JP2000210100A - 酸化還元反応を用いた測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて
測定する方法であって、信頼性に優れる測定値を得るこ
とができる測定方法を提供する。 【解決手段】 前記酸化還元反応に先立ち、試料にテト
ラゾリウム化合物を添加して、前記試料中に含まれる還
元物質の影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の
還元物質または酸化物質を発生させ、この量を酸化還元
反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量
を決定する。前記テトラゾリウム化合物としては、例え
ば、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-
5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩が使用
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の測定対象
物を、酸化還元反応を用いて測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、例えば、酸化還元反応を利用
して、試料中の測定対象物の量を測定することは、広く
実施されている。例えば、生化学分析や臨床検査等にお
ける糖化タンパク質の測定にも適用されている。

【０００３】例えば、血液中の糖化タンパク質、特に赤
血球中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）は、生体血糖
値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療
等における重要な指標とされている。例えば、赤血球中
の糖化タンパク質は、酸化還元反応を用いて、以下に示
すようにして測定されている。

【０００４】まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、
この溶血試料を適当なプロテアーゼ等で処理した後、フ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤとい
う）で処理し、過酸化水素を発生させる。この過酸化水
素量は、赤血球中の糖化タンパク質量に対応する。そし
て、この試料に、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤとい
う）および還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前
記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応を起こ
す。この時、前記還元剤として、酸化されることにより
発色する還元剤を用いれば、その発色を測定することに
より前記過酸化水素量を測定でき、この結果、赤血球中
の糖化タンパク質量を知ることができる。

【０００５】しかし、血液中には、通常、アスコルビン
酸（ＡｓＡ）、ビリルビン等の各種還元物質が存在し、
さらに、赤血球中には、グルタチオン（ＧＳＨ）等の各
種還元物質が存在する。これらの還元物質により、前記
過酸化水素が還元されたり、前記酸化還元反応が阻害さ
れたり、前記還元剤が発色した後に還元され退色するお
それがある。このため、赤血球中の糖化タンパク質量を
正確に測定することが困難であるという問題があった。

【０００６】また、試料ごとによって、含まれる還元物
質の濃度も一定ではないため、測定精度が劣るという問
題もあった。

【０００７】このような問題を回避するために、例え
ば、種々の酸化剤を前記試料に添加するという方法があ
る。例えば、特開昭５６−１５１３５８号公報には、酸
化剤としてヨウ素酸、過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物を
用いる方法が開示されており、特開昭５７−１３３５７
号公報、特開昭５７−１６１６５０号公報、特開昭５９
−１９３３５４号公報、特開昭６２−１６９０５３号公
報、特開平３−３０６９７号公報には、酸化剤としてコ
バルト、鉄、セリウム等の金属錯体を用いる方法が開示
されている。

【０００８】しかしながら、これらの酸化剤を用いた場
合でも、前述のような測定に対する影響を充分に回避で
きず、特に、測定対象物が赤血球内成分である場合に、
前述のような酸化剤による効果が低かった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定す
る方法であって、信頼性に優れる測定値を得ることがで
きる測定方法の提供である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の測定方法は、試料中の測定対象物を酸化還
元反応を用いて測定する方法であって、前記酸化還元反
応に先立ち、試料にテトラゾリウム化合物を添加して前
記試料中に含まれる還元物質の影響を排除し、その後、
前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質を発生さ
せ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値か
ら前記測定対象物の量を決定することを特徴とする。前
記テトラゾリウム化合物とは、テトラゾール環構造を有
する化合物である。

【００１１】本発明者らは、鋭意研究を行なった結果、
従来の方法によると、例えば、前記ＧＳＨやＡｓＡのよ
うな低分子量還元物質の影響が排除されていないのでは
なく、タンパク質等のような高分子量還元物質による影
響が排除されていないことを突き止めた。そして、本発
明者らは、前記テトラゾリウム化合物によれば、例え
ば、前記低分子量還元物質だけでなく、その他の還元物
質の影響をも排除できるということを見出し、本発明の
測定方法に到達した。本発明の測定方法によれば、より
信頼性に優れた測定対象物の量を求めることが可能であ
るため、例えば、臨床医療等における各種検査に有用で
ある。

【００１２】本発明の測定方法において、前記テトラゾ
リウム化合物が、テトラゾール環の少なくとも二箇所に
環構造置換基を有することが好ましく、より好ましく
は、３箇所に環構造置換基を有する構造である。

【００１３】前記テトラゾリウム化合物が、前述のよう
に、前記テトラゾール環の少なくとも二箇所に環構造置
換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾール環
の２位および３位に有することが好ましい。また、テト
ラゾリウム化合物が三箇所に環構造置換基を有する場合
は、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位、３位お
よび５位に有することが好ましい。

【００１４】本発明の測定方法において、少なくとも二
つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好
ましい。また、ベンゼン環以外の環構造置換基として
は、例えば、環骨格にＳまたはＯを含み、かつ共鳴構造
である置換基があげられ、例えば、チエニル基、チアゾ
イル基等である。

【００１５】本発明の測定方法において、前記テトラゾ
リウム化合物が、テトラゾール環の少なくとも三箇所に
環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくと
も２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であること
が好ましい。

