JP2000210086A - ヒト腫瘍抑制遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト成長ホルモン等により発現が抑制される
新規なヒト腫瘍抑制遺伝子、それを構成するＤＮＡ、及
びこれがコードするタンパク質の提供を目的とする 【解決手段】 配列表の配列番号１又は２に示す塩基配
列又はこれら何れかの塩基配列において１個若しくはそ
れ以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
を有する、成長因子によってその発現が阻害される、腫
瘍抑制性タンパク質をコードするヒト遺伝子を構成する
ＤＮＡ、及びこれがコードするタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、成長因子処理によ
り発現が阻害される性質を有するヒト腫瘍抑制遺伝子、
それを構成するＤＮＡ、及び該ＤＮＡがコードするタン
パク質に関する。

【０００２】

【従来の技術】組換え成長ホルモン(rhＧＨ)は、その成
長促進効果のために、ＧＨ分泌不全症小児やターナー症
候群小児、慢性腎疾患の小児など治療薬［Neely E.K.,a
nd Rosenfeld R.G.,Ann.Rev.Med. 45:407-420 (19949］
として世界的に繁用されて来た。更に、ＧＨは、種々の
生理的効果を示すため、例えば脂質代謝、タンパク質同
化作用、骨粗しょう症や造血との、また広くは、老化な
どとの関連で、薬剤としての利用性の拡大が期待されて
いる。

【０００３】高等動物は約100,000の遺伝子を保有して
おり、その内の約15%がそれぞれの細胞で発現され、生
命活動の全過程を、すなわち発達や増殖、分化、恒常
性、細胞サイクル調節等を支配している。これらの遺伝
子発現によるタンパク質の合成の調節は、主に転写(mRN
A)及び翻訳レベルで行われており、これらの機能にＧＨ
が深く関与していると推察されている。

【０００４】他方、細胞の異常増殖である腫瘍の研究に
おいて、1970年代に腫瘍遺伝子の実在が示唆され、次い
で花房等により初めて腫瘍遺伝子 v-srcが同定された。
その後、遺伝子性の腫瘍の解析から、様々な腫瘍抑制遺
伝子が、（その阻害が）腫瘍の原因となる遺伝子として
見いだされ、細胞増殖を抑制する腫瘍抑制遺伝子によっ
てある種の腫瘍の進行が阻害されることを示す証拠も蓄
積されてきた。

【０００５】一般的な腫瘍抑制遺伝子の判定において、
（１）腫瘍において対立遺伝子の双方に点変異及び欠失
変異が見られること、（２）遺伝性腫瘍の高発する癌家
系では、対立遺伝子の一つを持つ生殖細胞に突然変異が
見られることが、条件とされている。腫瘍抑制遺伝子の
特徴は、それらの機能の喪失が発癌につながることにあ
るとされている。

【０００６】腫瘍の発生および進行に、腫瘍遺伝子の活
性化、腫瘍抑制遺伝子の欠失又は突然変異に基づく不活
性化を含む、一連の遺伝子変異が関連することが明らか
にされて来た［Schmandt,R. et al., Clin.Chem.39:237
5-2385 (1993)］。腫瘍抑制遺伝子の同定や、多種の腫
瘍細胞において正常な対立形質が損失していることの証
拠によって、腫瘍抑制遺伝子の生理的な重要度が認識さ
れてきている［Knudson,A.G. et al., Proc.Natl.Acad.
Sci.90:10914-10921 (1993)］。

【０００７】これまでに発見されている主な腫瘍抑制遺
伝子としては、その変異が網膜芽細胞腫瘍の原因となる
RB1遺伝子［Friend,S.H.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 84:9059-9063(1987)］、大腸癌の原因となるp5
3遺伝子［Lane,D.P.e,t al.,Nature, 278:261-263(197
9)］、Wilms腫瘍の原因となるWTI遺伝子［Call,K.M.,et
al.,Cell,60:509-520(1990)］など、十数種が知られて
いる。

【０００８】最近、あるタイプの腫瘍と染色体13qにお
ける欠損との関係を明らかにする多くの研究が行なわれ
ている。種々の多形性ＤＮＡマーカーを用いて、制限酵
素切断断片長の多形性（RFLP：Restriction Fragment L
engh Polymorphism）により、特定の染色体領域の対立
遺伝子欠失、すなわちヘテロ接合性の喪失(ＬＯＨ:loss
of heterozygosity)の検出が可能になった。

【０００９】染色体の13q12上の対立遺伝子の欠損が、
前立腺、卵巣、子宮頚部、結腸、尿管、乳腺の腫瘍で観
察された [Gudmundsson J. et al., Canser Res., 55:
4830-4832(1997)]。 例えば、米国において、２つの癌
感受性遺伝子である、染色体17q21上のBRCA1と染色体13
q12上のBRCA2という乳癌感受性遺伝子（Breast CancerS
usceptibility gene）が、家族中複数の女性の乳癌早期
発病例を含む場合の乳癌の約80％において原因と考えら
れている[Gayther S. A. et al., Mol. Med.-Today, 3:
168-174(1997)]。 しかしながらこれは米国民について
のものであり、他の国民ではおそらく異なる。例えば、
フィンランドの乳癌家系では、全体で21％のみがBRCA1
遺伝子及びBRCA2遺伝子の変異で説明されたに過ぎない
［Verhmanen. P. et al. Hum.Mol.Genet.6:2309-2315
(1997)］。 これらのデータは、更なる別の乳癌及び乳
−卵巣癌感受性遺伝子が重要であるらしいことを示して
おり、そのうち幾つかは染色体13q12-13q13にあること
が予想される［Van Den Berg J.et al., Br. J. Cancer
74:1615-1619(1996)］。

【００１０】また、染色体13q12を含む染色体13におけ
る欠損が、小細胞癌 [Yokota J. etal, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 84: 9252-9256(1987)]、偏平上皮癌、大
細胞癌、腺癌等、多くのタイプのヒト肺癌に見出された
[Weston A et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:
5099-5103(1989)]。 しかしながら、染色体13の広範な
領域が失われているため、原因となる遺伝子座を特定す
ることは不可能であった。 最近、染色体13q12の特異的
欠損を示すはるかに正確なデータが非小細胞肺癌につい
て入手可能となった[Virmani A.K. et al., Genes Chro
mosomes Cancer21: 308-319(1998)]。更には、いくつか
の未知の腫瘍抑制遺伝子がこの領域に存在すると推察さ
れている［Tamura K.,et al. Int.J.Cancer 74:45-49
(1997)］。

【００１１】染色体13q12遺伝子座の明らかな欠損が、
（肝炎ウイルスの陽性及び陰性に関りなく）肝細胞癌の
67％に［Jacob A.N.et al., Oncogene 13: 213-221(199
6),Walker G.J.et al., Cancer Res.51:4367-4370 (199
1), Walker G.J. et al., Cancer Res., 51: 4367-4370
(1991) ］、頭部及び頚部偏平上皮癌（染色体の13q上、
特に13q12に局在する未だ同定されていない別の腫瘍抑
制遺伝子の欠損によると考えられている）に[Kirkpatri
ck H. et al, Oncogene 14: 2189-2193(1997)]、膵臓癌
[Schutte M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9
2: 5950-5954(1995)]及び腺癌に[Jacob A.N.et al., On
cogene 13: 213-221(1996)]、下垂体腺腫に（診断マー
カーとしての潜在的価値を有する積極的な生物学的活性
を反映する）[Pearce S.H. et al., Clin. Endocrinol.
(Oxf.), 45: 195-200(1996), Bates A.S. et al., J.
Clin. Endocrinol. Metab., 82: 818-824(1997)]、副甲
状腺腺腫に[Pearce S.H. et al., Clin. Endocrinol.
(Oxf.), 45: 195-200(1996), Yoshimoto K. et al., Cl
in. Endocrinol. (Oxf), 48: 67-72(1998)]、そしてリ
ンパ腫に [Mandahl N. et al., J. Cancer Res. Clin.
Oncol., 120: 707-711(1994), Sreekantaiah C. et a
l., Cancer Genet. Cytogenet., 39: 281-288(1989)]お
いて見出された。

【００１２】更に、染色体13q12の欠損を伴う広範なデ
ータが、いくつかの血液癌からも得られた。すなわち、
多発性骨髄腫及び形質細胞白血病［Avet-Loiseau H. et
al., Genes Chromosomes Cancer 19:124-133(199
7)］、骨髄増殖性新生物[ Still I.H. et al., Ann. Hu
m. Genet., 61(Pt1):15-24 (1997)］、及び、Ｔ−細胞
白血病／リンパ腫及び抹消血好酸球増加症を伴なった非
特的骨髄増殖性疾患［StillI.H. et al., Blood, 90:31
36-3141(1997)］、慢性リンパ球性白血病［Garcia-Marc
o J.A. et al., Cancer Genet. Cytogenet., 94:52-58
(1997), Garcia-MarcoJ.A. et al., Blood, 88:1568-15
75(1996), Catovsky D., Hematol. Cell Ther., 39 Su
ppl.1:S5-S22(1997), Garcia-Marco J.A. et al., Br.
J. Haematol.,99:708-709(1997)］。これらの文献の幾
つかは、染色体13q12上に新たな腫瘍抑制遺伝子の存在
を予言している[Garcia-Marco J.A. et al., Cancer Ge
net. Cytogenet., 94:52-58(1997), Garcia-Marco J.A.
et al., Blood, 88:1568-1575(1996), Catovsky D.,
Hematol. Cell Ther., 39 Suppl.1:S5-S22(1997)]。

【００１３】この様な腫瘍抑制遺伝子は、生物間で種を
越えて保存されており、細胞増殖やアポトーシスの制御
に関与すると推察され、腫瘍抑制遺伝子産物の多くのも
のが細胞周期を制御している。すなわち腫瘍抑制遺伝子
産物は、細胞吸着タンパク質、シグナル導入分子、転写
因子や細胞サイクル制御分子やアポトーシス制御分子に
関連することが明らかにされてきた。

【００１４】一方、最近の遺伝子分析研究で、ヒト遺伝
子の約80％はキイロショウジョウバエ(Drosphila Melan
ogaster)と相同であることが明らかにされ、ショウジョ
ウバエはヒトの腫瘍発生を分子レベルで研究することが
卓越したモデルであると期待されている［Cookson,C.,
Financial Times, June 14 (1997)］。ショウジョウバ
エのゲノム遺伝子数は約10,000で、ヒトのゲノム遺伝子
数の約100,000に比較して少ないが、大部分のヒト遺伝
子は重複遺伝子及び派生遺伝子であり、昆虫の遺伝子の
均等遺伝子とされている。多くのタンパク質やそのドメ
インのみならず、全体の複合体や種々の代謝及び情報伝
達系が、ヒトとショウジョウバエの間で保存されている
［Artavanis-Tsakonas S.,et al.,Science 268:225-232
(1995)］。

【００１５】また、キイロショウジョウバエがヒトの全
腫瘍と同様な特徴の腫瘍を発生することや、さらに、キ
イロショウジョウバエの腫瘍遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子
がヒトの腫瘍遺伝子や腫瘍抑制遺伝子の相同遺伝子であ
ることも明らかにされて来た［Miklos,G.L.G.,and Rubi
n,G.M., Cell 86:521-529 (1996)］。 従って、キイロ
ショウジョウバエの遺伝子データを用いる方法は、ヒト
の新規な遺伝子の探索に強力な手段を提供している［Ti
an Xu,et al.,Developments 121:1053-1063 (1995)］。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】このような状況にあっ
て、本発明は、ヒト成長ホルモン等により発現が抑制さ
れる新規なヒト腫瘍抑制遺伝子、それを構成するＤＮ
Ａ、及びこれがコードするタンパク質を提供することを
目的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】後述の通り、本発明者等
は、家兎の軟骨細胞を用いた研究で、ある遺伝子の発現
が成長ホルモン（ＧＨ）等の成長因子によって阻害され
ることを見出し、該遺伝子を単離・同定して検討し、そ
の結果、該遺伝子が新規の腫瘍抑制遺伝子であろうとの
結論に達し、本発明を完成させた。

【００１８】すなわち本発明は、配列表の配列番号１又
は２に示す塩基配列を有するＤＮＡを提供する。

【００１９】また本発明は、配列表の配列番号１又は２
に示す塩基配列又はこれら何れかの塩基配列において１
個若しくはそれ以上の塩基が欠失、置換若しくは付加さ
れた塩基配列を有する、成長因子によってその発現が阻
害されるヒト遺伝子を構成するＤＮＡをも提供する。

【００２０】更に本発明は、該成長因子がヒト成長ホル
モン又はインスリン様成長因子−１である、かかるヒト
遺伝子を構成するＤＮＡをも提供する。

【００２１】更に本発明は、配列表の配列番号１又は２
に示す塩基配列又はこれら何れかの塩基配列において１
個若しくはそれ以上の塩基が欠失、置換若しくは付加さ
れた塩基配列を有する、腫瘍抑制性タンパク質をコード
するヒト遺伝子を構成するＤＮＡをも提供する。

【００２２】更に本発明は、配列表の配列番号３又は４
に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をも提供する。

【００２３】更に本発明は、配列表の配列番号３又は４
に示すアミノ酸配列又はこれら何れかのアミノ酸配列に
おいて１個若しくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列を有する、成長因子によ
ってその発現が阻害されるタンパク質をも提供する。

【００２４】更に本発明は、該成長因子がヒト成長ホル
モン又はインスリン様成長因子−１である、請求項６の
タンパク質をも提供する。

【００２５】更に本発明は、配列表の配列番号３又は４
に示すアミノ酸配列又はこれら何れかのアミノ酸配列に
おいて１個若しくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列を有する、腫瘍抑制性タ
ンパク質をも提供する。

【００２６】更に本発明は、上記の各アミノ酸配列の何
れかを有するタンパク質をコードする塩基配列よりなる
ＤＮＡをも提供する。

【００２７】更に本発明は、上記の各塩基配列の何れか
よりなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを含んでな
るプローブをも提供する。

【００２８】更に本発明は、上記の塩基配列の何れかよ
りなるＤＮＡを含んだ組換えベクターをも提供する。

【００２９】更に本発明は、上記の各塩基配列の何れか
の部分配列よりなる、プライマー用ＤＮＡ断片をも提供
する。

【００３０】更に本発明は、上記プローブを含んでな
る、ヒト用診断薬をも提供する。該診断薬は、小人症、
巨人症、先端巨大症、血管障害、糖尿病性腎疾患、心臓
疾患又は白血病を含む腫瘍における、成長因子によって
阻害される腫瘍抑制遺伝子の発現を検査するために役立
つ。

【００３１】更に本発明は、上記タンパク質の何れかを
含有する抗腫瘍剤をも提供する。

【００３２】更に本発明は、上記タンパク質の何れかに
対する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体をも提
供する。

【００３３】更に本発明は、上記抗体を含むことを特徴
とする、腫瘍抑制遺伝子発現の診断薬をも提供する。

【００３４】

【発明の実施の形態】本発明者等は散発性、家族性及び
遺伝性の乳癌患者からの84個の原発性腫瘍試料のＬＯＨ
を分析した。その結果、腫瘍試料の34％にBRCA2遺伝子
（breast cancer susceptibility gene）領域における
ＬＯＨが、及び27％にRB1遺伝子領域におけるＬＯＨが
見出された。しかしながら、BRCA2に選択的なＬＯＨは
腫瘍の７％に過ぎず、RB1に選択的なＬＯＨもまた７％
に過ぎなかった。更には、２〜３の腫瘍は、BRCA2の手
前側及び抹消側の双方に更なる腫瘍抑制遺伝子の存在を
示唆する、制限酵素での欠損パターンを示した。高度に
有意性のある且つ独立した相関が、BRCA2におけるＬＯ
Ｈと早期再発及び死亡との間に存在することも、また見
出された。これらの結果は、染色体13q12-13q13領域の
一つまたはそれ以上の腫瘍抑制遺伝子の不活性化が、家
族性乳癌及び散発性乳癌の双方において、強い腫瘍増殖
能と予後の不良とをもたらしていることを示唆してい
る。

【００３５】本発明者等は、ｍＲＮＡディファレンシャ
ル（differential）・ディスプレー及びＰＣＲ選択ｃＤ
ＮＡサブトラクション法を用いて、成長ホルモンによっ
て制御される複数遺伝子の予備的検出を行ない、家兎軟
骨細胞中に成長ホルモンによって制御される遺伝子を確
認した。すなわち、ディファレンシャル・ディスプレー
法を用いて、電気泳動バンド N 119 が成長ホルモンに
よって制御されることが見出された。このバンドを切り
出し、そのＤＮＡを抽出し、クローニングして配列決定
した。このＤＮＡ断片の長さは僅か219塩基であること
が判明し、既知の遺伝子やＥＳＴ（Expressed Sequence
Tags）との意味のある相同性は認められなかった。バ
ンド N 119 のＤＮＡは、バンド N62、71、111 及び 11
2 のＤＮＡと相同であった。従って、これら５個のバン
ドからのＤＮＡを、相同クラスター HCD10 と分類し、
問題の家兎遺伝子を 「HCD10(119)」と命名した。成長
ホルモンによる阻害に加えて、HCD10(119) 遺伝子の転
写はコンカナバリンＡによって活性化されることも見出
された。

