JP2000201699A - 生体高分子における変異の同定法 - Google Patents

生体高分子における変異の同定法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 染色体ＤＮＡにおける変異の同定のための新
規かつ改良された方法の提供。 【解決手段】 本発明は、異なる２セット以上のそれぞ
れ標識された検出分子を用いて、生体高分子、特に染色
体ＤＮＡ、における変異を同定する方法、ならびにこれ
らの変異を検出するための診断用キットに関する。本発
明による方法およびキットによれば、ヒトの染色体異常
を検出できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、異なる２セット以上のそれぞれ標識された(m
arked or labelled)検出分子を用いて、生体高分子、特
に染色体ＤＮＡにおける変異を同定する方法、ならびに
これらの変異を検出するための診断用キットに関する。
【０００２】背景技術 現在まで、ヒト染色体の表示は、明・暗バンドを用いて
染色体の特定の認識が可能なバンド方法を用いて行われ
てきた（例えば「Ｇバンド法、Ｑバンド法、Ｒバンド
法」）。これらのバンド法はCaspersson et al.,(Exp.
Cell Res. 60, 1970, 315-319), Sumner et al. (Natur
e 232, 1971, 31), Seabright et al. (Lancet 2, 197
1, 971-972)およびDutrillaux et al. (C R Acad. Sc
i., Paris, 272, 1971, 3638-3640)により開発された方
法に基づいている。しかしながら、総ての染色体の総て
のバンドが明または暗のいずれかでしか現れないので、
これらの方法のいずれの例においても個々の染色体バン
ドの同一性を決定することはできない。染色体は細胞間
および組織間で形態学的に非常に異なる可能性があり、
また、おそらく転座を含んでおり（例えば腫瘍の場
合）、検査される患者にとってその識別が特に重要であ
るために、このことは重大な欠点となる。これは例えば
一方の親における平衡転座（それぞれ「乗換え」または
「染色体の一部の交換」）の症例における子供を持ちた
いという欲求の実現、子供における精神遅滞を伴うまた
は伴わない先天異常の原因の認識、および白血病の診断
およびしばしば診断上、また治療上重要な特定の染色体
変異を示す他の腫瘍の診断にあてはまる。
【０００３】この問題を解決するための提案として、Pi
nkel et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, 2
934-2938)により、蛍光in-situハイブリダイゼーション
法(FISH)が慣例法としては初めて実施可能な形で記載さ
れた。今日、染色体特異的ＤＮＡライブラリー（染色体
彩色、24色FISH、Schrock et al., Science 273, 1996,
496-497；Speicher et al., Nature Genet. 12, 1996,
368-375)を用いることにより、さらには種々の量のヒ
トＤＮＡを含有するができ、FISHによる多色技術を通し
て特定の染色体領域の保全性を再確認することが可能と
なる、例えばコスミド、pacsまたはYACsのようなベクタ
ーの使用により、この方法で、総ての分裂中期のヒト染
色体を種々の色で表示することが可能となる。また、遺
伝子の一部および反復ＤＮＡエレメントも、それらの染
色体の局在化、ならびにそれらの存在または不在のそれ
ぞれに関して、この方法を用いて同定できる。しかしな
がら、バンドレベルでの染色体部位の（多色）表示は今
のところ不可能である。
【０００４】
【発明の概要】このように、本発明の基調をなす課題
は、その方法がバンドレベルでの多色表示を可能にす
る、特に染色体ＤＮＡにおける変異の同定のための新
規、かつ改良された方法を提供することである。
【０００５】この課題は請求の範囲において特徴づけら
れる本発明の具体例によって解決される。
【０００６】特に、異なる２セット以上の標識された検
出分子を用いて、標的分子としての生体高分子における
変異を同定する方法であって、少なくとも２セットが標
的分子中のある領域に特異的であり、かつ、標的分子中
のある領域に特異的なこれらのセットの特定の検出分子
の標識(markings or labellings)がそれぞれ異なり、
(a)少なくとも２セットの特定の標識された検出分子
が、その検出分子の異なる標識が重複するように標的分