【００１６】本発明の測定方法において、少なくとも一
つの環構造置換基が官能基を有することが好ましく、前
記官能基の数が多いことがより好ましい。

【００１７】前記官能基としては、電子吸引性の官能基
が好ましく、例えば、ハロゲン基、エーテル基、エステ
ル基、カルボキシ基、アシル基、ニトロソ基、ニトロ
基、ヒドロキシ基、スルホ基等があげられる。この他に
も、例えば、前記官能基以外で、ヒドロペルオキシ基、
オキシ基、エポキシ基、エピジオキシ基、オキソ基等の
酸素を含む特性基や、メルカプト基、アルキルチオ基、
メチルチオメチル基、チオキソ基、スルフィノ基、ベン
ゼンスルホニル基、フェニルスルホニル基、p-トルエン
スルホニル基、p-トリルスルホニル基、トシル基、スル
ファモイル基、イソチオシアネート基等の硫黄を含む特
性基等があげられる。これらの電子吸引性官能基の中で
も、好ましくは、ニトロ基、スルホ基、ハロゲン基、カ
ルボキシ基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基で
ある。また、前記電子吸引性の官能基の他に、例えば、
フェニル基（Ｃ₆Ｈ₅−）、スチリル基（Ｃ₆Ｈ₅ＣＨ＝Ｃ
Ｈ−）等の不飽和炭化水素基等もあげられる。なお、前
記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。

【００１８】本発明の測定方法において、前記テトラゾ
リウム化合物が、テトラゾール環の２位および３位にベ
ンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方
が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ
基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群
から選択された少なくとも一つの官能基を有することが
好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基
を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇
所（ortho-、meta-、pra-）に前記官能基を有してもよ
い。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を
有しても、異なる官能基を有してもよい。

【００１９】本発明の測定方法において、前記テトラゾ
リウム化合物は、例えば、前記テトラゾール環の２位、
３位および５位にベンゼン環構造置換基を有する化合物
として、例えば、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフ
ェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム
塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-
5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(2
-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5
-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(4-
ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H
-テトラゾリウム塩、3,3'-(1,1'-ビフェニル-4,4'-ジ
ル)-ビス(2,5-ジフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、3,3'
-[3,3'-ジメトキシ-(1,1'-ビフェニル)-4,4'-ジル]-ビ
ス[2-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウ
ム塩]、2,3-ジフェニル-5-(4-クロロフェニル)テトラゾ
リウム塩、2,5-ジフェニル-3-(p-ジフェニル)テトラゾ
リウム塩、2,3-ジフェニル-5-(p-ジフェニル)テトラゾ
リウム塩、2,5-ジフェニル-3-(4-スチリルフェニル)テ
トラゾリウム塩、2,5-ジフェニル-3-(m-トリル)テトラ
ゾリウム塩および2,5-ジフェニル-3-(p-トリル)テトラ
ゾリウム塩等があげられる。

【００２０】また、前記テトラゾリウム化合物は、前述
のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラ
ゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所
にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例
えば、2,3-ジフェニル-5-(2-チエニル)テトラゾリウム
塩、2-ベンゾチアゾイル-3-(4-カルボキシ-2-メトキシ
フェニル)-5-[4-(2-スルホエチル カルバモイル)フェ
ニル]-2H-テトラゾリウム塩、2,2'-ジベンゾチアゾイル
-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニ
ル]-3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテト
ラゾリウム塩および3-(4,5-ジメチル-2-チアゾイル)-2,
5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム塩等があげられる。

【００２１】また、前記テトラゾール環の２箇所にベン
ゼン環構造置換基および１箇所に環構造でない置換基を
有するテトラゾリウム化合物も使用でき、例えば、2,3-
ジフェニル-5-シアノテトラゾリウム塩、2,3-ジフェニ
ル-5-カルボキシテトラゾリウム塩、2,3-ジフェニル-5-
メチルテトラゾリウム塩、2,3-ジフェニル-5-エチルテ
トラゾリウム塩等があげられる。

【００２２】前述のテトラゾリウム化合物の中でも、前
述のように、環構造置換基を３つ有する化合物が好まし
く、より好ましくは、環構造がベンゼン環である置換基
を３つ有し、かつ電子吸引性官能基を多く有するもので
あり、特に好ましくは、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-
ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テト
ラゾリウム塩である。なお、このようなテトラゾリウム
化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態
等であってもよい。

【００２３】本発明の測定方法において、前記テトラゾ
リウム化合物の添加量は、特に制限されず、試料の種類
や前記還元物質の量により適宜決定できる。具体的に
は、例えば、試料１μｌ当たり、前記テトラゾリウム化
合物を、０．００１〜１００μｍｏｌの範囲になるよう
に添加することが好ましく、より好ましくは０．００５
〜１０μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０１〜１
μｍｏｌの範囲である。

【００２４】本発明の測定方法において、前記試料が全
血の場合、前記テトラゾリウム化合物を、全血１μｌ当
たり、０．００１〜１０μｍｏｌの範囲になるように添
加することが好ましく、より好ましくは０．００５〜５
μｍｏｌの範囲、特に好ましくは０．０１〜１μｍｏｌ
の範囲である。具体的には、前記テトラゾリウム化合物
が2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-
(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩の場合
は、全血１μｌ当たり、０．００１〜０．４μｍｏｌの
範囲になるように添加することが好ましく、より好まし
くは０．００５〜０．１μｍｏｌの範囲、特に好ましく
は０．０１〜０．０７μｍｏｌの範囲である。

【００２５】本発明の測定方法において、前記測定対象
物由来の酸化物質が過酸化水素であり、酸化還元反応の
測定が、前記過酸化水素量の測定であることが好まし
い。

【００２６】前記過酸化水素量の測定は、酸化酵素と酸
化により発色する基質（以下、発色性基質という）とを
用いた測定であることが好ましい。

【００２７】前記発色性基質としては、特に制限されな
いが、高感度に検出可能であることから、例えば、Ｎ−
（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビ
ス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムが好
ましい。また、前記酸化酵素はペルオキシダーゼである
ことが好ましい。