【００３６】HCD10(119)タンパク質をコードする遺伝子
の部分的クローニングのために、5'−RACE（5'−ｃＤＮ
Ａ末端迅速増幅：Rapid Amplification of 5'-cDNA End
s）法を用いた。当該遺伝子の2.5ｋｂの断片よりなるＤ
ＮＡ配列が決定され、キイロショウジョウバエのイボ
（warts）腫瘍抑制遺伝子と相同であることが示され
た。

【００３７】更に、本研究で兎の軟骨細胞用いた実験
で、ある遺伝子の発現が成長ホルモン(ＧＨ)で阻害され
ることを見出した。 この様なデータから、本発明者等
はＧＨに阻害される腫瘍抑制遺伝子(GHITSG: Growth Ho
rmone Inhibited Tumor Suppressor Gene)の存在を予測
し、検討を行なった。

【００３８】続いて本発明者等は、BLASTサーチにおい
て、家兎 HCD10(119)遺伝子断片の 2.5ｋｂのＤＮＡ配
列を用いていくつかのヒトのＥＳＴを見出し、DNASIS
（Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.）を用いて
それらをヒトにおける類似物（hGHITS： Human Growth
Hormone Inhibited Tumor Suppressor Gene）の、推定
した1.65ｋｂの領域にコンパイルした。残念ながら、そ
のような方法を用いては該遺伝子の信頼できる配列を得
ることはできなかった。これはＥＳＴが元々かなり不正
確なためである［Sudo K.,et al.Genomics 24:276-279
(1994)., Frigerio J.-M., Hum. Mol. Genet., 4(1): 3
7-43 (1995)., Lanfranchi G.,et al.Genome Research
6:35-42 (1996).］。そこで次に、一群のプライマーに
よる配列決定を試みた。

【００３９】OLIGO（プライマー分析ソフトウェア：Nat
ional Bioscience,Inc.より入手）を用いて 1.65ｋｂの
ヒトＤＮＡ断片をカバーするそれぞれ５個の準方向及び
逆方向プライマーをデザインし、そして ユニバーサル
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲにおいて、７
組のプライマーを用いた。すなわち： 1) H119U142 + H119L739, 2) H119U142 + H119L1048 3) H119U142 + H119L1499, 4) H119U736 + H119L1048, 5) H119U736 + H119L1499, 6) H119U782 + H119L1048, 及び 7) H119U782 + H119L1499 である。最終的に、第１組及び第７組のプライマーを選
択した。ハイブリダイゼーションプローブとして最適の
正しいサイズをすると見られるＤＮＡバンドを、それら
が生じたからである。

【００４０】第１及び第７の組のプライマーと鋳型とし
ての14の個別のｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲを
反復した。その結果に基づき、ヒト肺ｃＤＮＡライブラ
リー（λgt10）を選択した。その増幅が、両プライマー
対の何れについても強いＤＮＡバンドを与えたからであ
る。

【００４１】得られたこれらＤＮＡバンドをプラスミド
ベクター（pMOSBlue：Pharmacia）にクローニングし、
ＤＮＡ配列決定によりそれらの信頼性が確認されたこと
から、それぞれのプラスミドを有する E. coli 株を増
殖させ、プラスミドＤＮＡを精製しそして EcoRI 及び
SalI制限酵素で消化し、そのＤＮＡ断片を電気泳動で分
離し、そしてＤＮＡ挿入物を精製することによって、特
異的ハイブリダイゼーション・プローブを作成した。

【００４２】hGHITS遺伝子の種々の領域を含んだ17個の
ファージクローンを回収した。それらのＤＮＡを精製
し、プラスミドベクター（pUC18：Pharmacia)に再クロ
ーニングし、ＤＮＡ配列決定した。4892塩基よりなるヌ
クレオチド配列を復元したが、全長遺伝子のうち 5'−
末端と 3'−末端の両方が欠損していた。

【００４３】OLIGOを用いて、ヌクレオチド配列の両端
部に対するプライマー対をデザインした。すなわち、5'
−領域に対して H311U13 及び H311L320 よりなるプラ
イマー対、並びにと遺伝子の3'-領域に対して H316U39
及び H319L498 よりなるプライマー対である。これらの
プライマーによるクローンしたファージＤＮＡ断片の増
幅は、アガロースゲル電気泳動で分離されるＰＣＲ産物
を与え、これを、クローニングせずにそのままプローブ
として使用した。5'−プローブとハイブリダイズする13
のファージクローン、及び 3'−プローブとハイブリダ
イズする12のクローンを回収し、分析した。

【００４４】これらのファージクローンの分析により、
２つの機能的対立遺伝子と見られるものの存在が明らか
となった。全長5486塩基のヌクレオチド配列、hGHITS1
（配列表の配列番号１）及びhGHITS2（配列番号２）が
組立てられた。また、これらhGHITS1及びhGHITS2のそれ
ぞれのコード領域に対応する、各1088個のアミノ酸残基
の配列よりなるタンパク質が求められた（それぞれ、配
列番号３及び４）。これらの塩基配列の間に、タンパク
質コード領域において３箇所の相違が見出された。すな
わち、hGHITS1 アレルは、467番目のヌクレオチド部位
が「ｇ」であり（従って27番目のアミノ酸がリジン）、
1357番目のヌクレオチド部位が「ｃ」（従って324番目
のアミノ酸がアラニン）、そして1473番目のヌクレオチ
ド部位が「ｇ」（従って363番目のアミノ酸がグリシ
ン）であるのに対し、hGHITS2 アレルは、それぞれ、46
7番目のヌクレオチド部位が「ａ」（アミノ酸変化はな
し）、1357番目のヌクレオチド部位は「ｔ」（324番目
のアミノ酸はバリン）、そして1473番目のヌクレオチド
部位は「ａ」（363番目もアミノ酸はセリン）である。
３箇所の変異を含む配列の間で、正常型と変異型とは判
別されていない。

【００４５】PSORT 解析によれば、最もありそうなこと
は、該タンパク質が酵素でありおそらく60番目及び61番
目の間に切断部位を有し、核に局在することである。

【００４６】BLASTPサーチを用いて、hGHITSタンパク質
のアミノ酸配列を、既知のポリペプチド配列と比較し
た。ショウジョウバエのイボ腫瘍抑制遺伝子［Justice
R.W.,et al. Genes & Dev.9:534-546 (1995)］（lats
遺伝子とも呼ばれる。Xu T. etal. Development, 121:
1053-1063 (1995)）が、hGHITSと最も高い相同性を示し
た。"GeneStream align”を用いたイボ遺伝子とhHGITS
との対比は、酵素のＣ−末端における顕著な相同性を明
らかにした。MOTIFによる調査は、やはりプロテインキ
ナーゼの一つであるキイロショウジョウバエイボ遺伝子
に高い相同性を有する領域に位置する、セリン／スレオ
ニンタンパク質キナーゼ活性部位パターン（signatur
e）及びプロテインキナーゼＡＴＰ−結合領域パターン
（signature）を含む、８個のモチーフ（motifs）を明
らかにした。

【００４７】今日、群内の他のものから限られた変動し
か示さないプロテインキナーゼの触媒ドメインは、細胞
生理学において同様の役割を演じていると予測できるこ
とが、良く知られている［Hanks S.K.et al., Science
241:42-52 (1988)］。他方、キイロショウジョウバエの
腫瘍抑制因子に対応するヒト類縁体が単離され、機能的
に保存されていることも示されている［Maie A.R.St.J.
& Xu T. Am.J.Hum.Genet. 61:1006-1010 (1997)］。キ
イロショウジョウバエのイボ腫瘍抑制遺伝子は、細胞の
正常増殖やその正常な形態の制御に必須であり、この遺
伝子の欠損により異常増殖が見られたことから、腫瘍抑
制遺伝子と考えられており、またこれはヒトの筋ジスト
ロフィーキナーゼに類似している。これらの事実は、hG
HITSが腫瘍抑制遺伝子であるということを強く示してい
る。

【００４８】hGHITS遺伝子は、DRES7と名付けられてい
る1053塩基対長のＥＳＴと最も高い相同性を示した。DR
ES7 は、染色体の13q12座に位置づけられている（GenBa
nk Accession U69566）。しかしながら、染色体のこの
領域には、更なる２つの腫瘍抑制遺伝子が見いだされて
いる：すなわち、乳癌感受性 (BRCA2) 遺伝子が染色体1
3q14に位置づけられ［Wooster R., et al., Science 26
5: 2088-2090 (1994)］、更に、網膜芽細胞腫（Retinol
blastoma: RB1）遺伝子が染色体13q14に位置づけられて
いる［Walbaum R., et al., Hum.Genet., 44: 219-226
(1978)］。

【００４９】本発明者等の実験によると、家兎 HCD10(1
19) は、ヒト成長ホルモンによって阻害されることか
ら、hGHITS 遺伝子によって影響を受けるタイプの癌を
明らかにする他の方法は、成長ホルモンやインスリン様
成長因子−１（IGF-1）の量の増大と、それぞれの癌の
発生との間の相関の有無の調査である。

【００５０】例えば、IGF-1に対する受容体は前立腺癌
［Lamharzi N., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:88
64-8868 (1998)］、膵臓癌［Bergmann U., et al. Canc
er Res.55:2007-2011 (1995)］、骨や軟組織の肉腫［Se
kyi-Otu A., et al. Cancer Res.55:129-134 (199
5)］、ウィルムス腫瘍、小細胞肺癌、結腸癌、髄膜腫、
神経芽細胞腫、黄紋筋肉腫、リンパ芽球白血病［Daugha
day W.H.,Endocrinology 127:1-4 (1990)］を含むいく
つかの異なった腫瘍タイプに見出されている。ある種の
腫瘍は、成長ホルモン又は IGF-1 で活性化され、例え
ば、急性白血病は、ヒト成長ホルモンで活性化されヒト
成長ホルモンに対する受容体を増加するように調節され
ることが知られている［Giesbert S., et al. Ann.Hema
tol.74:253-257(1997)］。

【００５１】これらから予想できるように、成長因子拮
抗剤の使用は、ある種の腫瘍の阻害をもたらす。すなわ
ち、ヒトの骨肉腫の増殖は、ソマトスタチン類縁体によ
って阻害される［Pinski, J. et al., Int. J. Cancer,
65: 870-874 (1996)］。また、成長ホルモン放出ホル
モンの拮抗剤は、ヒト腎臓の腺癌の増殖を阻害する［Ju
ngwirth A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:
5810-5813 (1997)］。

【００５２】患者の身長といくつかの腫瘍の発生頻度と
の間には正の関係が認められており、例えば、研究の一
つは髄芽腫が成長ホルモン産生によって影響を受け得る
ことを示唆している［Robertson S.C., et al.Neurosur
gery 41:561-565 (1997)］。しかしながら、乳癌に関し
ては、未解決の矛盾がある。研究者のある者は、IGF-1
が強力な乳腺細胞分裂促進剤であると信じている［Yang
X.F., et al. CancerRes. 56:1509-1511 (1996)］。彼
らは、成長ホルモンがヒトの乳腺の成長に関係すると考
えており、そして成長ホルモン治療を受けている子供に
女性化乳房の発生が見られること及び高身長や先端巨大
症は乳癌発生頻度の増加を伴うことを示した［Ng S.T.,
et al. Nat.Med. 3:1141-1144 (1997)］。しかしなが
ら、他の研究者等は、女性は、（最終的に到達した身長
そのものではなくて）身長が最大に達する年齢が、乳ガ
ンの危険要因の一つであることを見出したとしており
［LiC.T., et al. Epidemiology, 8:559-565 (199
7)］、最終的な身長に達する年齢が高いほど、乳癌の危
険性が低下する傾向が示される、との主張がある。

【００５３】先端巨大症の患者に関しての種々の知見
が、高レベルの成長ホルモンで引き起こされる疾患に関
係する例外的な情報を提供した。先端巨大症患者の押し
上げられた成長ホルモンレベルは、結腸腺腫［Vasen H.
F., et al., Eur. J. Endocrinol., 131(3):235-237 (1
994)］、結腸直腸癌癌［Jenkins P.J., et al., Clin.E
ndocrinol. Oxf., 47(1):17-22 (1997)］、心・血管疾
患［Lombardi G., et al., J. Pediatr. Endocrinol. M
erab., 10:553-560 (1997)］、及び全ての悪性疾患［Or
me S.M., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 83:2
730-2734 (1998)］の発生の危険度の上昇をもたらして
いる。

【００５４】ソマトスタチン類縁体であるオクトレオチ
ド（octreotide）による治療期間中における、血清のIG
F-1レベルの低下を伴なう腫瘍細胞の増殖活性の低下や
心機能の改善は、成長ホルモンが上記疾患の一因である
ことを確認させた［CascinuS.,et al., Gastroenterolo
gy, 113: 767-772 (1997), Lombardi G., et al. Horm.
Res., 48 Suppl.4:38-42 (1997)］。心・血管疾患の場
合、病気の根本原因は単なる心室質量の増大ではないよ
うに思われる。なぜならそれは他の内蔵のサイズの増大
とは不釣り合いであり、また先端巨大症性の心筋症の重
症度は、循環血中の成長ホルモン及び／又はIGF-1のレ
ベルとの間よりも、先端巨大症の「期間の長さ」との間
に一層よい相関が報告されたからである［Lombardi G.,
et al., J. Endocrinol., 155 Suppl. 1: S33-S37 (19
97)］。これは、心・血管疾患を発生させる結果となる
何らかの閾値レベルの成長ホルモンによって抑制される
遺伝子の存在を示すものである。

【００５５】更には、結腸を主要な標的として、種々の
正常細胞及び癌細胞から抽出した等しい量のｍＲＮＡを
用い、hGHITSに特異的なプローブによってノーザンハイ
ブリダイゼーションを行ったところ、結腸腺癌 SW480で
は、正常の腸細胞に比して、hGHITSの転写が少なくとも
10倍増加しているのが認められた（データ示さず）。そ
の発現レベルは、試験した８種の癌細胞培養物中で明ら
かに最も高かった。このことは、結腸腺癌において何ら
かの変異の結果、非機能的遺伝子類縁体が生じているこ
とを示唆している。

【００５６】また、機能するhGHITSの転写増加は、腫瘍
増殖に抑制的に作用する考えられるが、この試験におい
て Burkitt'sリンパ種 Raji の細胞培養については、hG
HITSのｍＲＮＡの目視し得る程の発現を欠くという予想
外の結果が得られた（データ示さず）。これは、このBu
rkitt'sリンパ種において hGHITS 遺伝子が欠損するこ
とにより腫瘍の発生や増殖が生じた可能性を示唆してい
る。

【００５７】これらのことから、本発明の遺伝子を構成
するＤＮＡ、その転写体であるｍＲＮＡ、及び翻訳され
たタンパク質は、例えば、巨人症や先端巨大症における
ような成長ホルモン分泌過剰や小人症における成長ホル
モンの投与過剰等のような、成長ホルモン又はIGF-1の
レベルの増大によって誘発される可能性のある、心臓疾
患、血管障害、糖尿病性腎疾患や乳癌、結腸直腸癌、白
血病等の悪性腫瘍に対して、例えば、患者への本発明の
遺伝子を構成するＤＮＡの導入、ｍＲＮＡ又はタンパク
質の患部への投与により、治療薬として使用できる可能
性がある。またコンカナバリンＡ等の、本発明の遺伝子
の転写を促進する物質など、本発明の遺伝子の発現を誘
導ないし増強する物質をこれらの疾患の治療薬として使
用できる可能性があることも、本発明は示唆している。

【００５８】また、hGHITS遺伝子の発現と発癌との間の
相関性を利用することにより、hGHITS遺伝子を構成する
ＤＮＡの一部（又は全体）を含んだＤＮＡは、例えば、
hGHITS遺伝子の転写物に対するプローブやＰＣＲプ用プ
ライマーを提供し、hGHITS遺伝子の発現状況に基いて癌
の診断や、癌患者における予後の判断等を行なえる可能
性を提供する。