子中のある領域に結合することを特徴とする、異なるセ
ットの検出分子間ならびに標的分子間の結合反応を行
い、(b)この検出分子の異なる標識を介する方法で得ら
れた結合を定性および定量評価する工程を含んでなる方
法が提供される。
【０００７】
【発明の具体的説明】「標的分子としての生体高分子」
とは、ＤＮＡ、好ましくは染色体ＤＮＡ、ＲＮＡまたは
ポリペプチドを意味する。この標的分子は、本発明の方
法を行う前、特に工程(a)の前に、例えば適切なマトリ
ックス中におけるゲル電気泳動による分離、もしくは例
えば適切な担体上に分裂中期の染色体または分裂間期の
核をそれぞれ固定または配合することにより、適切にそ
れぞれ固定化または配合されてよい。
【０００８】「標識された検出分子」とは、少なくとも
１つの標識を有する核酸または抗体を意味する。この抗
体はポリクローナル抗体として提供されてもよいし、ま
たはモノクローナル抗体として提供されてもよい。「核
酸」および「核酸配列」および「核酸プローブ」とは、
それぞれ、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリ
ボヌクレオチドおよび／またはアミノヌクレオチドまた
は[α-S]-トリホスフェートヌクレオチドのような修飾
ヌクレオチドの天然、半合成または修飾核酸分子を意味
する。本発明の好ましい具体例では、核酸は、例えばホ
モ・サピエンス・サピエンスのような哺乳類由来の染色
体ＤＮＡから生ずる。検出分子としてのこの染色体ＤＮ
Ａは、ベクター、例えばコスミドまたはYAC中に存在す
るか、もしくは例えば顕微解剖法またはレーザー活性化
フローサイトメトリーによる特定の染色体の分類、そし
て必要に応じ、それに続く例えばDOP-PCRによる増幅に
より得ることができる染色体または染色体領域特異的Ｄ
ＮＡライブラリーから生ずる。
【０００９】「標識」という用語は、検出分子に導入さ
れているか、またはそれらに結合している適切な、直接
的または間接的に検出可能な原子または分子を意味す
る。適切な標識とは、例えばヌクレオチドに結合する蛍
光色素および／または例えばビオチンおよび／またはジ
ゴキシゲニンおよび／または放射性同位元素で標識され
たヌクレオチドからなるものである。好ましい具体例で
は、標識化合物は、例えばクマリンおよびローダミンの
ような発光スペクトルの蛍光挙動、および／または例え
ば蛍光イソチオシアネートおよびユーロピウムキレート
標識および／またはポルフィリン標識アビジンのような
蛍光寿命における、微量の物質の選択に十分な差異を有
する蛍光色素である。
【００１０】「結合反応」という用語は、検出分子およ
び／または標的分子の選択による、ハイブリダイゼーシ
ョン、好ましくはin-situハイブリダイゼーションまた
は抗原／抗体反応を意味する。「in-situハイブリダイ
ゼーション」とは、検出分子としての検出のための生物
学的、物理学的または化学的標識を備えた合成より製造
されたＤＮＡ／ＲＮＡ分子を自然に生じる天然のＤＮＡ
／ＲＮＡ配列に付加することを意味し、このような付加
は適切な核酸の変性および復元により達成される。もち
ろん、これらＤＮＡ／ＲＮＡプローブは染色体のような
標的分子のＤＮＡ／ＲＮＡ配列とハイブリダイズする能
力を有する少なくとも１つの配列部分を含有する。この
配列部分は、特異的な、検出分子に個々に存在する配列
領域を含んでなり、その領域は好ましくは100〜1,000塩
基対の長さであり、好ましくは50℃以下の適切な温度
で、好ましくは50〜300mmol/lの一価のイオンおよび0〜
10mmol/lの二価のイオンを含有する適切な塩濃度におい
て水素結合が形成される下で、標的分子の相補領域に付
加される。標識された検出分子の特定のセットの結合反
応は同時に行ってもよいし、順次行ってもよい。
【００１１】「検出分子のセット」という表現は、標的
分子のある領域に特異的な検出分子を意味する。この検
出分子のセットは、例えばベクターに存在する染色体Ｄ
ＮＡであってもよいし、染色体特異的ＤＮＡライブラリ
ーであってもよい。このセット中の検出分子の標識は同
じであっても異なっていてもよく、例えば3個の異なる
標識であってもよい。
【００１２】「少なくとも異なる２以上のセットの標識
された検出分子」という表現は、少なくとも一対の異な
るセットの存在を意味し、この対のセットがそれぞれ標
的分子のある部分または領域に、少なくとも特定の検出
分子の異なる標識、好ましくはこれらの異なるセットの
特定の検出分子の結合部位が重複するように結合する。
本発明によれば、一対の異なるセットのこの特性は、標