【００２８】本発明の測定方法において、前記試料の種
類は、特に制限されず、全血、血漿、血清、血球等の他
に、例えば、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲
料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用
できる。

【００２９】本発明の測定方法において、測定対象物と
しては、例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成
分、血清中成分、尿成分、髄液成分等があげられるが、
好ましくは赤血球内成分である。前記赤血球内成分とし
ては、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の
糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコ
ース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシ
ン、グリセロール等があげられ、より好ましくは糖化タ
ンパク質である。例えば、前記赤血球成分を測定する場
合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよい
し、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させ
たものを試料として用いてもよい。

【００３０】本発明の測定方法において、前記糖化タン
パク質の糖部分をＦＡＯＤで酸化分解することにより過
酸化水素を生成させることが好ましい。また、前記糖化
ペプチド、糖化アミンも、同様にＦＡＯＤを作用させる
ことが好ましい。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプ
チドは、必要に応じて、前記ＦＡＯＤ処理前に、プロテ
アーゼ処理することが好ましい。

【００３１】前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示
す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。

【００３２】

【化１】 Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ² ＋ Ｈ₂Ｏ ＋ Ｏ₂ →Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ₂−Ｒ² ＋ Ｈ₂Ｏ₂ ．．．（１）

【００３３】前記式（１）において、Ｒ¹は、水酸基も
しくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味
する。前記糖残基（Ｒ¹）は、反応前の糖がアルドース
の場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトース
の場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグ
ルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造
はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基
（Ｒ¹）は、グルコース残基（アルドース残基）とな
る。この糖残基（Ｒ¹）は、例えば、−[ＣＨ（ＯＨ）]_n
−ＣＨ₂ＯＨで示すことができ、ｎは、０〜６の整数で
ある。

【００３４】前記式（１）において、Ｒ²は、特に制限
されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまた
は糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されてい
る場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合と
で異なる。

【００３５】前記式（１）において、α−アミノ基が糖
化されている場合、Ｒ²は、下記式（２）で示すアミノ
酸残基またはペプチド残基である。

【００３６】

【化２】 −ＣＨＲ³−ＣＯ−Ｒ⁴ ．．．（２）

【００３７】前記式（２）において、Ｒ³はアミノ酸側
鎖基を示す。また、Ｒ⁴は水酸基、アミノ酸残基または
ペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すこと
ができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数
であり、Ｒ³は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。

【００３８】

【化３】 −（ＮＨ−ＣＨＲ³−ＣＯ）_n−ＯＨ ．．．（３）

【００３９】また、前記式（１）において、α−アミノ
基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が
糖化されている）場合、Ｒ²は下記式（４）で示すこと
ができる。

【００４０】

【化４】

【００４１】前記式（４）において、Ｒ⁵は、アミノ酸
側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。
例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ⁵は −ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂− であり、例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場
合、Ｒ⁵は、 −ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ₂）− である。

【００４２】また、前記式（４）において、Ｒ⁶は、水
素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、
下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）
において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ³は、前述と同
様にアミノ酸側鎖基を示す。

【００４３】

【化５】 −（ＣＯ−ＣＨＲ³−ＮＨ）_n−Ｈ ．．．（５）

【００４４】また、前記式（４）において、Ｒ⁷は、水
酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例え
ば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式
（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ³は、前
述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。

【００４５】

【化６】 −（ＮＨ−ＣＨＲ³−ＣＯ）_n−ＯＨ ．．．（６）

【００４６】本発明の測定方法において、試料中の前記
還元物質は、特に制限されないが、その分子量が、例え
ば、１０，０００以上であり、好ましくは１０，０００
〜３，０００，０００の範囲であり、より好ましくは１
０，０００〜３００，０００の範囲であり、特に好まし
くは３０，０００〜１００，０００の範囲である。

【００４７】また、試料中の前記還元物質はタンパク質
であることが好ましい。前記タンパク質の分子量は、例
えば、３，０００以上であり、好ましくは、３，０００
〜３，０００，０００の範囲、より好ましくは１０，０
００〜３００，０００の範囲、特に好ましくは３０，０
００〜１００，０００の範囲である。このような還元物
質としては、例えば、ヘモグロビン、グロビン、グロブ
リン、アルブミン等があげられ、好ましくは、ヘモグロ
ビンである。

【００４８】

【発明の実施の形態】つぎに、本発明の測定方法につい
て、血球中の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明
する。

【００４９】まず、全血をそのまま溶血し、または全血
から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを
溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制
限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波に
よる方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。
この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性
剤を用いる方法が好ましい。

【００５０】前記界面活性剤としては、例えば、ポリオ
キシエチレン-p-t-オクチルフェニル エーテル（Ｔｒ
ｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソル
ビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤
等）、ポリオキシエチレンアルキル エーテル（Ｂｒｉ
ｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用で
き、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔ
ｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界
面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃
度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が
０．０１〜５重量％になるように前記界面活性剤を添加
し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよ
い。

