACCCGGGTC ATACATCAAG CACCATGTCA TACTG 35

【００８９】配列番号：１４配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 His Cys Glu Arg Phe Leu Cys Val 1 5

【００９０】配列番号：１５配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gln Tyr Asp Met Val Leu Asp Val 1 5

【００９１】配列番号：１６配列の長さ：33 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCGAATTCAC CGGTGCAGCT GACTACAGCC CTG 33

【００９２】配列番号：１７配列の長さ：28 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCGAATTCTC ACACCGCAAA AGCCAGGC 28

【００９３】配列番号：１８配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Pro Val Gln Leu Thr Thr Ala Leu 1 5

【００９４】配列番号：１９配列の長さ：６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Leu Ala Phe Ala Glu Val1 5

【００９５】配列番号：２０配列の長さ：25 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTCTGTGCC ACTAGGTGTG CGCTG 25

【００９６】配列番号：２１配列の長さ：26 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTGTGTACA TGACCTCACG TTTGCC 26

【００９７】配列番号：２２配列の長さ：23 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTCTTCGCTT ACCTGGAGCA CCG 23

【００９８】配列番号：２３配列の長さ：26 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTCATAGGTC ATCCATGCGT GGTGGC 26

【００９９】配列番号：２４配列の長さ：26 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTTCAAGGCA CTGGGCGACT CCGTGG 26

【０１００】配列番号：２５配列の長さ：36 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CGGAATTCAG CGCTGTGGTC TCGGGCCTCT TCCCTTT 36

【０１０１】配列番号：２６配列の長さ：34 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GATAGATCTG CATTGTGAGA GGTTTCTATG TGTC 34

【０１０２】配列番号：２７配列の長さ：24 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTCCGTACA GTCCAAATGA GAAG 24

【０１０３】配列番号：２８配列の長さ：26 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTGTGTACA TGACTTCTCT CTTTCC 26

【０１０４】配列番号：２９配列の長さ：26 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTTTTTAGCC TCGCATCTCA TCATCC 26

【０１０５】配列番号：３０配列の長さ：265 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTCATAGGTC ATCCACAGGT GATGCT 26

【０１０６】配列番号：３１配列の長さ：26 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTTCAGAGCA CTGGGGCGAA GCGTGG 26

【０１０７】配列番号：３２配列の長さ：37 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CGGAATTCAG CGCTGTTATC ACTGGATTCT TTCCTTT 37

【０１０８】配列番号：３３配列の長さ：26 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTGTTTGCCT TCCTGGAGCA CCGTCG 26

【０１０９】配列番号：３４配列の長さ：25 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTCATAGGTC ATCCAGAGGT GGTGC 25

【０１１０】配列番号：３５配列の長さ：26 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTTCAAGGCC CTTGGCAACT CAGTGG 26

【０１１１】配列番号：３６配列の長さ：24 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TATTAGGACA AGGCTGGTGG GCAC 24