的分子のこのある領域から重複する様式でそれぞれ製造
される、または得られる一対の異なるセットの特定の検
出分子をそれぞれ標準として、または患者由来の適切に
処理された標本との比較試験のために使用できることを
意味する。本発明の具体例では、最良の検出分子は、ハ
イブリダイゼーションの後に検出分子が、好ましくはガ
ウス分布に従う連続的に変化する濃度中で、標的分子、
例えば染色体に対して縦方向に結合するように設計する
ことが好ましい。
【００１３】検出分子の異なる標識により工程(a)で得
られた結合の定性および定量評価は、本発明の方法の工
程(b)において特徴付けられる。この定性および定量評
価は、それぞれ走査装置または方向性走査装置、例え
ば、試験する染色体に沿ってまたは染色体の縦方向への
走査装置、を用いることにより使用してよい。かかる走
査装置には、例えば蛍光顕微鏡が挙げられる。画像形成
シグナルは、例えばCCDカメラなどの画像処理装置を介
して、所望の標的分子に付加された検出分子の物理的お
よび／または化学的および／または生物学的標識を介し
て走査装置により取り込むことができ、この画像処理装
置がコンピューターにより支援される適当な方法で、異
なる標識の個々のシグナルを処理する。特定の検出分子
の重複する、また重複しない（non-overlapping）標識
の領域における異なる標識のそれぞれ強度または強度比
は、特に固定された分裂中期染色体の標的分子の好まし
くは縦方向において、走査装置と連結された画像処理装
置を用いて記録し、定性および定量評価を行うことがで
きる。
【００１４】本発明のさらなる主題は、前記の定義に従
い標的分子として少なくとも異なる２セットの標識され
た検出分子を含有する、前記で定義した生体高分子にお
ける変異の同定のための診断用キットにより構成され
る。
【００１５】特に、本発明のこのキットは、ヒト遺伝学
における染色体異常のそれぞれ同定または排除のために
使用することができる。染色体異常としては、例えば、
先天異常および／または精神遅滞の原因としての均衡
（balanced）および非均衡（unbalanced）染色体変異の
ような変異の保因者（carrier）である場合にも子供を
持ちたい欲求を実現するために、あるいは固形腫瘍なら
びに血液学的新形成(AML、ALL、MDS、その他)の腫瘍の
診断において、一方では予後に関連する公知の変化の検
出のために、他方ではさらなる、従前に知られていない
変化を検出するために、非常に重要であると知られてい
る均衡染色体再配列（balanced chromosome rearrangem
ents）が挙げられる。
【００１６】本発明のさらなる主題は、限局性ＤＮＡプ
ローブを加えることによる自動補正に関する。
【００１７】多色バンド法のために使用される標本のよ
うな種々の蛍光色素で標識された染色体領域特異的標本
を記録する場合、特殊蛍光フィルターと組み合わせたモ
ノクロCCDカメラを使用する。個々の蛍光色素のシグナ
ルは連続的に個々の画像として記録され、同時にカラー
画像に結びつけられる。フィルターの光学的影響（種々
のウェッジ・エラー(wedge errors)、光路のわずかな傾
斜による平行移動）のために相互に関連する個々の画像
の位置の移動は、これによっては排除できない。ほとん
どの部分と重複しているプローブは、それに続く重ね合
わせに使用できる共通の構造を持っていないので、例え
ば個々の画像の相関性による相互補正または自動補正
は、要求される精度では不可能である。総てのわずかな
移動により、結果としてバンドパターンにおける人工産
物の強度比の評価することになる。
【００１８】本発明の方法に使用される総ての蛍光色素
を用いて同時に標識された限局性ＤＮＡプローブを加え
ることにより、自動補正が可能となる。個々の画像総て
において同一の構造は、それに加え、自動的位置補正の
ために利用可能である。この位置補正は、例えばそれぞ
れの個々の画像におけるプローブの強度の中央の測定を
通じ、続いて、個々の画像の中央が同じ位置に位置する
よう持ってくるような方法で個々の画像を相対移動させ
ることにより行えばよい。
【００１９】また、２種の異なるプローブを用いること
により、相互に関連する画像のひずみを測定し、補正す
ることもできる。
【００２０】基本的に、さらに多くのプローブの使用
は、例えば目盛りの変化のような平行移動や回転よりも
より複雑な位置変換の補正を可能にする。
【００２１】さらに、本発明のさらなる好ましい具体例
では、評価される蛍光シグナルの強度の標準化に役立ち
得る既知の強度の校正プローブ（ＤＮＡプローブまたは
蛍光粒子）を加えることが有利であり得る。