【００５１】つぎに、前記溶血試料に対し、前記テトラ
ゾール環構造を有するテトラゾリウム化合物を添加し、
試料の前処理を行なう。

【００５２】前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前
処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、濃度
０．０２〜２０００ｍｍｏｌ／リットルの範囲になるよ
うに添加することが好ましく、より好ましくは０．１〜
１０００ｍｍｏｌ／リットルの範囲、特に好ましくは
０．４〜２００ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。具体
的に、前記テトラゾリウム化合物が 2-(4-ヨードフェ
ニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェ
ニル)-2H-テトラゾリウム塩の場合は、濃度０．０２〜
８０ｍｍｏｌ／リットルの範囲になるように添加するこ
とが好ましく、より好ましくは０．１〜２０ｍｍｏｌ／
リットルの範囲、特に好ましくは０．２〜１５ｍｍｏｌ
／リットルの範囲である。

【００５３】前記前処理は、通常、緩衝液中で行われ
る。前記緩衝液は、例えば、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳ
Ｏ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩
衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が使用でき
る。そのｐＨは、例えば、６〜１３の範囲であり、好ま
しくは８〜１２の範囲、より好ましくは９〜１１の範囲
である。また、前記前処理溶液中における前記緩衝液の
最終濃度は、例えば、１〜４００ｍｍｏｌ／リットルの
範囲であり、好ましくは１０〜２００ｍｍｏｌ／リット
ルの範囲である。

【００５４】この前処理の条件は、特に制限されない
が、通常、温度１０〜３７℃の範囲であり、処理時間１
０秒〜６０分の範囲である。

【００５５】前記テトラゾリウム化合物は、そのまま使
用してもよいが、操作の簡便性や処理効率等の点から、
溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液として使用す
ることが好ましい。前記溶液の濃度は、テトラゾリウム
化合物の種類（例えば、分子量等）等により適宜決定で
き、例えば、０．０１〜１２０ｍｍｏｌ／リットルの範
囲であり、好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／リットル
の範囲、より好ましくは０．２〜２０ｍｍｏｌ／リット
ルの範囲である。前記溶媒としては、例えば、蒸留水、
生理食塩水、緩衝液等が使用でき、前記緩衝液として
は、例えば、前述と同様の緩衝液が使用できる。なお、
前記テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種
類以上を併用してもよい。

【００５６】つぎに、この前処理済み溶血試料に対し、
プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用する
ＦＡＯＤを測定対象物に作用し易くするためである。

【００５７】前記プロテアーゼの種類は、特に制限され
ず、例えば、プロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプシ
ン、アミノペプチダーゼ等が使用できる。前記プロテア
ーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件
は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象物である糖
化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定さ
れる。

【００５８】具体的には、例えば、前記プロテアーゼと
してプロテアーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を
処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０
〜３０，０００ｍｇ／リットル、反応液中の血球濃度
０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時
間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。また、
前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩
酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用
できる。

【００５９】つぎに、前記プロテアーゼ処理により得ら
れた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ
処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。

【００６０】このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処
理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。その処理条
件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化
タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定され
る。

【００６１】具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ
濃度５０〜５０，０００Ｕ／リットル、反応液中の血球
濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応
時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。また、前記
緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理
と同様の緩衝液が使用できる。

【００６２】つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸
化水素を、ＰＯＤおよび前記発色性基質を用いて酸化還
元反応により測定する。

【００６３】前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−
（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビ
ス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オ
ルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と
４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげら
る。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノー
ル、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、
ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘
導体等があげらる。また、前記アミノアンチピリンの他
に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスル
ホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴ
Ｈ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン
（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質
の中でも、特に好ましくは、前述のように、Ｎ−（カル
ボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジ
メチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。

【００６４】前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行
われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等に
より適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０
〜１００，０００ＩＵ／リットル、発色性基質濃度０．
００５〜３０ｍｍｏｌ／ｌ、反応温度１５〜３７℃、反
応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記
緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ
処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用でき
る。

【００６５】前記酸化還元反応において、例えば、前記
発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光
度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の
量を測定できる。そして、例えば、この過酸化水素濃度
と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求
めることができる。

【００６６】なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等
を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により
測定することもできる。

【００６７】この測定方法において、テトラゾリウム化
合物による前処理工程は、前述のように、酸化還元反応
が実質的に生じる前であれば、特に制限されないが、前
記ＦＡＯＤ処理後に過酸化水素が発生することから、前
記ＦＡＯＤ処理前に行なうことが好ましい。また、各処
理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例え
ば、以下に示すような組み合わせで同時に行ってもよい
処理工程がある。

【００６８】１：溶血処理＋前処理 ２：溶血処理＋前処理＋プロテアーゼ処理 ３：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理 ４：ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元処理 ５：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元
処理

【００６９】また、前記ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび発色性
基質の添加順序も、特に制限されない。

【００７０】このように、試料にテトラゾリウム化合物
を接触させることにより、ＧＳＨ、ＡｓＡ、ジチオスレ
イトール、システイン、Ｎ−アセチル−システイン等の
低分子量還元物質による影響だけでなく、例えば、タン
パク質や前述のような分子量の範囲である還元物質によ
る影響も回避することができる。

【００７１】また、本発明の測定方法の前記テトラゾリ
ウム化合物による前処理工程において、例えば、前記テ
トラゾリウム化合物以外の酸化剤を、さらに併用しても
よい。前記酸化剤としては、例えば、ヨード酢酸ナトリ
ウム、ヨーソ酸、過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物、ＥＤ
ＴＡ−Ｆｅ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビン
オキシダーゼ等が使用できる。このような酸化剤の添加
量は、例えば、試料１μｌ当たり０．００１〜０．１ｍ
ｇの範囲である。