【００５９】成長ホルモンの常態的な過剰状態である巨
人症や先端巨大症の患者の疫学調査では、腫瘍発生や血
管障害などの疾患の増加が示されており、これら腫瘍発
生や血管障害などの疾患が血液中の常態的な成長ホルモ
ン過剰によって本発明の腫瘍抑制遺伝子が阻害された結
果発生する疾患であることが、示唆されている。一方、
本来、生理的な成長ホルモンの分泌はパルス型であるこ
とを特徴としており、本発明の遺伝子の発現抑制も、あ
る閾値以上の成長ホルモンレベルの持続時間の長さが問
題であると考えられる。これは、成長ホルモン療法にお
いても、持続的投与の方式でなく、本来の生理的なリズ
ムに合致したパルス型の投与が可能な方式が安全性の点
で好ましいものであることを示唆している。一般的に
も、疾患の治療のための薬剤の選択及び投与量の決定に
当たっては、個々の患者の遺伝情報を参照して判断する
ことが望ましい。

【００６０】従って、例えば、低身長症の子供に成長ホ
ルモン治療を施す場合、本発明の遺伝子及びその変異体
に基づいて作製したプローブ、プライマーは診断薬とし
て、該腫瘍抑制遺伝子の発現の強弱を測定してその結果
を治療への患者の適合性の評価、適切な治療期間・投与
量の設定に利用することができ、それにより腫瘍発生の
可能性を低下させることもできるようになる可能性があ
る。

【００６１】また、確定的結論を得るには広範な調査を
待つ必要があるが、ヒト集団において hGHITS 遺伝子の
低レベルの発現や非機能的対立遺伝子発現と、将来の癌
発生の確率との間には正の相関関係が合理的に推定され
る。従って、本発明の遺伝子に基づいて得られるプロー
ブ、プライマー等を利用して個人の hGHITS 遺伝子の発
現を調べることにより、当該個人の将来の発癌の可能性
について初期的診断が可能となるであろう。またこのよ
うなモニタリングと共に、例えばコンカナバリンＡ等の
ような hGHITS遺伝子の発現を促進又は誘導できる物質
のうち適当なものが、腫瘍の発生を防ぐために利用でき
る可能性も示唆される。

【００６２】本発明は、配列表において配列番号１又は
配列番号２でそれぞれ特定して示された塩基配列を有す
るＤＮＡのみならず、これらの塩基配列において１個若
しくはそれ以上の塩基が欠失、置換又は付加された、同
様の性質を有する遺伝子を構成するＤＮＡをも包含す
る。１個若しくはそれ以上の塩基とは、通常は例えば、
数個（例えば３、４個）ないし10個である。本発明はま
た、配列番号３又は配列番号４でそれぞれ特定して示さ
れた塩基配列を有するタンパク質のみならず、該タンパ
ク質のアミノ酸配列において１個若しくはそれ以上のア
ミノ酸が欠失、置換又は付加された、同様の性質を有す
るタンパク質をも包含する。１個若しくはそれ以上のア
ミノ酸とは、通常は例えば、数個（例えば３、４個）な
いし10個である。更に本発明は、そのようなタンパク質
をコードするＤＮＡ配列をも包含する。そのような塩基
配列は、コドンの縮重に関する周知の知識を利用して、
種々のものを容易に作成することが可能である。

【００６３】組換えＤＮＡ技術により、種々の変異体の
作製が可能である。最初に、種々の化学的及び／又は酵
素的方法を用いてＤＮＡのクローン断片に変異を生じさ
せることができ、得られた変異型のＤＮＡにつきＤＮＡ
配列分析を行い、利点を持つ特定の変異体を選び出す。
この方法で種々の変異体を、その表現型に関係なく、シ
ステマティックに作製することができる。一般的に用い
られる変異型クローンＤＮＡ作製方法は以下の通りに記
載される。

【００６４】１．オリゴヌクレオチドを用いて直接にＤ
ＮＡ配列に置換、欠損、挿入、付加を起こさせることが
できる。この方法によれば、ＤＮＡの小さな領域に多く
の変異を起こさせることが可能である。 ２．より長いオリゴヌクレオチドを用いて所望の遺伝子
の合成が可能である。 ３．部位特的変異作製法（Region-specific Mutagenesi
s）を用いて、大きなＤＮＡ領域（１〜３ｋｂ）に所望
の変異体を作製可能である。 ４．ＤＮＡのリンカースキャニング変異体作製法（Link
er-scanning Mutagenesis)は相対的に小さなＤＮＡ領域
(4-10 bp)にクラスター点変異を作製するのに適した方
法である。 ５．ＰＣＲも、直接的な変異体作製法として利用でき
る。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y. 3 vols. Edited by Ausubel F.M.et al., John Wile
y & Sons, Inc., Current Protocols., Vol.1, Chapter
8: Mutagenesis of cloned DNA, pages 8.0.1-8.5.1
0］

【００６５】これらの方法で得られた種々の変異型を含
む所望の遺伝子を発現可能なプラスミドやベクターの作
製方法も当業者に周知である。すなわち、制限酵素とリ
ガーゼとの組合わせを用いて、所望の遺伝子含んだＤＮ
Ａを発現ベクターＤＮＡに挿入することにより、所望の
遺伝子を含んだ組換えプラスミドを容易に構築すること
ができる。得られた組換えプラスミドを種々の細胞に導
入することにより細胞をトランスフェクションし形質転
換細胞を作製することができる。細胞としては、大腸菌
などの原核生物から、酵母や昆虫、植物や動物細胞も利
用することができる。 ［参考文献： Vectors essential data. Gacesa P. an
d Ramji D.P.166 pages.BIOSScientific Publishers Li
mited 1994., John Wiley & Sons in association with
BIOS Scientific Publishers Ltd. Expression vector
s, pages 9-12.］

【００６６】宿主細胞への組換えプラスミドの導入は、
塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法により行
うことができる。塩化カルシウム法は効率的なトランス
ホーメイションを与え、特別な装置を必要としない。よ
り高い効率を求めるならば、エレクトロポレーション法
が用いられるべきである。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolo
gy.3 vols. Edited by Ausubel F.M.et al., John Wile
y & Sons, Inc., Current Protocols.Vol.1,unit1.8: I
ntroduction of plasmid DNA into cells, pages 1.8.1
-1.8.10.］

【００６７】動物細胞系で通常行われるトランスフェク
ションには、一過性のものと安定で永久的なものとの２
通りが知られている。一過性のトランスフェクションで
は、形質転換細胞を１〜４日間培養してトランスフェク
トした遺伝子の転写、複製を起こさせた後、細胞を回収
してＤＮＡ分析を行なう。代わりに、多くの研究では、
トランスフェクト遺伝子を染色体遺伝子に組み込む安定
型の形質転換細胞系を作製している。トランスフェクシ
ョン法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレ
ーション法、リポソーム触媒法などが用いられる。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y.3 vols. Edited by Ausubel F.M.et al., John Wiley
& Son,Inc., Current Protocols. Vol.1, chapter 9:
Introduction of DNA into mammalian cells, pages 9.
0.1-9.17.3.］

【００６８】本発明の腫瘍抑制遺伝子について、それが
コードするタンパク質（ポリペプチド）及びその断片や
類似体に対するポリクローナルやモノクローナル抗体の
作成も当該分野において周知の技術を用いて容易に行な
うことができる。作製された抗体は研究試薬や本腫瘍遺
伝子の関連する疾患の診断薬として利用可能である。ま
た、得られた抗体は抗体カラムの作製、免疫沈殿法、更
にはウェスタンブロッティングによる抗原の同定その他
に広く利用できる。

【００６９】本発明の腫瘍抑制遺伝子がコードするタン
パク質に対するミリグラムレベルのモノクローナル抗体
の一般的作製法は、次の通りである。すなわち、抗原タ
ンパク質をマウスに接種して免疫し、十分な抗体タイタ
ーを示すマウスから脾臓を除去する。脾臓細胞を分離し
て脾臓Ｂ細胞を選択し、Ｂ細胞起源の骨髄腫細胞に融合
し、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を構築し、ハイ
ブリドーマ細胞から分泌されたモノクローナル抗体を、
細胞培養液からアフィニティーカラム、イオン交換法、
ゲルろ過法等を用いて精製する。また、一般的な方法で
本発明物質のポリクローナル抗体をも製造できる。すな
わち、免疫動物としては兎、馬、マウス、モルモットな
どを用い、当業者に既知の種々のスケジュールで抗原タ
ンパク質を接種して免疫し、採血した血清から免疫グロ
ブリンＧなどを単離する。 ［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y. 3 vols. Edited by Ausubel F.M.et al. John Wiley
& Sons,Inc., Current Protocols. Vol.2, chapter 1
1: Immunology, pages 11.0.1-11.16.13.］

【００７０】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明が下記の実施例に限定されることは
意図しない。

【００７１】＜プライマーの作製＞hGHITSに特異的なプ
ライマーのデザインは DNASIS ソフトエアと OLIGO ソ
フトエアを用いて行った。pUC18ベクター中の挿入物の
配列決定のためのＭ13ユニバーサルシークエンシングプ
ライマー（ＵＳＰ）（gtaaaacgacggccagt）とＭ13リバ
ースシークエンシングプライマー（caggaaacagctatga
c）の合成及び次のhGHITS特異的プライマーの合成を、
日清紡東京リサーチセンターに依頼して行なった。すな
わち、H119U89（tccaaatattaccagaaagggagcca）、H119U
142（gacctctgggatgatgtgt）、H119U219（agaggtcttggg
cacatttcactggt）、H119U736（cctgagcacgcattttac
g）、H119U782（acaatggctacccctttcg）、H119L739（tt
cgtaaaatgcgtgctc）、H119L1048（cctgtttgggttttcttgg
t）、H119L1493（tcatcaccttgctcacacttccctatta）、H1
19L1499（catcaccttgctcacacttcc）、H119L1515（gtcgg
aaatcacagccacatcatca）、H311U13（ttcgtttgcgtcctacc
ac）、H311L320（gcggcgtcttgctctg）、H316U39（ctgct
ctggtctcaatttaag）、H316L498（caagtctgctgtgcctgt
c）。

【００７２】ＤＮＡ合成装置、モデル391 PCR-mate EP
^TM (Applied Biosystems, 米国)を用いて、クローニン
グ用pMOSBlue T-ベクターの挿入物の配列決定のための
順方向T7プロモータープライマー（ctaatacgactcactata
ggga）と逆方向U-20merプライマー（ggttttcccagtcacga
cgt）を合成した。

【００７３】＜適切なヒトｃＤＮＡライブラリーのサー
チ＞14の別個のｃＤＮＡライブラリーの各試料及び組み
合わされたライブラリー（ユニバーサルｃＤＮＡライブ
ラリー）の一試料とを含む、Quick-Screen Human cDNA
ライブラリーパネル(Clontech)を、hGHITS遺伝子を最も
よく表しているライブラリーを調べるのに用いた。

【００７４】キャップ付きMicroAmp反応チューブ（Perk
in Elmer）中に、反応液 10μlを調製した。すなわち、
6.4μlのH２O、1μlの10倍希釈した増幅緩衝液(100 mM
Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl２, 0.01%
W/V gelatin)、0.2μlのdNTP混合溶液（各2.5 mM）、１
μlの順方向プライマー（2 μM）、１μlの逆方向プラ
イマー（2μM）、0.2 μlの熱処理ｃＤＮＡライブラリ
ー試料、及び0.2 μlのポリメラーゼ混合溶液［0.1μl
のAmpliTaq DNA ポリメラーゼ（5 U/μl）（Perkin Elm
erより入手）及び0.1μlのTaqStart Antibody（7μM，
1.1μg／μl）（Clontechより入手）］。これらの混合
液をピペットで上下させてよく混合した。ＰＣＲ反応
は、GeneAmp PCR System 9600 サーマルサイクラー（Pe
rkin Elmer）中において、次の増幅サイクルで行なっ
た。

【００７５】［40 サイクル反復］ 10秒：96℃（変性） １分：56℃（アニーリング） １分：72℃ （延長） ［最終ステップ］ 4℃ (維持)

【００７６】0.5μg／ｍＬのエチジウムブロマイドを含
む２倍希釈ＴＢＥ緩衝液（45 mM Tris、45 mM ホウ酸、
1 mM EDTA, pH 8.3）中の１％のアガロースGP-36（Naca
laiTesque）を、マイクロウェーブオーブン上で溶か
し、この溶液を Mupid-2 Mini-Gel電気泳動システム（A
dvance）の110×60×7.5 mmの型に注ぎ、櫛を挿入した
まま少なくとも30分間室温で固化させることにより、分
画用ゲルを調製した。

【００７７】それぞれのＰＣＲ反応液を、２μlの10倍
希釈の試料添加緩衝液（50% グリセロール、0.01% ブロ
ムフェノールブルー)と混合し、ゲルに適用した。ゲル
電気泳動は、Mupid-2 Mini-Gel電気泳動システムを用
い、緩衝液チャンバー内に0.5倍希釈ＴＢＥ緩衝液を加
えて、100Vにて30分間行った。

【００７８】透過照明装置によりゲルを透過照明して、
電気泳動写真を撮影した。 適したＰＣＲ断片をゲルか
ら切り出した。

【００７９】＜ＰＣＲ断片の精製＞QIAEX II ゲル抽出
キット（QIAGEN）を、ＤＮＡ断片の精製に用いた。100
bp〜4 kbpのＤＮＡ断片について、３体積の緩衝液QX1を
１体積のゲルに加えた。QIAEX IIを30秒間攪拌（渦流）
して再懸濁させ、10μlの樹脂をそれぞれのサンプルに
加えた。Thermo Alumi Bath ALB-120（Iwaki）中で混合
物を50℃にて12分間インキュベートした。サンプルを２
分毎に手短に攪拌した。試料のチューブを18,000×ｇ
（TOMY MRX-150 高速冷凍遠心機で15,000 rpm）にて１
分間遠心し、上清を除去した。500μlの緩衝液QX1をＤ
ＮＡ含有ペレットにそれぞれ加え、手短に攪拌し、18,0
00×ｇにて1分間遠心し、そして上清を完全に除去し
た。500μlの緩衝液ＰＥをＤＮＡ含有の各ペレットに加
え、手短に撹拌し、18,000×ｇにて１分間遠心分離し、
そして上清を完全に除去した。この洗浄処理をもう１度
繰り返した。ペレットを、それらが白色になるまで、25
〜30分、空気乾燥した。ペレットの過乾燥は回収率を低
下させるために、真空乾燥処理は避けた。純水を各サン
プルに加え、ペレットを撹拌して再懸濁させ、時々攪拌
しつつ混合物を５分間、室温でインキュベートした。サ
ンプルを18,000×ｇにて１分間遠心し、そしてＤＮＡを
含有する上清を清浄なチューブに移し替えた。このステ
ップを、50℃のインキュベーションを加えて繰り返し
た。同一のＰＣＲ産物からの１回目及び２回目のＤＮＡ
抽出物を合わせ、その溶液１μlをアガロース電気泳動
で試験した。精製したＤＮＡ断片は、−20℃で貯蔵し
た。

【００８０】＜精製したＰＣＲ断片のクローニング＞pM
OSBlue平滑末端クローニングキット（pMOSBlue blunt e
nded cloning kit (Amersham)）を、こうして増幅・精
製したバンドのクローングに用いた。3.75μlの各濃縮
した精製試料を、1.5 mlチューブ中で、0.5μlの10倍希
釈ｐｋ緩衝液、0.25μlの100 mM ＤＴＴ及び0.5μlのｐ
ｋ酵素と混合した。混合液をピペットチップで穏やかに
攪拌し、マイクロ遠心機で短時間遠心した。チューブ
を、更に、Sanyo Incubator中で22℃にて40分間インキ
ュベートした。反応物を、Thermo Alimu Bath中におい
て75℃にて10分間熱不活性化し、氷上で２分間冷却し、
濃縮物を収集するために短時間遠心した。

【００８１】各ライゲーション反応は、５μlの上記産
物を0.5μlのpMOSBlueベクター（50ｎｇ／μl）及び0.5
μlのＴ４ＤＮＡリガーゼ（２ Weiss units）と混合す
ることによって行なった。これらの混合物をピペットチ
ップで穏やかに攪拌し、マイクロ遠心機で短時間遠心し
た。これらのチューブを、Sanyo インキュベータ内にお
いて22℃にて終夜インキュベートした。

【００８２】200μlのpMOSBlueのコンピテント細胞(200
ul)を含んだチューブを解凍し、振り混ぜて細胞を均一
に懸濁させ。15μlのコンピテント細胞を、ピペット
で、予め冷却した1.5 mlの各チューブに入れた。１μl
のライゲーション混合物を、細胞に直接加え、穏やかに
攪拌して混合した。残りの細胞は再度凍結し、次の形質
転換操作に用いた（形質転換効率の幾分の損失はあ
る）。試料チューブを30分間氷上に放置した。次いで、
Thermo Alumi Bath ALB-120中で、細胞に正確に45秒間4
2℃のヒートショックを加え、30秒間氷上に置いた。80
μlの室温のSOC培地を各チューブに加え、チューブを37
℃にて１ 時間放置した。