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＡＳタンパク質構造と膜局在を示す模式
図。

【図２】ＨＡＳキメラタンパク質（Chim1〜16）の構
造を示す模式図。

【図３】ＨＡＳキメラタンパク質（Chim17〜20）の構
造を示す模式図。矢印は、Ｂ領域間で置換されているフ
ラグメントの両端を表す。

【図４】変異型ＨＡＳタンパク質中の変異の位置を示
す図。

【図５】キメラタンパク質Ｃｈｉｍ１〜Ｃｈｉｍ１６
のＨＡＳ活性を示すグラフ図。「ｍｏｃｋ」は、ブラン
クを表す。

【図６】キメラタンパク質Ｃｈｉｍ１７〜Ｃｈｉｍ２
０及び変異型ＨＡＳタンパク質のＨＡＳ活性を示すグラ
フ図。「ｍｏｃｋ」は、ブランクを表す。

【図７】変異型ＨＡＳ１により合成されたＨＡの電気
泳動の結果を示すオートラジオグラム。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 BA07 BA12 CA04 DA02 EA04 GA14 HA01 4B050 CC04 DD07 LL01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】連続する３つの領域（Ｎ末端領域、内部
領域およびＣ末端領域）からなり、配列番号２、配列番
号４及び配列番号６に示すアミノ酸配列を有する３種の
ヒアルロン酸合成酵素タンパク質から選ばれる１種のタ
ンパク質の前記３つの領域のうち１つ又は２つの領域
を、残りの１種又は２種のヒアルロン酸合成酵素タンパ
ク質の前記１つ又は２つの領域に相当する領域で置換さ
れた組換えタンパク質。
【請求項２】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有する請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜７１で示さ
れるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号５２〜３７９で
示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。
【請求項３】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜７１で示さ
れるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号５１〜３８３で
示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。
【請求項４】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜５１で示さ
れるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号７１〜４０９で
示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。
【請求項５】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜５１で示さ
れるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号５１〜３８３で
示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。
【請求項６】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号１９８〜３７９
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。
【請求項７】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２０１〜３８３
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。
【請求項８】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号２２８〜４０９
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。
【請求項９】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端
領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ
酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２０１〜３８３
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。
【請求項１０】前記Ｎ末端領域および内部領域、並び
にＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示され
るアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０９で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。
【請求項１１】前記Ｎ末端領域、並びに内部領域およ
びＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示され
るアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号２２８〜５８３
で示されるアミノ酸配列。
【請求項１２】前記Ｎ末端領域および内部領域、並び
にＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示され
るアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜３７９で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３
で示されるアミノ酸配列。
【請求項１３】前記Ｎ末端領域、並びに内部領域およ
びＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示され
るアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２７で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号１９８〜５５２
で示されるアミノ酸配列。列。
【請求項１４】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末
端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミ
ノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜２７５で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２８０〜３８３
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。
【請求項１５】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末
端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミ
ノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９６で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２０１〜２７９
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号２７６〜５５２
で示されるアミノ酸配列。
【請求項１６】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末
端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミ
ノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜３１８で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号３２３〜３８３
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２
で示されるアミノ酸配列。
【請求項１７】前記Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末
端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミ
ノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜２７５で示
されるアミノ酸配列。（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２８０〜３２２
で示されるアミノ酸配列。（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３１９〜５５２
で示されるアミノ酸配列。
【請求項１８】請求項１〜１７のいずれか１項記載の
タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１９】配列番号２で示されるアミノ酸配列を
有するタンパク質において、２４２位のアスパラギン酸
のグルタミン酸への置換、３３７位のスレオニンからセ
リンへの置換、３３８位のヒスチジンからリジンへの置
換、３４４位のアスパラギン酸のグルタミン酸への置
換、３８０位のグルタミンのアスパラギンへの置換、３
８３位のアルギニンのリジンへの置換、３８４位のトリ
プトファンのチロシンへの置換から選ばれるアミノ酸置
換を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２０】前記アミノ酸置換が、２４２位のアス
パラギン酸のグルタミン酸への置換、３４４位のアスパ
ラギン酸のグルタミン酸への置換、３８０位のグルタミ
ンのアスパラギンへの置換、３８３位のアルギニンのリ
ジンへの置換、３８４位のトリプトファンのチロシンへ
の置換から選ばれる請求項１９記載のタンパク質。
【請求項２１】前記アミノ酸置換が、３３７位のスレ
オニンのセリンへの置換、並びに３３７位のスレニオン
のセリンへの置換及び３３８位のヒスチジンのリジンへ
の置換から選ばれる請求項１９記載のタンパク質。
【請求項２２】請求項１９〜２１のいずれか一項に記
載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】配列番号６で示されるアミノ酸配列を
有するタンパク質において、２９７位のグルタミンのヒ
スチジンへの置換、２９８位のグルタミンのグルタミン
酸への置換、３００位のロイシンのバリンへの置換、３
０５位のヒスチジンのアスパラギンへの置換、３０７位
のリジンのグルタミン酸への置換、３０９位のロイシン
のメチオニンへの置換、３１１位のセリンのアスパラギ
ンへの置換、３１２位のリジンのグルタミンへの置換か
ら選ばれるアミノ酸置換を有することを特徴とするタン
パク質。
【請求項２４】前記アミノ酸置換が、２９７位のグル
タミンのヒスチジンへの置換、２９８位のグルタミンの
グルタミン酸への置換、３０７位のリジンのグルタミン
酸への置換、３１２位のリジンのグルタミンへの置換か
ら選ばれる請求項２３記載のタンパク質。
【請求項２５】請求項２３又は２４に記載のタンパク
質をコードするＤＮＡ。
【請求項２６】配列番号４で示されるアミノ酸配列を
有するタンパク質において、２９３位のヒスチジンのグ
ルタミンへの置換及び２９４位のグルタミン酸のグルタ
ミンへの置換を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２７】配列番号４で示されるアミノ酸配列を
有するタンパク質において、２９３位のヒスチジンのグ
ルタミンへの置換、２９４位のグルタミン酸のグルタミ
ンへの置換、及び３０３位のグルタミン酸のリジンへの
置換を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２８】配列番号４で示されるアミノ酸配列を
有するタンパク質において、２９３位のヒスチジンのグ
ルタミンへの置換、２９４位のグルタミン酸のグルタミ
ンへの置換、３０３位のグルタミン酸のリジンへの置
換、３０７位のアスパラギンのセリンへの置換、及び３
０８位のグルタミンからリジンへの置換を有することを
特徴とするタンパク質。
【請求項２９】請求項２６〜２８のいずれか一項に記
載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３０】ヒアルロン酸合成酵素タンパク質の研
究用キットであって、請求項１〜１７、１９、２０、２
１、２３、２４及び２６〜２８に記載のタンパク質を含
むキット。