【００７２】本発明の測定方法において、測定対象物
は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限さ
れず、前記糖化タンパク質の他に、例えば、前述のよう
に、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレス
テロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロ
ール等があげられる。

【００７３】例えば、過酸化水素を発生させて、前記各
測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコ
ースにはグルコースオキシダーゼを、前記コレステロー
ルにはコレステロールオキシダーゼを、前記尿酸にはウ
リカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンオキシダ
ーゼを、前記サルコシンにはサルコシンオキシダーゼ
を、前記グリセロールにはグリセロールオキシダーゼ
を、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよ
い。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして
行なうことができる。また、糖化ペプチド、糖化アミノ
酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして
測定できる。

【００７４】また、前記テトラゾリウム化合物による試
料中の還元物質の処理後、測定対象物由来の還元物質を
発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測
定値から、前記測定対象物の量を決定する場合は、例え
ば、以下に示すようにして測定を行なうことができる。

【００７５】例えば、前記測定対象物がグルコースの場
合、例えば、ＮＡＤやＮＡＤＰ等の存在下、グルコース
デヒドロゲナーゼを用いて、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の
還元物質を発生させる。そして、前記測定対象物由来の
還元物質であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを、例えば、ジア
ホラーゼと、還元により発色する基質とを用いて、酸化
還元反応により測定する。そして、前述のように、例え
ば、この測定対象物由来の還元物質の濃度と検量線等と
を用いて、試料中の測定対象物の量を求めることができ
る。また、例えば、測定対象物がコレステロールの場合
はコレステロールデヒドロゲナーゼを、サルコシンの場
合は、サルコシンデヒドロゲナーゼをそれぞれ使用でき
る。

【００７６】前記還元により発色する基質としては、特
に制限されないが、例えば、前記試料中の還元物質の影
響を排除するために添加した発色性のテトラゾリウム化
合物を用いてもよい。また、各測定波長に応じて、前記
試料の前処理に使用したものとは違う種類の発色性のテ
トラゾリウム化合物を使用してもよい。前記発色性のテ
トラゾリウム化合物の他には、例えば、２，６−ジクロ
ロフェノールインドフェノール等も使用できる。なお、
より優れた信頼性の測定値を得るために、例えば、前記
測定対象物由来の還元物質を測定する前に、予め吸光度
を測定しておくことが好ましい。

【００７７】このように、前記テトラゾリウム化合物を
用いて試料を処理すれば、前記低分子量還元物質だけで
なく、例えば、前述のようなタンパク質等の高分子量還
元物質の影響も回避できる。このため、分子量１万以上
の還元物質や、タンパク質である還元物質が影響する場
合は、前記全血試料だけには限定されず、前述のような
各種試料に対しても適用できる。全血試料以外の試料を
用いる場合は、前記試料が異なる以外は同様の試薬を用
いて、同様にして測定することができる。

【００７８】

【実施例】つぎに、実施例について比較例と併せて説明
する。

【００７９】（実施例１、比較例１）この実施例は、試
料をテトラゾリウム化合物で前処理し、前記試料中の還
元物質の影響を排除した例である。以下に、使用した試
薬および方法を示す。

【００８０】（界面活性剤溶液）ポリオキシエチレン
（10）-p-t-オクチルフェニル エーテル（以下、Trito
nX-100という)を、濃度０．１体積％になるように精製
水と混合して調製した。

【００８１】（ＷＳＴ−３溶液）濃度が１ｍｍｏｌ／リ
ットルになるように、精製水に 2-(4-ヨードフェニル)
-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)
-2H-テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３、
同仁化学研究所社製）を溶解して調製した。

【００８２】（フルクトシルバリン溶液）フルクトシル
バリン（以下、ＦＶという）は、特開平２−６９６４４
号公報にしたがって製造した（以下、同じ）。前記ＦＶ
を、濃度５０μｍｏｌ／リットルになるように０．５ｍ
ｏｌ／リットルＴｒｉｓ−HＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
に添加して調製した。

【００８３】 （酸化還元反応溶液Ａ） ＦＡＯＤ（旭化成工業社製：以下同じ） ２８．６ＫＵ／リットル ＰＯＤ（東洋紡社製：以下、同じ） １４．３ＫＵ／リットル ＤＡ−６４（和光純薬工業社製：以下、同じ） ２８．６μｍｏｌ／リットル 蒸留水 残分

【００８４】健常者の全血を遠心分離（１６３０Ｇ、１
０分間）して血球を回収した。そして、前記血球を前記
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で、２０倍（体積）希釈
し、溶血させたものを溶血試料とした。

【００８５】前記試料５０μｌに、０．５ｍｏｌ／リッ
トル ＣＨＥＳ緩衝液（ＰＨ９．０）５０μｌを添加し
てから、前記ＷＳＴ−３溶液１００μｌを添加し、攪拌
後、３７℃で１０分間処理した。前記処理後、前記処理
済み試料に、前記ＦＶ溶液４００μｌを添加してから、
前記酸化還元反応溶液Ａ １４００μｌを添加し、反応
を開始した。そして、反応溶液の７２６ｎｍにおける吸
光度を測定した。

【００８６】コントロールとしては、前記溶血試料の代
り蒸留水を用いた以外は、前述と同様にして測定を行な
った。比較例１としては、前記ＷＳＴ−３溶液の代りに
蒸留水を用いた以外は、前記実施例１と同様にして測定
を行なった。