【００８３】1.5% Bacto-Agar (Difco)、30 カプセル/L
のCircleGrow (Bio 101, Inc.)、75μg/mlのアンピシリ
ン及び15μg/mlのテトラサイクリンを含んだプレート
に、100μlの20 mg/ml X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-イ
ンドリル-β-D-ガラクトシド）及び20μlの100 mM IPTG
（イソプロピル-β-D-チオ-ガラクトピラノシド）を広
げた。平板培養前に寒天プレートを少なくとも30分間放
置して染み込ませた。

【００８４】各形質転換細胞液の全量を寒天プレート上
に播いた。裏返したプレートを、37℃にて終夜インキュ
ベートした。４つの異なった表現型が観察された：濃青
色、淡青色、青色の中心を持った白色（いわゆる「bul
l's-eye」）、及び白色の各プラークである。挿入物
は、白色のプラークにのみ見出された。

【００８５】＜プラスミドＤＮＡの精製＞形質転換体を
含んだ白色コロニーを、滅菌トゥースピック（toothpic
k）を用いて用いてプレートから採取した。細菌を、100
μg／mlのアンピシリンを含有する2.5 mlのCircle Grow
培地（40カプセル/L）を含んだ、キャップ付きの14 ml
のポリエチレンチューブ（Falcon)に移した。チューブ
を、200 rpmで37℃にて16〜72時間震盪した（１日の培
養により最高集率でプラスミドＤＮＡ与える）。

【００８６】RPM AFS Kit (Bio 101, Inc.)を、細菌培
養物からの二本鎖ＤＮＡの迅速単離、精製に用いた。一
度に12種類でのプラスミドＤＮＡが精製された。細菌を
２ mlのSafe-Lock チューブ (Eppendorf)中で、18,000
×ｇにて（, TOMY MRX-150 高速マイクロ冷凍遠心機
で、15,000 rpm）1 分間遠心した。上清を傾捨した。細
胞を1 mlの水中で攪拌することによって再懸濁し、再び
遠心した。上清を傾捨した。細胞が完全に再懸濁するま
で、各細胞ペレットを、200μlのPre-Lysis緩衝液＃1中
で攪拌することによって再懸濁させた。400μlのAlkali
ne Lysis Solution＃2を細胞懸濁液に直接加え、そして
チューブを穏やかに15回上下反転させた。１分後に、30
0μlの氷冷Neutralizing Solution＃3を加え、そして均
一な白色析出物が形成されるまでチューブを３〜５回激
しく震盪した。この混合物を氷上で5分間インキュベー
トし、室温で５分間遠心し、そして上清を新しい２ ml
チューブに移した。

【００８７】500μlのGlassmilk SpinBuffer #4を上清
に加え、Glass-milkに効率よくＤＮＡが結合するよう５
分間上下反転させ、18,000×ｇにて２秒間遠心した。上
清を傾捨した。Glassmilk／ＤＮＡ複合体の各々を、500
μlの洗浄液（Wash Solution）#5 中にて、ピペットチ
ップで穏やかに攪拌し次いでピペットで上下することに
よって再懸濁させ、そして該キットに付属のRPM AFS ス
ピンフィルター（SpinFilter）に移した。フィルターを
10秒間遠心して、ペレットを乾燥させること無くペレッ
トのレベルまで洗浄液のレベルを低下させた。キャッチ
チューブ（Catch Tube）を空け、そしてスピンフィルタ
ーを再び取付けた。500μlの洗浄液を各スピンフィルタ
ーに加え、続いて２分間遠心してフィルター内容物を
「乾燥」させた。スピンフィルターをキットに付属の新
しい RPM AFS キャッチチューブに移した。140μlの溶
出液＃8（RNase/DNase/パイロージェンを何れも含まな
い水)を各サンプルに加え、そしてGlassmilk/DNA複合体
を、指で軽く叩いてスラリー状にまで混合した。プラス
ミドＤＮＡを、15,000 rpmにて３分間の遠心によってキ
ャッチチューブ内に集めた。これらのＤＮＡ溶液は、−
20℃で貯蔵した。

【００８８】＜ＤＮＡ挿入物の確認＞挿入物の存在とＤ
ＮＡ配列決定のためのＤＮＡ溶液の適切量とを、制限酵
素で消化したプラスミドＤＮＡのアガロース電気泳動に
より決定した。２ulのプラスミドＤＮＡ溶液を、11.1μ
lの水、1.5μlの10倍希釈 H Universal緩衝液（0.5 MTr
is-HCl, pH 7.5, 100mM MgCl２, 10 mM DTT, 1 M NaC
l)、0.2μlのSalI（10U/μl）(TAKARAより入手)、0.2μ
lのEcoRI（10 U/μl）（TAKARAより入手)と混合し、少
なくとも２時間 37℃にてインキュベートした。

【００８９】１%アガロース GP-36（Nacalai Tesqu
e）、0.5 μｇ/ml エチジウムブロマイド(Sigma)、及び
0.5倍ＴＢＥ緩衝液を含有する混合物をマイクロウェー
ブオーブンで溶融させることにより、分離用ゲルを調製
し、この溶液を Mupid-2 Mini-Gel電気泳動システム（A
dvance）の型に注ぎ、そして室温で少なくとも30分間か
けて固化させた

【００９０】消化したプラスミドＤＮＡの各々を、1.5
μlの10倍希釈試料添加緩衝液（50%グリセロール、0.01
% ブロムフェノールブルー)と混合し、ゲルに適用し
た。ＤＮＡ分子量標準マーカーとして、pHYマーカー(TA
KARA)を用いた。ゲル電気泳動は、緩衝液チャンバーに
0.5×ＴＢＥ緩衝液を入れた Mupid-2-Mini-Gel Electro
phoresis Systemを用いて、100Vで30分間行った。FAS-I
I（東洋紡）を用いて、泳動像を得た: ゲルを紫外線透
過照明装置（Electronic U.V. Transilluminator）で照
明し、写真をXC-75/75CE CCD Video Camera Module（SO
NY）で撮り、そしてVideo Graphic Printer UP-880（SO
NY）でプリントアウトした。適切な長さの挿入物を含ん
だクローンからのＤＮＡを、最終確認のため、ＤＮＡ配
列決定用に選んだ。

【００９１】＜ＤＮＡ配列決定用のサンプル作成＞Ampl
i-Taq ポリメラーゼ，FSを用いたABI PRISM^TM Dye Term
inator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitを、ＤＮ
Ａシーケンシングに用いた。18個までのＰＣＲ反応物が
一度に処理できた。キャップ付きMicroAmp反応チューブ
（Perkin Elmer）内で、反応混合物を次の通りにして調
製した：すなわち、８μlのTerminator Ready 反応混合
液、２μlの順方向又は逆方向プライマー（２μM）、0.
1〜0.5μｇのプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡ液の必要量は電
気泳動図から見積もった)、及び水を加えて最終液量20
μlとした。調合物をピペットで上下して十分に混合し
た。ＰＣＲ反応は、GeneAmp PCR System 9600 サーマル
サイクラー（PerkinElmer）中で、次の通りの増幅サイ
クルを用いて行った：

【００９２】［25 サイクル反復］ 10秒：96℃ (変性) ５秒：50℃ (アニーリング) ４分：60℃ (延長) [最終段階] 4℃ (保存)

【００９３】ＰＣＲ産物をエタノール沈澱で精製した。
各反応物につき２μlの３M酢酸ナトリウム（pH 5.2）及
び50μlの99.5%エタノール を加えることにより、1.5 m
lのマイクロ遠心チューブを用意した。反応チューブの2
0ulの内容物全部を、このエタノール溶液を含むマイク
ロ遠心チューブに移した。チューブの溶液を攪拌し、そ
して氷上に10分間置いた。次いで混合物を18,000×ｇ
（TOMY MC-150 高速マイクロ遠心機で15,000 rpm)で４
℃にて20分間遠心を行った。エタノール溶液をマイクロ
ピペットで注意深く吸引した。250μlの70%エタノール
を加えることによってペレットを濯ぎ、15、000 rpmに
て１分間遠心した。ペレットを乱さないよう注意深く、
マイクロピペットでアルコール溶液を吸引した。真空下
に10分間チューブを乾燥させた。乾燥した沈殿は、直ち
に使用するか又は−20℃にて貯蔵した。

【００９４】＜ＤＮＡ配列決定＞373-18 DNAシーケンサ
ー(Applied Biosystems)をプラスミドＤＮＡの配列決定
に用いた。ガラスの清浄度が信頼できる正確な配列決定
に極めて重要であることから、ガラス器具類を水で注意
深く洗浄し、イソプロピルアルコールで拭った。8.3 M
尿素を含んだ4.75%の変性PAAGを、ＰＣＲ産物の分離に
用いた。50 mlの遠心チューブ内において、19.94gの尿
素を、4.75 mlの40%の(19:1) Acrylamide/Bis Solution
(Bio-Rad Laboratories)及び８ mlの5倍希釈ＴＢＥ緩
衝液と混合し、そして蒸留水で40 mlとした。試料チュ
ーブを激しく攪拌し、マイクロウェーブで受け皿が１回
転する間暖め、全てのウレア結晶が溶解するまでさらに
激しく攪拌した。ゲル成形装置を準備する間、A-3S Asp
iratorを備えたデシケータ内で溶液を（約10分間）脱気
した。18 μlのTEMED (Sigma)及び160μlの10% 過硫酸
アンモニウム (Sigma)（−20℃にて貯蔵）を加え、30秒
間穏やかに混合し、ガラスプレート型(420×250×0.25
mm)内に注いだ。ゲルを室温で2〜5時間放置して固化さ
せた。

【００９５】50 mM EDTA（pH８）中の10μlの３%ブルー
デキストラン（Sigma）と52μlのホルムアミドと混合す
ることによって、試料添加緩衝液を調製した。配列決定
サンプルをこの緩衝液３μlに溶かし、Thermo Alumi Ba
th ALB-120 (Iwaki)中で94℃、２分間加熱し、そして氷
上においた。ゲルを備えたガラスプレートをもう一度注
意深く洗い、スキャンニングによりチェックし、電気泳
動チャンバーを組立てた。歯櫛（shark teeth comb）を
１mmの深さに挿入し、1×ＴＢＥ緩衝液を両方の緩衝液
チャンバーに注ぎ、そして20〜30分間、前電気泳動を行
った。ＰＭＴ電圧を900Vにセットし、運転パラメータを
2500 V、20 mA、及び30 Wにセットした。シリンジを用
いてウェルを１×ＴＢＥ緩衝液で注意深く洗浄し、サン
プルをウェル添加して、９時間電気泳動を行なった。泳
動開始後直ちにデータ収集コンピュータープログラムを
スタートさせた。

【００９６】分析コンピュータープログラムは、データ
ー収集終了後に自動的に作動した。ソフトエアの誤りは
マニュアルで補正した。ヌクレオチド配列の最初の分析
は、DNASISソフトウエアを用いて行った。

【００９７】＜ハイブリダイゼーションプローブの調製
＞「挿入物の検出」に記載されているところに従って、
適切な挿入物を有するハイブリダイゼーションプローブ
をプラスミドＤＮＡ原液から調製した。精製されたＤＮ
Ａを、0.116 液量の10×H ユニバーサル緩衝液、各0.02
液量のSalI (10U/μl)及びEcoRI (10 U/μl)と混合し
た。消化は、37℃にて終夜行なった。アガロースゲル電
気泳動を50分、50Vで行い、ＤＮＡ挿入物をゲルから切
り出し、同一のものは合わせ、「精製ＰＣＲ断片」の欄
に記載したようにして精製した。

【００９８】＜ファージ平板培養細胞の調製＞ファージ
感染を高い効率で行なわせるためには、ファージ増殖に
用いる細胞は対数増殖相で収穫し死細胞を実質的に含ま
ないことが重要である。XL1-BlueMRF'株を用いることが
最も便利であることが判明した。 その遺伝子型は、 △
(mcrA)183 △(mcrCB-hsdsSMR-mrr)173 endA1 supE44 th
i-1 recA1 gyrA96 relA1 lac［F'proABlacl^qZ△M15 Tn1
0(Tet^r)］である。この細胞株を、25μg／mlのテトラサ
イクリンを補充したCGアガープレート（1.6% Bacto-Aga
r（Difco）及び 40 カプセル/L Circlegrow （Bio101,
Inc.）)で培養した。細胞を37℃でインキュベートし
て、２週間毎に新鮮なプレートに植え替え、そして4℃
で保存した。

【００９９】平板培養段階の前日に、１個のコロニーを
CGアガープレートから採取し、0.4%マルトースと25μg/
mlのテトラサイクリンを補充した３mlのCG ブロス（40
カプセル/L CircleGrow)に播き、震盪しつつ37℃にて終
夜インキュベートした。

【０１００】1.0 mlの終夜培養物を47 mlの同じ保温前
の培地の47mlに加え、激しく震盪しつつ37℃にて3時間
インキュベートした。細胞濃度を、Beckman DU 640 spe
ctrophtometerを用いて、0.1 mlの石英ガラスキュベッ
トで評価した。通常、OD６００の強度は、約0.3（1.5×
10⁸細胞/ml)である。培養物をキャップ付き滅菌50 mlポ
リカーボネート遠心ボトル(Beckman)に移し、3,000 rpm
で10分間4℃にて、Beckman JA 20 rotorを用いてBeckma
n J2-MC 遠心機で分離した。細胞ペレットを、細胞濃度
２×10⁹ 細胞/mlの懸濁液を調製するように、冷却した
滅菌10 mM MgSO４液中に再懸濁した。細胞を氷上に置
き、スクリーニングのため直ちにタイトレーション及び
ファージ平板培養に用いた。

【０１０１】＜ファージのタイトレーション＞25μg/ml
のテトラサイクリンを補充したCGアガーを含んだ100 mm
のペトリ皿（Falcon）をタイトレーションに用いた。ア
ガーを注いだペトリ皿を蓋を開けたまま室温にて20分放
置してアガーを固化させ、次いで30分間安全キャビネッ
ト(SCV-130EC II B：日立製作所)内で滅菌空気を吹き付
けることによって乾燥させ、そして4℃で保存した。使
用前に、それらを冷蔵庫から取り出して恒温室にて37
℃、1時間加温した。

【０１０２】ファージ液 2μlをＳＭ緩衝液 198μl(100
mM NaCl, 8 mM MgSO₄, 0.01% ゼラチン(Sigma), 50mM
Tris-HCl pH 7.5)と混合した。この希釈物を10⁴ と表示
した。この希釈液の10μlを播いたときプレート上の１
個のプラークは元のファージ原液における10⁴ pfu/mlに
等しいからである。同じ仕方で、ＳＭ緩衝液により10 ⁹
までの段階的希釈液を調製した。

【０１０３】10μlの各ファージ希釈液を90μlのＳＭ緩
衝液で希釈し、10 mM MgCl２中の細胞懸濁液100ulと混
合し、そしてThermo Alumi Bath ALB-120のメタルホル
ダー中で37℃、15分間インキュベートした。

【０１０４】CGトップアガー(0.8% Type I-B アガロー
ス(Sigma), 40 カプセル/L CircleGrow)をマイクロウェ
ーブストーブで溶かし、そして20%のマルトースを最終
濃度0.4%まで補充した。３mlのトップアガロースをスク
リューキャップ付きの 16×125mm の組織培養チューブ
(Falcon)に加え、そして使用時までThermo Alumi Bath
ALB-120で48℃に維持した。

【０１０５】各プレーティング組成物を、溶解したアガ
ロースを含んだ上記チューブに加え、チューブを5回上
下反転させて素早く撹拌し、そして 25μg/mlのテトラ
サイクリンを補充した乾燥 CGアガーの100mmプレートに
注いだ。プレートを動かす前に、３分間かけてトップア
ガーを完全に固化させた。プレートを裏返しにして、37
℃、5時間インキュベートし、次いで室温で終夜放置し
た。プラーク数をカウントして、そしてプラーク総数に
希釈倍数を掛けることにより、ファージのタイターを計
算した。

【０１０６】＜ファージのプレーティング及びプラーク
の膜への移転＞プレーティングのプロトコールは、ファ
ージのタイトレーションについで上に記載したのと基本
的に同じである。一度に12個までのプレートが処理され
た。ｃＤＮＡライブラリーは、外傷で死亡した75才のコ
ーカサス人男性の肺（Clontech）を用い、λgt10のクロ
ーニングベクターにより、オリゴ（dT）及びランダムプ
ライミング法を用いて構築した。