【００２２】さらに、本発明のさらなる好ましい具体例
では、そのゲノム内の正確な位置が知られており、しか
も、カラーバンドとISCNバンドの間の関係を確立するた
めに使用することができるＤＮＡプローブを加えること
が有利であり得る。
【００２３】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。
【００２４】第5染色体の多色バンドパターンのために
合計7つの重複する染色体領域特異的顕微解剖ライブラ
リーを作製した(Meltzer et al., Nature Genet. 1, 19
92, 24-25)。このために第5染色体のp腕を2つの領域
に、q腕を4つの領域に再分し、顕微鏡下、顕微鏡スライ
ドから、精巧に引き抜かれたガラス針を用いて染色体領
域あたり8〜10個の断片を単離した(Senger et al., Hu
m. Genet. 84, 1990, 507-511)。このようにして得られ
たＤＮＡをDOP-PCR（変性オリゴヌクレオチドポリメラ
ーゼ鎖反応、Telenius et al., Genomics 13, 1992, 71
8-725; Zhang et al.,Blood 81, 1993, 3365-3371)によ
り増幅した。続いて起こる反応では、これらの染色体領
域特異的ＤＮＡライブラリーをヌクレオチドに結合して
存在している蛍光色素により部分的に直接標識した（例
えば、Spectrum Orange-dUTP、Spectrum Green-dUTP、V
ysisおよびTexas Red-dUTPの双方、Molecular Probe)。
その他の部分においては、ＤＮＡライブラリーをハプテ
ンに結合させたヌクレオチドで標識した（例えば、ビオ
チン-dUTPおよびジゴキシゲニン-dUTP、Boehringer, Ma
nnheim）。ハイブリダイゼーションが起こった後、ハプ
テンは適切な検出試薬（例えば、アビジン-Cy5, Amersh
am、およびCy5.5, Mab標識キット, Amershamと結合して
いる抗ジゴキシゲニンIgG, Boehringer, Mannheim)を用
いて検出できる。
【００２５】ハイブリダイゼーション、洗浄工程および
検出は、標準プロトコールに従って行う(Senger et a
l., Cytogenet. Cell Genet. 54, 1993, 49-53)。
【００２６】解析は、例えば適切なフィルターセットを
備えた蛍光顕微鏡を用いて行う。分離画像は、各色チャ
ンネルについて取り込み、この画像は引き続いてコンピ
ューターを用いて処理することができる。
【００２７】境界領域において連続的に弱まる蛍光シグ
ナルは、顕微解剖により得られた部分的「彩色」プロー
ブ特有の特性である。プローブの、および、それゆえの
2つの隣接する部分的「彩色」プローブの蛍光シグナル
の同時重複により、第5染色体に沿った蛍光強度比率の
連続的変化が起こる。このような方法で染色された染色
体がいくつかの(20〜25)小さな断片に再分された場合、
使用された総ての蛍光色素の相対蛍光強度に基づく適切
なコンピュータープログラムを通じて、誤った着色がこ
れらの断片の各々に割り当てられる可能性がある。この
割り当て（assignment）が、染色体、この場合第5染色
体に沿った彩色バンドパターンをもたらす。蛍光相関お
よび誤った色の同じ組み合わせを、同じ標本セットを用
いるさらなるあらゆるハイブリダイゼーションのために
用いることができる。
【００２８】ハイブリダイゼーションは十分に普遍的な
様式で挙動するので、バンドパターンもまた相応して再
現性を持つ(図3)。従来の慣例バンド法（例えばGTGバン
ド法）から知られているように、より短い染色体の場合
における解像力の低下は、この場合には認められない。
第5染色体については少なくとも25バンドの再現性ある
パターンが得られる。これは半数性染色体セットあたり
約550バンドのバンドレベルに相当する。
【００２９】この方法を用いることにより、その縮合状
態に関係なく染色体における変異を同定することが可能
となる。これは、特に腫瘍細胞遺伝学においてもまた重
要である。腫瘍染色体ではしばしばバンドパターンの解
像度が低く、このことは染色体変異の認識を非常に困難
にしている。それゆえに、おそらく重要な予後因子を表
す、これまでには知られていない細胞遺伝学的変異が腫
瘍中に存在すると推定され、それゆえに例えばリスク適
応療法のために重要となり得る。本発明によれば、前記
で詳述した(図5)第5染色体の標本セットを用いたハイブ
リダイゼーションの後に、腫瘍染色体においてでさえも