【００８７】そして、これらの測定値を下記式（数１）
に代入し、コントロールの吸光度を１００％とした時の
相対値（％）を求めた。これらの結果を下記表１に示
す。

【００８８】

【数１】 相対値（％）＝（Ｘ₁−Ｘ₀／Ｙ₁−Ｙ₀）×１００ Ｘ₁：５分後の吸光度 Ｘ₀：反応開始時の吸光度 Ｙ₁：コントロールの５分後の吸光度 Ｙ₀：コントロールの反応開始時の吸光度

【００８９】

【表１】

【００９０】このように、血球の溶血試料をテトラゾリ
ウム化合物で処理することにより、前記試料中の還元物
質の影響を排除でき、測定の信頼性が向上した。

【００９１】（比較例２および比較例３）実施例１と同
様にして血球を回収し、これを１．０体積％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００溶液で、５倍（体積）希釈し、溶血させ
たものを溶血試料とした。この溶血試料５０μｌに、
１．０ｍｏｌ／リットル ヨード酢酸ナトリウム（Ａｌ
ｄｏｒｉｃｈ社製：以下、同じ）溶液１５０μｌを添加
し、攪拌後、３７℃で１０分間処理した。前記処理後、
前記処理済み試料に、前記ＦＶ溶液４００μｌを添加
し、続いて、前記酸化還元反応溶液Ａ １４００μｌを
添加して反応を開始した。そして、前記実施例１と同様
にして吸光度を測定し、コントロールに対する相対値
（％）を求めた。これを比較例２とした。なお、コント
ロールとしては、前記溶血試料の代りに蒸留水を用いた
以外は、前述と同様にして測定を行なった。

【００９２】比較例３は、前記ヨード酢酸ナトリウム溶
液の代りに蒸留水を添加した以外は、前記実施例１と同
様にして測定を行なった。これらの結果を下記表２に示
す。

【００９３】

【表２】

【００９４】前記表２に示すように、従来から使用され
ている酸化剤であるヨード酢酸ナトリウムでは、溶血試
料中の還元物質の影響を回避できないことが確認でき
た。

【００９５】（比較例４）この比較例は、赤血球の溶血
試料を分子量分画してから、ヨード酢酸ナトリウムで処
理した例である

【００９６】ヘパリンを添加した健常者血液１０ｍｌを
遠心分離（１６３０Ｇ、１０分間）し、血漿層および白
血球層をピペットで除去した。得られた赤血球層に、生
理食塩水加え、前記赤血球が溶血しないように、ゆっく
り混和してから、前述と同様に遠心分離を行ない、上清
を除去した。この一連の洗浄操作は、３回繰り返し行な
った。つぎに、得られた赤血球に、同量（体積）の蒸留
水を加えて完全に溶血させた後、再度、遠心分離（４５
３０Ｇ、１０分間）を行ない、膜成分を除去した溶液を
試料１とした。

【００９７】つぎに、試料１を、ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ
３０（ミリポア社製）を用いて、遠心分離（１６３０
Ｇ、４時間）することにより限外濾過した。前記ＣＥＮ
ＴＲＩＰＲＥＰ ３０に残った分子量３万以上の画分
を、試料２とし、濾液を試料３とした。

【００９８】つぎに、前記試料３を、さらに、ＣＥＮＴ
ＲＩＰＲＥＰ １０（ミリポア社製）を用いて、遠心分
離（１６３０Ｇ、２時間）することにより限外濾過し
た。前記ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ １０に残った分子量１
万以上３万未満の画分を試料４とし、濾液を試料５とし
た。

【００９９】そして、前記各試料を蒸留水で希釈した希
釈溶液２００μｌに、前記ＦＶ溶液４００μｌを添加
し、続いて、前記酸化還元反応溶液Ａ １４００μｌを
添加して反応を開始した。そして、前記実施例１と同様
にして吸光度を測定し、コントロールに対する相対値
（％）を求めた。なお、前記試料１〜２は、蒸留水によ
り８０倍に希釈し、試料３〜試料５は、１０倍に希釈し
た。コントロールとしては、前記溶血試料の代り蒸留水
を用いた以外は、前述と同様にして測定を行なった。

【０１００】また、前記各試料の希釈溶液５０μｌに対
し、前記ヨード酢酸ナトリウム溶液１５０μｌを添加
し、攪拌後、３７℃で１０分間処理した。そして、前記
処理済み希釈試料に、前記ＦＶ溶液４００μｌを添加
し、続いて、前記酸化還元反応溶液Ａ １４００μｌを
添加して反応を開始した。前記実施例１と同様にして吸
光度を測定し、コントロールに対する相対値（％）を求
めた。これらの結果を下記表３に示す。

【０１０１】

【表３】 相対値（％） 試料１ ０ 試料２ ７ 試料３ ９３ 試料４ １００ 試料５ ９３ 試料１＋ヨード酢酸ナトリウム ０ 試料２＋ヨード酢酸ナトリウム ８ 試料３＋ヨード酢酸ナトリウム ９８ 試料４＋ヨード酢酸ナトリウム １００ 試料５＋ヨード酢酸ナトリウム ９８ コントロール １００

【０１０２】前記表３に示すように、試料１（未分画）
および試料２（分子量３万以上の画分）については、ほ
とんど測定することができなかった。また、前記試料１
および試料２をヨード酢酸ナトリウムで処理しても、同
様に、ほとんど測定できなかった。このことから、ヨー
ド酢酸ナトリウムでは、１万以上、特に３万以上の還元
物質についての影響を、ほとんど回避できないことがわ
かった。