【０１０７】最初のスクリーニングでは、ＳＭ 緩衝液
に希釈した100ulのファージライブラリー（50,000〜50
0,000 pfu（プラーク形成単位）を含有）を、等量の10
mM MgCl₂ 中に懸濁させた細胞と混合し、37℃にて15分
間インキュベートした後、７mlの48℃のCGトップアガー
に加え、５回上下反転させてよく混合し、25μg／mlの
テトラサイクリンを補充したCGアガープレート（150m
m： Falcon）上に注いだ。プレートを裏返して37℃にて
５時間インキュベートし、次いで室温で終夜放置した。

【０１０８】Hybond^TM-N+ （円形の132 mmの、グリッド
付きの正に帯電したナイロン膜（Amersham））をプラー
クを含んだアガープレート上に載せた。21Ｇ針によりフ
ィルターの配向を3点でマークした後、フィルターを除
去して上に向けてテーブル上に置き、少なくとも３分乾
燥させた。ＤＮＡ固定化のために、フィルターを 0.4M
NaOH液を浸した２枚のWhatman紙上に、10〜30分間置い
た。細菌の砕片やアルカリを除くために、膜を、5×SSP
E緩衝液(20×SSPE: 3.0 M NaCl, 0.2 M NaH２PO４, 0.0
2M EDTA, pH 7.4 (GibcoBRL))で徹底して２回、更に蒸
留水で１回洗浄し、ペーパタオルで吸い取り、そして室
温にて乾燥させた。

【０１０９】＜プローブの標識化と精製＞Multiprime D
NA ラベリングシステム(Amersham)をプローブの標識化
に用いた。回収した各ＤＮＡ挿入物の約25 ngに水を加
えて27μlとし、98℃の98℃ThermoAlumi Bath ALB-120
中で５分間加熱し、そして氷上で冷やした。試料を18,0
00×g（TOMY MRY-150 高速マイクロ冷凍遠心機で15,000
rpm)にて１秒間遠心して、チューブの内容物を沈降さ
せた。４つの反応物の各々を、次のようにキャップ付き
のMicroAmp Reaction Tube内に入れて氷上にセットし
た。すなわち、変性ＤＮＡプローブの全量、10μlの標
識化緩衝液、５μlのプライマー/BSA 溶液、６μlの
［α-³²P］dCTP（〜110 TBq/mmol,370 MBq/ml)(Amersha
m)、及び２μlのKlenow 酵素である。ピペットで上下す
ることにより調合物を穏やかに混合し、Gene Amp PCRシ
ステム2400中で37℃にて30分間インキュベートし、組み
込まれなかったヌクレオチドを除去するまで、20℃にて
3〜4時間維持し、ハイブリダイゼーションを行った。

【０１１０】QIAquick Nucleotide Removal Kit(QIAGE
N)を、標識されたプローブの精製に用いた。各標識化混
合物を、500 μlの緩衝液ＰＮを含む1.5 mlのチューブ
内で混合した。QIAquick スピンカラムを、備え付けの
２ mlの収集チューブ内に入れた。ＤＮＡを結合させる
ために、試料をQIAquick スピンカラムに適用し、そし
て6000 rpm（TOMY MC-150 高速マイクロ遠心機）で1分
間遠心した。QIAquickカラムを清浄な２mlの収集チュー
ブ内におき、素通りした放射活性液を、後でＤＮＡへの
標識取り込みを計算するために、保存した。QIAquick
カラムの洗浄のために、500μlのＰＥ緩衝液を加え、60
00 rpmで１分間遠心した。通過した液を捨て、更なる50
0μlのＰＥ緩衝液で再度洗浄を行なった。通過した液を
捨て、QIAquick カラムを更に13,000rpmで１分間遠心し
て、残存の液を除去した。QIAquickカラムを清浄な1.5
mlのマイクロ遠心チューブ内に入れた。カラムからＤＮ
Ａを溶出するために、100μlのBufferＥＢ(10mM Tris-H
Cl, pH 8.5)をカラムの中心に加え、１分間放置し、次
いで13,000 rpmで１分間遠心した。

【０１１１】溶出した標識ＤＮＡの各々を、キャップ付
きのMicroAmp Reaction Tubeに移し、GeneAmp PCR Syst
em 2400中において99.9℃で５分間で加熱し、そして４
℃に冷却した。変性させたプローブを 450ulのハイブリ
ダイザション緩衝液を含んだ1.5 mlのチューブに加え、
β(γ)Survey Meter TGS-133 (Aloka)を用いて標識組み
込み効率を評価して、組み込まれなかったヌクレオチド
の放射活性と比較した。

【０１１２】＜プラークのハイブリダイゼーション＞ハ
イブリダイゼーションとフィルター洗浄は、陽性プラー
クを切り出すためのフィルターの正確な位置決定のため
に有利であるよう、低温で行った。100 mlのハイブリダ
イゼーション緩衝液を次の様に調製した。すなわち、50
mlの、脱イオン化ヌクレアーゼ及びプロテアーゼ試験
済ホルムアミド（Nacalai Tesque)、25 mlの20×SSPE緩
衝液(3 M NaCl、0.2M NaH₂PO₄、20 mM EDTA、pH 7.4：G
ibcoBRL)、5 mlの10% SDS、18 mlの水。200μlの10 mg/
mlのHerring Sperm DNA 溶液(GibcoBRL)及び0.8 mlの水
を含んだ1.5 mlの２本のチューブを、Thermo Alumi Bat
h ALB-120中で98℃にて５分間加熱し、氷上で冷却し、
そしてハイブリダイゼーション緩衝液と合わせた。SDS
は温度低下と共に沈澱する傾向があるため、ハイブリダ
イゼーション緩衝液は、使用直前に約40℃に暖めた（冬
季）。

【０１１３】80 mlのハイブリダイゼーション緩衝液
を、150 mmの丸いプラスティック容器に注ぎ、そして12
個のフィルターを、各々の膜の表側の面が隣の膜の表側
の面と、そして裏面が隣の膜の裏面と接するように、１
つずつ注意して浸漬した。蓋を閉じ、Thomastat Shaker
T-22S中で、32℃、40 rpm の条件で少なくとも３時間
の前ハイブリダイゼーションを行った。

【０１１４】ハイブリダイゼーション緩衝液を前ハイブ
リダイゼーションフィルターから別の150 ml の丸いプ
ラスチック容器内へ注ぎ出し、ハイブリダイゼーション
緩衝液の残り及び４種の標識プローブと混合し、フィル
ターを前述のようにして浸漬した。容器の蓋を閉じて、
Thomastat Shaker T-22S中で、32℃、40 rpm で終夜ハ
イブリダイゼーションを実施した。

【０１１５】別の蓋付きプラスチック容器に入れたフィ
ルターを、Thomastat Shaker T-22S中で40 rpm にて、
次の各洗浄液で洗浄した。 1) 2×SSPE緩衝液, 0.1% SDS： 32℃、10 分 2) 2×SSPE緩衝液, 0.1% SDS： 50℃、1.5 時間 3) 2×SSPE緩衝液, 0.1% SDS： 50℃、1.5 時間

【０１１６】残存の洗浄緩衝液をフィルターから吸い取
り、そして少なくとも1.5時間室温で乾燥させた。12枚
のフィルターを、２つの 35.6×43.2 cm Fuji EC-Aカセ
ットに配列し、Hyperfilm-MP X-ray film (Amersham)を
３〜４日間露光させた。

【０１１７】＜ファージの回収＞Ｘ線フィルムを現像
し、照射にBright Light Boxを用いて、位置決めマーク
に従って陽性プラークの位置を決定した。Ｘ線フィルム
上で各陽性シグナルをその中心に一致させて、各々５×
５mmの栓状にトップアガロースを21Ｇの針で切り出し
て、各0.3mlのＳＭ緩衝液を含む蓋付きの４ mlのサンプ
ルバイアルに入れた。ファージを４℃にて１日の間溶出
した。

【０１１８】＜ファージの第２スクリーニング＞ファー
ジの２回目スクリーニングは、１回目について上記した
のと基本的に同様である。予備的調節の後は、もはや平
板培養のためにファージ溶出液をタイトレーションする
必要はなかた。多くの場合、150 mmのペトリ皿当り、0.
0001μlのファージ溶出液に対応するファージ量が適当
であることが判明した。個々のプラークを、0.2 mlのＳ
Ｍ緩衝液で、４℃にて１日の間溶出し、14μlのDMSO
（ジメチルスルホキシド）を添加して、ファージＤＮＡ
の増殖及び精製まで−70℃で保存した。

【０１１９】＜ファージＤＮＡの調製＞ファージ平板培
養段階の前日の朝に、１個のコロニーをCGアガープレー
トから採取して、0.4% マルトース及び25μg/mlのテト
アサイクリンを補充した３mlのCGブロス（40カプセル/L
CircleGrow)に播き、震盪しつつ37℃にてインキュベー
トした。同日の夕刻に、50μlの培養物を、47 mlの予め
加温した同じ増殖培地に加え、激しく攪拌しつつ37℃に
て終夜インキュベートした。翌日の朝、滅菌した50 ml
の蓋付きポリカーボネート遠心壜 (Beckman)に培養物を
移し、Beckman JA20 rotorを用いて3,000 rpmで10分間
4℃にて遠心した。得られた細胞ペレットを、4.5 mlの
冷却した無菌の10mM MgSO４に再懸濁させ、次いで氷上
においた。

【０１２０】25μg/mlのテトラサイクリンを補充した1.
2% CGアガロース GP-36を含んだ150 mmペトリ皿 (Falco
n)を、ファージの増殖に用いた。アガーを注いだペトリ
皿は、固化した後は乾燥させなかった。それらは冷凍庫
に保存し、そして使用前に37℃の恒温室中で１時間加温
した。

【０１２１】約５×10⁶ pfuを含むファージ溶出液の50
μlを、450μlのＳＭ緩衝液及び500μlの細胞懸濁液と
よく混合し、37℃にて15分間インキュベートし、６mlの
溶融アガロースと混合し、そしてペトリ皿の上に広げ
た。３分後、ペトリ皿を裏返し、37℃にて約８時間イン
キュベートした。

【０１２２】ファージを溶出させるため、各プレートを
８mlのＳＭ緩衝液及び200μlのクロロホルムで覆い、ロ
ータリーシェイカー R-20 mini(Taitec)に固定して、15
0 rpmで4℃にて終夜震盪した。

【０１２３】ファージ溶出液を15 mlの円錐形遠心チュ
ーブ (Greiner) に移し、そしてプレートを更なる２ml
のＳＭ緩衝液で室温にて１時間洗浄した。この２番目の
溶出液を最初のものと合わせ、チューブを3500 rpmで10
分間遠心した（TOMY TS-7 ローター：TOMY LC-122 低速
遠心機）。

【０１２４】QIAGEN Lamda Mini Kit (QIAGEN)を、ファ
ージＤＮＡの精製に用いた。澄明化したプレート溶解物
の８mlを、新しい15 mlの遠心チューブに移し、25μlの
緩衝液Ｌ１(300 mM NaCl, 100mM Tris-HCl, pH 7.5, 10
mM EDTA, 0.2 mg/ml BSA, 20 mg/mlのRNase A 及び 6
mg/mlのDNase I)と混合し、そしてThermo Alumi BathAL
B-120(Iwaki)中で、37℃にて30分間インキュベートし
た。溶解物を1.6 mlの氷冷した緩衝液Ｌ２(30% ポリェ
チレングリコール PEG 6000、3M NaCl)と混合し、氷上
で60分間インキュベートした。チューブの内容物を16×
76 mmの遠心チューブ (Beckman) に移し、そして50 Ti
rotor L70 超遠心機(Beckman)により15,000rpmで４℃に
て15分間遠心した。上清を除去し、チューブを１分間倒
置して残りの液体を切った。先の段階で行われたPEG沈
澱によって形成されたファージ沈澱物を見ることは困難
であった。透明で且つチューブの壁面に分布しているた
めである。そこで、ペレットの完全な再懸濁を確実にす
るために、0.65 mlの緩衝液Ｌ３(100 mM NaCl,100mM Tr
is-HCl, pH 7.5, 25 mM EDTA)を、チューブの壁にピペ
ットで数回かけ、そして２mlのセーフロックチューブに
(Eppendorf)移した。等量の緩衝液４(４% ドデシル硫酸
ナトリウム)をチューブに加え、穏やかに撹拌し、Themo
Alumi Bath ALB-120中で70℃に10分間加熱し、次いで
氷上で冷却した。0.65 mlの緩衝液Ｌ５(3 M 酢酸カリウ
ム, pH 5.5)をチューブに注ぎ、直ちにしかし穏やか
に、４℃ にて30分間、15,000 rpmで遠心した（高速マ
イクロ冷凍遠心機 MRX-150 (TOMY)）。上清を新しい２m
lのチューブに移し、室温にて10分間、15,000 rpmで再
遠心して、あらゆる残存の懸濁物質を除去した。

【０１２５】遠心が行われている間、QIAGEN-tip 20を
廃液トレー上のQIArack 1の中に入れ、そして１mlの緩
衝液QBT(750 mM NaCl, 50 mM MOPS, pH 7.0, 15% エタ
ノール、0.15% Triton X-100)でカラムをと平衡化し
た。QIAGEN-tipが緩衝液を完全に流し去るのに任せた。
樹脂ベッドは幾らかの緩衝液を保持し、容易には乾燥し
ないことから、QIAGEN-tip から目を離してもよい。

【０１２６】上清を即座にQIAGEN-tipに適用し、そして
重力に従って樹脂を通して流した。チップを １mlの緩
衝液ＱＣ(1.0 M NaCl,50 mM MOPS, pH 7.0, 15% エタノ
ール)で２回洗浄した。QIArack 1の上側部分で、清浄な
1.5 mlチューブを取付けた下側ラックを覆い、そしてＤ
ＮＡを0.75 mlの緩衝液ＱＣ(1.25 M NaCl, 50 mM Tris-
HCl, pH 8.5, 15% エタノール)で２回、２本の別の1.5m
l マイクロ遠心チューブ(Treff Lab.) 内にへと溶出し
た。

【０１２７】0.7 液量のイソプロパノールでＤＮＡを沈
澱させ、そして15,000 rpmで30分間、室温にて遠心し
た。上清を注意深く除去して捨てた。ＤＮＡのペレット
を、0.5mlの室温下の70% エタノールで洗浄し、次いで
再遠心した。室温下の70%エタノールによる洗浄を反復
した。エタノールを完全に除去した。ペレットを５分間
手短に風乾し、各チューブ内のＤＮＡを、18μlの NaOH
(pH8) に溶かし、そして同じＤＮＡを含んだ２本のチ
ューブの内容物を合わせた。

【０１２８】＜ファージ挿入物の再クローニング＞ファ
ージ挿入物の配列を調べるために、適当なクローンから
得られたＤＮＡ断片をpUC18ベクターに再クローンし
た。

【０１２９】36μlのλＤＮＡ溶液を、4.5μlの10×Ｈ
緩衝液及び4.5μlのEcoRI(10U/μl)(Takara)と混合し
た。37℃にて終夜消化を行ない、次いで混合物を３つの
ウエルに分け、１% アガロース GP-36ゲルを用いて50 V
にて50分間電気泳動を行った。挿入物を、「ＰＣＲ断片
の精製」の欄に記述したようにして、QIAEX II Gel Ext
raction Kitで精製した。

【０１３０】５μlの溶出された断片を15μlの水と混合
し、Ready-To-Go pUC18 EcoRI/BAP+Ligase(Pharmacia B
iotech)のチューブに加えた。混合物を室温にて３分
間、次いで16℃にて0.5〜３時間、MIR-153インキュベー
ター(Sanyo)内でインキュベートした。0.5μlのライゲ
ーション反応物を、25μlのDH5 Competent High cells
（東洋紡）の形質転換に用いた。形質転換は、基本的
に、「精製したＰＣＲ断片のクローニング」のプロトコ
ールによって行った。形質転換体の1/10を、1.4% Bacto
-Agar (Difuco)、40カプセル/L のCircleGrow (Bio 10
1, Inc.)及び100μg/mlのアンピシリンを含むプレート
上に播いた。プレートを37℃にて終夜インキュベートし
た。

【０１３１】各形質転換体から３つのクローンを採取
し、100μg/mlのアンピシリンを添加した2.5 mlのCircl
eGrow培地で、37℃にて16〜72時間増殖させた。プラス
ミドＤＮＡを、「プラスミドＤＮＡの精製」に記載した
ようにして、RPM AFS Kitを用いて精製した。