少なくとも25個のバンドを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図1は、第5染色体における領域特異的彩色の位
置の定性および定量評価のための写真表示である。この
図の上部には、染色体の縦方向において標識された検出
分子の分布ならびに検出分子の異なる標識の強度がグラ
フで示されている。
【図２】図2は、図1で示された第5染色体の領域特異的
染色体部分の標識パターンを表で示したものである。Cy
5、TR(Texas Red)、Cy5.5、SO(Spectrum Orange)、SG(S
pectrum Green)は、個々の領域特異的ＤＮＡライブラリ
ーを標識するために用いられた種々の蛍光色素である。
割り当ては黒四角で示している。相当する領域における
ＤＮＡライブラリーの重複の結果生じた標識は白四角で
表す。
【図３】図3は多色バンドによる、２種の異なる分裂中
期プレートに由来するそれぞれの相同正常第5染色体を
示している。この図によると、バンドパターンは相同染
色体上では同一であり、分裂中期プレートの間で再現性
があることさえ明らかである。
【図４】図4は、複雑な染色体異常を有する分裂中期プ
レートの多色FISHの写真表示を示している。
【図５】図5は、急性骨髄性白血病の症例の第5染色体を
示している。それぞれの正常第5染色体は右側に示し、
左側の染色体は、長腕における間隙の欠失を示してい
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トマス、レオルッヒ ドイツ連邦共和国ライリンゲン、イン、デ ル、ホルツロット、６ (72)発明者 アンドレアス、プレシュ ドイツ連邦共和国シュベッツィンゲン、シ ェルツィッヒウェーク、78 Ｆターム(参考） 4B024 AA12 BA80 CA01 CA09 CA11 DA03 HA11 HA12 HA14 4B063 QA01 QA17 QA19 QQ08 QQ42 QQ52 QQ58 QQ60 QQ79 QQ96 QR32 QR35 QR42 QR48 QR51 QR56 QR66 QR82 QS25 QS34 QX02

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】異なる２以上のセットの標識された検出分
    子を用いて標的分子としての生体高分子における変異を
    同定する方法であって、少なくとも２セットが標的分子
    中のある領域に特異的であり、かつ、標的分子中のある
    領域に特異的な該セットの特定の検出分子の標識が異な
    っており、 (a)少なくとも２セットの特定の標識された検出分子
    が、その特定の検出分子の異なる標識が重複するように
    標的分子のある領域に結合する、異なるセットの検出分
    子間のおよび標的分子間の結合反応を行い、 (b)この検出分子の異なる標識を介する方法で得られた
    結合の定性および定量評価する工程を含んでなる方法。
  2. 【請求項２】工程(a)の前に標的分子が固定化される、
    請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】１つの標的分子または複数の標的分子が担
    体に、または基材に配合される、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】特定のセットの標識された検出分子の結合
    反応を同時にまたは順次に行う、請求項１〜３のいずれ
    か１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】工程(a)の結合反応がハイブリダイゼーシ
    ョンまたは抗原／抗体反応である、請求項１〜４のいず
    れか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】ハイブリダイゼーションがin-situハイブ
    リダイゼーションである、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】標的分子が核酸またはポリペプチドであ
    る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】核酸がＤＮＡおよびＲＮＡから選択され
    る、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】核酸が染色体ＤＮＡである、請求項７また