【０１０３】（実施例２、比較例５）この実施例は、各
種テトラゾリウム化合物を用いて、血液試料を処理し
て、前記試料中の還元物質の影響を排除した例である。
以下に、使用したテトラゾリウム化合物の化合物名とそ
の構造を示す。

【０１０４】（１）テトラゾール環の３箇所にベンゼン
環構造置換基を有するテトラゾリウム化合物 （１−１）ＷＳＴ−１

【化７】 2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-
ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム，モノナトリウ
ム塩 （１−２）ＷＳＴ−３

【化８】 2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-
(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム，モノナト
リウム塩 （１−３）ＷＳＴ−８

【化９】 2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニ
ル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム，モ
ノナトリウム塩 （１−４）ＩＮＴ

【化１０】 2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニ
ル-2H-テトラゾリウムクロライド （１−５）Ｎｅｏ−ＴＢ

【化１１】 3,3'-(1,1'-ビフェニル-4,4'-ジル)-ビス(2,5-ジフェニ
ル)-2H-テトラゾリウムクロライド （１−６）ＮＴＢ

【化１２】 3,3'-[3,3'-ジメトキシ-(1,1'-ビフェニル)-4,4'-ジル]
-ビス[2-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾ
リウム クロライド] （１−７）Ｂ３２９

【化１３】 2,3-ジフェニル-5-(4-クロロフェニル)テトラゾリウム
クロライド （１−８）Ｄ０８８３

【化１４】 2,5-ジフェニル-3-(p-ジフェニル)テトラゾリウム ク
ロライド （１−９）Ｄ０８８４

【化１５】 2,3-ジフェニル-5-(p-ジフェニル)テトラゾリウム ク
ロライド （１−１０）Ｄ０９１５

【化１６】 2,5-ジフェニル-3-(4-スチリルフェニル)テトラゾリウ
ム クロライド （１−１１）Ｔ３２４

【化１７】 2,5-ジフェニル-3-(m-トリル)テトラゾリウム クロラ
イド （１−１２）Ｔ３２６

【化１８】 2,5-ジフェニル-3-(p-トリル)テトラゾリウム クロラ
イド

【０１０５】（２）テトラゾール環の２箇所にベンゼン
環構造置換基を有し、１箇所にその他の環構造置換基を
有するテトラゾリウム化合物 （２−１）Ｂ０３２５

【化１９】 2,3-ジフェニル-5-(2-チエニル)テトラゾリウム クロ
ライド （２−２）ＷＳＴ−４

【化２０】 2-ベンゾチアゾイル-3-(4-カルボキシ-2-メトキシフェ
ニル)-5-[4-(2-スルホエチル カルバモイル)フェニル]
-2H-テトラゾリウム （２−３）ＷＳＴ−５

【化２１】 2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエ
チル)カルバモイルフェニル] -3,3'-(3,3'-ジメトキシ-
4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム，ジナトリウム塩 （２−４）ＭＴＴ

【化２２】 3-(4,5-ジメチル-2-チアゾイル)-2,5-ジフェニル-2H-テ
トラゾリウム クロライド

【０１０６】（３）テトラゾール環の２箇所にベンゼン
環構造置換基を有し、１箇所に環構造以外の置換基を有
するテトラゾリウム化合物 （３−１）Ｂ０２９３

【化２３】 2,3-ジフェニル-5-シアノテトラゾリウム クロライド （３−２）Ｂ２９５

【化２４】 2,3-ジフェニル-5-カルボキシテトラゾリウム クロラ
イド （３−３）Ｂ３１３

【化２５】 2,3-ジフェニル-5-メチルテトラゾリウム クロライド （３−４）Ｂ３１９

【化２６】 2,3-ジフェニル-5-エチルテトラゾリウム クロライド

【０１０７】なお、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−
８、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＩＮＴ、ＭＴＴ、ＮＴ
Ｂ、Ｎｅｏ−ＴＢは、同仁化学研究所製、その他は、東
京化成社製である。

【０１０８】（ＦＶ溶液）前記ＦＶを、濃度１０μｍｏ
ｌ／リットルになるように０．１４５ｍｏｌ／リットル
ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に添加して調製した。

【０１０９】（酸化還元反応溶液Ｂ） ＦＡＯＤ ７３ＫＵ／リットル ＰＯＤ ２１９ＫＵ／リットル ＤＡ−６４ １４６μｍｏｌ／リットル 蒸留水 残分

【０１１０】１．０ｍｏｌ／リットル ＣＡＰＳＯ緩衝
液（ｐＨ１０．０）２５μｌに、前記１０体積％ Trit
on X-100溶液４１．３μｌおよび健常者の全血１．６
５μｌを添加し、蒸留水で２５０μｌに定量した。そし
て、これを精製水で３倍（体積）希釈したものを溶血試
料とした。

【０１１１】前記溶血試料２５０μｌに、各種テトラゾ
リウム化合物溶液１５０μｌを添加し、攪拌後、３７℃
で６０分間処理した。そして、前記処理済み試料２５μ
ｌに、前記ＦＶ溶液５５μｌを添加してから、前記酸化
還元反応溶液Ｂ １５μｌを添加し、反応を開始した。
そして、前記実施例１と同様にして吸光度を測定し、コ
ントロールに対する相対値（％）を求めた。なお、前記
テトラゾリウム化合物溶液の濃度は、ＷＳＴ−５につい
ては０．５ｍｍｏｌ／リットルとし、それ以外の溶液は
濃度５ｍｍｏｌ／リットルとした。