【０１３２】挿入物の存在と精製ＤＮＡのおよその濃度
は、２μlのＤＮＡ溶液を2UのEcoRIで消化し１%アガロ
ースゲル電気泳動をすることにより評価した。挿入物の
配向は、上記のプロトコールに従って、M13 ユニバーサ
ル・シークエンシン・グプライマー及びM13 リバース・
シークエンスプライマーを用いたＤＮＡ配列決定により
調べた。

【０１３３】＜入れ子になった欠損体の構築＞再クロー
ンされたＤＮＡ挿入物の配列決定のために、二本鎖ＤＮ
Ａ中に単一方向のみの欠損部位を構築するためエキソヌ
クレアーゼ IIIによるＤＮＡの制御された消化を用い
た。この酵素は、二本鎖ＤＮＡにのみに作用する 3'-エ
キソヌクレーゼであり、平滑末端及び 5'-突出末端は消
化を受けるが、対して、３個以上の塩基長の 3'-突出末
端はこの酵素には抵抗性である。加えて、リン酸骨格中
のモノチオリン酸エステル結合はエキソヌクレアーゼ I
IIの消化に抵抗性であることから、チオヌクレオチドで
「満たされた」 3'-末端（すなわち、5'-突出末端）も
また、消化に抵抗する。当該遺伝子の各ＤＮＡ領域を含
んだ少なくとも２つの独立したクローンを、両端からの
欠損体を作り出すために、Double-strandedNested Dele
tion Kit (Pharmacia Biotech)と共に使用した。

【０１３４】適切な制限酵素は、ＤＮＡ挿入物を切断し
てはならない。3'-及び5'-突出末端又は平滑末端を生ず
る適切な制限酵素のペアが利用できる場合には、２μg
の精製プラスミドＤＮＡをそれらの酵素で少なくとも３
時間消化した。消化の進行をアガロースゲル電気泳動で
モニターするのには、２μlの試料を用いた。両方の消
化が完了したとき、ＤＮＡサンプルを70℃にて10分間加
熱することにより、酵素を失活させた。

【０１３５】適切な制限酵素のペアが見出せない場合
や、3'-突出末端を生じるエンドヌクレアーゼがない場
合、チオヌクレオチドによる末端保護を、方法として選
択した。そのような場合は、2μgのプラスミドＤＮＡ溶
液を、10μlの液量中で第１の制限酵素で消化した。こ
の反応液の最大３μlまでを、反応の進行をモニターす
るのに用いた。FPLCpure Klenow 断片（１単位／μl）
を 20μlの１×Klenow 緩衝液（50 mM Tris-HCl, pH7.
5; 10 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT）と混合することによっ
て、希釈したKlenow断片 (0.05 単位/μl)を調製した。
次のものを1.5 mlのマイクロ遠心チューブに加えた。す
なわち、７μlの制限酵素消化ＤＮＡ、１μlの10×Klen
ow緩衝液、１μlのdNTPαS混合液 (dATPαS、dCTPαS、
dGTPαS及びdTTPαSの各400uMを含んだ水溶液)、及び１
μlの希釈したKlenow断片である。チューブを穏やかに
攪拌し、手短に遠心し、そして37℃にて15分間インキュ
ベートした。反応物を65℃に20分間加熱し、続いて20μ
lのNaCl/グリコーゲン（250 mMのNaClと250 ng/μlのグ
リコーゲンとを含んだ水溶液）及び75μlのエタノール
加え、混合物をドライアイス上に10分間置くか又は−80
にて少なくとも１時間冷却した。沈殿したＤＮＡを、４
℃にて10分間、15、000rpm の遠心を行なうことによっ
て収集した。上清を注意深く除去して捨てた。ペレット
を250μlの70%エタノールで濯ぎ、１分間遠心した。上
清を注意深く除去し、ペレットを真空下に５分間乾燥さ
せ、そして10μlの水に再溶解させた。ＤＮＡを、最終
反応液量20μl中で、第２の制限酵素により消化し、70
℃に10分間加熱して酵素を失活させた。

【０１３６】マイクロ遠心チューブ中に、S1ヌクレアー
ゼ/緩衝液混合液を次のように調整した。すなわち、33
μlのS1緩衝液、66μlの蒸留水及び１μlのS1ヌクレア
ーゼである。この混合物の３μlをピペットで20本のマ
イクロ遠心チューブの各々に移し、氷上に置いた。

【０１３７】適切なNaCl濃度の２×ExoIII緩衝液24μl
を調製した。NaCl濃度は、２回消化されたＤＮＡの等量
で希釈されたときに75 mM又はそれ以下になるようでな
ければならない。

【０１３８】1.5 mlのマイクロ遠心チューブ中で、20μ
lの２×ExoIII緩衝液を20μl (2ug)の２回消化された二
本鎖ＤＮＡと混合し、Thermo Bath ALB-120中で30℃に
て２〜３分間平衡化した。２μlの試料を「時間＝０」
のコントロールサンプルとして採取し、そして３μlのS
1ヌクレアーゼ/緩衝液を含んだ適当なチューブに入れて
よく混合し、氷上に置いた。

【０１３９】１μlのエキソヌクレアーゼ IIIを加え、
穏やかに混合し、30℃でインキュベーションを続け、５
分ごとに２μlのサンプルを反応物から採取して、直ち
に３μlのS1ヌクレアーゼ／緩衝液と確実に混合した。
これらのチューブは何れも、エキソヌクレアーゼ III反
応物から全ての経時的サンプルを採取し終わるまで、氷
上に維持した。

【０１４０】全ての経時的サンプルを採取してS1ヌクレ
アーゼ／緩衝液と混合し終わった後、それらを同時に室
温にて30分間インキュベートした。

【０１４１】１μlのS1ヌクレアーゼ停止溶液を各サン
プルに加え、チューブを65℃にて30分間インキュベート
した。経時的サンプルの半分を、欠損体の電気泳動分析
に用い、残りの半分を、ライゲーションによる再環状化
に用いた。これらの２つの工程は、全ての試料につき同
時に平行して行い、そして欠損体分析の結果を、形質転
換に使用すべき再環状化サンプルの選択に用いた。

【０１４２】３μlの各サンプルを２μlの試料添加緩衝
液（50% グリセロール、1 mM EDTA及び0.01% ブロムフ
ェノールブルー）と混合し、0.5μg/mlのエチジウムブ
ロマイドを含む1%のアガロースゲル（Agarose GP-36、N
acalai Tesqu）による30分の電気泳動によって分析し
た。

【０１４３】電気泳動が進行する間に、各経時的サンプ
ルの残りの３μlを、再ライゲーションにションに用い
た。ライゲーション液の調製は、1.5 mlのマイクロ遠心
チューブ中で次のものを混合することによって調製し
た。すなわち、40μlの10×ライゲーション緩衝液、80
μlの25% PEG、２μlのT4 DNA リガーゼ、及び218μlの
蒸留水である。このライゲーション混合液の17μlを各
経時的サンプルの３μlに加え、穏やかに混合し、室温
にて２時間インキュベートした。

【０１４４】電気泳動が完了したとき、問題の欠損体を
どの経時的サンプルが含んでいるかを決定するために、
ゲルを検査した。問題の欠損体を含んだサンプルのみ
を、Ecoliの形質転換に用いた。２μlのライゲーション
反応物を、10μlのDH5 Competent High Cell（東洋紡）
の形質転換に用いた。形質転換は、前記「精製ＰＣＲ断
片のクローニング」の欄のプロトコールに従って行なっ
た。得られた形質転換体の1/10を、1.4%のBacto-Agar(D
ifco)、40カプセル/LのCircleGrow,L(Bio 101,Inc.)及
び100μg/mlのアンピシリンを含んだプレート上に播い
た。各プレートからの２つのコロニーを増殖させ、EcoR
I消化したプラスミドＤＮＡの電気泳動及びそれに続く
前述の手順によるＤＮＡ配列決定によって、欠損の程度
を分析した。ＤＮＡ配列をDNASISコンピュータプログラ
ムとリンクさせ、全長挿入物を編纂（コンパイル）し
た。

【０１４５】＜配列決定データのコンピュータ解析＞ヌ
クレオチド配列の解析は、DNASISコンピュータープログ
ラム及びインターネットで入手可能な次ののソフトウェ
アを用いて実施した。すなわち、BLAST (Basic Local A
lignment Search Tool)、MOTIF (Protein Sequence Mot
if Search)、PSORT (Prediction of Protein Sorting S
ignals and Localization Sites inAmino Acid Sequenc
es)、SOSUI (Prediction of Transmembrane Segment
s)、SIM(Alignment Tool for Protein sequences)、及
びGeneStream align である。

【０１４６】＜ノーザーンハイブリダイゼーション＞１
レーン当り種々のヒト細胞からのpolyA⁺RNA 約２μgを
含んだMutile TissueNorthern (MTN)ブロット (Clontec
h)を、前記「プラークのハイブリダイゼーション」の欄
に記載したようにして、hGHITSに特異的なプローブとハ
イブリダイズさせた。

【０１４７】前ハイブリダイゼーション及びハイブリダ
イゼーションを、32℃でなく42℃で行った。次の洗浄を
行なった： 1) 2×SSPE緩衝液、0.1% SDS ：42℃、10 分間 2) 2×SSPE緩衝液、0.1% SDS ：65℃、1.5 時間 3) 0.5×SSPE緩衝液、0.1% SDS：65℃、1.5 時間 4) 0.1×SSPE緩衝液、0.1% SDS：65℃、1.5 時間 5) 0.1×SSPE緩衝液、0.1% SDS：65℃、1.5 時間

【０１４８】BIOMAX MS scientific imaging film (Kod
ak)を利用した。理由は、Hyperfilm-MPより殆ど８倍も
感度が高いからである。 膜でフィルムを露光し、Fuji
EC-Aカセットを用いて３週間-80℃で増感スクリーンを
備えたFuji EC-Aカセットを用いて、フィルムを膜に３
週間露光させた。フィルムの現像前、カセットを室温で
少なくとも１時間暖めた。

【０１４９】

【発明の効果】本発明の遺伝子を構成するＤＮＡ、その
転写体であるｍＲＮＡ、及び翻訳されたタンパク質は、
成長ホルモン分泌過剰や小人症における成長ホルモンの
投与過剰等のような、成長ホルモン又はIGF-1のレベル
の増大によって誘発される可能性のある、心臓疾患、血
管障害、糖尿病性腎疾患や乳癌、結腸直腸癌、白血病等
の悪性腫瘍において、治療薬、診断薬、予防薬として使
用できる可能性を提供する。