    は８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】標識された検出分子が核酸または抗体か
    ら選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】特定セットの核酸が異なる染色体領域特
    異的ＤＮＡライブラリーに由来する、請求項１０記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】各セットの検出分子が１以上の異なる標
    識を含む、請求項１０または１１のいずれか１項に記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】標識が蛍光色素を含んでなる、請求項１
    ２記載の方法。
  14. 【請求項１４】特定の検出分子の重複および非重複標識
    の領域における標識の強度または強度比をそれぞれ標的
    分子の縦方向に記録する走査装置を用いて、工程(b)の
    評価を行う、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】請求項のいずれか１項に記載の標識され
    た検出分子の少なくとも異なる２セットを含有する、標
    的分子としての生体高分子における変異を同定するため
    の診断用キット。
  16. 【請求項１６】ヒト遺伝学における、また腫瘍診断にお
    ける染色体異常を同定するための、請求項１５記載のキ
    ットの使用。
  17. 【請求項１７】光学上、引き起こされる蛍光色素の画像
    情報の相対移動を測定するために、あるいはそれらの位
    置補正のために、少なくとも２種のＮ蛍光色素の使用に
    より標識した少なくとも１種のＤＮＡプローブを加え
    る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】総ての蛍光色素を同時に位置補正するた
    めに、総てのＮ使用蛍光色素で標識した少なくとも１種
    のＤＮＡプローブを加える、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】N-1ＤＮＡプローブを各々２種の適切な
    蛍光色素で標識し、次いで位置補正を対で行う、請求項
    １７記載の方法。
  20. 【請求項２０】十分な数のＤＮＡプローブを用いること
    により、より自由度の高い位置変換を補正する、請求項
    １７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】相対移動と位置補正の決定が相互作用的
    になされる、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の
    方法。
  22. 【請求項２２】相対移動と位置補正の決定が自動的にな
    される、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】シグナル強度を標準化するために、それ
    ぞれ既知の、または再現性ある一定強度を有する校正プ
    ローブを加える、請求項１７〜２２のいずれか１項に記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】校正プローブが蛍光標識ＤＮＡプローブ
    である、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】校正プローブが蛍光標識粒子である、請
    求項２３記載の方法。
  26. 【請求項２６】位置補正のために校正プローブが同時に
    用いられる、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】位置補正のために適切なプローブをさら
    に含む、請求項１５記載の診断用キット。
  28. 【請求項２８】強度の標準化のために適切な校正プロー
    ブをさらに含む、請求項２７記載の診断キット。
  29. 【請求項２９】ISCN表記法に対する色彩バンドの直接的
    割り当て（direct assignment）のために、さらなるＤ
    ＮＡプローブを加える、請求項２７または２８のいずれ
    か１項に記載の診断用キット。
  30. 【請求項３０】位置補正および／または強度の標準化の
    ためにプローブを同時に使用する、請求項２７〜２９の
    いずれか１項に記載の診断キット。
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