【０１１２】コントロールとしては、前記溶血試料の代
り蒸留水を用いた以外は、前述と同様にして測定を行な
った。比較例５としては、前記テトラゾリウム化合物溶
液の代りに蒸留水を用いた以外は、前記実施例２と同様
にして測定を行なった。これらの結果を下記表４に示
す。

【０１１３】

【表４】テトラゾリウム化合物 相対値（％） １−１ ９０ １−２ ９４ １−３ ８９ １−４ ９０ １−５ ８８ １−６ ９４ １−７ ９４ １−８ ９１ １−９ ９３ １−１０ ９１ １−１１ ９１ １−１２ ７４ ２−１ ８１ ２−２ ４２ ２−３ ４４ ２−４ ４７ ３−１ ７６ ３−２ ７４ ３−３ ７４ ３−４ ６８ 比較例５ ３５ コントロール １００

【０１１４】前記表４に示すように、溶血試料を前記各
種テトラゾリウム化合物で処理することにより、測定値
の信頼性が向上した。特に、テトラゾール環の３箇所に
ベンゼン環構造置換基を有するテトラゾリウム化合物
（１−１）〜（１−１２）によれば、さらに信頼性に優
れた測定値を得ることができた。

【０１１５】（実施例３）この実施例は、テトラゾリウ
ム化合物としてＷＳＴ−３、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８お
よびＩＮＴを用い、処理時のｐＨを変化させた例であ
る。以下に、使用した緩衝液を示す。

【０１１６】（緩衝液） １．０ｍｏｌ／リットル ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．
０） １．０ｍｏｌ／リットル ＣＡＰＳＯ緩衝液（ｐＨ１
０．０） １．０ｍｏｌ／リットル ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１．
０）

【０１１７】前記各緩衝液をそれぞれ用いた以外は、前
記実施例２と同様にして、前記各テトラゾリウム化合物
を用いた処理を行い、吸光度の測定を行なった。なお、
相対値は、ＷＳＴ−３のｐＨ１０．０における吸光度を
１００％として求めた。その結果、前記各テトラゾリウ
ム化合物について、前記各緩衝液（ｐＨ９、１０、１
１）を用いても、これらの相対値は１００％であり、ｐ
Ｈによる影響は見られなかった。

【０１１８】（実施例４、比較例６）この実施例は、反
応溶液における全血試料の最終希釈倍率が約１００倍に
なるように設定して、ＷＳＴ−３により処理を行なった
例である。

【０１１９】健常者の全血３３μｌおよび１．０ｍｏｌ
／リットル ＣＡＰＳＯ緩衝液（ｐＨ１０）５０μｌを
用いた以外は、前記実施例２と同様にして溶血を行な
い、蒸留水１２５．７μｌを添加することにより、２５
０μｌに定量した。そして、これを精製水で３倍（体
積）希釈したものを溶血試料とした。

【０１２０】前記溶血試料２５μｌに、５ｍｍｏｌ／リ
ットルＷＳＴ−３溶液１５μｌを添加し、攪拌後、３７
℃で５分間処理した。そして、前記処理済み試料に、６
μｍｏｌ／リットルＦＶ溶液５５μｌを添加してから、
前記酸化還元反応溶液Ｂ １５μｌを添加し、反応を開
始した。そして、前記実施例１と同様にして吸光度を測
定し、コントロールに対する相対値（％）を求めた。コ
ントロールとしては、前記溶血試料の代りに蒸留水を用
いた以外は、前述と同様にして測定を行なった。比較例
６としては、前記ＷＳＴ−３溶液の代りに蒸留水を用い
た以外は、前述と同様にして測定を行なった。これらの
結果を下記表５に示す。

【０１２１】

【表５】

【０１２２】実施例４では、全血試料の最終希釈倍率を
低くすることによって、反応溶液中の還元物質濃度が高
くなっても、前記表５に示すように還元物質の影響を排
除でき、優れた信頼性の測定値を得ることができた。こ
れに対し、ＷＳＴ−３で処理しない比較例６では、反応
開始直後、わずかに発色が見られたが、すぐに退色がお
こり、５分経過後には完全に退色した。このため、吸光
度を測定できず、前記表５に示すように相対値は０％で
あった。

【０１２３】

【発明の効果】以上のように、本発明の測定方法は、前
記テトラゾリウム化合物を試料に添加することにより、
試料中の還元物質の影響を排除できるため、信頼性に優
れた測定を行なうことができる。このため、本発明の測
定方法は、例えば、臨床医療における各種分析に適用で
き、特に、糖尿病診断において重要である、赤血球中の
糖化ヘモグロビン等の糖化タンパク質の測定に有用であ
る。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の測定対象物を酸化還元反応を用
   いて測定する方法であって、前記酸化還元反応に先立
   ち、試料にテトラゾリウム化合物を添加して前記試料中
   に含まれる還元物質の影響を排除し、その後、前記測定
   対象物由来の還元物質または酸化物質を発生させ、この
   量を酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測
   定対象物の量を決定する測定方法。
2. 【請求項２】 テトラゾリウム化合物が、テトラゾール
   環の少なくとも二箇所にベンゼン環構造置換基を有する
   請求項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】 テトラゾリウム化合物が、テトラゾール
   環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン
   環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ
   基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基お
   よびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも一
   つの官能基を有する請求項１または２記載の測定方法。
4. 【請求項４】 テトラゾリウム化合物が、2-(4-ヨード
   フェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホ
   フェニル)-2H-テトラゾリウム塩である請求項１〜３の
   いずれか一項に記載の測定方法。