【０１５０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Human Tumor Suppressing Gene <160> 4 <210> 1 <211> 5486 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgcggcgtga gcgccccggg aagatggagc agtcgccgtc cacgccaccg ccgccgcccg 60 gggctccccc gtccctgcgg ggccagcagc agctccagcc accagtgccc ggtctcccgg 120 cgcgagaggc ccgggagccg ccggccagga cgcccccgag ggtgtagacc gcgcccctgg 180 agagagtgat aatcttcaaa atgaagactt tggaaaattt taggttctct ataggaacta 240 caaaaatgga aggaaagaac attttcaaaa ggaaattatt ttgaaagtat gtttacaaca 300 aactgatact attgacagtt ttttttttta aataataaaa cactttaaga agattgtatt 360 tatggtaaaa ggaaactgga ctaaca atg agg cca aag act ttt cct gcc acg 413 Met Arg Pro Lys Thr Phe Pro Ala Thr 1 5 act tat tct gga aat agc cgg cag cga ctg caa gag att cgt gag ggg 461 Thr Tyr Ser Gly Asn Ser Arg Gln Arg Leu Gln Glu Ile Arg Glu Gly 10 15 20 25 tta aag cag cca tcc aag tct tcg gtt cag ggg cta ccc gca gga cca 509 Leu Lys Gln Pro Ser Lys Ser Ser Val Gln Gly Leu Pro Ala Gly Pro 30 35 40 aac agt gac act tcc ctg gat gcc aaa gtc ctg ggg agc aaa gat gcc 557 Asn Ser Asp Thr Ser Leu Asp Ala Lys Val Leu Gly Ser Lys Asp Ala 45 50 55 acc agg cag cag cag cag atg aga gcc acc cca aag ttc gga cct tat 605 Thr Arg Gln Gln Gln Gln Met Arg Ala Thr Pro Lys Phe Gly Pro Tyr 60 65 70 cag aaa gcc ttg agg gaa atc aga tat tcc ttg ttg cct ttt gct aat 653 Gln Lys Ala Leu Arg Glu Ile Arg Tyr Ser Leu Leu Pro Phe Ala Asn 75 80 85 gaa tcg ggc acc tct gca gct gca gaa gtg aac cgg caa atg ctg cag 701 Glu Ser Gly Thr Ser Ala Ala Ala Glu Val Asn Arg Gln Met Leu Gln 90 95 100 105 gaa ctg gtg aac gca gga tgc gac cag gag atg gct ggc cga gct ctc 749 Glu Leu Val Asn Ala Gly Cys Asp Gln Glu Met Ala Gly Arg Ala Leu 110 115 120 aag cag act ggc agc agg agc atc gag gcc gcc ctg gag tac atc agc 797 Lys Gln Thr Gly Ser Arg Ser Ile Glu Ala Ala Leu Glu Tyr Ile Ser 125 130 135 aag atg ggc tac ctg gac ccg agg aat gag cag att gtg cgg gtc att 845 Lys Met Gly Tyr Leu Asp Pro Arg Asn Glu Gln Ile Val Arg Val Ile 140 145 150 aag cag acc tcc cca gga aag ggg ctc atg cca acc cca gtg acg cgg 893 Lys Gln Thr Ser Pro Gly Lys Gly Leu Met Pro Thr Pro Val Thr Arg 155 160 165 agg ccc agc ttc gaa gga acc ggc gat tcg ttt gcg tcc tac cac cag 941 Arg Pro Ser Phe Glu Gly Thr Gly Asp Ser Phe Ala Ser Tyr His Gln 170 175 180 185 ctg agc ggt acc ccc tac gag ggc cca agc ttc ggc gct gac ggc ccc 989 Leu Ser Gly Thr Pro Tyr Glu Gly Pro Ser Phe Gly Ala Asp Gly Pro 190 195 200 acg gcg ctg gag gag atg ccg cgg ccg tac gtg gac tac ctt ttc ccc 1037 Thr Ala Leu Glu Glu Met Pro Arg Pro Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Pro 205 210 215 gga gtc ggc ccc cac ggg ccc ggc cac cag cac cag cac cca ccc aag 1085 Gly Val Gly Pro His Gly Pro Gly His Gln His Gln His Pro Pro Lys 220 225 230 ggc tac ggt gcc agc gta gag gca gca ggg gca cac ttc ccg ctg cag 1133 Gly Tyr Gly Ala Ser Val Glu Ala Ala Gly Ala His Phe Pro Leu Gln 235 240 245 ggc gcg cac tac ggg cgg ccg cac ctg ctg gtg cct ggg gaa ccc ctg 1181 Gly Ala His Tyr Gly Arg Pro His Leu Leu Val Pro Gly Glu Pro Leu 250 255 260 265 ggc tac gga gtg cag cgc agc ccc tcc ttc cag agc aag acg ccg ccg 1229 Gly Tyr Gly Val Gln Arg Ser Pro Ser Phe Gln Ser Lys Thr Pro Pro 270 275 280 gag acc ggg ggt tac gcc agc ctg ccc acg aag ggc cag gga gga ccg 1277 Glu Thr Gly Gly Tyr Ala Ser Leu Pro Thr Lys Gly Gln Gly Gly Pro 285 290 295 cca ggc gcc ggc ctc gct ttc cca ccc cct gcc gcc ggg ctc tac gtg 1325 Pro Gly Ala Gly Leu Ala Phe Pro Pro Pro Ala Ala Gly Leu Tyr Val 300 305 310 ccg cac cca cac cac aag cag gcc ggt ccc gcg gcc cac cag ctg cat 1373 Pro His Pro His His Lys Gln Ala Gly Pro Ala Ala His Gln Leu His 315 320 325 gtg ctg ggc tcc cgc agc cag gtg ttc gcc agc gac agc ccc ccg cag 1421 Val Leu Gly Ser Arg Ser Gln Val Phe Ala Ser Asp Ser Pro Pro Gln 330 335 340 345 agc ctg ctc act ccc tcg cgg aac agc ctc aac gtg gac ctg tat gaa 1469 Ser Leu Leu Thr Pro Ser Arg Asn Ser Leu Asn Val Asp Leu Tyr Glu 350 355 360 ttg ggc agc acc tcc gtc cag cag tgg ccg gct gcc acc ctg gcc cgc 1517 Leu Gly Ser Thr Ser Val Gln Gln Trp Pro Ala Ala Thr Leu Ala Arg 365 370 375 cgg gac tcc ctg cag aag ccg ggc ctg gag gcg ccg ccg cgc gcg cac 1565 Arg Asp Ser Leu Gln Lys Pro Gly Leu Glu Ala Pro Pro Arg Ala His 380 385 390 gtg gcc ttc cgg cct gac tgc cca gtg ccc agc agg acc aac tcc ttc 1613 Val Ala Phe Arg Pro Asp Cys Pro Val Pro Ser Arg Thr Asn Ser Phe 395 400 405 aac agc cac cag ccg cgg ccc ggt ccg cct ggc aag gcc gag ccc tcc 1661 Asn Ser His Gln Pro Arg Pro Gly Pro Pro Gly Lys Ala Glu Pro Ser 410 415 420 425 ctg ccc gcc ccc aac acc gtg acg gct gtc acg gcc gcg cac atc ttg 1709 Leu Pro Ala Pro Asn Thr Val Thr Ala Val Thr Ala Ala His Ile Leu 430 435 440 cac ccg gtg aag agc gtg cgt gtg ctg agg ccg gag ccg cag acg gct 1757 His Pro Val Lys Ser Val Arg Val Leu Arg Pro Glu Pro Gln Thr Ala 445 450 455 gtg ggg ccc tcg cac ccc gcc tgg gtg ccc gcg cct gcc ccg gcc ccc 1805 Val Gly Pro Ser His Pro Ala Trp Val Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 460 465 470 gcc ccc gcc ccc gcc ccg gct gcg gag ggc ttg gac gcc aag gag gag 1853 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Glu Gly Leu Asp Ala Lys Glu Glu 475 480 485 cat gcc ctg gcg ctg ggc ggc gca ggc gcc ttc ccg ctg gac gtg gag 1901 His Ala Leu Ala Leu Gly Gly Ala Gly Ala Phe Pro Leu Asp Val Glu 490 495 500 505 tac gga ggc cca gac cgg agg tgc ccg cct ccg ccc tac ccg aag cac 1949 Tyr Gly Gly Pro Asp Arg Arg Cys Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Lys His 510 515 520 ctg ctg ctg cgc agc aag tcg gag cag tac gac ctg gac agc ctg tgc 1997 Leu Leu Leu Arg Ser Lys Ser Glu Gln Tyr Asp Leu Asp Ser Leu Cys 525 530 535 gca ggc atg gag cag agc ctc cgt gcg ggc ccc aac gag ccc gag ggc 2045 Ala Gly Met Glu Gln Ser Leu Arg Ala Gly Pro Asn Glu Pro Glu Gly 540 545 550 ggc gac aag agc cgc aaa agc gcc aag ggg gac aaa ggc gga aag gat 2093 Gly Asp Lys Ser Arg Lys Ser Ala Lys Gly Asp Lys Gly Gly Lys Asp 555 560 565 aaa aag cag att cag acc tct ccc gtt ccc gtc cgc aaa aac agc aga 2141 Lys Lys Gln Ile Gln Thr Ser Pro Val Pro Val Arg Lys Asn Ser Arg 570 575 580 585 gac gaa gag aag aga gag tca cgc atc aag agc tac tcg cca tac gcc 2189 Asp Glu Glu Lys Arg Glu Ser Arg Ile Lys Ser Tyr Ser Pro Tyr Ala 590 595 600 ttt aag ttc ttc atg gag cag cac gtg gag aat gtc atc aaa acc tac 2237 Phe Lys Phe Phe Met Glu Gln His Val Glu Asn Val Ile Lys Thr Tyr 605 610 615 cag cag aag gtt aac cgg agg ctg cag ctg gag caa gaa atg gcc aaa 2285 Gln Gln Lys Val Asn Arg Arg Leu Gln Leu Glu Gln Glu Met Ala Lys 620 625 630 gct gga ctc tgt gaa gct gag cag gag cag atg cgg aag atc ctc tac 2333 Ala Gly Leu Cys Glu Ala Glu Gln Glu Gln Met Arg Lys Ile Leu Tyr 635 640 645 cag aaa gag tct aat tac aac agg tta aag agg gcc aag atg gac aag 2381 Gln Lys Glu Ser Asn Tyr Asn Arg Leu Lys Arg Ala Lys Met Asp Lys 650 655 660 665 tct atg ttt gtc aag atc aaa acc ctg ggg atc ggt gcc ttt gga gaa 2429 Ser Met Phe Val Lys Ile Lys Thr Leu Gly Ile Gly Ala Phe Gly Glu 670 675 680 gtg tgc ctt gct tgt aag gtg gac act cac gcc ctg tac gcc atg aag 2477 Val Cys Leu Ala Cys Lys Val Asp Thr His Ala Leu Tyr Ala Met Lys 685 690 695 acc cta agg aaa aag gat gtc ctg aac cgg aat cag gtg gcc cac gtc 2525 Thr Leu Arg Lys Lys Asp Val Leu Asn Arg Asn Gln Val Ala His Val 700 705 710 aag gcc gag agg gac atc ctg gcc gag gca gac aat gag tgg gtg gtc 2573 Lys Ala Glu Arg Asp Ile Leu Ala Glu Ala Asp Asn Glu Trp Val Val 715 720 725 aaa ctc tac tac tcc ttc caa gac aaa gac agc ctg tac ttt gtg atg 2621 Lys Leu Tyr Tyr Ser Phe Gln Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Phe Val Met 730 735 740 745 gac tac atc cct ggt ggg gac atg atg agc ctg ctg atc cgg atg gag 2669 Asp Tyr Ile Pro Gly Gly Asp Met Met Ser Leu Leu Ile Arg Met Glu 750 755 760 gtc ttc cct gag cac ctg gcc cgg ttc tac atc gca gag ctg act ttg 2717 Val Phe Pro Glu His Leu Ala Arg Phe Tyr Ile Ala Glu Leu Thr Leu 765 770 775 gcc att gag agt gtc cac aag atg ggc ttc atc cac cga gac atc aag 2765 Ala Ile Glu Ser Val His Lys Met Gly Phe Ile His Arg Asp Ile Lys 780 785 790 cct gat aac att ttg ata gat ctg gat ggt cac att aaa ctc aca gat 2813 Pro Asp Asn Ile Leu Ile Asp Leu Asp Gly His Ile Lys Leu Thr Asp 795 800 805 ttc ggc ctc tgc act ggg ttc agg tgg act cac aat tcc aaa tat tac 2861 Phe Gly Leu Cys Thr Gly Phe Arg Trp Thr His Asn Ser Lys Tyr Tyr 810 815 820 825 cag aaa ggg agc cat gtc aga cag gac agc atg gag ccc agc gac ctc 2909 Gln Lys Gly Ser His Val Arg Gln Asp Ser Met Glu Pro Ser Asp Leu 830 835 840 tgg gat gat gtg tct aac tgt cgg tgt ggg gac agg ctg aag acc cta 2957 Trp Asp Asp Val Ser Asn Cys Arg Cys Gly Asp Arg Leu Lys Thr Leu 845 850 855 gag cag agg gcg cgg aag cag cac cag agg tgc ctg gca cat tca ctg 3005 Glu Gln Arg Ala Arg Lys Gln His Gln Arg Cys Leu Ala His Ser Leu 860 865 870 gtg ggg act cca aac tac atc gca ccc gag gtg ctc ctc cgc aaa ggg 3053 Val Gly Thr Pro Asn Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Leu Arg Lys Gly 875 880 885 tac act caa ctc tgt gac tgg tgg agt gtt gga gtg att ctc ttc gag 3101 Tyr Thr Gln Leu Cys Asp Trp Trp Ser Val Gly Val Ile Leu Phe Glu 890 895 900 905 atg ctg gtg ggg cag ccg ccc ttt ttg gca cct act ccc aca gaa acc 3149 Met Leu Val Gly Gln Pro Pro Phe Leu Ala Pro Thr Pro Thr Glu Thr 910 915 920 cag ctg aag gtg atc aac tgg gag aac acg ctc cac att cca gcc cag 3197 Gln Leu Lys Val Ile Asn Trp Glu Asn Thr Leu His Ile Pro Ala Gln 925 930 935 gtg aag ctg agc cct gag gcc agg gac ctc atc acc aag ctg tgc tgc 3245 Val Lys Leu Ser Pro Glu Ala Arg Asp Leu Ile Thr Lys Leu Cys Cys 940 945 950 tcc gca gac cac cgc ctg ggg cgg aat ggg gcc gat gac ctg aag gcc 3293 Ser Ala Asp His Arg Leu Gly Arg Asn Gly Ala Asp Asp Leu Lys Ala 955 960 965 cac ccc ttc ttc agc gcc att gac ttc tcc agt gac atc cgg aag cag 3341 His Pro Phe Phe Ser Ala Ile Asp Phe Ser Ser Asp Ile Arg Lys Gln 970 975 980 985 cca gcc ccc tac gtt ccc acc atc agc cac ccc atg gac acc tcg aat 3389 Pro Ala Pro Tyr Val Pro Thr Ile Ser His Pro Met Asp Thr Ser Asn 990 995 1000 ttc gac ccc gta gat gaa gaa agc cct tgg aac gat gcc agc gaa ggt 3437 Phe Asp Pro Val Asp Glu Glu Ser Pro Trp Asn Asp Ala Ser Glu Gly 1005 1010 1015 agc acc aag gcc tgg gac aca ctc acc tcg ccc aat aac aag cat cct 3485 Ser Thr Lys Ala Trp Asp Thr Leu Thr Ser Pro Asn Asn Lys His Pro 1020 1025 1030 gag cac gca ttt tac gaa ttc acc ttc cga agg ttc ttt gat gac aat 3533 Glu His Ala Phe Tyr Glu Phe Thr Phe Arg Arg Phe Phe Asp Asp Asn 1035 1040 1045 ggc tac ccc ttt cga tgc cca aag cct tca gga gca gaa gct tca cag 3581 Gly Tyr Pro Phe Arg Cys Pro Lys Pro Ser Gly Ala Glu Ala Ser Gln 1050 1055 1060 1065 gct gag agc tca gat tta gaa agc tct gat ctg gtg gat cag act gaa 3629 Ala Glu Ser Ser Asp Leu Glu Ser Ser Asp Leu Val Asp Gln Thr Glu 1070 1075 1080 ggc tgc cag cct gtg tac gtg tagatggggg ccaggcaccc ccaccactcg 3680 Gly Cys Gln Pro Val Tyr Val 1085 ctgcctccca ggtcagggtc ccggagccgg tgccctcaca ggccaatagg gaagccgagg 3740 gctgttttgt tttaaattag tccgtcgatt acttcacttg aaattctgct cttcaccaag 3800 aaaacccaaa caggacactt ttgaaaacag gactcagcat cgctttcaat aggcttttca 3860 ggaccttcac tgcattaaaa caatattttt gaaaatttag tacagtttag aaagagcact 3920 tattttgttt atatccattt tttcttacta aattataggg attaactttg acaaatcatg 3980 ctgctgttat tttctacatt tgtattttat ccatagcact tattcacatt taggaaaaga 4040 cataaaaact gaagaacatt 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tggaaaattt taggttctct ataggaacta 240 caaaaatgga aggaaagaac attttcaaaa ggaaattatt ttgaaagtat gtttacaaca 300 aactgatact attgacagtt ttttttttta aataataaaa cactttaaga agattgtatt 360 tatggtaaaa ggaaactgga ctaaca atg agg cca aag act ttt cct gcc acg 413 Met Arg Pro Lys Thr Phe Pro Ala Thr 1 5 act tat tct gga aat agc cgg cag cga ctg caa gag att cgt gag ggg 461 Thr Tyr Ser Gly Asn Ser Arg Gln Arg Leu Gln Glu Ile Arg Glu Gly 10 15 20 25 tta aaa cag cca tcc aag tct tcg gtt cag ggg cta ccc gca gga cca 509 Leu Lys Gln Pro Ser Lys Ser Ser Val Gln Gly Leu Pro Ala Gly Pro 30 35 40 aac agt gac act tcc ctg gat gcc aaa gtc ctg ggg agc aaa gat gcc 557 Asn Ser Asp Thr Ser Leu Asp Ala Lys Val Leu Gly Ser Lys Asp Ala 45 50 55 acc agg cag cag cag cag atg aga gcc acc cca aag ttc gga cct tat 605 Thr Arg Gln Gln Gln Gln Met Arg Ala Thr Pro Lys Phe Gly Pro Tyr 60 65 70 cag aaa gcc ttg agg gaa atc aga tat tcc ttg ttg cct ttt gct aat 653 Gln Lys Ala Leu Arg Glu Ile Arg Tyr Ser Leu Leu Pro Phe Ala Asn 75 80 85 gaa 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4400 gttctagaca gtgtgctgat aatgtattgt gcgggtgacc tcttcgctat gattgtatct 4460 cttactgttt tgttaaagaa atgcagatgt gtaactgaga agtgatttgt gtgtgtgtct 4520 tggttgtgat tggattcttt gggggggggg gaactgaaac atttgtcata tactgaactt 4580 atatacatca aaagggatta atacagcgat gccaaaaagt ttaatcacgg acacacgtcc 4640 gtttctgtag tccgtatgct ctttcattct tggtagagct ggtatgtgga atgccatacc 4700 tctgacccta ctacttacct ttttactgac agactgccca cactgaaagc ttcagtgaat 4760 gttcttagtc ctgttttctt ctgttactgt caggaaactg agtgatctaa tggttctctc 4820 actttttttt tgttctttta gtgtactttg aagtatcaaa tcttaacttg gtttaaacaa 4880 tacatattcc taacctttgt aaaaaagcaa agattcttca aaatgacatt gaaataaaaa 4940 gtaagccata cgtattttct tagaagtata gatgtatgtg cgtgtataca cacacacaca 5000 cacacacaga gataaacaca atattcctta tttcaaatta gtatgattcc tatttaaagt 5060 gatttatatt tgagtaaaaa gttcaattct tttttgcttt ttaaaaaatc tgatgcttca 5120 taattttcat tatattattc cacatatttt tccttgaagt tcttagcata atgtatccat 5180 tacttagtat atatctaggc aacaacactt agaagtttat cagtgtttaa actaaaaaaa 5240 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Leu Asp Pro 130 135 140 Arg Asn Glu Gln Ile Val Arg Val Ile Lys Gln Thr Ser Pro Gly Lys 145 150 155 160 Gly Leu Met Pro Thr Pro Val Thr Arg Arg Pro Ser Phe Glu Gly Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Phe Ala Ser Tyr His Gln Leu Ser Gly Thr Pro Tyr Glu 180 185 190 Gly Pro Ser Phe Gly Ala Asp Gly Pro Thr Ala Leu Glu Glu Met Pro 195 200 205 Arg Pro Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Pro Gly Val Gly Pro His Gly Pro 210 215 220 Gly His Gln His Gln His Pro Pro Lys Gly Tyr Gly Ala Ser Val Glu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Ala His Phe Pro Leu Gln Gly Ala His Tyr Gly Arg Pro 245 250 255 His Leu Leu Val Pro Gly Glu Pro Leu Gly Tyr Gly Val Gln Arg Ser 260 265 270 Pro Ser Phe Gln Ser Lys Thr Pro Pro Glu Thr Gly Gly Tyr Ala Ser 275 280 285 Leu Pro Thr Lys Gly Gln Gly Gly Pro Pro Gly Ala Gly Leu Ala Phe 290 295 300 Pro Pro Pro Ala Ala Gly Leu Tyr Val Pro His Pro His His Lys Gln 305 310 315 320 Ala Gly Pro Ala Ala His Gln Leu His Val Leu Gly Ser Arg Ser Gln 325 330 335 Val Phe Ala Ser Asp Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Thr Pro Ser Arg 340 345 350 Asn Ser Leu Asn Val Asp Leu Tyr Glu Leu Gly Ser Thr Ser Val Gln 355 360 365 Gln Trp Pro Ala Ala Thr Leu Ala Arg Arg Asp Ser Leu Gln Lys Pro 370 375 380 Gly Leu Glu Ala Pro Pro Arg Ala His Val Ala Phe Arg Pro Asp Cys 385 390 395 400 Pro Val Pro Ser Arg Thr Asn Ser Phe Asn Ser His Gln Pro Arg Pro 405 410 415 Gly Pro Pro Gly Lys Ala Glu Pro Ser Leu Pro Ala Pro Asn Thr Val 420 425 430 Thr Ala Val Thr Ala Ala His Ile Leu His Pro Val Lys Ser Val Arg 435 440 445 Val Leu Arg Pro Glu Pro Gln Thr Ala Val Gly Pro Ser His Pro Ala 450 455 460 Trp Val Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 465 470 475 480 Ala Glu Gly Leu Asp Ala Lys Glu Glu His Ala Leu Ala Leu Gly Gly 785 490 495 Ala Gly Ala Phe Pro Leu Asp Val Glu Tyr Gly Gly Pro Asp Arg Arg 500 505 510 Cys Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Lys His Leu Leu Leu Arg Ser Lys Ser 515 520 525 Glu Gln Tyr Asp Leu Asp Ser Leu Cys Ala Gly Met Glu Gln Ser Leu 530 353 340 Arg Ala Gly Pro Asn Glu Pro Glu Gly Gly Asp Lys Ser Arg Lys Ser 545 550 555 560 Ala Lys Gly Asp Lys Gly Gly Lys Asp Lys Lys Gln Ile Gln Thr Ser 565 570 575 Pro Val Pro Val Arg Lys Asn Ser Arg Asp Glu Glu Lys Arg Glu Ser 580 585 590 Arg Ile Lys Ser Tyr Ser Pro Tyr Ala Phe Lys Phe Phe Met Glu Gln 595 600 605 His Val Glu Asn Val Ile Lys Thr Tyr Gln Gln Lys Val Asn Arg Arg 610 615 620 Leu Gln Leu Glu Gln Glu Met Ala Lys Ala Gly Leu Cys Glu Ala Glu 625 630 635 640 Gln Glu Gln Met Arg Lys Ile Leu Tyr Gln Lys Glu Ser Asn Tyr Asn 645 650 655 Arg Leu Lys Arg Ala Lys Met Asp Lys Ser Met Phe Val Lys Ile Lys 660 665 670 Thr Leu Gly Ile Gly Ala Phe Gly Glu Val Cys Leu Ala Cys Lys Val 675 680 685 Asp Thr His Ala Leu Tyr Ala Met Lys Thr Leu Arg Lys Lys Asp Val 690 695 700 Leu Asn Arg Asn Gln Val Ala His Val Lys Ala Glu Arg Asp Ile Leu 705 710 715 720 Ala Glu Ala Asp Asn Glu Trp Val Val Lys Leu Tyr Tyr Ser Phe Gln 725 730 735 Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Phe Val Met Asp Tyr Ile Pro Gly Gly Asp 740 745 750 Met Met Ser Leu Leu Ile Arg Met Glu Val Phe Pro Glu His Leu Ala 755 760 765 Arg Phe Tyr Ile Ala Glu Leu Thr Leu Ala Ile Glu Ser Val His Lys 770 775 780 Met Gly Phe Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn Ile Leu Ile Asp 785 790 795 800 Leu Asp Gly His Ile Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Thr Gly Phe 805 810 815 Arg Trp Thr His Asn Ser Lys Tyr Tyr Gln Lys Gly Ser His Val Arg 820 825 830 Gln Asp Ser Met Glu Pro Ser Asp Leu Trp Asp Asp Val Ser Asn Cys 835 840 845 Arg Cys Gly Asp Arg Leu Lys Thr Leu Glu Gln Arg Ala Arg Lys Gln 850 855 860 His Gln Arg Cys Leu Ala His Ser Leu Val Gly Thr Pro Asn Tyr Ile 865 870 875 880 Ala Pro Glu Val Leu Leu Arg Lys Gly Tyr Thr Gln Leu Cys Asp Trp 885 890 895 Trp Ser Val Gly Val Ile Leu Phe Glu Met Leu Val Gly Gln Pro Pro 900 905 910 Phe Leu Ala Pro Thr Pro Thr Glu Thr Gln Leu Lys Val Ile Asn Trp 915 920 925 Glu Asn Thr Leu His Ile Pro Ala Gln Val Lys Leu Ser Pro Glu Ala 930 935 940 Arg Asp Leu Ile Thr Lys Leu Cys Cys Ser Ala Asp His Arg Leu Gly 945 950 955 960 Arg Asn Gly Ala Asp Asp Leu Lys Ala His Pro Phe Phe Ser Ala Ile 965 970 975 Asp Phe Ser Ser Asp Ile Arg Lys Gln Pro Ala Pro Tyr Val Pro Thr 980 985 990 Ile Ser His Pro Met Asp Thr Ser Asn Phe Asp Pro Val Asp Glu Glu 995 1000 1005 Ser Pro Trp Asn Asp Ala Ser Glu Gly Ser Thr Lys Ala Trp Asp Thr 1010 1015 1020 Leu Thr Ser Pro Asn Asn Lys His Pro Glu His Ala Phe Tyr Glu Phe 1025 1030 1035 1040 Thr Phe Arg Arg Phe Phe Asp Asp Asn Gly Tyr Pro Phe Arg Cys Pro 1045 1050 1055 Lys Pro Ser Gly Ala Glu Ala Ser Gln Ala Glu Ser Ser Asp Leu Glu 1060 1065 1070 Ser Ser Asp Leu Val Asp Gln Thr Glu Gly Cys Gln Pro Val Tyr Val 1075 1080 1085 <210> 4 <211> 1088 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Arg Pro Lys Thr Phe Pro Ala Thr Thr Tyr Ser Gly Asn Ser Arg 1 5 10 15 Gln Arg Leu Gln Glu Ile Arg Glu Gly Leu Lys Gln Pro Ser Lys Ser 20 25 30 Ser Val Gln Gly Leu Pro Ala Gly Pro Asn Ser Asp Thr Ser Leu Asp 35 40 45 Ala Lys Val Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Arg Gln Gln Gln Gln Met 50 55 60 Arg Ala Thr Pro Lys Phe Gly Pro Tyr Gln Lys Ala Leu Arg Glu Ile 65 70 75 80 Arg Tyr Ser Leu Leu Pro Phe Ala Asn Glu Ser Gly Thr Ser Ala Ala 85 90 95 Ala Glu Val Asn Arg Gln Met Leu Gln Glu Leu Val Asn Ala Gly Cys 100 105 110 Asp Gln Glu Met Ala Gly Arg Ala Leu Lys Gln Thr Gly Ser Arg Ser 115 120 125 Ile Glu Ala Ala Leu Glu Tyr Ile Ser Lys Met Gly Tyr Leu Asp Pro 130 135 140 Arg Asn Glu Gln Ile Val Arg Val Ile Lys Gln Thr Ser Pro Gly Lys 145 150 155 160 Gly Leu Met Pro Thr Pro Val Thr Arg Arg Pro Ser Phe Glu Gly Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Phe Ala Ser Tyr His Gln Leu Ser Gly Thr Pro Tyr Glu 180 185 190 Gly Pro Ser Phe Gly Ala Asp Gly Pro Thr Ala Leu Glu Glu Met Pro 195 200 205 Arg Pro Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Pro Gly Val Gly Pro His Gly Pro 210 215 220 Gly His Gln His Gln His Pro Pro Lys Gly Tyr Gly Ala Ser Val Glu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Ala His Phe Pro Leu Gln Gly Ala His Tyr Gly Arg Pro 245 250 255 His Leu Leu Val Pro Gly Glu Pro Leu Gly Tyr Gly Val Gln Arg Ser 260 265 270 Pro Ser Phe Gln Ser Lys Thr Pro Pro Glu Thr Gly Gly Tyr Ala Ser 275 280 285 Leu Pro Thr Lys Gly Gln Gly Gly Pro Pro Gly Ala Gly Leu Ala Phe 290 295 300 Pro Pro Pro Ala Ala Gly Leu Tyr Val Pro His Pro His His Lys Gln 305 310 315 320 Ala Gly Pro Val Ala His Gln Leu His Val Leu Gly Ser Arg Ser Gln 325 330 335 Val Phe Ala Ser Asp Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Thr Pro Ser Arg 340 345 350 Asn Ser Leu Asn Val Asp Leu Tyr Glu Leu Ser Ser Thr Ser Val Gln 355 360 365 Gln Trp Pro Ala Ala Thr Leu Ala Arg Arg Asp Ser Leu Gln Lys Pro 370 375 380 Gly Leu Glu Ala Pro Pro Arg Ala His Val Ala Phe Arg Pro Asp Cys 385 390 395 400 Pro Val Pro Ser Arg Thr Asn Ser Phe Asn Ser His Gln Pro Arg Pro 405 410 415 Gly Pro Pro Gly Lys Ala Glu Pro Ser Leu Pro Ala Pro Asn Thr Val 420 425 430 Thr Ala Val Thr Ala Ala His Ile Leu His Pro Val Lys Ser Val Arg 435 440 445 Val Leu Arg Pro Glu Pro Gln Thr Ala Val Gly Pro Ser His Pro Ala 450 455 460 Trp Val Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 465 470 475 480 Ala Glu Gly Leu Asp Ala Lys Glu Glu His Ala Leu Ala Leu Gly Gly 785 490 495 Ala Gly Ala Phe Pro Leu Asp Val Glu Tyr Gly Gly Pro Asp Arg Arg 500 505 510 Cys Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Lys His Leu Leu Leu Arg Ser Lys Ser 515 520 525 Glu Gln Tyr Asp Leu Asp Ser Leu Cys Ala Gly Met Glu Gln Ser Leu 530 353 340 Arg Ala Gly Pro Asn Glu Pro Glu Gly Gly Asp Lys Ser Arg Lys Ser 545 550 555 560 Ala Lys Gly Asp Lys Gly Gly Lys Asp Lys Lys Gln Ile Gln Thr Ser 565 570 575 Pro Val Pro Val Arg Lys Asn Ser Arg Asp Glu Glu Lys Arg Glu Ser 580 585 590 Arg Ile Lys Ser Tyr Ser Pro Tyr Ala Phe Lys Phe Phe Met Glu Gln 595 600 605 His Val Glu Asn Val Ile Lys Thr Tyr Gln Gln Lys Val Asn Arg Arg 610 615 620 Leu Gln Leu Glu Gln Glu Met Ala Lys Ala Gly Leu Cys Glu Ala Glu 625 630 635 640 Gln Glu Gln Met Arg Lys Ile Leu Tyr Gln Lys Glu Ser Asn Tyr Asn 645 650 655 Arg Leu Lys Arg Ala Lys Met Asp Lys Ser Met Phe Val Lys Ile Lys 660 665 670 Thr Leu Gly Ile Gly Ala Phe Gly Glu Val Cys Leu Ala Cys Lys Val 675 680 685 Asp Thr His Ala Leu Tyr Ala Met Lys Thr Leu Arg Lys Lys Asp Val 690 695 700 Leu Asn Arg Asn Gln Val Ala His Val Lys Ala Glu Arg Asp Ile Leu 705 710 715 720 Ala Glu Ala Asp Asn Glu Trp Val Val Lys Leu Tyr Tyr Ser Phe Gln 725 730 735 Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Phe Val Met Asp Tyr Ile Pro Gly Gly Asp 740 745 750 Met Met Ser Leu Leu Ile Arg Met Glu Val Phe Pro Glu His Leu Ala 755 760 765 Arg Phe Tyr Ile Ala Glu Leu Thr Leu Ala Ile Glu Ser Val His Lys 770 775 780 Met Gly Phe Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn Ile Leu Ile Asp 785 790 795 800 Leu Asp Gly His Ile Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Thr Gly Phe 805 810 815 Arg Trp Thr His Asn Ser Lys Tyr Tyr Gln Lys Gly Ser His Val Arg 820 825 830 Gln Asp Ser Met Glu Pro Ser Asp Leu Trp Asp Asp Val Ser Asn Cys 835 840 845 Arg Cys Gly Asp Arg Leu Lys Thr Leu Glu Gln Arg Ala Arg Lys Gln 850 855 860 His Gln Arg Cys Leu Ala His Ser Leu Val Gly Thr Pro Asn Tyr Ile 865 870 875 880 Ala Pro Glu Val Leu Leu Arg Lys Gly Tyr Thr Gln Leu Cys Asp Trp 885 890 895 Trp Ser Val Gly Val Ile Leu Phe Glu Met Leu Val Gly Gln Pro Pro 900 905 910 Phe Leu Ala Pro Thr Pro Thr Glu Thr Gln Leu Lys Val Ile Asn Trp 915 920 925 Glu Asn Thr Leu His Ile Pro Ala Gln Val Lys Leu Ser Pro Glu Ala 930 935 940 Arg Asp Leu Ile Thr Lys Leu Cys Cys Ser Ala Asp His Arg Leu Gly 945 950 955 960 Arg Asn Gly Ala Asp Asp Leu Lys Ala His Pro Phe Phe Ser Ala Ile 965 970 975 Asp Phe Ser Ser Asp Ile Arg Lys Gln Pro Ala Pro Tyr Val Pro Thr 980 985 990 Ile Ser His Pro Met Asp Thr Ser Asn Phe Asp Pro Val Asp Glu Glu 995 1000 1005 Ser Pro Trp Asn Asp Ala Ser Glu Gly Ser Thr Lys Ala Trp Asp Thr 1010 1015 1020 Leu Thr Ser Pro Asn Asn Lys His Pro Glu His Ala Phe Tyr Glu Phe 1025 1030 1035 1040 Thr Phe Arg Arg Phe Phe Asp Asp Asn Gly Tyr Pro Phe Arg Cys Pro 1045 1050 1055 Lys Pro Ser Gly Ala Glu Ala Ser Gln Ala Glu Ser Ser Asp Leu Glu 1060 1065 1070 Ser Ser Asp Leu Val Asp Gln Thr Glu Gly Cys Gln Pro Val Tyr Val 1075 1080 1085

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ 33/574 Ａ 33/574 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/36 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA26 AA34 AA35 DA12 DA13 DA14 DA36 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA21 BA80 CA04 CA09 CA20 DA06 EA03 EA04 GA11 GA19 HA13 HA14 4B063 QA08 QA19 QQ02 QQ08 QQ43 QR55 QS34 4B064 AG01 AG02 CA01 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4C084 AA02 AA07 BA01 BA22 DA27 ZB262 4H045 AA10 AA11 AA30 CA40 DA01 DA76 EA28 EA51 FA74

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号１又は２に示す塩基配列
   を有するＤＮＡ。
2. 【請求項２】配列表の配列番号１又は２に示す塩基配列
   又はこれら何れかの塩基配列において１個若しくはそれ
   以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を
   有する、成長因子によってその発現が阻害されるヒト遺
   伝子を構成するＤＮＡ。
3. 【請求項３】該成長因子がヒト成長ホルモン又はインス
   リン様成長因子−１である、請求項２のヒト遺伝子を構
   成するＤＮＡ。
4. 【請求項４】配列表の配列番号１又は２に示す塩基配列
   又はこれら何れかの塩基配列において１個若しくはそれ
   以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を
   有する、腫瘍抑制性タンパク質をコードするヒト遺伝子
   を構成するＤＮＡ。
5. 【請求項５】配列表の配列番号３又は４に示すアミノ酸
   配列を有するタンパク質。
6. 【請求項６】配列表の配列番号３又は４に示すアミノ酸
   配列又はこれら何れかのアミノ酸配列において１個若し
   くはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
   たアミノ酸配列を有する、成長因子によってその発現が
   阻害されるタンパク質。
7. 【請求項７】該成長因子がヒト成長ホルモン又はインス
   リン様成長因子−１である、請求項６のタンパク質。
8. 【請求項８】配列表の配列番号３又は４に示すアミノ酸
   配列又はこれら何れかのアミノ酸配列において１個若し
   くはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
   たアミノ酸配列を有する、腫瘍抑制性タンパク質。
9. 【請求項９】請求項５ないし８のアミノ酸配列の何れか
   を有するタンパク質をコードする塩基配列を含んでなる
   ＤＮＡ。
10. 【請求項１０】請求項１、２、３、４又は９の何れかに
    記載の塩基配列の何れかよりなるＤＮＡとハイブリダイ
    ズするＤＮＡを含んでなるプローブ。
11. 【請求項１１】請求項１、２、３、４又は９の何れかに
    記載の塩基配列の何れかよりなるＤＮＡを含んだ組換え
    ベクター。
12. 【請求項１２】請求項１、２、３、４又は９の何れかに
    記載の塩基配列の何れかの部分配列よりなる、プライマ
    ー用ＤＮＡ断片。
13. 【請求項１３】請求項１０のプローブを含んでなる、ヒ
    ト用診断薬。
14. 【請求項１４】小人症、巨人症、先端巨大症、血管障
    害、糖尿病性腎疾患、心臓疾患又は乳癌、結腸直腸癌及
    び白血病を含む悪性腫瘍における、成長因子によって阻
    害される腫瘍抑制遺伝子の発現を検査するための診断薬
    である、請求項１３の診断薬。
15. 【請求項１５】請求項５ないし８の何れかのタンパク質
    を含有する抗腫瘍剤。
16. 【請求項１６】請求項１ないし８の何れかのタンパク質
    に対する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体。
17. 【請求項１７】請求項１６の抗体を含むことを特徴とす
    る、腫瘍抑制遺伝子発現の診断薬。